CA3198168A1 - Composition symbiotique comme additif d'alimentation pour les porcelets ou les truies et son utilisation - Google Patents
Composition symbiotique comme additif d'alimentation pour les porcelets ou les truies et son utilisationInfo
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Abstract
Composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clostridium butyricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post- sevrage.
Description
COMPOSITION SYMBIOTIQUE COMME ADDITIF D'ALIMENTATION POUR LES
PORCELETS OU LES TRUIES ET SON UTILISATION
La présente invention se rapporte à une composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
La dysbiose intestinale est un déséquilibre du microbiote intestinal pouvant générer une prolifération de pathogènes (par ex E. cou) provoquant la diarrhée. Le microbiote est, quant à lui, défini comme l'ensemble des microorganismes présents dans un milieu déterminé (définition de l'office québécois de la langue française, 2008). Ce milieu déterminé est appelé microbiome. Le déséquilibre du microbiote intestinal se traduit par une réduction de la diversité des populations bactériennes et par un excès des bactéries pathogènes du microbiote.
A l'inverse un microbiote équilibré dans la répartition des espèces de microorganismes qui le composent est dit en eubiose.
Le secteur de la production de viande grandit rapidement dans le monde, la production de porc augmente de manière régulière et représente l'un des plus gros consommateurs d'antibiotiques dans la production animale.
Dans les fermes porcines, le sevrage (interruption de l'allaitement et changement vers une alimentation sèche) est une période associée à un risque pour les jeunes animaux. Une problématique récurrente lors du sevrage des animaux est le risque accru de diarrhées résultant de la transition abrupte de régime alimentaire.
Cette transition abrupte peut engendrer une dysbiose intestinale.
Les diarrhées peuvent entraîner une perte de poids, voire la mort du nouveau-né dans des cas graves. Le traitement de routine ainsi que les procédures de prophylaxie appliquées pour la diarrhée détectée juste après la naissance du porcelet sont souvent peu efficaces.
Cette période de transition génère par ailleurs chez l'animal, en particulier chez le porcelet, un stress significatif au niveau comportemental, nutritionnel et environnemental, responsable d'une forte réduction dans la consommation de nourriture.
PORCELETS OU LES TRUIES ET SON UTILISATION
La présente invention se rapporte à une composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
La dysbiose intestinale est un déséquilibre du microbiote intestinal pouvant générer une prolifération de pathogènes (par ex E. cou) provoquant la diarrhée. Le microbiote est, quant à lui, défini comme l'ensemble des microorganismes présents dans un milieu déterminé (définition de l'office québécois de la langue française, 2008). Ce milieu déterminé est appelé microbiome. Le déséquilibre du microbiote intestinal se traduit par une réduction de la diversité des populations bactériennes et par un excès des bactéries pathogènes du microbiote.
A l'inverse un microbiote équilibré dans la répartition des espèces de microorganismes qui le composent est dit en eubiose.
Le secteur de la production de viande grandit rapidement dans le monde, la production de porc augmente de manière régulière et représente l'un des plus gros consommateurs d'antibiotiques dans la production animale.
Dans les fermes porcines, le sevrage (interruption de l'allaitement et changement vers une alimentation sèche) est une période associée à un risque pour les jeunes animaux. Une problématique récurrente lors du sevrage des animaux est le risque accru de diarrhées résultant de la transition abrupte de régime alimentaire.
Cette transition abrupte peut engendrer une dysbiose intestinale.
Les diarrhées peuvent entraîner une perte de poids, voire la mort du nouveau-né dans des cas graves. Le traitement de routine ainsi que les procédures de prophylaxie appliquées pour la diarrhée détectée juste après la naissance du porcelet sont souvent peu efficaces.
Cette période de transition génère par ailleurs chez l'animal, en particulier chez le porcelet, un stress significatif au niveau comportemental, nutritionnel et environnemental, responsable d'une forte réduction dans la consommation de nourriture.
2 Il est donc crucial de maîtriser ce risque de diarrhées car elles occasionnent une perte considérable pour les éleveurs puisqu'elles sont souvent associées à un taux de mortalité élevé, une perte de poids, un retard de croissance, et des coûts liés aux traitements.
Actuellement ce risque de diarrhées est maîtrisé par l'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques (ZnO, CuSO4) dans le régime des porcelets sevrés mais, au-delà de la résistance déjà observée à ces composés, la pratique d'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques mène à des problèmes environnementaux (contamination des eaux par les minéraux lessivés et contenus dans les effluents d'élevage).
L'ajout d'antibiotiques thérapeutiques dans la nourriture des animaux autour du sevrage est également une pratique courante. Ce traitement reste problématique car il induit la résistance des bactéries aux antibiotiques.
Chez les animaux d'élevage, une utilisation aveugle d'antibiotiques peut également favoriser la dysbiose intestinale. De plus, sachant que la résistance aux antibiotiques augmente de plus en plus et en particulier chez les animaux d'élevage, la commission européenne a interdit depuis le ler janvier 2006 l'utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance dans les aliments pour animaux.
Compte tenu de la croissance de la démographie mondiale et de la demande croissante de viande dans le monde, il est donc crucial de trouver des solutions alternatives à l'usage des antibiotiques et des additifs minéraux pour réduire l'incidence et la sévérité des problèmes digestifs chez les animaux sevrés et, de manière plus générale, pour soutenir une croissance durable de l'industrie de la viande.
Au vu de ce qui précède, des solutions alternatives aux antibiotiques et minéraux bactériostatiques ont été développées impliquant une utilisation optimale de probiotiques en combinaison ou non avec des prébiotiques.
Dune manière générale, une combinaison d'au moins un probiotique avec au moins un prébiotique est appelée un symbiotique, lorsque le prébiotique agit comme substrat en synergie avec le probiotique pour procurer un effet positif sur la santé, en particulier sur la digestion.
Actuellement ce risque de diarrhées est maîtrisé par l'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques (ZnO, CuSO4) dans le régime des porcelets sevrés mais, au-delà de la résistance déjà observée à ces composés, la pratique d'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques mène à des problèmes environnementaux (contamination des eaux par les minéraux lessivés et contenus dans les effluents d'élevage).
L'ajout d'antibiotiques thérapeutiques dans la nourriture des animaux autour du sevrage est également une pratique courante. Ce traitement reste problématique car il induit la résistance des bactéries aux antibiotiques.
Chez les animaux d'élevage, une utilisation aveugle d'antibiotiques peut également favoriser la dysbiose intestinale. De plus, sachant que la résistance aux antibiotiques augmente de plus en plus et en particulier chez les animaux d'élevage, la commission européenne a interdit depuis le ler janvier 2006 l'utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance dans les aliments pour animaux.
Compte tenu de la croissance de la démographie mondiale et de la demande croissante de viande dans le monde, il est donc crucial de trouver des solutions alternatives à l'usage des antibiotiques et des additifs minéraux pour réduire l'incidence et la sévérité des problèmes digestifs chez les animaux sevrés et, de manière plus générale, pour soutenir une croissance durable de l'industrie de la viande.
Au vu de ce qui précède, des solutions alternatives aux antibiotiques et minéraux bactériostatiques ont été développées impliquant une utilisation optimale de probiotiques en combinaison ou non avec des prébiotiques.
Dune manière générale, une combinaison d'au moins un probiotique avec au moins un prébiotique est appelée un symbiotique, lorsque le prébiotique agit comme substrat en synergie avec le probiotique pour procurer un effet positif sur la santé, en particulier sur la digestion.
3 La digestion des protéines, des sucres et des graisses chez les individus monogastriques, et en particulier chez les porcs et la volaille, repose d'abord sur une digestion s'effectuant au niveau de l'estomac qui constitue un environnement acide entraînant une dénaturation des macromolécules pour former un digesta.
Le digesta arrive ensuite dans l'intestin et y subit encore une hydrolyse par action du suc pancréatique qui contient plusieurs protéases et par action des aminopeptidases et des dipeptidases intestinales.
L'absorption des produits de ces hydrolyses a lieu dans la partie supérieure de l'intestin grêle et tous les produits non digérés dans l'intestin grêle gagnent le gros intestin où ils sont soumis à l'action des microorganismes (microbiote intestinal) en entraînant une fermentation.
Il existe de nombreuses publications qui confirment le rôle indispensable du microbiote intestinal sur la santé des animaux (et des humains). Le microbiote intestinal interagit aussi de manière permanente avec le système immunitaire présent dans la paroi intestinale. Certaines études ont aussi démontré la capacité des probiotiques et/ou des prébiotiques à rééquilibrer le microbiote intestinal et leur utilité sur la santé intestinale par effets généralement directs et à
court-terme.
L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) ont défini les probiotiques comme étant des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité
suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels . Il existe des définitions plus larges qui ne font pas référence à
l'alimentation, et où le mot ingérés peut être remplacé par administrés.
Bien que les gens pensent souvent aux bactéries et autres micro-organismes comme des germes nocifs, beaucoup sont en fait utiles.
Cerhaines bactéries aident à digérer les aliments, à détruire les cellules pathogènes ou à
produire des vitamines. Beaucoup de micro-organismes dans les produits probiotiques sont les mêmes que ou similaires aux micro-organismes qui vivent naturellement, de manière endogène, dans notre corps.
Sans être exhaustif, les probiotiques comprennent différents microorganismes comme les bactéries Bacillus coagulons, Bacillus Bifidobacterium animalis lactis, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus licheniformis,
Le digesta arrive ensuite dans l'intestin et y subit encore une hydrolyse par action du suc pancréatique qui contient plusieurs protéases et par action des aminopeptidases et des dipeptidases intestinales.
L'absorption des produits de ces hydrolyses a lieu dans la partie supérieure de l'intestin grêle et tous les produits non digérés dans l'intestin grêle gagnent le gros intestin où ils sont soumis à l'action des microorganismes (microbiote intestinal) en entraînant une fermentation.
Il existe de nombreuses publications qui confirment le rôle indispensable du microbiote intestinal sur la santé des animaux (et des humains). Le microbiote intestinal interagit aussi de manière permanente avec le système immunitaire présent dans la paroi intestinale. Certaines études ont aussi démontré la capacité des probiotiques et/ou des prébiotiques à rééquilibrer le microbiote intestinal et leur utilité sur la santé intestinale par effets généralement directs et à
court-terme.
L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) ont défini les probiotiques comme étant des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité
suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels . Il existe des définitions plus larges qui ne font pas référence à
l'alimentation, et où le mot ingérés peut être remplacé par administrés.
Bien que les gens pensent souvent aux bactéries et autres micro-organismes comme des germes nocifs, beaucoup sont en fait utiles.
Cerhaines bactéries aident à digérer les aliments, à détruire les cellules pathogènes ou à
produire des vitamines. Beaucoup de micro-organismes dans les produits probiotiques sont les mêmes que ou similaires aux micro-organismes qui vivent naturellement, de manière endogène, dans notre corps.
Sans être exhaustif, les probiotiques comprennent différents microorganismes comme les bactéries Bacillus coagulons, Bacillus Bifidobacterium animalis lactis, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus licheniformis,
4 Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium thermophilum, Clostridium but yricum, Enterococcus faecium, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium mongoliense, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus solivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Collinsella tanakaei, Pediococcus acidilacticiici, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes but yraticus. Les bactéries probiotiques les plus courantes étant celles du genre Lactobacillus et Bifidobacterium. Les probiotiques comprennent également des levures comme Saccharomyces boulardii (Sa nders M. E., Probiotics, strains motter , Fu nctiona I foods nutraceuticals magazine, 2007, 36-41).
Les prébiotiques, quant à eux, sont des substrats utilisés de manière sélective par les micro-organismes de l'hôte qui stimulent sélectivement la croissance ou l'activité de micro-organismes souhaitables (Expert consensus document : The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14, 491-502, https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75).
Sans être exhaustif, les prébiotiques comprennent entre autres l'inuline, le beta-glucane, le 2'-Fucosyllactose (2FL), des oligosaccharides comme les galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides (FOS), mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS), acides gras polyinsaturés (polyunsaturated fatty acid: PUFA), acide linoléique conjugué
(ALC).
Une formulation combinant au moins un probiotique en association avec au moins un prébiotique pour prévenir et traiter les infections bactériennes pouvant mener à la diarrhée, augmenter le poids de l'animal et promouvoir la croissance est connue du document W02014049023. Le document W02014049023 décrit des produits et compositions pouvant être bénéfiques en élevage.
Lesdits produits et compositions qui y sont décrits comprennent des microorganismes, tels que des bactéries, en particulier des bactéries probiotiques. Les souches, ainsi que les compositions les comprenant, peuvent être administrées à des animaux, de préférence à des animaux d'élevage, tels que les porcs. L'administration peut avoir lieu dans les premiers jours de vie. Selon ce document, l'administration des produits
Les prébiotiques, quant à eux, sont des substrats utilisés de manière sélective par les micro-organismes de l'hôte qui stimulent sélectivement la croissance ou l'activité de micro-organismes souhaitables (Expert consensus document : The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14, 491-502, https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75).
Sans être exhaustif, les prébiotiques comprennent entre autres l'inuline, le beta-glucane, le 2'-Fucosyllactose (2FL), des oligosaccharides comme les galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides (FOS), mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS), acides gras polyinsaturés (polyunsaturated fatty acid: PUFA), acide linoléique conjugué
(ALC).
Une formulation combinant au moins un probiotique en association avec au moins un prébiotique pour prévenir et traiter les infections bactériennes pouvant mener à la diarrhée, augmenter le poids de l'animal et promouvoir la croissance est connue du document W02014049023. Le document W02014049023 décrit des produits et compositions pouvant être bénéfiques en élevage.
Lesdits produits et compositions qui y sont décrits comprennent des microorganismes, tels que des bactéries, en particulier des bactéries probiotiques. Les souches, ainsi que les compositions les comprenant, peuvent être administrées à des animaux, de préférence à des animaux d'élevage, tels que les porcs. L'administration peut avoir lieu dans les premiers jours de vie. Selon ce document, l'administration des produits
5 ou des compositions favorise la croissance animale et la prise de poids de l'animal.
Les infections bactériennes peuvent également être prévenues ou traitées par lesdits composés ou compositions. Ce document W02014049023 mentionne qu'une composition comprenant au moins 2 probiotiques est appropriée pour traiter la diarrhée chez le porcelet nouveau-né (non sevré). En particulier, une composition comprenant Lactobacillus reuteri et Enterococcus faecium permet de réduire la diarrhée, d'augmenter le gain quotidien moyen de prise de poids et de réduire la mortalité du porcelet nouveau-né.
Le document W02018002671 divulgue une composition pour le traitement et/ou la nutrition de volailles telles que des poulets de chair comprenant (i) un probiotique commensal choisi parmi Bifidobacterium animalis, Collinsella tanakaei, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes, Lactobacillus crispatus, Pediococcus acidilacticiici, Lactobacillus pontis, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes but yraticus, But yricicoccus, Lactobacillus johnsonii et Ruminococcus sp.; et (ii) un prébiotique. Ce document divulgue également l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des maladies entériques chez les volailles, telles que l'entérite nécrotique.
Le document W02006133472A1 concerne un additif alimentaire et/ou additif pour l'eau potable animale ou humaine favorisant la santé ou la croissance de probiotiques. Ce document concerne en outre une utilisation de l'additif alimentaire humain et animal et/ou de l'eau potable, notamment pour la prévention de l'effet néfaste d'un certain nombre de germes indésirables dans le système digestif des animaux et/ou des oiseaux domestiques.
Finalement, le document W0201 7156548A1 concerne certains aliments comprenant un composant nutritionnel fermentescible et un composant probiotique, où le composant probiotique est sélectionné, sur la base de critères génétiques et/ou métaboliques, pour métaboliser spécifiquement tout monomère de sucre libre (Free Sugar Monomers (FSM)) ou tout acide aminé libre (Free Amino Acids (FAA)) ou peptide qui s'accumulent dans l'intestin grêle et le gros intestin en raison de la composante nutritionnelle fermentescible, qui, sans cette métabolisation seraient fermentés et métabolisés par des bactéries moins adaptées / opportunistes, créant des efflorescences de bactéries intestinales délétères et déplaçant le microbiome vers un potentiel état de dysbiose.
Les infections bactériennes peuvent également être prévenues ou traitées par lesdits composés ou compositions. Ce document W02014049023 mentionne qu'une composition comprenant au moins 2 probiotiques est appropriée pour traiter la diarrhée chez le porcelet nouveau-né (non sevré). En particulier, une composition comprenant Lactobacillus reuteri et Enterococcus faecium permet de réduire la diarrhée, d'augmenter le gain quotidien moyen de prise de poids et de réduire la mortalité du porcelet nouveau-né.
Le document W02018002671 divulgue une composition pour le traitement et/ou la nutrition de volailles telles que des poulets de chair comprenant (i) un probiotique commensal choisi parmi Bifidobacterium animalis, Collinsella tanakaei, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes, Lactobacillus crispatus, Pediococcus acidilacticiici, Lactobacillus pontis, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes but yraticus, But yricicoccus, Lactobacillus johnsonii et Ruminococcus sp.; et (ii) un prébiotique. Ce document divulgue également l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des maladies entériques chez les volailles, telles que l'entérite nécrotique.
Le document W02006133472A1 concerne un additif alimentaire et/ou additif pour l'eau potable animale ou humaine favorisant la santé ou la croissance de probiotiques. Ce document concerne en outre une utilisation de l'additif alimentaire humain et animal et/ou de l'eau potable, notamment pour la prévention de l'effet néfaste d'un certain nombre de germes indésirables dans le système digestif des animaux et/ou des oiseaux domestiques.
Finalement, le document W0201 7156548A1 concerne certains aliments comprenant un composant nutritionnel fermentescible et un composant probiotique, où le composant probiotique est sélectionné, sur la base de critères génétiques et/ou métaboliques, pour métaboliser spécifiquement tout monomère de sucre libre (Free Sugar Monomers (FSM)) ou tout acide aminé libre (Free Amino Acids (FAA)) ou peptide qui s'accumulent dans l'intestin grêle et le gros intestin en raison de la composante nutritionnelle fermentescible, qui, sans cette métabolisation seraient fermentés et métabolisés par des bactéries moins adaptées / opportunistes, créant des efflorescences de bactéries intestinales délétères et déplaçant le microbiome vers un potentiel état de dysbiose.
6 Malheureusement, les formulations connues sont essentiellement utilisées comme agent thérapeutique de dysbiose ou de déséquilibre du microbiome chez l'animal d'élevage. Les effets démontrés in vivo par ces formulations restent très généraux comme la prise de poids ou le pourcentage de mortalité de l'animal. De nombreux probiotiques sont décrits en association avec n'importe quel prébiotique dans des buts bien divers. De plus, selon Wang et col.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104: 335-349, D01: 10.1007/s00253-019-10259-6, il est admis que des compositions symbiotiques comprenant plusieurs probiotiques auront un effet avantageux pour lutter contre la dysbiose par rapport à des compositions comprenant un seul probiotique. Par contre, de telles compositions comprenant plusieurs probiotiques présentent l'inconvénient d'être moins simple et plus coûteuse à produire de manière industrielle.
En outre, selon Barba-Vidal et col. Animal, 2018, 12, 2489-2498, D01: 10.1017/S1751731118000873, il existe un manque criant de reproductibilité
au niveau des expérimentations montrant l'effet bénéfique des probiotiques.
Les interventions à la fin de la gestation de la truie et/ou dès la naissance du porcelet devraient permettre par le principe de la programmation précoce d'influencer de manière optimale et durable le bon développement du microbiote du nouveau-né. Par conséquent, les effets positifs pour la santé de l'animal ne seraient pas observés seulement en début de vie et durant les 3-4 semaines après le sevrage mais ils resteraient aussi observables au long de la vie adulte.
La première colonisation intestinale du porcelet par le microbiote maternel au moment de la mise bas est cruciale pour l'établissement d'un microbiote intestinal favorable du nouveau-né, mais la composition du microbiote peut être influencée par de nombreux facteurs tels que des antibiotiques, la nourriture, l'environnement, les agents infectieux, etc.
La présente invention entend donc pallier les inconvénients précités en procurant une composition comprenant une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lac fis, ou de
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104: 335-349, D01: 10.1007/s00253-019-10259-6, il est admis que des compositions symbiotiques comprenant plusieurs probiotiques auront un effet avantageux pour lutter contre la dysbiose par rapport à des compositions comprenant un seul probiotique. Par contre, de telles compositions comprenant plusieurs probiotiques présentent l'inconvénient d'être moins simple et plus coûteuse à produire de manière industrielle.
En outre, selon Barba-Vidal et col. Animal, 2018, 12, 2489-2498, D01: 10.1017/S1751731118000873, il existe un manque criant de reproductibilité
au niveau des expérimentations montrant l'effet bénéfique des probiotiques.
Les interventions à la fin de la gestation de la truie et/ou dès la naissance du porcelet devraient permettre par le principe de la programmation précoce d'influencer de manière optimale et durable le bon développement du microbiote du nouveau-né. Par conséquent, les effets positifs pour la santé de l'animal ne seraient pas observés seulement en début de vie et durant les 3-4 semaines après le sevrage mais ils resteraient aussi observables au long de la vie adulte.
La première colonisation intestinale du porcelet par le microbiote maternel au moment de la mise bas est cruciale pour l'établissement d'un microbiote intestinal favorable du nouveau-né, mais la composition du microbiote peut être influencée par de nombreux facteurs tels que des antibiotiques, la nourriture, l'environnement, les agents infectieux, etc.
La présente invention entend donc pallier les inconvénients précités en procurant une composition comprenant une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lac fis, ou de
7 (iii) Clostridium but yricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudi/actis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, dans le but d'améliorer les conditions de santé
du nouveau-né.
La présente invention vise donc à procurer une formulation symbiotique qui a un effet qui se maintient dans le temps en agissant spécifiquement sur la modulation du microbiote de manière précoce, favorisant ainsi une eubiose intestinale de manière fiable. De plus, la présente invention vise à procurer une formulation symbiotique (composition symbiotique) simple avec un probiotique principal déterminé, ce qui facilite la production et la vérification des lots de production. En effet, la production industrielle d'une composition symbiotique simple, minimale, sera plus facile, plus rapide, et sera économiquement plus rentable que la production d'une composition symbiotique comprenant, par exemple, plusieurs probiotiques.
Selon la présente invention, il a ainsi été mis en évidence qu'il était possible de mettre à disposition une formulation symbiotique simple comprenant comme probiotique principal Enterococcus faecium, ou Bificlobacterium animalis lac fis, ou Clostridium butyricum, ou Bifidobacterium crudilactis qui génère de manière démontrée et reproductible un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif, tant de l'animal en gestation que plus tard du nouveau-né, lequel se maintient dans le temps pour protéger l'animal contre des dysbioses ultérieures.
La formulation symbiotique selon la présente invention permettant de moduler le microbiote du foetus dans un animal en gestation ou du nouveau-né
permettra d'avoir un effet prophylactique maximal et assurera une croissance et un développement optimal de l'animal.
En effet, la formulation selon la présente invention favorise une flore intestinale saine qui protège ainsi l'animal qui l'ingère, en particulier lorsque celle-ci est ingérée par la femelle en gestation par la génération démontrée et
du nouveau-né.
La présente invention vise donc à procurer une formulation symbiotique qui a un effet qui se maintient dans le temps en agissant spécifiquement sur la modulation du microbiote de manière précoce, favorisant ainsi une eubiose intestinale de manière fiable. De plus, la présente invention vise à procurer une formulation symbiotique (composition symbiotique) simple avec un probiotique principal déterminé, ce qui facilite la production et la vérification des lots de production. En effet, la production industrielle d'une composition symbiotique simple, minimale, sera plus facile, plus rapide, et sera économiquement plus rentable que la production d'une composition symbiotique comprenant, par exemple, plusieurs probiotiques.
Selon la présente invention, il a ainsi été mis en évidence qu'il était possible de mettre à disposition une formulation symbiotique simple comprenant comme probiotique principal Enterococcus faecium, ou Bificlobacterium animalis lac fis, ou Clostridium butyricum, ou Bifidobacterium crudilactis qui génère de manière démontrée et reproductible un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif, tant de l'animal en gestation que plus tard du nouveau-né, lequel se maintient dans le temps pour protéger l'animal contre des dysbioses ultérieures.
La formulation symbiotique selon la présente invention permettant de moduler le microbiote du foetus dans un animal en gestation ou du nouveau-né
permettra d'avoir un effet prophylactique maximal et assurera une croissance et un développement optimal de l'animal.
En effet, la formulation selon la présente invention favorise une flore intestinale saine qui protège ainsi l'animal qui l'ingère, en particulier lorsque celle-ci est ingérée par la femelle en gestation par la génération démontrée et
8 reproductible d'un environnement anti-inflammatoire dans l'estomac et/ou l'intestin, et ce de manière systématique.
En effet, il est crucial d'analyser l'impact des probiotiques à travers 3 critères importants : la concentration en cellules viables, l'effet bénéfique sur la croissance de l'hôte et l'effet bénéfique sur le fonctionnement du tube digestif grâce notamment à un impact anti-inflammatoire (Markowiak P. et Slizewska K., Gut Pathog. 2018, 10, 21, dol: 10.1186/s13099).
La formulation symbiotique selon la présente invention procure une solution efficace contre la dysbiose et le problème de diarrhée survenant lors du sevrage, dont le probiotique et le ou les prébiotiques sont choisis spécifiquement non pas uniquement sur la viabilité cellulaire, mais pour leurs effets associés sur la viabilité
cellulaire et sur la réponse anti-inflammatoire du microbiote de l'hôte.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et au moins un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une augmentation des acides gras à courtes chaînes Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi qu'une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus et les bifidobacteries ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate ou d'autres acides gras à chaines courtes. Le probiotique et le ou les prébiotique(s), ensemble, forment un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la génération ensemble d'un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif de l'animal, en particulier du mammifère, en particulier du porc, de préférence de l'animal en gestation et du nouveau-né, en particulier de la truie en gestation ou non et du porcelet.
En effet, ces indicateurs sont importants car il a été montré qu'un environnement inflammatoire du tractus gastrointestinal peut générer une dysbiose intestinale (Zeng et col., Mucosal Immunol., 2017, 10,18-26, doi:
10.1038/mi.2016.75).
Il a également été montré que les Short Chain Fatty Acids, SCFA peuvent avoir additionnellement un effet bénéfique de régulateurs immunologiques sur l'environnement gastro-intestinal (Parada Venegas et col., Frontiers in lmmunology, 2019, 10, doi:10.3389/fimmu.2019.00277). Les SCFAs sont des acides gras à
courtes chaînes, produits par le processus de fermentation dans le colon. L'acétate, le
En effet, il est crucial d'analyser l'impact des probiotiques à travers 3 critères importants : la concentration en cellules viables, l'effet bénéfique sur la croissance de l'hôte et l'effet bénéfique sur le fonctionnement du tube digestif grâce notamment à un impact anti-inflammatoire (Markowiak P. et Slizewska K., Gut Pathog. 2018, 10, 21, dol: 10.1186/s13099).
La formulation symbiotique selon la présente invention procure une solution efficace contre la dysbiose et le problème de diarrhée survenant lors du sevrage, dont le probiotique et le ou les prébiotiques sont choisis spécifiquement non pas uniquement sur la viabilité cellulaire, mais pour leurs effets associés sur la viabilité
cellulaire et sur la réponse anti-inflammatoire du microbiote de l'hôte.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et au moins un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une augmentation des acides gras à courtes chaînes Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi qu'une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus et les bifidobacteries ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate ou d'autres acides gras à chaines courtes. Le probiotique et le ou les prébiotique(s), ensemble, forment un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la génération ensemble d'un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif de l'animal, en particulier du mammifère, en particulier du porc, de préférence de l'animal en gestation et du nouveau-né, en particulier de la truie en gestation ou non et du porcelet.
En effet, ces indicateurs sont importants car il a été montré qu'un environnement inflammatoire du tractus gastrointestinal peut générer une dysbiose intestinale (Zeng et col., Mucosal Immunol., 2017, 10,18-26, doi:
10.1038/mi.2016.75).
Il a également été montré que les Short Chain Fatty Acids, SCFA peuvent avoir additionnellement un effet bénéfique de régulateurs immunologiques sur l'environnement gastro-intestinal (Parada Venegas et col., Frontiers in lmmunology, 2019, 10, doi:10.3389/fimmu.2019.00277). Les SCFAs sont des acides gras à
courtes chaînes, produits par le processus de fermentation dans le colon. L'acétate, le
9 propionate et le butyrate sont les trois principaux SCFAs. Le butyrate est particulièrement important pour le bon fonctionnement du colon car il est la source d'énergie principale des colonocytes (cellules épithéliales du colon). Les SCFAs peuvent également réduire la réponse pro-inflammatoire des cellules épithéliales de l'intestin ( Ira porda C. et col., lmmunology, 2015 10:1161-1169.
https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.06.004).
Administrée à la truie en gestation ou non et au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d'un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant le porc ou l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière soutenue dans le temps contre la dysbiose par le probiotique et le prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Avantageusement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique pour (i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, et/ou (ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Préférentiellement, dans la composition selon l'invention, la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace pour diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle la quantité de selles molles et/ou liquides produite par ledit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus petite que la quantité de selles molles et/ou liquides produite par un porcelet contrôle au cours d'une même période de temps et au même stade de développement.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace pour augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle a) un poids dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus élevé par rapport au poids d'un porcelet contrôle au même stade de développement et pendant une même période de temps et/ou b) une courbe de croissance non-pathologique
https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.06.004).
Administrée à la truie en gestation ou non et au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d'un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant le porc ou l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière soutenue dans le temps contre la dysbiose par le probiotique et le prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Avantageusement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique pour (i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, et/ou (ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Préférentiellement, dans la composition selon l'invention, la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace pour diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle la quantité de selles molles et/ou liquides produite par ledit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus petite que la quantité de selles molles et/ou liquides produite par un porcelet contrôle au cours d'une même période de temps et au même stade de développement.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace pour augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle a) un poids dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus élevé par rapport au poids d'un porcelet contrôle au même stade de développement et pendant une même période de temps et/ou b) une courbe de croissance non-pathologique
10 dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est au-dessus, pendant au moins deux jours, d'une courbe de croissance d'un porcelet contrôle pendant une même période de temps au même stade de développement.
Dans une forme de réalisation préférentielle de la présente invention, ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo-oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
Selon la présente invention, Bifidobacterium thermophilum provient de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) répertoriée sous le numéro 18892, Enterococcus faecium (LMG S-28935), Bifidobacterium animalis lactis est une souche déposée à la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) ayant le numéro de dépôt LMG
P-28149, Clostridium butyricum (LMG1217), Bifidobacterium crudilactis est une souche déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM, Institut Pasteur) ayant le numéro de dépôt (CNCM 1-3342) dans le cadre du document W02006122850.
De préférence, dans la composition symbiotique selon l'invention, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
Avantageusement, dans la composition symbiotique selon l'invention, une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Préférentiellement, dans la composition symbiotique selon l'invention, ledit probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clos tridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis. Plus préférentiellement, dans la composition symbiotique, ledit probiotique est constitué
pour au moins 85%, encore plus préférentiellement pour au moins 90%, de manière avantageuse pour au moins 95%, de manière favorable pour au moins 99%, 100% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus
Dans une forme de réalisation préférentielle de la présente invention, ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo-oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
Selon la présente invention, Bifidobacterium thermophilum provient de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) répertoriée sous le numéro 18892, Enterococcus faecium (LMG S-28935), Bifidobacterium animalis lactis est une souche déposée à la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) ayant le numéro de dépôt LMG
P-28149, Clostridium butyricum (LMG1217), Bifidobacterium crudilactis est une souche déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM, Institut Pasteur) ayant le numéro de dépôt (CNCM 1-3342) dans le cadre du document W02006122850.
De préférence, dans la composition symbiotique selon l'invention, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
Avantageusement, dans la composition symbiotique selon l'invention, une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Préférentiellement, dans la composition symbiotique selon l'invention, ledit probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clos tridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis. Plus préférentiellement, dans la composition symbiotique, ledit probiotique est constitué
pour au moins 85%, encore plus préférentiellement pour au moins 90%, de manière avantageuse pour au moins 95%, de manière favorable pour au moins 99%, 100% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus
11 faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta-g luca nes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyric um et beta-glucanes,Clostridium butyricum et 2' fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus faecium et beta-glucanes, Enterococcus faecium et inuline, Enterococcus faecium et 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et GOS/FOS, Enterococcus faecium et l'amidon résistant.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, la combinaison est préférentiellement choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jourfanimal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal. En effet, selon la présente invention, une composition symbiotique comprenant par exemple Bifidobacterium crudilactis et
De manière avantageuse, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta-g luca nes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyric um et beta-glucanes,Clostridium butyricum et 2' fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus faecium et beta-glucanes, Enterococcus faecium et inuline, Enterococcus faecium et 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et GOS/FOS, Enterococcus faecium et l'amidon résistant.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, la combinaison est préférentiellement choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jourfanimal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal. En effet, selon la présente invention, une composition symbiotique comprenant par exemple Bifidobacterium crudilactis et
12 beta-glucanes, ou comprenant Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose ou comprenant Clostridium butyricum et GOS/FOS ou encore comprenant Enterococcus faecium et beta-glucanes a montré une capacité synergique à créer un environnement anti-inflammatoire, en réduisant la présence d'IL-8, en augmentant la production d'acide gras à courtes chaînes et en favorisant la croissance des populations bactérienne favorables au microbiote.
De préférence, la composition selon l'invention contient au moins un excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit au moins un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous forme de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide. Ledit probiotique et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
De préférence, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace procure le traitement ou la prévention de la dysbiose pendant une période de temps, comptée à partir du jour de naissance dudit porcelet, supérieure à 3 jours, préférentiellement supérieure à 5 jours, encore plus préférentiellement supérieure à
15 jours, de manière favorable supérieure à 50 jours, de manière encore plus favorable supérieure à 100 jours. En effet, il a été montré que la composition suivant la présente invention peut générer un effet de rémanence pour traiter ou prévenir la dysbiose du porcelet. En fonction de la composition symbiotique et du profil d'administration de cette composition, par exemple en fonction d'une administration de la composition à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement, le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet pourra être favorisé même lorsque celui-ci est au stade de post-sevrage.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est administrée à
une truie en gestation pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à une truie allaitante pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à un porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention la dysbiose du porcelet en
De préférence, la composition selon l'invention contient au moins un excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit au moins un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous forme de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide. Ledit probiotique et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
De préférence, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace procure le traitement ou la prévention de la dysbiose pendant une période de temps, comptée à partir du jour de naissance dudit porcelet, supérieure à 3 jours, préférentiellement supérieure à 5 jours, encore plus préférentiellement supérieure à
15 jours, de manière favorable supérieure à 50 jours, de manière encore plus favorable supérieure à 100 jours. En effet, il a été montré que la composition suivant la présente invention peut générer un effet de rémanence pour traiter ou prévenir la dysbiose du porcelet. En fonction de la composition symbiotique et du profil d'administration de cette composition, par exemple en fonction d'une administration de la composition à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement, le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet pourra être favorisé même lorsque celui-ci est au stade de post-sevrage.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est administrée à
une truie en gestation pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à une truie allaitante pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à un porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention la dysbiose du porcelet en
13 allaitement et/ou en post-sevrage. De manière préférée alternative, la composition selon l'invention est administrée à une truie en gestation et/ou allaitante et/ou à un porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Avantageusement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la production de mucus dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle une quantité de cellules en gobelet (cellules caliciformes) dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que la quantité de cellules en gobelet dans l'intestin dudit porcelet contrôle au même stade de développement.
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la capacité d'absorption des villosités intestinales du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle (i) un rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que le rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou (ii) une épaisseur de la lamina proprio intestinale dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que l'épaisseur de la lamina proprio intestinale dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique selon laquelle des concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal telles que les iactobaciilus, et les bificlobacteries sont augmentées chez le porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport aux concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal du porcelet contrôle au même stade de développement.
Avantageusement, cette augmentation des concentrations en populations
Avantageusement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la production de mucus dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle une quantité de cellules en gobelet (cellules caliciformes) dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que la quantité de cellules en gobelet dans l'intestin dudit porcelet contrôle au même stade de développement.
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la capacité d'absorption des villosités intestinales du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle (i) un rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que le rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou (ii) une épaisseur de la lamina proprio intestinale dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que l'épaisseur de la lamina proprio intestinale dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique selon laquelle des concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal telles que les iactobaciilus, et les bificlobacteries sont augmentées chez le porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport aux concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal du porcelet contrôle au même stade de développement.
Avantageusement, cette augmentation des concentrations en populations
14 bactériennes génère un meilleur équilibre du microbiote intestinal de l'hôte diminuant le risque de dysbiose intestinal.
Avantageusement, selon l'invention, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace de probiotique selon laquelle la concentration d'IL-est réduite d'au moins 10% dans l'intestin du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport à la concentration d'IL-8 dans l'intestin du porcelet contrôle au même stade de développement, ladite concentration réduite d'IL-8 formant ledit environnement anti-inflammatoire. Dans le cadre de la présente invention, la concentration d' IL-8 a été mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC_J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester).
Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique est caractérisée, de préférence, en ce que la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace selon laquelle la sécrétion d'acides gras à courte chaîne (SCFA's) par le microbiote intestinal d'un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage et/ou de cellules intestinales in vitro, est stabilisée ou augmentée par rapport à la sécrétion d'acides gras à courte chaîne d'un porcelet contrôle et/ou de cellules intestinales contrôles in vitro. Lesdits SCFAs, produits lors du processus de fermentation du microbiote sont un indicateur de l'équilibre et de la croissance du microbiote. Les SCFAs ont en effet un rôle bénéfique multiple au niveau de l'intestin :
le butyrate, notamment, a un rôle régulateur dans le transport de fluide transépithélial. Il améliore également l'état oxydatif et l'inhibition de l'inflammation de la muqueuse de l'intestin, il renforce la barrière de défense épithéliale, il module la sensibilité viscérale et la mobilité intestinale (Canani, R.B. et col.
World J.
Gastroenterol., 2011, 17: 1519-1528, doi: 10.3748/wjg.v17.i12.1519).
De préférence, selon l'invention, lesdits SCFAs sont choisis parmi le butyrate, le propionate, l'acétate, le lactate ou leurs combinaisons.
Dans le cadre de la présente invention, la production desdits SCFAs est mesurée grâce au modèle in vitro fermentation statique détaillé plus en détails ci-après.
Avantageusement, selon l'invention, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace de probiotique selon laquelle la concentration d'IL-est réduite d'au moins 10% dans l'intestin du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport à la concentration d'IL-8 dans l'intestin du porcelet contrôle au même stade de développement, ladite concentration réduite d'IL-8 formant ledit environnement anti-inflammatoire. Dans le cadre de la présente invention, la concentration d' IL-8 a été mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC_J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester).
Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique est caractérisée, de préférence, en ce que la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace selon laquelle la sécrétion d'acides gras à courte chaîne (SCFA's) par le microbiote intestinal d'un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage et/ou de cellules intestinales in vitro, est stabilisée ou augmentée par rapport à la sécrétion d'acides gras à courte chaîne d'un porcelet contrôle et/ou de cellules intestinales contrôles in vitro. Lesdits SCFAs, produits lors du processus de fermentation du microbiote sont un indicateur de l'équilibre et de la croissance du microbiote. Les SCFAs ont en effet un rôle bénéfique multiple au niveau de l'intestin :
le butyrate, notamment, a un rôle régulateur dans le transport de fluide transépithélial. Il améliore également l'état oxydatif et l'inhibition de l'inflammation de la muqueuse de l'intestin, il renforce la barrière de défense épithéliale, il module la sensibilité viscérale et la mobilité intestinale (Canani, R.B. et col.
World J.
Gastroenterol., 2011, 17: 1519-1528, doi: 10.3748/wjg.v17.i12.1519).
De préférence, selon l'invention, lesdits SCFAs sont choisis parmi le butyrate, le propionate, l'acétate, le lactate ou leurs combinaisons.
Dans le cadre de la présente invention, la production desdits SCFAs est mesurée grâce au modèle in vitro fermentation statique détaillé plus en détails ci-après.
15 Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique peut contenir plus de 1 probiotique, par exemple 2 probiotiques, ou par exemple 3 probiotiques, ou par exemple 4 probiotiques ou par exemple 5 probiotiques.
Selon l'invention, la composition symbiotique pourra également contenir plus de 1 prébiotique, par exemple 2 prébiotiques, ou par exemple 3 prébiotiques, ou par exemple 4 prébiotiques. D'autres formes de réalisation de la composition symbiotique suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à un complément alimentaire administrable à la truie en gestation ou non et au porcelet pour le traitement préventif et/ou curatif de la dysbiose intestinale.
Ledit complément alimentaire, comprenant ladite composition, peut être sous forme liquide par exemple dans une base lactée ou huileuse ou sous forme solide comme une poudre, une poudre dans une gélule, un granulé ou un comprimé
ou une autre forme quelconque.
D'autres formes de réalisation du complément alimentaire suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte en outre à un aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition, ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
D'autres formes de réalisation de l'aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte de plus à un aliment pour nouveau-né animal comprenant ladite composition selon la présente invention et une base lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
D'autres formes de réalisation de l'aliment pour nouveau-né animal suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la
Selon l'invention, la composition symbiotique pourra également contenir plus de 1 prébiotique, par exemple 2 prébiotiques, ou par exemple 3 prébiotiques, ou par exemple 4 prébiotiques. D'autres formes de réalisation de la composition symbiotique suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à un complément alimentaire administrable à la truie en gestation ou non et au porcelet pour le traitement préventif et/ou curatif de la dysbiose intestinale.
Ledit complément alimentaire, comprenant ladite composition, peut être sous forme liquide par exemple dans une base lactée ou huileuse ou sous forme solide comme une poudre, une poudre dans une gélule, un granulé ou un comprimé
ou une autre forme quelconque.
D'autres formes de réalisation du complément alimentaire suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte en outre à un aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition, ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
D'autres formes de réalisation de l'aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte de plus à un aliment pour nouveau-né animal comprenant ladite composition selon la présente invention et une base lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
D'autres formes de réalisation de l'aliment pour nouveau-né animal suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la
16 dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, le probiotique et le prébiotique de la composition étant administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition symbiotique prédécrite, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres formes d'utilisation de ladite composition suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte enfin à une méthode de traitement ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant une administration de la composition selon l'invention à une truie en gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
La figure 1 montre le schéma du dispositif expérimental du système BabySPIME (Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167:
105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019). Compartiment 1 :
Estomac/duodenum/jejunum, compartiment 2: iléon, compartiment 3: colon ascendant. A: Alimentation, B: probiotique, C: prébiotique.
La figure 2 illustre le niveau de production d'IL-8 (pg/ml) par des cellules IPEC-J2. Les cellules IPEC-J2 ont été mise en contact d'un jus de fermentation venant d'une fermentation avec uniquement un prébiotique: GOS/FOS (GF) ou
thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, le probiotique et le prébiotique de la composition étant administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition symbiotique prédécrite, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres formes d'utilisation de ladite composition suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte enfin à une méthode de traitement ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant une administration de la composition selon l'invention à une truie en gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
La figure 1 montre le schéma du dispositif expérimental du système BabySPIME (Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167:
105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019). Compartiment 1 :
Estomac/duodenum/jejunum, compartiment 2: iléon, compartiment 3: colon ascendant. A: Alimentation, B: probiotique, C: prébiotique.
La figure 2 illustre le niveau de production d'IL-8 (pg/ml) par des cellules IPEC-J2. Les cellules IPEC-J2 ont été mise en contact d'un jus de fermentation venant d'une fermentation avec uniquement un prébiotique: GOS/FOS (GF) ou
17 Inuline (mu) ou 2'FL (2FL) ou beta-glucane (BG) ou amidon résistant (RS), ou bien provenant d'une fermentation pendant laquelle une composition combinant un prébiotique et un probiotique selon l'invention a été testée. Les résultats montrent la moyenne du niveau de production d'IL-8 +/- l'écart-type. La ligne horizontale correspond au niveau d'IL-8 dans la condition contrôle (blanc-mucine). La signification statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple de type Dunnett de chaque prébiotique et symbiotique par rapport à la condition contrôle (indiqué par *), et entre les combinaisons symbiotiques et le prébiotique seul (indiqué par #). Lorsque p <0.05 :*, #;
lorsque p < 0.01 :**, ##; lorsque p <0.001 :***, ###; et lorsque p <0.0001 :****, .
BCO :
Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophibm, CB: Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium crudilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP:
Lactobacillus plan forum.
La figure 3 montre une série temporelle indiquant l'accumulation de la production de gaz dans une fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) d'un prébiotique seul ou en combinaison avec un probiotique (symbiotique).
La fermentation in vitro en lot de la combinaison symbiotique se réalise avec 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0.1g de prébiotique (même quantité dans la condition où le prébiotique est présent seul), en présence d'un inoculat de 3%
en fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2' FL, BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO :
Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium butyricum, EF :
Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium cruclilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 4 montre l'abondance relative de groupes de bactéries bénéfiques pour l'eubiose intestinale à 24h après le démarrage de la fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) en présence du prébiotique seul ou en présence de combinaisons symbiotiques (prébiotique + probiotique). Les groupes de bactéries bénéfiques sélectionnés comprennent les bifidobacteria, les lactobacilli, les clostridium cluster IV, les clostridium cluster XlVa et le gène butyryl-CoA:acetyl-CoA transférase. La méthode de mesure par qPCR 2A(-3,ACt) a été utilisée pour établir l'abondance relative, les mesures ont été normalisées par rapport aux
lorsque p < 0.01 :**, ##; lorsque p <0.001 :***, ###; et lorsque p <0.0001 :****,
BCO :
Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophibm, CB: Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium crudilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP:
Lactobacillus plan forum.
La figure 3 montre une série temporelle indiquant l'accumulation de la production de gaz dans une fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) d'un prébiotique seul ou en combinaison avec un probiotique (symbiotique).
La fermentation in vitro en lot de la combinaison symbiotique se réalise avec 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0.1g de prébiotique (même quantité dans la condition où le prébiotique est présent seul), en présence d'un inoculat de 3%
en fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2' FL, BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO :
Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium butyricum, EF :
Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium cruclilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 4 montre l'abondance relative de groupes de bactéries bénéfiques pour l'eubiose intestinale à 24h après le démarrage de la fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) en présence du prébiotique seul ou en présence de combinaisons symbiotiques (prébiotique + probiotique). Les groupes de bactéries bénéfiques sélectionnés comprennent les bifidobacteria, les lactobacilli, les clostridium cluster IV, les clostridium cluster XlVa et le gène butyryl-CoA:acetyl-CoA transférase. La méthode de mesure par qPCR 2A(-3,ACt) a été utilisée pour établir l'abondance relative, les mesures ont été normalisées par rapport aux
18 bactéries totales et un mélange d'échantillons d'ADN de tous les extraits a été utilisé
comme calibrateur. La fermentation in vitro, en fermenteur individuel, des combinaisons symbiotiques a été effectuée à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et de 0.1 g de prébiotique (même quantité pour la condition avec le prébiotique seul), en présence de 3% d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. La signifiance statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple de type Dunnett et où * correspond à p <0.05, ** à p <0.01, *** à p <0.01, et **** à
p < 0.0001. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL, BG
: beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lochs, BCU: Bifidobacterium crudilactis, BMO:
Bifidobacterium mon goliense, LP: Lactobacillus plan forum.
La figure 5 montre la capacité du probiotique à survivre et à s'établir dans une communauté microbienne complexe. La figure 5 montre l'abondance relative de chaque probiotique par rapport aux bactéries totales à 12h, 24h et 48h après le démarrage de la fermentation pour différentes compositions symbiotiques.
L'abondance relative de chaque probiotique est normalisée par rapport à la quantité relative de probiotique obtenu dans l'échantillon où seul le probiotique a été ajouté. Pour les prébiotiques, GoF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL, BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium but yricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 6 montre l'évolution de la population bactérienne entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement: Les résultats sont montrés avec les compositions symbiotiques suivantes Enterococcus faecium (EF) +
beta-glucane (BG); Bifidobacterium thermophilum (BT) + inuline (Inu);
Clostridium butyricum (CB) + GOS/FOS (G/F); Bifidobacterium animalis lactis (BAL) + 2'FL
(2FL);
Bifidobacterium cruclilactis (BC) + beta-glucane (BG); et la condition contrôle.
Les résultats correspondent aux abondances relatives de la quantité
d'ADN de la bactérie cible par rapport à la quantité d'ADN des bactéries totales (méthode de mesure par qPCR 2A(-AACt)).
comme calibrateur. La fermentation in vitro, en fermenteur individuel, des combinaisons symbiotiques a été effectuée à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et de 0.1 g de prébiotique (même quantité pour la condition avec le prébiotique seul), en présence de 3% d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. La signifiance statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple de type Dunnett et où * correspond à p <0.05, ** à p <0.01, *** à p <0.01, et **** à
p < 0.0001. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL, BG
: beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lochs, BCU: Bifidobacterium crudilactis, BMO:
Bifidobacterium mon goliense, LP: Lactobacillus plan forum.
La figure 5 montre la capacité du probiotique à survivre et à s'établir dans une communauté microbienne complexe. La figure 5 montre l'abondance relative de chaque probiotique par rapport aux bactéries totales à 12h, 24h et 48h après le démarrage de la fermentation pour différentes compositions symbiotiques.
L'abondance relative de chaque probiotique est normalisée par rapport à la quantité relative de probiotique obtenu dans l'échantillon où seul le probiotique a été ajouté. Pour les prébiotiques, GoF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL, BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium but yricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 6 montre l'évolution de la population bactérienne entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement: Les résultats sont montrés avec les compositions symbiotiques suivantes Enterococcus faecium (EF) +
beta-glucane (BG); Bifidobacterium thermophilum (BT) + inuline (Inu);
Clostridium butyricum (CB) + GOS/FOS (G/F); Bifidobacterium animalis lactis (BAL) + 2'FL
(2FL);
Bifidobacterium cruclilactis (BC) + beta-glucane (BG); et la condition contrôle.
Les résultats correspondent aux abondances relatives de la quantité
d'ADN de la bactérie cible par rapport à la quantité d'ADN des bactéries totales (méthode de mesure par qPCR 2A(-AACt)).
19 La figure 7 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Bifidobacterium thermophilum et inuline sur la production des acides gras volatiles (AGV), SCFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 8 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Bacillus animalis lactis et 2'FL sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 9 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Bacillus crudilactis et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 10 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Enterococcus faecium et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
Comme indiqué précédemment, la présente invention se rapporte à
une composition symbiotique comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clos tridium but yricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques.
Préférentiellement choisis dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS, de l'amidon résistant et de leur mélange.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une stabilisation ou une augmentation des Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi qu'une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus, les bifidobactéries, les Clostridium clusters IV et XlVa ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate, formant un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la
La figure 8 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Bacillus animalis lactis et 2'FL sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 9 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Bacillus crudilactis et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 10 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Enterococcus faecium et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SOFA entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
Comme indiqué précédemment, la présente invention se rapporte à
une composition symbiotique comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clos tridium but yricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques.
Préférentiellement choisis dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS, de l'amidon résistant et de leur mélange.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une stabilisation ou une augmentation des Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi qu'une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus, les bifidobactéries, les Clostridium clusters IV et XlVa ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate, formant un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la
20 génération d'un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Administrée à la truie en gestation et/ou au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d'un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière durable contre la dysbiose à l'aide du probiotique et du prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Préférentiellement, la combinaison est choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/a nima I, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Avantageusement, selon l'invention, le probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium but yricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière préférentielle, selon l'invention, la composition comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
Administrée à la truie en gestation et/ou au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d'un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière durable contre la dysbiose à l'aide du probiotique et du prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Préférentiellement, la combinaison est choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/a nima I, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Avantageusement, selon l'invention, le probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium but yricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière préférentielle, selon l'invention, la composition comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
21 Préférentiellement, la quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Fermentation statique in vitro:
La capacité de fermentation des différentes combinaisons symbiotiques a été testée dans un modèle statique de fermentation in vitro, suivant le protocole décrit par Bindelle et col. Journal of Animal Science 2010, 87, 583-93.
https://doi.org/10.2527/jas.2007-0717 et par Iran et col. FEMS Microbiology Ecology 2016, 92, 1-13. https://doi.orq/10.1093/femsec/f1v165. En résumé, la fermentation in vitro a été réalisée dans des flacons contenant 15 ml d'une solution contenant 3%
de matières fécales de porcelet en pré-sevrage; trois supports recouverts de mucine préalablement immergés dans de la gélose à la mucine; 100 mg de prébiotique et 1,00E+07 CFU / ml de probiotique. Les flacons scellés ont été incubés à 39 oc sous agitation pendant 48 h dans un bain-marie. Trois répétitions ont été réalisées par condition de test.
Production de gaz:
La pression du gaza été mesurée 2, 5,8, 12, 16, 20, 24 et 48h après le début de la fermentation pour la détermination de la cinétique de fermentation en utilisant le modèle mathématique monophasique de Groot et col. Animal Feed Science and Technology 1996, 64, 77-89. https://doi.org/10.1016/S0377-8401(96)01012-7. Plusieurs paramètres ont été calculés avec ce modèle: A
(volume de gaz maximal, ml/g substrat), B (temps pour atteindre A/2, h), C comme constante déterminant la pente du point d'inflexion du profil, Rmax (taux de fermentation maximum, ml/g de substrat/heure) et Tmax (temps pour atteindre Rmax (h)).
Acides gras a chaîne courte:
Le lactate et les acides gras à chaîne courte (SCFA) ont été dosés dans le jus de fermentation obtenu après 24h par HPLC isocratique. La courbe standard utilisée contenait de l'acétate, du propionate, du butyrate ainsi que des acides gras à chaîne ramifiée (BCFA): isobutyrate, valérate et isovalérate.
La mesure de SOFA a ensuite été calculée en tenant compte de la production basale dans les flacons témoins-mucine contenant les supports de microcosme avec de la mucine. Les valeurs sont données en mmol par g de substrat
Fermentation statique in vitro:
La capacité de fermentation des différentes combinaisons symbiotiques a été testée dans un modèle statique de fermentation in vitro, suivant le protocole décrit par Bindelle et col. Journal of Animal Science 2010, 87, 583-93.
https://doi.org/10.2527/jas.2007-0717 et par Iran et col. FEMS Microbiology Ecology 2016, 92, 1-13. https://doi.orq/10.1093/femsec/f1v165. En résumé, la fermentation in vitro a été réalisée dans des flacons contenant 15 ml d'une solution contenant 3%
de matières fécales de porcelet en pré-sevrage; trois supports recouverts de mucine préalablement immergés dans de la gélose à la mucine; 100 mg de prébiotique et 1,00E+07 CFU / ml de probiotique. Les flacons scellés ont été incubés à 39 oc sous agitation pendant 48 h dans un bain-marie. Trois répétitions ont été réalisées par condition de test.
Production de gaz:
La pression du gaza été mesurée 2, 5,8, 12, 16, 20, 24 et 48h après le début de la fermentation pour la détermination de la cinétique de fermentation en utilisant le modèle mathématique monophasique de Groot et col. Animal Feed Science and Technology 1996, 64, 77-89. https://doi.org/10.1016/S0377-8401(96)01012-7. Plusieurs paramètres ont été calculés avec ce modèle: A
(volume de gaz maximal, ml/g substrat), B (temps pour atteindre A/2, h), C comme constante déterminant la pente du point d'inflexion du profil, Rmax (taux de fermentation maximum, ml/g de substrat/heure) et Tmax (temps pour atteindre Rmax (h)).
Acides gras a chaîne courte:
Le lactate et les acides gras à chaîne courte (SCFA) ont été dosés dans le jus de fermentation obtenu après 24h par HPLC isocratique. La courbe standard utilisée contenait de l'acétate, du propionate, du butyrate ainsi que des acides gras à chaîne ramifiée (BCFA): isobutyrate, valérate et isovalérate.
La mesure de SOFA a ensuite été calculée en tenant compte de la production basale dans les flacons témoins-mucine contenant les supports de microcosme avec de la mucine. Les valeurs sont données en mmol par g de substrat
22 et comparées aux mesures dans le jus de fermentation ne contenant que le prébiotique correspondant.
Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le système de fermentation statique in vitro, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR
sur des échantillons prélevés après 24 heures de fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer l'expression par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le système de fermentation statique in vitro, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR
sur des échantillons prélevés après 24 heures de fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer l'expression par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.
23 Tableau 1.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour mesurer par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin.
Population Séquence des amorces 5'¨>3' bactérienne/gèn Gènes cibles Référence des gènes cibles es cibles Unibac-F CGTGCCAGCCGCGGTAATAC
Bactéries totales GGGTTGCGCTCGTTGCGGGA Amit-Romach Unibac-R et col. (2004) CTTAACCCAAC
LAA-F CATCCAGTGCAAACCTAAGA
Lactobacillus Wang et col.
LAA-R GATCCGCTTGCCTTCGC
(1996) Bif164-F GGGTGGTAATGCCGGAT
Bifidobacterium Langendijk et Bif662-R CCACCGTTACACCGGGAA col.
(1995) Clostridium Sg-Clept-F GCACAAGCAGTGGAG
Matsuki et cluster IV Sg-Clept-R CTTCCTCCGTTTTGTCAA col.
(2004) Clostridium g-Ccoc-F AAATGACGGTACCTGACTA
Matsuki et cluster XlVa g-Ccoc-R CITTGAGITTCATTCTTGCG col.
(2002) Butyryl- F TGGACAGAAAGGTTGCGGA
CoA:acetate-Uerlings et R GTGTGTACGCCCAGATCCT col.
(2019) CoA transférase Les bactéries totales sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Amit-Romach E. et col. Poult Soi 2004, 83, 1093-1098, doi: 10.3382/ps/pey394.
Les bactéries faisant partie du groupe lactobacillus sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Wang R.F. et col. Appl Environ Microbiol 1996, 62, 1242-1247, doi: 10.1128/AEM.62.4.1242-1247.1996.
Les bactéries faisant partie du groupe bifidobacterium sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Langendijk P.S. et col. Appl Environ Microbiol 1995, 61, 3069-3075, doi: 10.1128/AEM.61.8.3069-3075.1995.
Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster IV sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol 2004, 70, 7220-7228, doi: 10.1128/AEM.70.12.7220-7228.2004.
Population Séquence des amorces 5'¨>3' bactérienne/gèn Gènes cibles Référence des gènes cibles es cibles Unibac-F CGTGCCAGCCGCGGTAATAC
Bactéries totales GGGTTGCGCTCGTTGCGGGA Amit-Romach Unibac-R et col. (2004) CTTAACCCAAC
LAA-F CATCCAGTGCAAACCTAAGA
Lactobacillus Wang et col.
LAA-R GATCCGCTTGCCTTCGC
(1996) Bif164-F GGGTGGTAATGCCGGAT
Bifidobacterium Langendijk et Bif662-R CCACCGTTACACCGGGAA col.
(1995) Clostridium Sg-Clept-F GCACAAGCAGTGGAG
Matsuki et cluster IV Sg-Clept-R CTTCCTCCGTTTTGTCAA col.
(2004) Clostridium g-Ccoc-F AAATGACGGTACCTGACTA
Matsuki et cluster XlVa g-Ccoc-R CITTGAGITTCATTCTTGCG col.
(2002) Butyryl- F TGGACAGAAAGGTTGCGGA
CoA:acetate-Uerlings et R GTGTGTACGCCCAGATCCT col.
(2019) CoA transférase Les bactéries totales sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Amit-Romach E. et col. Poult Soi 2004, 83, 1093-1098, doi: 10.3382/ps/pey394.
Les bactéries faisant partie du groupe lactobacillus sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Wang R.F. et col. Appl Environ Microbiol 1996, 62, 1242-1247, doi: 10.1128/AEM.62.4.1242-1247.1996.
Les bactéries faisant partie du groupe bifidobacterium sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Langendijk P.S. et col. Appl Environ Microbiol 1995, 61, 3069-3075, doi: 10.1128/AEM.61.8.3069-3075.1995.
Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster IV sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol 2004, 70, 7220-7228, doi: 10.1128/AEM.70.12.7220-7228.2004.
24 Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster XlVa sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol 2002, 68, 5445-5451, doi: 10.1128/aem.68.11.5445-5451.2002.
La Butyril-CoA:acetate-CoA transférase est ciblée à l'aide des amorces décrites dans Uerlings J. et col. J Sci Food Agric 2019, 99, 5720-5733, doi: 10.1002/jsfa .9837.
Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s'établir dans un écosystème microbien complexe par qPCR lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le modèle de fermentation statique in vitro, l'analyse et suivi de la présence de chaque probiotique dans le jus de fermentation a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés à 12, 24 et 48 heures après le début de la fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par RT-qPCR l'abondance relative des probiotiques sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.
La Butyril-CoA:acetate-CoA transférase est ciblée à l'aide des amorces décrites dans Uerlings J. et col. J Sci Food Agric 2019, 99, 5720-5733, doi: 10.1002/jsfa .9837.
Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s'établir dans un écosystème microbien complexe par qPCR lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le modèle de fermentation statique in vitro, l'analyse et suivi de la présence de chaque probiotique dans le jus de fermentation a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés à 12, 24 et 48 heures après le début de la fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par RT-qPCR l'abondance relative des probiotiques sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.
25 Tableau 2.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour mesurer par qPCR l'abondance relative des probiotiques.
Séquence des amorces 5'¨>3' des Probiotique Référence gènes cibles Bifidobacterium F CCC TTT CCA CGG GTC CC
Veiga et col.
animalis lactis R AAG GGA AAC CGT GTC TCC AC
(2010) F GCATGGAGGAAAAAG- GAA
Bacillus coagulons Hidaka et col.
R CCCGGCAACAGAGTTTTA
(2010) Bifidobacterium F TTG CTT GCG GGT GAG AGI
Mathys et thermophilum R CGC CAA CAA GCT GAI AGG AC
col. (2008) Clos tridium F ATGGGTTAGGCAAGCAGAAA
Cremonesi et butyricum R GCTGGATCTGCCTTCTCATC
col. (2012) Enterococus F GAA ACG ACG GTG TCA TCA
Loquasto et faecium R TCC AIT TTG TCG TTA ICI G
col. (2013) TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG
Lac tobacillus F
AAT
Haarman et plan tarum col. (2005) R TGT ICI CGG TTT CAT TAT GAA
AAA ATA
Bifidobacterium F TGACCGACGAGATCACCTAT
Cette crudilactis (rpoB) R ACCATCTGACGTGGAGAGA
invention Bifidobacterium F CCATCGAGCTTCGTCCTTT
Cette crudilactis (rpIB) R GCCTTACCGAGCTGAAGATT
invention Références bibliographiques du Tableau 2:
Veiga, P., et col. 2010. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107:
18132-37, https://doi.org/10.1073/pnas.1011737107.
Hidaka T., et col. Water Research 2010, 44, 2554-62, https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.01.007.
Mathys S. et col. BMC Microbiology 2008, 8, 179, https://doi.org/10.1186/1471-8-179.
Cremonesi P. et col. Journal of Dairy Research 2012, 79,318-23, https://doi.org/10.1017/5002202991200026X.
Loquasto J.R. et col. Applied and Environmental Microbiology 2013, 79, 6903-10,
Séquence des amorces 5'¨>3' des Probiotique Référence gènes cibles Bifidobacterium F CCC TTT CCA CGG GTC CC
Veiga et col.
animalis lactis R AAG GGA AAC CGT GTC TCC AC
(2010) F GCATGGAGGAAAAAG- GAA
Bacillus coagulons Hidaka et col.
R CCCGGCAACAGAGTTTTA
(2010) Bifidobacterium F TTG CTT GCG GGT GAG AGI
Mathys et thermophilum R CGC CAA CAA GCT GAI AGG AC
col. (2008) Clos tridium F ATGGGTTAGGCAAGCAGAAA
Cremonesi et butyricum R GCTGGATCTGCCTTCTCATC
col. (2012) Enterococus F GAA ACG ACG GTG TCA TCA
Loquasto et faecium R TCC AIT TTG TCG TTA ICI G
col. (2013) TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG
Lac tobacillus F
AAT
Haarman et plan tarum col. (2005) R TGT ICI CGG TTT CAT TAT GAA
AAA ATA
Bifidobacterium F TGACCGACGAGATCACCTAT
Cette crudilactis (rpoB) R ACCATCTGACGTGGAGAGA
invention Bifidobacterium F CCATCGAGCTTCGTCCTTT
Cette crudilactis (rpIB) R GCCTTACCGAGCTGAAGATT
invention Références bibliographiques du Tableau 2:
Veiga, P., et col. 2010. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107:
18132-37, https://doi.org/10.1073/pnas.1011737107.
Hidaka T., et col. Water Research 2010, 44, 2554-62, https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.01.007.
Mathys S. et col. BMC Microbiology 2008, 8, 179, https://doi.org/10.1186/1471-8-179.
Cremonesi P. et col. Journal of Dairy Research 2012, 79,318-23, https://doi.org/10.1017/5002202991200026X.
Loquasto J.R. et col. Applied and Environmental Microbiology 2013, 79, 6903-10,
26 https://doi.org/10.1128/AEM.01777-13.
Haarman M. et col. Applied and Environmental Microbiology 2005, 71, 2318-24, https://doi.org/10.1128/AEM.71.5.2318.
Détermination de la réponse immunitaire causée par incubation du jus de fermentation obtenu lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Dans la cadre de la présente invention, la lignée IPEC-J2 (entérocytes intestinaux isolés du jéjunum d'un porcelet nouvellement né et non allaité (ou alimenté avec une formulation lactée) et appartenant à une lignée cellulaire ni transformée ni tumorigène) a été incubée dans le jus de fermentation produit par la combinaison symbiotique à tester ou contenant uniquement le prébiotique en question pendant 24h. A la suite de cette période d'incubation, la réponse immunitaire est évaluée par la production de cytokines induites (IL-8, IL-6, IL-1b) et TNF-alpha.
Préalablement, la cytotoxicité des jus de fermentation sur les cellules IPEC-J2 a été évaluée car, pour pouvoir observer une réponse immunitaire, il est important que la lignée cellulaire reste viable. Pour chaque combinaison sélectionnée, l'effet des différentes concentrations en jus de fermentation, préalablement filtré à 0.8 lim, sur la viabilité des cellules IPEC-J2 a été
mesurée par le test MTT (sel de tétrazolium MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium), qui est un test colorimétrique de numérotation des cellules viables. Le contact avec les cellules IPEC-J2 a été ensuite réalisé avec un taux d'inoculation du jus de fermentation de 0.8% ( V/V) .
Haarman M. et col. Applied and Environmental Microbiology 2005, 71, 2318-24, https://doi.org/10.1128/AEM.71.5.2318.
Détermination de la réponse immunitaire causée par incubation du jus de fermentation obtenu lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Dans la cadre de la présente invention, la lignée IPEC-J2 (entérocytes intestinaux isolés du jéjunum d'un porcelet nouvellement né et non allaité (ou alimenté avec une formulation lactée) et appartenant à une lignée cellulaire ni transformée ni tumorigène) a été incubée dans le jus de fermentation produit par la combinaison symbiotique à tester ou contenant uniquement le prébiotique en question pendant 24h. A la suite de cette période d'incubation, la réponse immunitaire est évaluée par la production de cytokines induites (IL-8, IL-6, IL-1b) et TNF-alpha.
Préalablement, la cytotoxicité des jus de fermentation sur les cellules IPEC-J2 a été évaluée car, pour pouvoir observer une réponse immunitaire, il est important que la lignée cellulaire reste viable. Pour chaque combinaison sélectionnée, l'effet des différentes concentrations en jus de fermentation, préalablement filtré à 0.8 lim, sur la viabilité des cellules IPEC-J2 a été
mesurée par le test MTT (sel de tétrazolium MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium), qui est un test colorimétrique de numérotation des cellules viables. Le contact avec les cellules IPEC-J2 a été ensuite réalisé avec un taux d'inoculation du jus de fermentation de 0.8% ( V/V) .
27 Mesure de la concentration d'IL-8:
Dans le cadre de la présente invention, la concentration d'IL-8 a été
mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC-J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester) (voir Figure 2).
Pour réaliser le test, un essai a été réalisé en comparant les concentrations de IL-8 (les autres marqueurs IL-6, IL-lb et TNF-alpha n'ont pas été détectés) produites en présence du jus de fermentation dans différentes conditions : témoin-mucine (ligne horizontale de la Figure 2), prébiotiques seules (conditions GOS/FOS (GF), 2FL, Inuline (Inu), amidon résistant (RS) et (3-glucane (BG)), et symbiotiques (les autres conditions de la Figure 2). Cet essai indique que, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition prébiotique ou symbiotique comparé au jus de fermentation témoin-mucine, cela montre un effet anti-inflammatoire de la présence du pré- ou symbiotique. En plus, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition symbiotique comparé au jus de fermentation contenant uniquement le prébiotique, cela montre que la combinaison spécifique dudit au moins un probiotique avec ledit au moins un prébiotique possède un effet anti-inflammatoire supplémentaire par rapport au prébiotique seul. La viabilité cellulaire des symbiotiques (résultats du test IVITT) a été prise en compte pour ajuster les concentrations d'IL-8. Le niveau d'expression d'IL-8 est déterminé par ELISA (Porcine IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA
kit DY535: R&D Systems).
Modèle BabySPIME :
Le modèle BabySPIME est un modèle scientifiquement validé
(Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019) qui simule la dynamique et les conditions physiologiques d'un tractus gastrointestinal complet chez le porcelet dans un environnement in vitro (équipement dérivé du modèle SHIME de ProDigest Bvba, Gent, Belgium). Le modèle comprend 2 fois 3 réacteurs qui simulent de manière séquentielle l'estomac (condition acide et digestion par la pepsine), l'iléon (processus de digestion enzymatique) et le côlon proximal (processus de fermentation par le microbiote) (voir Figure 1). Ce système permet d'obtenir des communautés microbiennes complexes et stables dont la fonction et la structure
Dans le cadre de la présente invention, la concentration d'IL-8 a été
mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC-J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester) (voir Figure 2).
Pour réaliser le test, un essai a été réalisé en comparant les concentrations de IL-8 (les autres marqueurs IL-6, IL-lb et TNF-alpha n'ont pas été détectés) produites en présence du jus de fermentation dans différentes conditions : témoin-mucine (ligne horizontale de la Figure 2), prébiotiques seules (conditions GOS/FOS (GF), 2FL, Inuline (Inu), amidon résistant (RS) et (3-glucane (BG)), et symbiotiques (les autres conditions de la Figure 2). Cet essai indique que, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition prébiotique ou symbiotique comparé au jus de fermentation témoin-mucine, cela montre un effet anti-inflammatoire de la présence du pré- ou symbiotique. En plus, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition symbiotique comparé au jus de fermentation contenant uniquement le prébiotique, cela montre que la combinaison spécifique dudit au moins un probiotique avec ledit au moins un prébiotique possède un effet anti-inflammatoire supplémentaire par rapport au prébiotique seul. La viabilité cellulaire des symbiotiques (résultats du test IVITT) a été prise en compte pour ajuster les concentrations d'IL-8. Le niveau d'expression d'IL-8 est déterminé par ELISA (Porcine IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA
kit DY535: R&D Systems).
Modèle BabySPIME :
Le modèle BabySPIME est un modèle scientifiquement validé
(Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019) qui simule la dynamique et les conditions physiologiques d'un tractus gastrointestinal complet chez le porcelet dans un environnement in vitro (équipement dérivé du modèle SHIME de ProDigest Bvba, Gent, Belgium). Le modèle comprend 2 fois 3 réacteurs qui simulent de manière séquentielle l'estomac (condition acide et digestion par la pepsine), l'iléon (processus de digestion enzymatique) et le côlon proximal (processus de fermentation par le microbiote) (voir Figure 1). Ce système permet d'obtenir des communautés microbiennes complexes et stables dont la fonction et la structure
28 sont fortement similaires aux communautés microbiennes retrouvées dans les différentes régions de l'intestin.
Des pompes péristaltiques permettent le transfert du milieu de culture, du jus pancréatique, de la bile, de l'acide (HCI 0.5M), de la base (NaOH 0.5M) et des liquides de fermentation d'un réacteur à l'autre au cours d'un cycle complet.
En pratique, le réacteur 1 simule les fonctions de l'estomac, du duodenum et du jejunum, le réacteur 2 simule les fonctions de I' ileum, le réacteur 3 simule les fonctions du colon proximal.
Un essai complet dans le système babySPIME dure 3 semaines : 2 semaines de stabilisation du microbiote suivie par une semaine de traitement avec la composition symbiotique. Une solution de 1,00E+08 CFU/ml a été préparée pour inoculer une dose finale de 1,00E+07 CFU/ml de contenu intestinal. La dose de prébiotique est de 2g de prébiotique/jour pour atteindre une concentration de 1%
de l'alimentation.
Les matières fécales de 6 porcelets âgé de 27 jours en allaitement et n'ayant pas subi de traitement antibiotique ont été utilisées pour préparer l'inoculat de l'étude. Les matières fécales ont été prélevées directement des porcelets et maintenues sur glace dans des conditions anaérobies. Pour chaque essai, l'inoculat a ensuite été homogénéisé pendant 10 minutes en ajoutant les matières fécales de chaque porcelet à une solution de tampon phosphate en condition anaérobie.
Après une filtration macroscopique pour éliminer les particules encore en suspension, le filtrat a été injecté de manière simultanée dans les réacteurs 2 et 3.
Avant l'inoculation, ces deux réacteurs ont été remplis avec un milieu de culture non-acidifié et le pH a été ajusté de manière automatique dans chaque réacteur de manière à simuler au mieux les conditions physiologiques.
Le milieu de culture a été préparé et validé préalablement. Les bouteilles de milieu ont été stockées à 4 C et le pH a été ajusté à 3.0 avant l'utilisation dans le premier réacteur. Une solution mimant le jus pancréatique contenant du bicarbonate de sodium (2.5 g/L, VWR Chemicals, Radnol, Pennsylvania, USA), de la pancréatine (0.9g/L, ProDigest) et des sels biliaires (Oxgall 4.0 g/L) a été
ajoutée au milieu.
Le cycle d'alimentation est planifié 3 fois par jour basé sur un temps total de rétention de 14h. Au cours de chaque cycle, le milieu de culture, maintenu
Des pompes péristaltiques permettent le transfert du milieu de culture, du jus pancréatique, de la bile, de l'acide (HCI 0.5M), de la base (NaOH 0.5M) et des liquides de fermentation d'un réacteur à l'autre au cours d'un cycle complet.
En pratique, le réacteur 1 simule les fonctions de l'estomac, du duodenum et du jejunum, le réacteur 2 simule les fonctions de I' ileum, le réacteur 3 simule les fonctions du colon proximal.
Un essai complet dans le système babySPIME dure 3 semaines : 2 semaines de stabilisation du microbiote suivie par une semaine de traitement avec la composition symbiotique. Une solution de 1,00E+08 CFU/ml a été préparée pour inoculer une dose finale de 1,00E+07 CFU/ml de contenu intestinal. La dose de prébiotique est de 2g de prébiotique/jour pour atteindre une concentration de 1%
de l'alimentation.
Les matières fécales de 6 porcelets âgé de 27 jours en allaitement et n'ayant pas subi de traitement antibiotique ont été utilisées pour préparer l'inoculat de l'étude. Les matières fécales ont été prélevées directement des porcelets et maintenues sur glace dans des conditions anaérobies. Pour chaque essai, l'inoculat a ensuite été homogénéisé pendant 10 minutes en ajoutant les matières fécales de chaque porcelet à une solution de tampon phosphate en condition anaérobie.
Après une filtration macroscopique pour éliminer les particules encore en suspension, le filtrat a été injecté de manière simultanée dans les réacteurs 2 et 3.
Avant l'inoculation, ces deux réacteurs ont été remplis avec un milieu de culture non-acidifié et le pH a été ajusté de manière automatique dans chaque réacteur de manière à simuler au mieux les conditions physiologiques.
Le milieu de culture a été préparé et validé préalablement. Les bouteilles de milieu ont été stockées à 4 C et le pH a été ajusté à 3.0 avant l'utilisation dans le premier réacteur. Une solution mimant le jus pancréatique contenant du bicarbonate de sodium (2.5 g/L, VWR Chemicals, Radnol, Pennsylvania, USA), de la pancréatine (0.9g/L, ProDigest) et des sels biliaires (Oxgall 4.0 g/L) a été
ajoutée au milieu.
Le cycle d'alimentation est planifié 3 fois par jour basé sur un temps total de rétention de 14h. Au cours de chaque cycle, le milieu de culture, maintenu
29 à 4 C, passe dans le réacteur 1 pendant 1h30. Ensuite, le mélange de jus pancréatique/sels biliaires (60m1), aussi maintenu à 4 C, est ajouté dans le même réacteur pendant 1h. Après ce temps, et de manière simultanée, le contenu des réacteurs 1, 2 et 3 est transvasé, respectivement, dans les réacteurs 2, 3 ainsi que un conteneur biologique de déchet.
Les conditions anaérobies de tous les réacteurs sont maintenues grâce à un flux d'azote (N2) une fois par jour pendant 10 minutes au niveau des réacteurs.
Le contenu des réacteurs est agité de manière continue (300 rpm) et maintenu à
39.5 C. Le pH des réacteurs 2 et 3 est contrôlé en continu afin de stabiliser le pH de l'ileum et du colon proximal.
Des prélèvements ont été collectés dans le système babySPIME durant la phase de stabilisation, avant le traitement avec les formulations symbiotiques et en fin de traitement avec le symbiotique.
Pour chaque essai dans le système babySPIME, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés en fin de phase de stabilisation et à la fin de la semaine de traitement par une composition symbiotique. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR la quantité relative des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 mentionné plus haut.
Trois répétitions sur le modèle BABY-SPIME ont été réalisées pour chacune des combinaisons symbiotiques.
Exemples.-Exemple 1 : La capacité de fermentation de la composition symbiotique par modélisation de la production de gaz et la production de lactate et SCFA dans un modèle de fermentation statique in vitro Les courbes de la fermentation des pré- ou symbiotiques sont montrées dans la figure 3. Dans toutes les conditions de la Figure 3, il y a une augmentation de la capacité de fermentation mesurée par l'augmentation de la production de gaz. Dans toutes les conditions de la figure 3, cette production de gaz est plus imporhante en présence d'une composition symbiotique par rapporh à la présence du prébiotique seul.
Les conditions anaérobies de tous les réacteurs sont maintenues grâce à un flux d'azote (N2) une fois par jour pendant 10 minutes au niveau des réacteurs.
Le contenu des réacteurs est agité de manière continue (300 rpm) et maintenu à
39.5 C. Le pH des réacteurs 2 et 3 est contrôlé en continu afin de stabiliser le pH de l'ileum et du colon proximal.
Des prélèvements ont été collectés dans le système babySPIME durant la phase de stabilisation, avant le traitement avec les formulations symbiotiques et en fin de traitement avec le symbiotique.
Pour chaque essai dans le système babySPIME, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés en fin de phase de stabilisation et à la fin de la semaine de traitement par une composition symbiotique. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR la quantité relative des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 mentionné plus haut.
Trois répétitions sur le modèle BABY-SPIME ont été réalisées pour chacune des combinaisons symbiotiques.
Exemples.-Exemple 1 : La capacité de fermentation de la composition symbiotique par modélisation de la production de gaz et la production de lactate et SCFA dans un modèle de fermentation statique in vitro Les courbes de la fermentation des pré- ou symbiotiques sont montrées dans la figure 3. Dans toutes les conditions de la Figure 3, il y a une augmentation de la capacité de fermentation mesurée par l'augmentation de la production de gaz. Dans toutes les conditions de la figure 3, cette production de gaz est plus imporhante en présence d'une composition symbiotique par rapporh à la présence du prébiotique seul.
30 Les paramètres issus de la modélisation de la production de gaz pendant la fermentation statique des symbiotiques sont comparés par rapport aux paramètres des prébiotiques seules (tableau 3).
o o o ,0 Tableau 3.- Pahmè'res=dé td proclition de gaz de Id ferriérikitibil iri'Vittderi Ut- (feirriénktibh statique) 'én présent.
1µ.) d'un préblolque seul ou en présence Jonc combinaison ente un prébiotique et un pfcbiotlque (syr ique). (Moy : rric,yenne, : édart-type, p-val p-valeur.
A - VoLnye ma>:
production de flc71,-.: B - Tamp$ (heures', C- Pente Rrhax !g substrat) Trndx.fneorés' ss,ibstrat N.^,cy ET p-va ,Moy ET o-val M.cy ET p-val MOy E7 p-val Mo,/ ET. p-val GOS/FOS 'GoF' 11-7,42 42,19 4,55 0,78 .3,11 0,51 124,37 3,35 3.63 0,64 ;-[2oF :73713 0.03 ço,oco: 4,81 0,51 C.999:3 1,97 0,09 <0.0001 45,67 6,28 0,3011 2.T 0,14 0,3598 B7-G F 6370 4.5,40 0,9939 5,98 1,33 0,0089 3,13 0,08 >0.9323 25,92 10,61 0,0073 4,86 1,13 0,0047 CE-C,oF 263,62 7, - 0,10001.5 7. 5 0,25 <0,0001 2,02 0,10 0.0031 24,10 0,36 0,0009 4,16 0,30 0,6262:
EF-GpF 208,63 7,32 0,6858 5.19 0,19 0.6948 2,98 0,11 0:9963 33,63 0,91 0.,9993 0,21 0.7613 2Fucos'ylac-ose (21'4 203,03 1 5.43 3,64 0,34 .72,93 5.17' 5.19 0..13 BAL-2FL 207,5 é I c. 3.2 0,9983 L.:_141.34 2,32 0,11 <0.00D1 29:33 0,5227 3.37 0..22 02003 -429.53 15361 0,0044 3.44 0,39 00062 2,77 .0,32 0.0096 2µ-;,22, 9,55 0,6089 2.59 0:14 <0:9001 713,14 0.24 /,90 3,12 0,0!
22,47 346 6,31-1 1,221 BAL- nu 525,17 11,70 0,3057 6.33 0,04 <0.0001 2,47 0,13 0.0037 25,47 ,93 0,2055 4,47 0,20 <0,0001 B74n3 '66,0 7.22 0,2837 6.03 0,13 -=0:0001 3,21 0,11 09966 27,27 0;42 0,0152 4,93 0,03 0,0002 An-loct3 -éistont IRS 153,64 .8.7J 20.90 1.07 5,84 136 13,73 õ44 19,03 1,08 CE-RS 250,32 1.6.20 (0,1=100- 7,95 0,36 <1..0001 1,97 0,06 <0,01001 20:37 1,59 <0,0001 4,50 0,26 0,0001 sid L73.
oc La cinétique de production de gaz et les paramètres du modèle incluent : A: la production maximale de gaz ; B: le temps pour avoir 50% de la production maximale de gaz; C : la pente ; D: le taux maximal de production de gaz (Rmax) ; le temps à
Rmax (Tmax). La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été
réalisée à 1,00E+7 CFU/ml de probiotique et 0.1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Du nnett.
Les résultats sont considérés comme étant significatifs lorsque p <0.05.
Les SCFAs présents dans le jus de fermentation après 24h de fermentation sont présentés dans le tableau 4. Il n'y avait pas de production de lactate après 24h de fermentation.
o o o Tableau 4.- Production des acides gras à courtes chdihes par fermentation en présence d'un prébiotique seul ou en présence des combinaisons symbiotiques analysées dans Ic fermentation in vitra en lot. (Moy:
moyenne, ET: écart-type, p-val :
n.) ACETATE otig PROHC:NATE BUTYRATE 'ET mol/g BCFA rrmLçj de: SCFA TOTA.UX 'rrin-101,/g de subir:r1) (mmoL/c de substrat) de sub.nd,1:i su:Dstra'.; de st_ b.7`771::
ET p-val Moy ET p-val !.1.cy ET p-va] Moy ET p-val ET p-val GGE/FOS
2,569 0,075 2,210 0,033 0,636 0,013 0,140 G1306 5,554 0,111 (GDF) .2,789 0,128 0,284.5 2.L4 3,083 0,2319 0,745 0,070 0,9951 0,225 0,028 0,9631 6,185 0,.281 0,6103 Gc.:F
3f-GoF
2,374 0,061 07'595 2,67-. 3,024 0,4378 1,495 0,033 0,0001 0,435 0,032 0,0135 6,976 0,191 0,2029 CE-GoF
1.494 1,295 0,949- 4,863 1,0.40 <3..000- 2,183 0,42" <3,000" 1.104 0,231 <0,0001 9,642 3,019 0,0.00.7 EF-GoF
2.084 0,076 0.9789 2,794 3,092 .-',1,28:56 1,432 C,C72 3,0003 0.415 0:055 0,0242 6,727 3,255 0.3028 2FL 2,789 0,695 1,87" 0,53.0 0,315 0,065 0.035 0,001 5,010 1,285 BA L-2:71_ 2.682 0,090 0,9893 2,764 3,386 0,0626 1,056 C,C6.4 78i,000 r 0.373 0,041 0,0007 6,875 0,122 3:505 B.r..20-2FL 1:2,7 0,697 0,3144 2,732 3,423 0,0722 1,264 0,132 -781,000 0,484 0,098 0,0001 5,630 1,407 ECU-2FL 1.288 0,423 0,0119 2.8'] 3,354 0..052 1,210 0,113 <3,000 0.539 3,072 <0,0001 5,647 0.966 3.8099 'ne 2.956 0.087 2,38.7 0,058 0,698 0,029 0,123 2,308 6,163 0,084 flu) L-Iriu 2,717 0,099 0,7282 2,141 0,147 0,248 1,145 0,140 0,0039 0.332 13,07 0,0046 6,341 0,392 0,9342 _
o o o ,0 Tableau 3.- Pahmè'res=dé td proclition de gaz de Id ferriérikitibil iri'Vittderi Ut- (feirriénktibh statique) 'én présent.
1µ.) d'un préblolque seul ou en présence Jonc combinaison ente un prébiotique et un pfcbiotlque (syr ique). (Moy : rric,yenne, : édart-type, p-val p-valeur.
A - VoLnye ma>:
production de flc71,-.: B - Tamp$ (heures', C- Pente Rrhax !g substrat) Trndx.fneorés' ss,ibstrat N.^,cy ET p-va ,Moy ET o-val M.cy ET p-val MOy E7 p-val Mo,/ ET. p-val GOS/FOS 'GoF' 11-7,42 42,19 4,55 0,78 .3,11 0,51 124,37 3,35 3.63 0,64 ;-[2oF :73713 0.03 ço,oco: 4,81 0,51 C.999:3 1,97 0,09 <0.0001 45,67 6,28 0,3011 2.T 0,14 0,3598 B7-G F 6370 4.5,40 0,9939 5,98 1,33 0,0089 3,13 0,08 >0.9323 25,92 10,61 0,0073 4,86 1,13 0,0047 CE-C,oF 263,62 7, - 0,10001.5 7. 5 0,25 <0,0001 2,02 0,10 0.0031 24,10 0,36 0,0009 4,16 0,30 0,6262:
EF-GpF 208,63 7,32 0,6858 5.19 0,19 0.6948 2,98 0,11 0:9963 33,63 0,91 0.,9993 0,21 0.7613 2Fucos'ylac-ose (21'4 203,03 1 5.43 3,64 0,34 .72,93 5.17' 5.19 0..13 BAL-2FL 207,5 é I c. 3.2 0,9983 L.:_141.34 2,32 0,11 <0.00D1 29:33 0,5227 3.37 0..22 02003 -429.53 15361 0,0044 3.44 0,39 00062 2,77 .0,32 0.0096 2µ-;,22, 9,55 0,6089 2.59 0:14 <0:9001 713,14 0.24 /,90 3,12 0,0!
22,47 346 6,31-1 1,221 BAL- nu 525,17 11,70 0,3057 6.33 0,04 <0.0001 2,47 0,13 0.0037 25,47 ,93 0,2055 4,47 0,20 <0,0001 B74n3 '66,0 7.22 0,2837 6.03 0,13 -=0:0001 3,21 0,11 09966 27,27 0;42 0,0152 4,93 0,03 0,0002 An-loct3 -éistont IRS 153,64 .8.7J 20.90 1.07 5,84 136 13,73 õ44 19,03 1,08 CE-RS 250,32 1.6.20 (0,1=100- 7,95 0,36 <1..0001 1,97 0,06 <0,01001 20:37 1,59 <0,0001 4,50 0,26 0,0001 sid L73.
oc La cinétique de production de gaz et les paramètres du modèle incluent : A: la production maximale de gaz ; B: le temps pour avoir 50% de la production maximale de gaz; C : la pente ; D: le taux maximal de production de gaz (Rmax) ; le temps à
Rmax (Tmax). La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été
réalisée à 1,00E+7 CFU/ml de probiotique et 0.1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Du nnett.
Les résultats sont considérés comme étant significatifs lorsque p <0.05.
Les SCFAs présents dans le jus de fermentation après 24h de fermentation sont présentés dans le tableau 4. Il n'y avait pas de production de lactate après 24h de fermentation.
o o o Tableau 4.- Production des acides gras à courtes chdihes par fermentation en présence d'un prébiotique seul ou en présence des combinaisons symbiotiques analysées dans Ic fermentation in vitra en lot. (Moy:
moyenne, ET: écart-type, p-val :
n.) ACETATE otig PROHC:NATE BUTYRATE 'ET mol/g BCFA rrmLçj de: SCFA TOTA.UX 'rrin-101,/g de subir:r1) (mmoL/c de substrat) de sub.nd,1:i su:Dstra'.; de st_ b.7`771::
ET p-val Moy ET p-val !.1.cy ET p-va] Moy ET p-val ET p-val GGE/FOS
2,569 0,075 2,210 0,033 0,636 0,013 0,140 G1306 5,554 0,111 (GDF) .2,789 0,128 0,284.5 2.L4 3,083 0,2319 0,745 0,070 0,9951 0,225 0,028 0,9631 6,185 0,.281 0,6103 Gc.:F
3f-GoF
2,374 0,061 07'595 2,67-. 3,024 0,4378 1,495 0,033 0,0001 0,435 0,032 0,0135 6,976 0,191 0,2029 CE-GoF
1.494 1,295 0,949- 4,863 1,0.40 <3..000- 2,183 0,42" <3,000" 1.104 0,231 <0,0001 9,642 3,019 0,0.00.7 EF-GoF
2.084 0,076 0.9789 2,794 3,092 .-',1,28:56 1,432 C,C72 3,0003 0.415 0:055 0,0242 6,727 3,255 0.3028 2FL 2,789 0,695 1,87" 0,53.0 0,315 0,065 0.035 0,001 5,010 1,285 BA L-2:71_ 2.682 0,090 0,9893 2,764 3,386 0,0626 1,056 C,C6.4 78i,000 r 0.373 0,041 0,0007 6,875 0,122 3:505 B.r..20-2FL 1:2,7 0,697 0,3144 2,732 3,423 0,0722 1,264 0,132 -781,000 0,484 0,098 0,0001 5,630 1,407 ECU-2FL 1.288 0,423 0,0119 2.8'] 3,354 0..052 1,210 0,113 <3,000 0.539 3,072 <0,0001 5,647 0.966 3.8099 'ne 2.956 0.087 2,38.7 0,058 0,698 0,029 0,123 2,308 6,163 0,084 flu) L-Iriu 2,717 0,099 0,7282 2,141 0,147 0,248 1,145 0,140 0,0039 0.332 13,07 0,0046 6,341 0,392 0,9342 _
31.-Inu 2,979 0,727 0,99.69 1,866 0,274 0,0229 1,164 0,117 0,0C3-. 1174 0,048 0,4423 6,183 1,161 0,9992 Anidcri résis7crt 2,837 0,159 1,590 0,092 0,558 0,101 0.029 0,020 5,014 0,314 ;=-;
CE-=S 3,763 0,267 0,0207 3,629 3,193 <0,0001 1,461 0,103 <0,0001 0.332 0,360 0:0002 9,185. .3,618 0,0004 -ECU-RS .2,253 0,453 0,1109 2, 22 0,326 3,0479 0,521 0,060 0,837 0.039 0,0.33 7.,'õ856 0,98311 gliirxrie 0.609 0,075 2,820 3,032 0,056 0,009 0,023 0,033 1,485 0,099 -tJ
BAI-BG 1.389 0,322 0,0116 1,3.79 3,090 0,00' 6 0,045 0,039 0,9994 0,005 0,008 0,9806 2,818 2,300 0,0144 n.) LP-.13G 1,304 35 0,78.25 1,527 0,076 3,000.?. 0,115 0,062 0,8436 C ;003 >0,9999 2,946 is.,253 0,0082 _1 EF-BG
1.723 0,049 0,00.7 1,972 0,018 <:0..02:2:' 0,231 0,011 0,1192 0,033 0.320 0,0543 3,960 :"..,379 0,0002 ree EC.L.-EG 1.554 0,433 0,0033 2,042 3,274 <0,0001 0,346 0,190 0,01 0,022 0,024 0,2327 3,964 3,910 0,0002 111 cet La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été réalisée à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0,1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett.
Lorsque p <0,05 : * ; p <0,01 : ** ; p <0,001 : *** ; p < 0,0001 :
Example 2: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques L'abondance relative des bactéries bénéfiques après 24h de fermentation sont présentés dans la figure 4. La méthode de delta-delta CT a été
utilisée pour exprimer les bactéries cibles par rapport aux bactéries totales.
Les résultats des symbiotiques sont comparés par rapport aux prébiotiques seuls.
Comme l'indique la figure 4, plusieurs compositions symbiotiques, comme BT-GF, CB-GF, BCO-GF, BCU-2FL, BMO-2FL, BAL-2FL, BAL-Inu, BT-Inu, CB-RS, BCU-RS, BAL-BG, LP-BG, ou BCU-BG, permettent d'augmenter de manière significative l'abondance relative des bactéries bénéfiques à 24h de fermentation.
Exemple 3: Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s'établir pendant la fermentation La figure 5 montre la présence des probiotiques dans le jus de fermentation après 12, 24 et 48h de fermentation. Des compositions symbiotiques, comme BT-Inu, permettent un bon établissement et une bonne capacité de survie du probiotique.
Exemple 4: Détermination de l'effet immunomodulateur de la composition symbiotique par quantification de la production d'IL-8 et NO par des cellules IPEC-J2.
La production d'IL-8 dans les cellules IPEC-J2 a été mesurée par un test ELISA.
Après 24h d'incubation, la réponse immunitaire a été évaluée en mesurant la production d'IL-8 dans le milieu de culture cellulaire. Les cellules IPEC-J2 ont été incubées avec 0,8% (V/V) de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration. De plus, le taux de survie des cellules IPEC-J2 est supérieur ou égal à 70%
dans toutes les conditions testées de jus de fermentation.
Pour déterminer l'impact de la composition symbiotique contenue dans le jus de fermentation sur la production d' IL-8, le taux de production d'IL-8 a été mesuré dans une condition contrôle où le jus de fermentation contient un inoculat de fèces, de la mucine (témoin-mucine), mais en absence de probiotiques, de prébiotiques ou de symbiotiques. Dans cette condition contrôle, un niveau de base d'expression d'IL-8 est de 932 pg/ml (représenté par la ligne horizontale à la figure 2). Les pré- et symbiotiques ont été comparés par rapport au témoin-mucine.
En plus les symbiotiques ont été comparés par rapport au prébiotique pour estimer l'effet additionnel de probiotique. Le tableau 5 montre les p-valeurs de ces comparaisons, et la figure 2 montre les concentrations d' 1L8.
Tableau 5.- Production d'IL-8 par les cellules IPEC-J2 dans le surnageant après 24h d'incubation avec 0,8% de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration produit par la composition symbiotique ou le prébiotique seul.
IL-8 (pg/ml) p-valeur moyenne ET
(vs prébiotique) (vs blanc-mucine) GOS/FOS (CE) 1094,0 40,5 0,0421 BCO-GF 897,3 96,3 0,0041 0,9207 BT-GF 1089,4 89,8 0,9999 0,0497 CB-GF 849,5 59,4 0,0006 0,3954 EF-GF 927,5 40,6 0,0138 0,9997 2'FL 1041,2 52,6 0,2193 BAL-2FL 581,3 81,1 <0,0001 <0,0001 BCU-2FL 570,8 81,8 <0,0001 <0,0001 BMO-2FL 715,1 41,5 <0,0001 0,0037 INULINE (Inu) 1116,4 40,9 0,0258 BAL-Inu 1177,7 112,6 0,4075 0,004 BT-Inu 1025,9 31,4 0,1816 0,3398 Amidon résistant (RS) 753,3 50,9 0,0086 BCU-RS 1150,3 38,9 <0,0001 0,003 CB-RS 1195,6 61,3 <0,0001 0,0007 13-GLUCANE 831,7 40,5 0,1916 BAL-BG 393,6 30,0 <0,0001 <0,0001 BCU-BG 413,2 46,4 <0,0001 <0,0001 EF-BG 1128,9 60,0 <0,0001 0,0066 LP-BG 775,7 106,0 0,5405 0,0232 blanc-mucine 937,1 110,8 Les valeurs sont corrigées en fonction de la viabilité cellulaire. Les résultats sont des moyennes avec leurs écart-types. Les comparaisons sont réalisées entre les compositions symbiotiques et le prébiotique seul. Les significativités statistiques sont analysées par une ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett. Lorsque p<0,05 :*; p<0,01 : ** ; p<0,001 :*** ;
p<0,0001 :
Exemple 5: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle baby SPIME en présence de différentes compositions symbiotiques.
Les résultats globaux obtenus sur le système baby SPIME sont présentés dans la figure 6 et le tableau 6.
Tableau 6.- Synthèse de la régulation à la hausse ou à la baisse de groupes bactériens d'intérêt suite au traitement symbiotique dans le système BABY-SPIME après une semaine de traitement avec les différents symbiotiques.
Test Lactobacillus Bifidobacterium Cluster IV
Cluster XIV Acetyl Wilcoxon CoA
Control Baisse Tendance à la Stable Stable Stable BABY- p<0,01 baisse SPIME 0,05<p<0,1 EF + BG Stable Tendance à la Baisse Stable Hausse baisse p = 0,01 p<0,05 0,05<p<0,1 BT + INU Stable Tendance à la Hausse Baisse Stable hausse p<0,05 (p = 0,05) 0,05<p<0,1 CB + Baisse Stable Stable Stable Hausse GOS/FOS p<0,01 p<0,01 BAL + 2FL Baisse Hausse Stable Stable Stable p<0,01 p<0,05 BCU + BG Baisse Tendance à la Hausse Tendance Stable p<0,01 hausse p<0,05 à la baisse 0,05<p<0,1 0,05<p<0,1 Nous retrouvons soit une diminution de la population bactérienne, soit une augmentation de la population bactérienne ou soit une stabilisation de la population bactérienne. Le test statistique réalisé est un test de Wilcoxon.
Exemple 6: Composition symbiotique Cl comprenant au moins Clostridium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition Cl en ajoutant 1E07 CFU/ml Clostridium but yricum et 0,1 g de GOS/FOS.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de GOS/FOS a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation. Pour le mélange GOS/FOS, le prébiotique consiste en une solution liquide homogène de 80% (p/p) de GOS et 20% (p/p) de FOS. Au niveau du probiotique, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté
au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation.
Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique comprenant au moins Clostriciium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale a montré un effet favorable sur la fermentation, en augmentant la valeur A (production maximale de gaz) par rapport au prébiotique seul (voir condition CB-GoF du Tableau 3, et en augmentant les concentrations de SCFAs totales et butyrate après 24 heures de fermentation statique in vitro (voir condition CB-GoF du Tableau 4). En plus, l'abondance relative des Bifidobacteries et lactobacilles a augmenté en comparaison avec le prébiotique seul (voir condition CB-GF de la Figure 4). Le probiotique Clostridium butyricum était encore présent dans le jus de fermentation après 48h de fermentation. Un effet anti-inflammatoire est montré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport au GOS/FOS seul, tandis que la concentration d'IL-8 n'était pas différent par rapport au témoin-mucine (voir condition CB-GF de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique Cl montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation de ces populations bactériennes a été analysée par qPCR (voir condition CB +
G/F
de la Figure 6 et Tableau 6 présentés plus haut). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
Exemple 7: Composition symbiotique C2 comprenant au moins Bifidobacterium thermophilum et au moins l'inuline contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C2 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium thermophilum et 0,1 g d'inuline.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g d'inuline a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation.
Au niveau du probiotique Bifidobacterium thermophilum, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C2 comprenant Bifidobacterium thermophilum (BT) et de l'inuline (Inu) contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à l'inuline seule (voir condition BT-Inu du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate et l'abondance relative des bifidobactéries dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BT-Inu de la Figure 4), Bifidobacterium thermophilum était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport à
l'inuline seule (pas de différence entre le symbiotique et le témoin-mucine) selon le protocole décrit à l'exemple 1 (voir condition BT-Inu de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique C2 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BT + INU de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1. En parallèle, une analyse des AGV (Figure 7) a pu montrer une tendance à l'augmentation du valérate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p =
0.066) et une tendance à l'augmentation des AGV totaux dans l'iléon (p =
0.090).
Exemple 8: Composition symbiotique C3 comprenant au moins Bifidobacterium animalis lactis et au moins 2'FL contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C3 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium animalis lactis et 0,1 g de 2'FL.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de 2'FL a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation.
Au niveau du probiotique Bifidobacterium animais lactis, une poudre lyophilisée de bactérie ci été pré-mixée dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C3 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à 2'FL seule (voir condition Bal-2FL du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate (voir condition BAL-2FL du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters IV
dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BAL-2FL de la Figure 4), Bifidobacterium animalis lactis était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 (voir condition BAL-2FL de la Figure 2) par rapport à 2'FL seul et par rapport au témoin-mucine selon le protocole de l'exemple 1.
De plus, la composition symbiotique 03 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes de bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été
mesurée par qPCR (voir condition BAL + 2FL de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR
l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1. En parallèle, une analyse des acides gras volatiles (AGV) (Figure 8) a pu montrer une augmentation significative de l'acétate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.034) et dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.023). Une tendance à l'augmentation de l'acétate dans le fermenteur mimant le colon ascendant (p = 0.075) et une tendance à la diminution de l'isobutyrate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p =
0.076) et colon ascendant (p = 0.095) ont également été observées.
Exemple 9 : Composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C4 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium crudilactis et 0,1 g de beta-glucane.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de beta-glucane a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium animalis lactis, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation.
Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à
une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition BCU-BG du Tableau 3).
En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate (voir condition BCU-BG du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters XI Va dans le jus de fermentation est démontré (voir condition BCU-BG de la Figure 4). Un effet anti-inflammatoire est démontré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d' IL-8 par rapport au beta-glucane seule et par rapport au témoin-mucine selon le protocole décrit à
l'exemple 1 (voir condition BCU-BG de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique 04 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une Tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BC + BG de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 9) a montré une diminution significative de l'isobutyrate (p = 0.018) dans les fermenteurs iléons et colons ascendants tandis qu'une tendance à la baisse des AGV totaux a été observée dans le colon ascendant (p = 0.058).
Exemple 10: Composition symbiotique C5 comprenant Enterococcus faecium et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
La composition symbiotique 05 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition EF-BG du Tableau 3).
En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate dans le jus de fermentation est démontré (voir condition EF-BG du Tableau 4).
De plus, la composition symbiotique C5 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition EF + BG
de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 10) a montré une diminution significative du valérate dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.0096). Une tendance à la diminution de l'isovalérate a également été observée dans l'iléon (p = 0.099) et dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.052).
Exemple 11: Compositions symbiotiques administrées in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement Le tableau 7 ci-dessous décrit les différentes compositions symbiotiques (SYN) donnée in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou aux porcelets en allaitement.
Tableau 7.- Différentes compositions symbiotiques (SYN) testées in vivo.
Exemples Compositions Probiotique Prébiotique SYN
donné à
(SYN) Ex. 13 SYN 1 C. butyricum Inuline Truie Ex. 14 SYN 1 C. butyricum GOS/FOS Porcelet en allaitement Ex. 15 SYN 2 B. anima lis Inuline Truie lactis Ex. 16 SYN 2 B. animalis 2'FL Porcelet en lactis allaitement Ex. 17 SYN 3 E. faecium Beta-glucane Truie Ex. 18 SYN 3 E. faecium Beta-glucane Porcelet en allaitement Ex. 19 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane Truie Ex. 20 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane Porcelet en allaitement Ex. 21 SYN 5 B. Inuline Truie thermophilum Ex. 22 SYN 5 B. Inuline Porcelet en thermophilum allaitement Exemple 12: Protocole de supplémentation in vivo aux truies et aux porcelets.
La supplémentation en symbiotique des truies a commencé à partir du 80ème jour de gestation et elle a été distribuée manuellement sous forme de portion directement ajoutée dans l'assiette de chaque truie (top feeding) une fois par jour avec un repas. La supplémentation du symbiotique a continué pendant toute la période de lactation (d'allaitement) de trois semaines. Les symbiotiques ont été préparés, c'est-à-dire mélangés à un aliment standard de croissance, juste avant le début des expériences et conservés dans un endroit frais et sec. Un groupe de truies non supplémentées a été utilisé comme groupe de référence/contrôle pour la comparaison. Les truies ont été distribuées en différents groupes selon leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale entre les groupes (4). Après 80 jours de gestation, les truies ont été placées dans des enclos individuels avec une alimentation individuelle distribuée automatiquement deux fois par jour.
Après 115 jours de gestation, les truies ont été transférées dans des loges de mise-bas individuelles. Les truies étaient nourries deux fois par jour avec une distribution automatique et avaient un accès illimité à l'eau en appuyant sur un bouton au-dessus de leur assiette. La supplémentation des compositions symbiotiques (exemples 13, 15, 17, 19,21 du tableau 7) était effectuée une fois par jour le matin.
Le tableau 8 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux truies en fonction du stade de développement (gestation ou allaitante).
Tableau 8.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux truies.
Dose probiotique mono- Dose prébiotique souche (CFU/truie/jour) (g/truie/jour) Gestation (G80-2,175E+10 12,325 insémination) allaitante (semaine 1) 1,6125E+10 9,1375 allaitante (semaine 2) 3,75E+10 21,25 allaitante (semaine 3) 3,375E+10 19,125 Les combinaisons symbiotiques sélectionnées consistaient en une seule souche de probiotique avec un seul prébiotique (voir exemples 13 (SYN
1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7). Les combinaisons symbiotiques qui comprenaient un oligosaccharide du lait comme prébiotique ont été remplacées par de l'inuline pour la supplémentation des truies.
Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indiquent les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Pendant la phase d'allaitement, les porcelets restaient avec leur mère dans des enclos de maternité dont le sol était recouvert d'un grillage en plastique.
Les porcelets avaient un accès illimité à la tétée et, à partir du premier jour après la naissance, une assiette fixée au sol était placée dans chaque enclos. Pendant la première semaine suivant la naissance, les porcelets ont reçu une fois par jour un substitut de lacto-remplaceur. Pendant les deuxième et troisième semaines de lactation, les porcelets ont reçu un aliment humide de transition.
La supplémentation symbiotique des porcelets a commencé le lendemain de la naissance, chaque loge de maternité a reçu un complément de lacto-remplaceur dans une assiette fixée au sol. La supplémentation du symbiotique s'est poursuivie pendant toute la période d'allaitement de trois semaines. La supplémentation symbiotique a été interrompue au moment du sevrage. Ainsi, aucune supplémentation symbiotique n'a été donnée aux porcelets pendant la période post-sevrage. Les portées/porcelets qui ont reçu les symbiotiques ont été
comparées aux portées/porcelets non supplémentés.
Les solutions prébiotiques (dissoutes dans l'eau potable) ont été
préparées une fois par semaine et conservées au réfrigérateur (+4 C). La poudre de probiotiques et la solution de prébiotiques étaient fraîchement mélangées chaque jour juste avant la distribution. Les compositions symbiotiques ont été
administrées à
une dose établie pour une portée moyenne de 15 porcelets recevant 2 ml de symbiotique par porcelet et par jour pendant la première semaine, et 4 ml par porcelet et par jour de la deuxième semaine jusqu'au sevrage. La composition symbiotique a été distribuée aux porcelets en l'administrant dans l'aliment d'allaitement qui leur a été donné pendant la première semaine et avec l'aliment liquide de transition humide jusqu'au sevrage.
Le tableau 9 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux porcelets en fonction du stade de développement.
Tableau 9.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux porcelets.
Stade de Mélange SYN 1, 2, 5 (Exemples 14, 16, 22) développement du symbiotique porcelet (ml/portée) Probiotique Prébiotique (g/m1) (CFU/ml) Semaine 1 30 3E09 0,4 Semaine 2 60 3E09 0,4 Semaine 3 60 3E09 0,4 SYN 3 et 4 (Exemples 18, 20) Probiotique Prébiotique (g/ml) (CFU/ml) Semaine 1 60 1,5E09 0,1 Semaine 2 120 1,5E09 0,1 Semaine 3 120 1,5E09 0,1 Exemples 13 à 22: Différentes compositions symbiotiques administrées in vivo aux truies et aux porcelets.
Les exemples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées à la truie en gestation ou allaitante. Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Exemples 23 à 43: Impact de différents protocoles d'administration d'une composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement sur différents critères zootechniques du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
A la naissance, les porcelets ont été comptés (vivants, morts et momifiés) et le poids total de la portée des porcelets vivants a été
enregistré. Un jour avant le sevrage, les porcelets ont été comptés et le poids total de la portée des porcelets vivants a été enregistré. Les porcelets ont été sevrés trois semaines après la mise bas, à l'âge de 21 jours environ. Au moment du sevrage, les porcelets ont été
transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement, réorganisés selon le sexe (mâle ou femelle) et la taille (petit, moyen, grand) en groupes d'environ 25 porcelets par enclos. Deux semaines après le sevrage, les porcelets ont été
comptés et pesés.
Le tableau 10 ci-dessous indique les différents protocoles d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement.
Tableau 10.- Différents protocoles/profils d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet.
Exemples SYN donné à la truie SYN donné au porcelet Ex. 23 Contrôle Contrôle Ex. 24 Contrôle SYN 1 Ex. 25 SYN 1 Contrôle Ex. 26 SYN 1 SYN 1 Ex. 27 Contrôle SYN 2 Ex. 28 SYN 2 Contrôle Ex. 29 SYN 2 SYN 2 Ex. 30 Contrôle Contrôle Ex. 31 Contrôle SYN 3 Ex. 32 SYN 3 Contrôle Ex. 33 SYN 3 SYN 3 Ex. 34 Contrôle SYN 4 Ex. 35 SYN 4 Contrôle Ex. 36 SYN 4 SYN 4 Ex. 37 Contrôle Contrôle Ex. 38 Contrôle SYN 2 (moitié de la dose) Ex. 39 Contrôle SYN 2 Ex. 40 Contrôle SYN 5 (moitié de la dose) Ex. 41 Contrôle SYN 5 Ex. 42 SYN 5 Contrôle Ex. 43 SYN 5 SYN 5 Le tableau 7 indique la composition en prébiotique et en probiotique de chaque SYN indiquée au tableau 10. Les tableaux 8 et 9 reprennent les doses administrées.
Différents critères zootechniques ont été mesurés sur le porcelet en allaitement et sur le porcelet en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration des différentes compositions symbiotiques. Ces différents critères zootechniques sont :
- le poids du porcelet (kg) (voir tableau 11) - la gain quotidien moyen, GQM (g/jour) (voir tableau 12) - la quantité (score) de diarrhée (%) (voir tableau 13) Les scores de diarrhées ont été mesurés en attribuant à chaque loge/portée le score le plus élevé selon l'échelle de score de diarrhée basée sur la consistance des matières fécales. L'échelle de cotation utilisée comprenait cinq catégories : score 0 - granule dur: 1 - granule mou et sec: 2 - granule humide/forme molle ; 3 - granule mou et non formé ; 4 - aqueux. Seul le score 4 était considéré
comme une diarrhée. Les observations de la diarrhée ont eu lieu deux fois pendant l'expérience, 3 jours avant le sevrage et 10 jours après le sevrage. Les jours d'observation des scores de diarrhée ont été choisis pour ne pas coïncider avec la pesée des porcelets ni avec la collecte des matières fécales afin d'éviter d'interférer avec les résultats en raison du stress causé par les manipulations sur les porcelets.
Le tableau 11 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 11.- Poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN SYN donné
donne Poids (kg) Poids (kg) au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy. ET p-value Contrôle Contrôle 11 5,6 0,6 6 10,0 1,2 Contrôle Synl 12 6,0 0,7 0,9856 0,36 10,1 1,3 0,8543 0,1 Synl Contrôle 14 5,8 0,8 0,9648 0,26 10,6 0,9 0,9970 0,6 Synl Synl 13 6,0 0,7 0,6792 0,46 11,1 1,1 0,0199 1,1 Contrôle Syn2 12 6,4 0,9 0,1270 0,86 10,7 1,3 0,9716 0,7 Syn2 Contrôle 14 5,9 0,5 0,7503 0,36 10,6 1,1 0,9645 0,6 Syn2 Syn2 15 5,8 0,6 0,8317 0,26 10,0 1,3 0,0009 -0,1 Contrôle Contrôle 12 5,6 0,8 6 8,1 1,6 Contrôle Syn3 6 5,5 1,4 1,0000 -0,2 4 7,9 1,9 0,9821 -0,3 Syn3 Contrôle 9 6,2 0,6 0,0508 0,55 8,0 1,2 0,4736 -0,1 Syn3 Syn3 12 5,9 0,8 0,7338 0,26 8,6 1,4 0,1794 0,5 Contrôle Syn4 10 5,4 1,0 0,8969 -0,26 8,2 1,2 0,0983 0,1 Syn4 Contrôle 7 5,8 0,5 0,9773 0,1 5 8,3 1,1 0,2384 0,2 Syn4 Syn4 13 5,5 1,0 0,9975 -0,1 6 8,0 1,5 0,6675 -0,1 Contrôle Contrôle 11 6,0 0,8 6 8,0 1,7 Contrôle Syn2 dosel :2 13 5,6 0,6 0,8171 -0,4 6 7,7 1,4 0,8340 -0,3 Contrôle Syn2 11 6,0 0,9 0,4493 0,06 7,4 1,2 0,9194 -0,6 Contrôle Syn5 dose 1:2 15 5,4 0,9 1,0000 -0,6 6 8,2 1,4 0,0974 0,2 Contrôle Syn5 13 5,8 0,9 0,9950 -0,26 8,1 1,6 0,0435 0,1 Syn5 Contrôle 14 5,6 0,6 0,9966 -0,46 7,7 1,3 0,9995 -0,3 Syn5 Syn5 13 5,5 0,7 0,8647 -0,56 7,6 1,2 0,1535 -0,4 Certains profils d'administration de compositions symbiotiques, comme SYN 1 et SYN 2 (exemple 26 ou 29) (voir tableau 10), permettent une augmentation significative du poids du porcelet par rapport à la condition contrôle en phase de post-sevrage ou en phase d'allaitement (voir par exemple SYN 3 à
l'exemple 32). Les compositions symbiotiques impliquant SYN 5 (Exemples 40 à
43) sont des contre-exemples montrant que certaines compositions symbiotiques ne seront pas forcément positives pour la prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Le tableau 12 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le gain quotidien moyen (GQM) du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 12.- GQM du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
SYN ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN donné
donne GQM (g/jour) GQM (g/jour) . au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy.
ET p-value Contrôle Contrôle 11 198 29 6 240 16 Contrôle Synl 12 206 36 0,9767 8,46 236 25 0,8573 -3,4 Synl Contrôle 14 207 39 0,9625 8,8 6 244 9 0,9975 4,7 Synl Synl 13 215 36 0,6572 16,56 268 18 0,0190 28,6 Contrôle Syn2 12 229 31 0,0979 30,96 244 15 0,9752 4,8 5yn2 Contrôle 14 213 22 0,7483 15,26 243 19 0,9684 3,8 Syn2 Syn2 15 211 27 0,8331 13,06 218 19 0,0009 -22,0 Contrôle Contrôle 12 198 28 6 144 27 Contrôle Syn3 6 190 65 1,0000 -7,34 151 22 0,6828 7,9 Syn3 Contrôle 9 226 31 0,5058 28,65 120 57 0,9973 -23,7 Syn3 Syn3 12 209 33 0,9989 11,76 177 18 0,0028 33,4 Contrôle Syn4 10 188 47 0,9870 -9,66 179 9 0,0004 35,4 Syn4 Contrôle 7 205 26 0,9996 7,65 174 18 0,0058 31,0 Syn4 Syn4 13 194 42 0,9998 -3,46 161 24 0,0911 17,4 Contrôle Contrôle 11 219 34 6 135 50 Contrôle 5yn2 dosel :2 13 203 35 0,9194 -16,2 6 140 25 0,8417 4,8 Contrôle Syn2 11 220 38 0,8340 1,46 134 27 0,927 -0,9 Contrôle Syn5 dose 1:2 15 200 37 0,0435 -19,3 6 162 26 0,0987 27,0 Contrôle Syn5 13 212 42 0,0974 -7,46 164 31 0,0446 28,8 5yn5 Contrôle 14 210 29 0,9995 -9,06 132 25 0,9996 -2,6 Syn5 Syn5 13 202 26 0,1535 -17,56 150 20 0,1601 15,2 Les résultats du tableau 12 montrent que les profils d'administration impliquant SYN 1 (exemple 26), SYN 3 (exemples 32, 33) et SYN 4 (exemples 34-36) permettent un meilleur gain quotidien moyen du porcelet par rapport à la condition contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Le tableau 13 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le score de diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 13.- Diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN
donne Y S N donné Diarrhée (%) Diarrhée (%) au porcelet à la truie NON OUI
N P- N
NON OUI P-value value Contrôle Contrôle 11 73%27% 6 100% 0%
Contrôle Synl 12 86% 14% 0,4203-13% 6 100% 0%>0,9999 0%
Synl Contrôle 14 93% 7% 0,9013 -20% 6 100% 0% >0,9999 0%
Synl Synl 13 85%15% 0,1729-12% 6 83% 17% >0,9999 17%
Contrôle Syn2 12 75%25% 0,4749 -2% 6 100% 0% 0,2963 0%
Syn2 Contrôle 14 86% 14% 0,4203 -13% 6 100% 0% >0,9999 0%
Syn2 Syn2 15 80%20% 0,6637 -7% 6 67%33% 0,1213 33%
Contrôle Contrôle 12 75%25% 6 67%33%
Contrôle Syn3 6 100% 0% 0,1797 -25% 4 75% 25% 0,7782 -8%
Syn3 Contrôle 9 67%33% 0,7805 8% 5 60%40% 0,1213 7%
Syn3 Syn3 12 58%42% 0,6757 17% 6 100% 0% 0,8190-33%
Contrôle Syn4 10 80%20% 0,3865 -5% 6 100% 0% 0,1213-33%
Syn4 Contrôle 7 75% 25% >0,9999 0% 5 80% 20% 0,6210 -13%
Syn4 Syn4 13 94% 6% 0,1414-19% 6 100% 0% 0,1213-33%
Contrôle Contrôle 11 60% 40% 6 83% 17%
Contrôle Syn2 dosel :2 13 71%29% 0,5176-11% 6 100% 0% 0,2963-17%
Contrôle Syn2 11 47% 53% 0,4642 13% 6 67% 33% 0,5050 17%
Contrôle Syn5 dose 1:215 86% 14% 0,1216 -26% 6 83% 17%>0,9999 0%
Contrôle 5yn5 13 77% 23% 0,3389 -17% 6 67% 33% 0,5050 17%
Syn5 Contrôle 14 93% 7% 0,0309 -33% 6 50% 50% 0,2207 33%
Syn5 Syn5 13 60% 40% >0,9999 0%6 83% 17% >0,9999 0%
Les profils d'administration impliquant SYN 3 et SYN 4 permettent une réduction des diarrhées sévère (score 4) du porcelet par rapport à un porcelet contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Ces résultats montrent qu'en fonction de la composition symbiotique et en fonction du profil d'administration, certaines compositions auront un impact positif direct (par rapport à la condition contrôle) sur les critères zootechniques pour porcelet en allaitement tandis que d'autres auront un effet de rémanence en ayant un impact positif plus marqué sur les critères zootechniques pour le porcelet en post-sevrage.
Exemple 44: Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. but yricum, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voir Tableau 14).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : avant mise bas, une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas,3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Au 76e jour de gestation, les truies ont été pesées. Les truies ont ensuite été réparties dans trois groupes différents en fonction de leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale dans tous les groupes.
Le jour 80 après l'insémination, les truies ont été placées dans des enclos individuels.
Au 107e jour de gestation, les truies ont été pesées. Au 108e jour de gestation, les truies ont été transférées dans des cases individuelles dans la maternité.
La mise-bas a été planifiée pour le jour 115 de la gestation avec une injection de Pianote et l'involution utérine a été facilitée par une injection de dinolytic après la mise bas.
A la naissance, les porcelets ont été comptés et leur poids individuel a été enregistré. Les porcelets étaient logés avec les truies dans des loges de maternité
avec un accès continu à la tétée. Dès le premier jour, après que toutes les truies aient fini de mettre bas, la taille des portées a été équilibrée au moyen d'adoptions entre les portées d'un même traitement. Les porcelets ont été pesés individuellement chaque semaine. Dans cette expérience, les porcelets ont été sevrés quatre semaines après la mise bas, à environ 28 jours d'âge. Au moment du sevrage, une sélection de 2 mâles et de 2 femelles de la même portée a été effectuée en fonction du poids corporel moyen dans le traitement. Lorsque cela n'était pas possible, on a choisi des porcelets de poids et de sexe appropriés provenant d'une autre portée du même groupe de traitement. Les porcelets sélectionnés ont été transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement.
Pendant la période de post-sevrage, ils ont reçu une alimentation dépourvue de tout complément alimentaire (dépourvu de toute composition symbiotique). Les porcelets ont été contrôlés quotidiennement le matin pour vérifier leur état de santé général et surveiller l'apparition de diarrhées. Les mangeoires étaient remplies selon les besoin. Les enclos étaient nettoyés à l'eau tous les jours.
Une fois par semaine, les porcelets étaient pesés et la consommation d'aliments était notée.
Tableau 14.- Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. butyricum, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
Probiotique Prébiotique SYN 6 E. faecium C. but yricum Beta-glucane Inuline (CFU/truie/jour) (CFU/truie/jour) (g/truie/jour) (g/truie/jour) (avant mise bas, MB) 1,60E+09 1,60E+09 1,60 9,60 MB+1sem. 1,20E+09 1,20E+09 1,20 7,20 MB+2sem. 2,75E+09 2,75E+09 2,75 16,50 MB+3sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00 MB+4sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00 MB : mise-bas ; G : jour de gestation Les 5 stades de développement sont G80-G107 (entre 80 jours et 107 jours de gestation, avant mise bas), 1 semaine après mise bas, 2 semaines après mise base, 3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Exemple 45 : Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium, B. animalis lactis, B. crudilactis, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voir Tableau 15).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : G80-G107 (entre 80 et 107 jours de gestation, avant mise bas, MB), une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas et semaines après mise bas.
Tableau 15.- Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium, B. animalis lactis, B. crudifactis, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
, Pro biotiq ue Prébiotique E. B. an imalis Beta B. crudilactis Inuline SYN 7 faecium lac tis glucane (CFU/truie/jo (g/truie/j (CFU/truie (CFU/truie/jo (g/truie/jo ur) our) /jour) ur) ur) (avant mise bas, MB) 1,07E+09 1,07E+09 1,07E+09 1,60 9,60 MB+1sem. 8,00E+08 8,00E+08 8,00E+08 1,20 7,20 MB+2sem. 1,83E+09 1,83E+09 1,83E+09 2,75 16,50 MB+3sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00 MB+4sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00 MB : mise-bas ; G : jour de gestation Exemple 46: Composition symbiotique contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo au porcelet Dans un essai in vivo (première expérience), le symbiotique 1 (SYN 1) est composé de Clostridium but yricum et GOS/FOS (80/20) et le symbiotique 2 (SYN
2) est composé de B. animalis lactis et 2'FL (voir Tableau 16). La condition contrôle était juste de l'eau potable. De manière contrôlée, les porcelets ont ingéré
une quantité déterminée de symbiotique, qui a augmenté avec l'âge. La composition symbiotique a été préparé quotidiennement en mélangeant un mélange prébiotique de 0,4 g de prébiotique par ml dans l'eau potable avec le probiotique correspondant (6E08 CFU/ml). Le mélange prébiotique de GOS/FOS contenait 0,32 g/ml de GOS et 0,08 g/ml de FOS selon les proportions des oligosaccharides du lait de truie. La solution prébiotique a été préparée chaque semaine et stockée à
+4 C
jusqu'à son utilisation. Avant l'administration, les mélanges symbiotiques ont été
amenés à température ambiante. Les compositions symbiotiques ont été
administrées dès la naissance, à des intervalles de plus en plus rapprochés et à des doses croissantes avec l'âge, jusqu'au sevrage au 28e jour postnatal (voir tableau 16). Aucune composition symbiotique n'a été administrée pendant la période de post-sevrage. Les volumes des compositions symbiotiques administrés étaient les suivants :
- 1,25 ml/porcelet jusqu'au samedi compris qui suit, - 1,75 ml/porcelet les deux jours suivants, - 2,5 ml/porcelet jusqu'au vendredi inclus de la semaine suivante, - 3,75 ml/porcelet la deuxième semaine dès le lundi, - 5 ml/porcelet ensuite dès le lundi de la troisième semaine.
Tableau 16.- Volumes et doses de compositions symbiotiques administrées aux porcelets durant la phase de lactation de la naissance au sevrage (J28).
Åge en jours Volume SYN 1 SYN 2 (i) (ml) C. GOS FOS (0,08 B. 2'FL
(0,4 butyricum (0,32 g/m1) animalis g/m1) (6E08 g/m1) lactis CFU/ml) (6E08 CFU/m1) Naissance, 1,25 7,50E08 0,49 0,1 g 7,50E08 0,59 jl, j2, j3 CFU CFU
j4, j5 1,75 1,05E09 0,56 g 0,14 g 1,05E09 0,7 g CFU CFU
j6, Fe., j9 2,5 1,50E09 0,8 g 0,2 g 1,50E09 1 g CFU CFU
j12, j14, j16 3,75 2,25E09 1,2 g 0,3 g 2,25E09 1,5 g CFU CFU
jl 9, j22, j26 5 3,00E09 1,6 g 0,4 g 3,00E09 2 g CFU CFU
On a observé que l'administration d'une composition symbiotique comprenant plusieurs probiotiques, comme SYN 6 ou SYN 7 (exemples 44 et 45), ne permet pas une plus grande prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, ni un plus grand gain quotidien moyen du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport à une composition comprenant un seul probiotique, comme SYN1 ou SYN 2 (exemple 46), ou par rapport à une condition contrôle (porcelet contrôle) n'ayant pas reçu de composition symbiotique. De plus, les compositions symbiotiques SYN 6 et SYN 7 augmentent la quantité de diarrhée (score 4) du porcelet en allaitement de respectivement 10% et 17% par rapport à la condition contrôle.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
CE-=S 3,763 0,267 0,0207 3,629 3,193 <0,0001 1,461 0,103 <0,0001 0.332 0,360 0:0002 9,185. .3,618 0,0004 -ECU-RS .2,253 0,453 0,1109 2, 22 0,326 3,0479 0,521 0,060 0,837 0.039 0,0.33 7.,'õ856 0,98311 gliirxrie 0.609 0,075 2,820 3,032 0,056 0,009 0,023 0,033 1,485 0,099 -tJ
BAI-BG 1.389 0,322 0,0116 1,3.79 3,090 0,00' 6 0,045 0,039 0,9994 0,005 0,008 0,9806 2,818 2,300 0,0144 n.) LP-.13G 1,304 35 0,78.25 1,527 0,076 3,000.?. 0,115 0,062 0,8436 C ;003 >0,9999 2,946 is.,253 0,0082 _1 EF-BG
1.723 0,049 0,00.7 1,972 0,018 <:0..02:2:' 0,231 0,011 0,1192 0,033 0.320 0,0543 3,960 :"..,379 0,0002 ree EC.L.-EG 1.554 0,433 0,0033 2,042 3,274 <0,0001 0,346 0,190 0,01 0,022 0,024 0,2327 3,964 3,910 0,0002 111 cet La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été réalisée à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0,1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett.
Lorsque p <0,05 : * ; p <0,01 : ** ; p <0,001 : *** ; p < 0,0001 :
Example 2: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques L'abondance relative des bactéries bénéfiques après 24h de fermentation sont présentés dans la figure 4. La méthode de delta-delta CT a été
utilisée pour exprimer les bactéries cibles par rapport aux bactéries totales.
Les résultats des symbiotiques sont comparés par rapport aux prébiotiques seuls.
Comme l'indique la figure 4, plusieurs compositions symbiotiques, comme BT-GF, CB-GF, BCO-GF, BCU-2FL, BMO-2FL, BAL-2FL, BAL-Inu, BT-Inu, CB-RS, BCU-RS, BAL-BG, LP-BG, ou BCU-BG, permettent d'augmenter de manière significative l'abondance relative des bactéries bénéfiques à 24h de fermentation.
Exemple 3: Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s'établir pendant la fermentation La figure 5 montre la présence des probiotiques dans le jus de fermentation après 12, 24 et 48h de fermentation. Des compositions symbiotiques, comme BT-Inu, permettent un bon établissement et une bonne capacité de survie du probiotique.
Exemple 4: Détermination de l'effet immunomodulateur de la composition symbiotique par quantification de la production d'IL-8 et NO par des cellules IPEC-J2.
La production d'IL-8 dans les cellules IPEC-J2 a été mesurée par un test ELISA.
Après 24h d'incubation, la réponse immunitaire a été évaluée en mesurant la production d'IL-8 dans le milieu de culture cellulaire. Les cellules IPEC-J2 ont été incubées avec 0,8% (V/V) de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration. De plus, le taux de survie des cellules IPEC-J2 est supérieur ou égal à 70%
dans toutes les conditions testées de jus de fermentation.
Pour déterminer l'impact de la composition symbiotique contenue dans le jus de fermentation sur la production d' IL-8, le taux de production d'IL-8 a été mesuré dans une condition contrôle où le jus de fermentation contient un inoculat de fèces, de la mucine (témoin-mucine), mais en absence de probiotiques, de prébiotiques ou de symbiotiques. Dans cette condition contrôle, un niveau de base d'expression d'IL-8 est de 932 pg/ml (représenté par la ligne horizontale à la figure 2). Les pré- et symbiotiques ont été comparés par rapport au témoin-mucine.
En plus les symbiotiques ont été comparés par rapport au prébiotique pour estimer l'effet additionnel de probiotique. Le tableau 5 montre les p-valeurs de ces comparaisons, et la figure 2 montre les concentrations d' 1L8.
Tableau 5.- Production d'IL-8 par les cellules IPEC-J2 dans le surnageant après 24h d'incubation avec 0,8% de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration produit par la composition symbiotique ou le prébiotique seul.
IL-8 (pg/ml) p-valeur moyenne ET
(vs prébiotique) (vs blanc-mucine) GOS/FOS (CE) 1094,0 40,5 0,0421 BCO-GF 897,3 96,3 0,0041 0,9207 BT-GF 1089,4 89,8 0,9999 0,0497 CB-GF 849,5 59,4 0,0006 0,3954 EF-GF 927,5 40,6 0,0138 0,9997 2'FL 1041,2 52,6 0,2193 BAL-2FL 581,3 81,1 <0,0001 <0,0001 BCU-2FL 570,8 81,8 <0,0001 <0,0001 BMO-2FL 715,1 41,5 <0,0001 0,0037 INULINE (Inu) 1116,4 40,9 0,0258 BAL-Inu 1177,7 112,6 0,4075 0,004 BT-Inu 1025,9 31,4 0,1816 0,3398 Amidon résistant (RS) 753,3 50,9 0,0086 BCU-RS 1150,3 38,9 <0,0001 0,003 CB-RS 1195,6 61,3 <0,0001 0,0007 13-GLUCANE 831,7 40,5 0,1916 BAL-BG 393,6 30,0 <0,0001 <0,0001 BCU-BG 413,2 46,4 <0,0001 <0,0001 EF-BG 1128,9 60,0 <0,0001 0,0066 LP-BG 775,7 106,0 0,5405 0,0232 blanc-mucine 937,1 110,8 Les valeurs sont corrigées en fonction de la viabilité cellulaire. Les résultats sont des moyennes avec leurs écart-types. Les comparaisons sont réalisées entre les compositions symbiotiques et le prébiotique seul. Les significativités statistiques sont analysées par une ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett. Lorsque p<0,05 :*; p<0,01 : ** ; p<0,001 :*** ;
p<0,0001 :
Exemple 5: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle baby SPIME en présence de différentes compositions symbiotiques.
Les résultats globaux obtenus sur le système baby SPIME sont présentés dans la figure 6 et le tableau 6.
Tableau 6.- Synthèse de la régulation à la hausse ou à la baisse de groupes bactériens d'intérêt suite au traitement symbiotique dans le système BABY-SPIME après une semaine de traitement avec les différents symbiotiques.
Test Lactobacillus Bifidobacterium Cluster IV
Cluster XIV Acetyl Wilcoxon CoA
Control Baisse Tendance à la Stable Stable Stable BABY- p<0,01 baisse SPIME 0,05<p<0,1 EF + BG Stable Tendance à la Baisse Stable Hausse baisse p = 0,01 p<0,05 0,05<p<0,1 BT + INU Stable Tendance à la Hausse Baisse Stable hausse p<0,05 (p = 0,05) 0,05<p<0,1 CB + Baisse Stable Stable Stable Hausse GOS/FOS p<0,01 p<0,01 BAL + 2FL Baisse Hausse Stable Stable Stable p<0,01 p<0,05 BCU + BG Baisse Tendance à la Hausse Tendance Stable p<0,01 hausse p<0,05 à la baisse 0,05<p<0,1 0,05<p<0,1 Nous retrouvons soit une diminution de la population bactérienne, soit une augmentation de la population bactérienne ou soit une stabilisation de la population bactérienne. Le test statistique réalisé est un test de Wilcoxon.
Exemple 6: Composition symbiotique Cl comprenant au moins Clostridium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition Cl en ajoutant 1E07 CFU/ml Clostridium but yricum et 0,1 g de GOS/FOS.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de GOS/FOS a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation. Pour le mélange GOS/FOS, le prébiotique consiste en une solution liquide homogène de 80% (p/p) de GOS et 20% (p/p) de FOS. Au niveau du probiotique, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté
au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation.
Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique comprenant au moins Clostriciium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale a montré un effet favorable sur la fermentation, en augmentant la valeur A (production maximale de gaz) par rapport au prébiotique seul (voir condition CB-GoF du Tableau 3, et en augmentant les concentrations de SCFAs totales et butyrate après 24 heures de fermentation statique in vitro (voir condition CB-GoF du Tableau 4). En plus, l'abondance relative des Bifidobacteries et lactobacilles a augmenté en comparaison avec le prébiotique seul (voir condition CB-GF de la Figure 4). Le probiotique Clostridium butyricum était encore présent dans le jus de fermentation après 48h de fermentation. Un effet anti-inflammatoire est montré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport au GOS/FOS seul, tandis que la concentration d'IL-8 n'était pas différent par rapport au témoin-mucine (voir condition CB-GF de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique Cl montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation de ces populations bactériennes a été analysée par qPCR (voir condition CB +
G/F
de la Figure 6 et Tableau 6 présentés plus haut). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
Exemple 7: Composition symbiotique C2 comprenant au moins Bifidobacterium thermophilum et au moins l'inuline contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C2 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium thermophilum et 0,1 g d'inuline.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g d'inuline a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation.
Au niveau du probiotique Bifidobacterium thermophilum, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C2 comprenant Bifidobacterium thermophilum (BT) et de l'inuline (Inu) contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à l'inuline seule (voir condition BT-Inu du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate et l'abondance relative des bifidobactéries dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BT-Inu de la Figure 4), Bifidobacterium thermophilum était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport à
l'inuline seule (pas de différence entre le symbiotique et le témoin-mucine) selon le protocole décrit à l'exemple 1 (voir condition BT-Inu de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique C2 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BT + INU de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1. En parallèle, une analyse des AGV (Figure 7) a pu montrer une tendance à l'augmentation du valérate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p =
0.066) et une tendance à l'augmentation des AGV totaux dans l'iléon (p =
0.090).
Exemple 8: Composition symbiotique C3 comprenant au moins Bifidobacterium animalis lactis et au moins 2'FL contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C3 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium animalis lactis et 0,1 g de 2'FL.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de 2'FL a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation.
Au niveau du probiotique Bifidobacterium animais lactis, une poudre lyophilisée de bactérie ci été pré-mixée dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C3 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à 2'FL seule (voir condition Bal-2FL du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate (voir condition BAL-2FL du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters IV
dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BAL-2FL de la Figure 4), Bifidobacterium animalis lactis était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 (voir condition BAL-2FL de la Figure 2) par rapport à 2'FL seul et par rapport au témoin-mucine selon le protocole de l'exemple 1.
De plus, la composition symbiotique 03 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes de bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été
mesurée par qPCR (voir condition BAL + 2FL de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR
l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1. En parallèle, une analyse des acides gras volatiles (AGV) (Figure 8) a pu montrer une augmentation significative de l'acétate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.034) et dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.023). Une tendance à l'augmentation de l'acétate dans le fermenteur mimant le colon ascendant (p = 0.075) et une tendance à la diminution de l'isobutyrate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p =
0.076) et colon ascendant (p = 0.095) ont également été observées.
Exemple 9 : Composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C4 en ajoutant 1E07 CFU/ml de Bifidobacterium crudilactis et 0,1 g de beta-glucane.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de beta-glucane a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium animalis lactis, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation.
Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à
une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition BCU-BG du Tableau 3).
En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate (voir condition BCU-BG du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters XI Va dans le jus de fermentation est démontré (voir condition BCU-BG de la Figure 4). Un effet anti-inflammatoire est démontré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d' IL-8 par rapport au beta-glucane seule et par rapport au témoin-mucine selon le protocole décrit à
l'exemple 1 (voir condition BCU-BG de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique 04 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une Tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BC + BG de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 9) a montré une diminution significative de l'isobutyrate (p = 0.018) dans les fermenteurs iléons et colons ascendants tandis qu'une tendance à la baisse des AGV totaux a été observée dans le colon ascendant (p = 0.058).
Exemple 10: Composition symbiotique C5 comprenant Enterococcus faecium et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
La composition symbiotique 05 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition EF-BG du Tableau 3).
En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate dans le jus de fermentation est démontré (voir condition EF-BG du Tableau 4).
De plus, la composition symbiotique C5 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition EF + BG
de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 10) a montré une diminution significative du valérate dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.0096). Une tendance à la diminution de l'isovalérate a également été observée dans l'iléon (p = 0.099) et dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.052).
Exemple 11: Compositions symbiotiques administrées in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement Le tableau 7 ci-dessous décrit les différentes compositions symbiotiques (SYN) donnée in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou aux porcelets en allaitement.
Tableau 7.- Différentes compositions symbiotiques (SYN) testées in vivo.
Exemples Compositions Probiotique Prébiotique SYN
donné à
(SYN) Ex. 13 SYN 1 C. butyricum Inuline Truie Ex. 14 SYN 1 C. butyricum GOS/FOS Porcelet en allaitement Ex. 15 SYN 2 B. anima lis Inuline Truie lactis Ex. 16 SYN 2 B. animalis 2'FL Porcelet en lactis allaitement Ex. 17 SYN 3 E. faecium Beta-glucane Truie Ex. 18 SYN 3 E. faecium Beta-glucane Porcelet en allaitement Ex. 19 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane Truie Ex. 20 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane Porcelet en allaitement Ex. 21 SYN 5 B. Inuline Truie thermophilum Ex. 22 SYN 5 B. Inuline Porcelet en thermophilum allaitement Exemple 12: Protocole de supplémentation in vivo aux truies et aux porcelets.
La supplémentation en symbiotique des truies a commencé à partir du 80ème jour de gestation et elle a été distribuée manuellement sous forme de portion directement ajoutée dans l'assiette de chaque truie (top feeding) une fois par jour avec un repas. La supplémentation du symbiotique a continué pendant toute la période de lactation (d'allaitement) de trois semaines. Les symbiotiques ont été préparés, c'est-à-dire mélangés à un aliment standard de croissance, juste avant le début des expériences et conservés dans un endroit frais et sec. Un groupe de truies non supplémentées a été utilisé comme groupe de référence/contrôle pour la comparaison. Les truies ont été distribuées en différents groupes selon leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale entre les groupes (4). Après 80 jours de gestation, les truies ont été placées dans des enclos individuels avec une alimentation individuelle distribuée automatiquement deux fois par jour.
Après 115 jours de gestation, les truies ont été transférées dans des loges de mise-bas individuelles. Les truies étaient nourries deux fois par jour avec une distribution automatique et avaient un accès illimité à l'eau en appuyant sur un bouton au-dessus de leur assiette. La supplémentation des compositions symbiotiques (exemples 13, 15, 17, 19,21 du tableau 7) était effectuée une fois par jour le matin.
Le tableau 8 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux truies en fonction du stade de développement (gestation ou allaitante).
Tableau 8.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux truies.
Dose probiotique mono- Dose prébiotique souche (CFU/truie/jour) (g/truie/jour) Gestation (G80-2,175E+10 12,325 insémination) allaitante (semaine 1) 1,6125E+10 9,1375 allaitante (semaine 2) 3,75E+10 21,25 allaitante (semaine 3) 3,375E+10 19,125 Les combinaisons symbiotiques sélectionnées consistaient en une seule souche de probiotique avec un seul prébiotique (voir exemples 13 (SYN
1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7). Les combinaisons symbiotiques qui comprenaient un oligosaccharide du lait comme prébiotique ont été remplacées par de l'inuline pour la supplémentation des truies.
Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indiquent les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Pendant la phase d'allaitement, les porcelets restaient avec leur mère dans des enclos de maternité dont le sol était recouvert d'un grillage en plastique.
Les porcelets avaient un accès illimité à la tétée et, à partir du premier jour après la naissance, une assiette fixée au sol était placée dans chaque enclos. Pendant la première semaine suivant la naissance, les porcelets ont reçu une fois par jour un substitut de lacto-remplaceur. Pendant les deuxième et troisième semaines de lactation, les porcelets ont reçu un aliment humide de transition.
La supplémentation symbiotique des porcelets a commencé le lendemain de la naissance, chaque loge de maternité a reçu un complément de lacto-remplaceur dans une assiette fixée au sol. La supplémentation du symbiotique s'est poursuivie pendant toute la période d'allaitement de trois semaines. La supplémentation symbiotique a été interrompue au moment du sevrage. Ainsi, aucune supplémentation symbiotique n'a été donnée aux porcelets pendant la période post-sevrage. Les portées/porcelets qui ont reçu les symbiotiques ont été
comparées aux portées/porcelets non supplémentés.
Les solutions prébiotiques (dissoutes dans l'eau potable) ont été
préparées une fois par semaine et conservées au réfrigérateur (+4 C). La poudre de probiotiques et la solution de prébiotiques étaient fraîchement mélangées chaque jour juste avant la distribution. Les compositions symbiotiques ont été
administrées à
une dose établie pour une portée moyenne de 15 porcelets recevant 2 ml de symbiotique par porcelet et par jour pendant la première semaine, et 4 ml par porcelet et par jour de la deuxième semaine jusqu'au sevrage. La composition symbiotique a été distribuée aux porcelets en l'administrant dans l'aliment d'allaitement qui leur a été donné pendant la première semaine et avec l'aliment liquide de transition humide jusqu'au sevrage.
Le tableau 9 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux porcelets en fonction du stade de développement.
Tableau 9.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux porcelets.
Stade de Mélange SYN 1, 2, 5 (Exemples 14, 16, 22) développement du symbiotique porcelet (ml/portée) Probiotique Prébiotique (g/m1) (CFU/ml) Semaine 1 30 3E09 0,4 Semaine 2 60 3E09 0,4 Semaine 3 60 3E09 0,4 SYN 3 et 4 (Exemples 18, 20) Probiotique Prébiotique (g/ml) (CFU/ml) Semaine 1 60 1,5E09 0,1 Semaine 2 120 1,5E09 0,1 Semaine 3 120 1,5E09 0,1 Exemples 13 à 22: Différentes compositions symbiotiques administrées in vivo aux truies et aux porcelets.
Les exemples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées à la truie en gestation ou allaitante. Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Exemples 23 à 43: Impact de différents protocoles d'administration d'une composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement sur différents critères zootechniques du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
A la naissance, les porcelets ont été comptés (vivants, morts et momifiés) et le poids total de la portée des porcelets vivants a été
enregistré. Un jour avant le sevrage, les porcelets ont été comptés et le poids total de la portée des porcelets vivants a été enregistré. Les porcelets ont été sevrés trois semaines après la mise bas, à l'âge de 21 jours environ. Au moment du sevrage, les porcelets ont été
transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement, réorganisés selon le sexe (mâle ou femelle) et la taille (petit, moyen, grand) en groupes d'environ 25 porcelets par enclos. Deux semaines après le sevrage, les porcelets ont été
comptés et pesés.
Le tableau 10 ci-dessous indique les différents protocoles d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement.
Tableau 10.- Différents protocoles/profils d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet.
Exemples SYN donné à la truie SYN donné au porcelet Ex. 23 Contrôle Contrôle Ex. 24 Contrôle SYN 1 Ex. 25 SYN 1 Contrôle Ex. 26 SYN 1 SYN 1 Ex. 27 Contrôle SYN 2 Ex. 28 SYN 2 Contrôle Ex. 29 SYN 2 SYN 2 Ex. 30 Contrôle Contrôle Ex. 31 Contrôle SYN 3 Ex. 32 SYN 3 Contrôle Ex. 33 SYN 3 SYN 3 Ex. 34 Contrôle SYN 4 Ex. 35 SYN 4 Contrôle Ex. 36 SYN 4 SYN 4 Ex. 37 Contrôle Contrôle Ex. 38 Contrôle SYN 2 (moitié de la dose) Ex. 39 Contrôle SYN 2 Ex. 40 Contrôle SYN 5 (moitié de la dose) Ex. 41 Contrôle SYN 5 Ex. 42 SYN 5 Contrôle Ex. 43 SYN 5 SYN 5 Le tableau 7 indique la composition en prébiotique et en probiotique de chaque SYN indiquée au tableau 10. Les tableaux 8 et 9 reprennent les doses administrées.
Différents critères zootechniques ont été mesurés sur le porcelet en allaitement et sur le porcelet en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration des différentes compositions symbiotiques. Ces différents critères zootechniques sont :
- le poids du porcelet (kg) (voir tableau 11) - la gain quotidien moyen, GQM (g/jour) (voir tableau 12) - la quantité (score) de diarrhée (%) (voir tableau 13) Les scores de diarrhées ont été mesurés en attribuant à chaque loge/portée le score le plus élevé selon l'échelle de score de diarrhée basée sur la consistance des matières fécales. L'échelle de cotation utilisée comprenait cinq catégories : score 0 - granule dur: 1 - granule mou et sec: 2 - granule humide/forme molle ; 3 - granule mou et non formé ; 4 - aqueux. Seul le score 4 était considéré
comme une diarrhée. Les observations de la diarrhée ont eu lieu deux fois pendant l'expérience, 3 jours avant le sevrage et 10 jours après le sevrage. Les jours d'observation des scores de diarrhée ont été choisis pour ne pas coïncider avec la pesée des porcelets ni avec la collecte des matières fécales afin d'éviter d'interférer avec les résultats en raison du stress causé par les manipulations sur les porcelets.
Le tableau 11 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 11.- Poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN SYN donné
donne Poids (kg) Poids (kg) au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy. ET p-value Contrôle Contrôle 11 5,6 0,6 6 10,0 1,2 Contrôle Synl 12 6,0 0,7 0,9856 0,36 10,1 1,3 0,8543 0,1 Synl Contrôle 14 5,8 0,8 0,9648 0,26 10,6 0,9 0,9970 0,6 Synl Synl 13 6,0 0,7 0,6792 0,46 11,1 1,1 0,0199 1,1 Contrôle Syn2 12 6,4 0,9 0,1270 0,86 10,7 1,3 0,9716 0,7 Syn2 Contrôle 14 5,9 0,5 0,7503 0,36 10,6 1,1 0,9645 0,6 Syn2 Syn2 15 5,8 0,6 0,8317 0,26 10,0 1,3 0,0009 -0,1 Contrôle Contrôle 12 5,6 0,8 6 8,1 1,6 Contrôle Syn3 6 5,5 1,4 1,0000 -0,2 4 7,9 1,9 0,9821 -0,3 Syn3 Contrôle 9 6,2 0,6 0,0508 0,55 8,0 1,2 0,4736 -0,1 Syn3 Syn3 12 5,9 0,8 0,7338 0,26 8,6 1,4 0,1794 0,5 Contrôle Syn4 10 5,4 1,0 0,8969 -0,26 8,2 1,2 0,0983 0,1 Syn4 Contrôle 7 5,8 0,5 0,9773 0,1 5 8,3 1,1 0,2384 0,2 Syn4 Syn4 13 5,5 1,0 0,9975 -0,1 6 8,0 1,5 0,6675 -0,1 Contrôle Contrôle 11 6,0 0,8 6 8,0 1,7 Contrôle Syn2 dosel :2 13 5,6 0,6 0,8171 -0,4 6 7,7 1,4 0,8340 -0,3 Contrôle Syn2 11 6,0 0,9 0,4493 0,06 7,4 1,2 0,9194 -0,6 Contrôle Syn5 dose 1:2 15 5,4 0,9 1,0000 -0,6 6 8,2 1,4 0,0974 0,2 Contrôle Syn5 13 5,8 0,9 0,9950 -0,26 8,1 1,6 0,0435 0,1 Syn5 Contrôle 14 5,6 0,6 0,9966 -0,46 7,7 1,3 0,9995 -0,3 Syn5 Syn5 13 5,5 0,7 0,8647 -0,56 7,6 1,2 0,1535 -0,4 Certains profils d'administration de compositions symbiotiques, comme SYN 1 et SYN 2 (exemple 26 ou 29) (voir tableau 10), permettent une augmentation significative du poids du porcelet par rapport à la condition contrôle en phase de post-sevrage ou en phase d'allaitement (voir par exemple SYN 3 à
l'exemple 32). Les compositions symbiotiques impliquant SYN 5 (Exemples 40 à
43) sont des contre-exemples montrant que certaines compositions symbiotiques ne seront pas forcément positives pour la prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Le tableau 12 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le gain quotidien moyen (GQM) du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 12.- GQM du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
SYN ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN donné
donne GQM (g/jour) GQM (g/jour) . au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy.
ET p-value Contrôle Contrôle 11 198 29 6 240 16 Contrôle Synl 12 206 36 0,9767 8,46 236 25 0,8573 -3,4 Synl Contrôle 14 207 39 0,9625 8,8 6 244 9 0,9975 4,7 Synl Synl 13 215 36 0,6572 16,56 268 18 0,0190 28,6 Contrôle Syn2 12 229 31 0,0979 30,96 244 15 0,9752 4,8 5yn2 Contrôle 14 213 22 0,7483 15,26 243 19 0,9684 3,8 Syn2 Syn2 15 211 27 0,8331 13,06 218 19 0,0009 -22,0 Contrôle Contrôle 12 198 28 6 144 27 Contrôle Syn3 6 190 65 1,0000 -7,34 151 22 0,6828 7,9 Syn3 Contrôle 9 226 31 0,5058 28,65 120 57 0,9973 -23,7 Syn3 Syn3 12 209 33 0,9989 11,76 177 18 0,0028 33,4 Contrôle Syn4 10 188 47 0,9870 -9,66 179 9 0,0004 35,4 Syn4 Contrôle 7 205 26 0,9996 7,65 174 18 0,0058 31,0 Syn4 Syn4 13 194 42 0,9998 -3,46 161 24 0,0911 17,4 Contrôle Contrôle 11 219 34 6 135 50 Contrôle 5yn2 dosel :2 13 203 35 0,9194 -16,2 6 140 25 0,8417 4,8 Contrôle Syn2 11 220 38 0,8340 1,46 134 27 0,927 -0,9 Contrôle Syn5 dose 1:2 15 200 37 0,0435 -19,3 6 162 26 0,0987 27,0 Contrôle Syn5 13 212 42 0,0974 -7,46 164 31 0,0446 28,8 5yn5 Contrôle 14 210 29 0,9995 -9,06 132 25 0,9996 -2,6 Syn5 Syn5 13 202 26 0,1535 -17,56 150 20 0,1601 15,2 Les résultats du tableau 12 montrent que les profils d'administration impliquant SYN 1 (exemple 26), SYN 3 (exemples 32, 33) et SYN 4 (exemples 34-36) permettent un meilleur gain quotidien moyen du porcelet par rapport à la condition contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Le tableau 13 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le score de diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 13.- Diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN
donne Y S N donné Diarrhée (%) Diarrhée (%) au porcelet à la truie NON OUI
N P- N
NON OUI P-value value Contrôle Contrôle 11 73%27% 6 100% 0%
Contrôle Synl 12 86% 14% 0,4203-13% 6 100% 0%>0,9999 0%
Synl Contrôle 14 93% 7% 0,9013 -20% 6 100% 0% >0,9999 0%
Synl Synl 13 85%15% 0,1729-12% 6 83% 17% >0,9999 17%
Contrôle Syn2 12 75%25% 0,4749 -2% 6 100% 0% 0,2963 0%
Syn2 Contrôle 14 86% 14% 0,4203 -13% 6 100% 0% >0,9999 0%
Syn2 Syn2 15 80%20% 0,6637 -7% 6 67%33% 0,1213 33%
Contrôle Contrôle 12 75%25% 6 67%33%
Contrôle Syn3 6 100% 0% 0,1797 -25% 4 75% 25% 0,7782 -8%
Syn3 Contrôle 9 67%33% 0,7805 8% 5 60%40% 0,1213 7%
Syn3 Syn3 12 58%42% 0,6757 17% 6 100% 0% 0,8190-33%
Contrôle Syn4 10 80%20% 0,3865 -5% 6 100% 0% 0,1213-33%
Syn4 Contrôle 7 75% 25% >0,9999 0% 5 80% 20% 0,6210 -13%
Syn4 Syn4 13 94% 6% 0,1414-19% 6 100% 0% 0,1213-33%
Contrôle Contrôle 11 60% 40% 6 83% 17%
Contrôle Syn2 dosel :2 13 71%29% 0,5176-11% 6 100% 0% 0,2963-17%
Contrôle Syn2 11 47% 53% 0,4642 13% 6 67% 33% 0,5050 17%
Contrôle Syn5 dose 1:215 86% 14% 0,1216 -26% 6 83% 17%>0,9999 0%
Contrôle 5yn5 13 77% 23% 0,3389 -17% 6 67% 33% 0,5050 17%
Syn5 Contrôle 14 93% 7% 0,0309 -33% 6 50% 50% 0,2207 33%
Syn5 Syn5 13 60% 40% >0,9999 0%6 83% 17% >0,9999 0%
Les profils d'administration impliquant SYN 3 et SYN 4 permettent une réduction des diarrhées sévère (score 4) du porcelet par rapport à un porcelet contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Ces résultats montrent qu'en fonction de la composition symbiotique et en fonction du profil d'administration, certaines compositions auront un impact positif direct (par rapport à la condition contrôle) sur les critères zootechniques pour porcelet en allaitement tandis que d'autres auront un effet de rémanence en ayant un impact positif plus marqué sur les critères zootechniques pour le porcelet en post-sevrage.
Exemple 44: Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. but yricum, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voir Tableau 14).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : avant mise bas, une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas,3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Au 76e jour de gestation, les truies ont été pesées. Les truies ont ensuite été réparties dans trois groupes différents en fonction de leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale dans tous les groupes.
Le jour 80 après l'insémination, les truies ont été placées dans des enclos individuels.
Au 107e jour de gestation, les truies ont été pesées. Au 108e jour de gestation, les truies ont été transférées dans des cases individuelles dans la maternité.
La mise-bas a été planifiée pour le jour 115 de la gestation avec une injection de Pianote et l'involution utérine a été facilitée par une injection de dinolytic après la mise bas.
A la naissance, les porcelets ont été comptés et leur poids individuel a été enregistré. Les porcelets étaient logés avec les truies dans des loges de maternité
avec un accès continu à la tétée. Dès le premier jour, après que toutes les truies aient fini de mettre bas, la taille des portées a été équilibrée au moyen d'adoptions entre les portées d'un même traitement. Les porcelets ont été pesés individuellement chaque semaine. Dans cette expérience, les porcelets ont été sevrés quatre semaines après la mise bas, à environ 28 jours d'âge. Au moment du sevrage, une sélection de 2 mâles et de 2 femelles de la même portée a été effectuée en fonction du poids corporel moyen dans le traitement. Lorsque cela n'était pas possible, on a choisi des porcelets de poids et de sexe appropriés provenant d'une autre portée du même groupe de traitement. Les porcelets sélectionnés ont été transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement.
Pendant la période de post-sevrage, ils ont reçu une alimentation dépourvue de tout complément alimentaire (dépourvu de toute composition symbiotique). Les porcelets ont été contrôlés quotidiennement le matin pour vérifier leur état de santé général et surveiller l'apparition de diarrhées. Les mangeoires étaient remplies selon les besoin. Les enclos étaient nettoyés à l'eau tous les jours.
Une fois par semaine, les porcelets étaient pesés et la consommation d'aliments était notée.
Tableau 14.- Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. butyricum, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
Probiotique Prébiotique SYN 6 E. faecium C. but yricum Beta-glucane Inuline (CFU/truie/jour) (CFU/truie/jour) (g/truie/jour) (g/truie/jour) (avant mise bas, MB) 1,60E+09 1,60E+09 1,60 9,60 MB+1sem. 1,20E+09 1,20E+09 1,20 7,20 MB+2sem. 2,75E+09 2,75E+09 2,75 16,50 MB+3sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00 MB+4sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00 MB : mise-bas ; G : jour de gestation Les 5 stades de développement sont G80-G107 (entre 80 jours et 107 jours de gestation, avant mise bas), 1 semaine après mise bas, 2 semaines après mise base, 3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Exemple 45 : Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium, B. animalis lactis, B. crudilactis, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voir Tableau 15).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : G80-G107 (entre 80 et 107 jours de gestation, avant mise bas, MB), une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas et semaines après mise bas.
Tableau 15.- Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium, B. animalis lactis, B. crudifactis, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
, Pro biotiq ue Prébiotique E. B. an imalis Beta B. crudilactis Inuline SYN 7 faecium lac tis glucane (CFU/truie/jo (g/truie/j (CFU/truie (CFU/truie/jo (g/truie/jo ur) our) /jour) ur) ur) (avant mise bas, MB) 1,07E+09 1,07E+09 1,07E+09 1,60 9,60 MB+1sem. 8,00E+08 8,00E+08 8,00E+08 1,20 7,20 MB+2sem. 1,83E+09 1,83E+09 1,83E+09 2,75 16,50 MB+3sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00 MB+4sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00 MB : mise-bas ; G : jour de gestation Exemple 46: Composition symbiotique contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo au porcelet Dans un essai in vivo (première expérience), le symbiotique 1 (SYN 1) est composé de Clostridium but yricum et GOS/FOS (80/20) et le symbiotique 2 (SYN
2) est composé de B. animalis lactis et 2'FL (voir Tableau 16). La condition contrôle était juste de l'eau potable. De manière contrôlée, les porcelets ont ingéré
une quantité déterminée de symbiotique, qui a augmenté avec l'âge. La composition symbiotique a été préparé quotidiennement en mélangeant un mélange prébiotique de 0,4 g de prébiotique par ml dans l'eau potable avec le probiotique correspondant (6E08 CFU/ml). Le mélange prébiotique de GOS/FOS contenait 0,32 g/ml de GOS et 0,08 g/ml de FOS selon les proportions des oligosaccharides du lait de truie. La solution prébiotique a été préparée chaque semaine et stockée à
+4 C
jusqu'à son utilisation. Avant l'administration, les mélanges symbiotiques ont été
amenés à température ambiante. Les compositions symbiotiques ont été
administrées dès la naissance, à des intervalles de plus en plus rapprochés et à des doses croissantes avec l'âge, jusqu'au sevrage au 28e jour postnatal (voir tableau 16). Aucune composition symbiotique n'a été administrée pendant la période de post-sevrage. Les volumes des compositions symbiotiques administrés étaient les suivants :
- 1,25 ml/porcelet jusqu'au samedi compris qui suit, - 1,75 ml/porcelet les deux jours suivants, - 2,5 ml/porcelet jusqu'au vendredi inclus de la semaine suivante, - 3,75 ml/porcelet la deuxième semaine dès le lundi, - 5 ml/porcelet ensuite dès le lundi de la troisième semaine.
Tableau 16.- Volumes et doses de compositions symbiotiques administrées aux porcelets durant la phase de lactation de la naissance au sevrage (J28).
Åge en jours Volume SYN 1 SYN 2 (i) (ml) C. GOS FOS (0,08 B. 2'FL
(0,4 butyricum (0,32 g/m1) animalis g/m1) (6E08 g/m1) lactis CFU/ml) (6E08 CFU/m1) Naissance, 1,25 7,50E08 0,49 0,1 g 7,50E08 0,59 jl, j2, j3 CFU CFU
j4, j5 1,75 1,05E09 0,56 g 0,14 g 1,05E09 0,7 g CFU CFU
j6, Fe., j9 2,5 1,50E09 0,8 g 0,2 g 1,50E09 1 g CFU CFU
j12, j14, j16 3,75 2,25E09 1,2 g 0,3 g 2,25E09 1,5 g CFU CFU
jl 9, j22, j26 5 3,00E09 1,6 g 0,4 g 3,00E09 2 g CFU CFU
On a observé que l'administration d'une composition symbiotique comprenant plusieurs probiotiques, comme SYN 6 ou SYN 7 (exemples 44 et 45), ne permet pas une plus grande prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, ni un plus grand gain quotidien moyen du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport à une composition comprenant un seul probiotique, comme SYN1 ou SYN 2 (exemple 46), ou par rapport à une condition contrôle (porcelet contrôle) n'ayant pas reçu de composition symbiotique. De plus, les compositions symbiotiques SYN 6 et SYN 7 augmentent la quantité de diarrhée (score 4) du porcelet en allaitement de respectivement 10% et 17% par rapport à la condition contrôle.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Claims (16)
1. Composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clostridium butyricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2'Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo-oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit probiotique est constitué pour au moins 80%
en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus ) faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus ) faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
6. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ( iii) Clos tridium butyric um, et (iv) Bifidobacterium cru dila c tis .
7. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, sous forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta-g luca nes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et in u line, Clostridium butyricum et beta-g I u ca nes, Clostridium butyricum et 2' fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus faecium et beta-glucanes, Enterococcus faecium et inuline, Enterococcus faecium et 2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et GOS/FOS, Enterococcus faecium et l' amidon résista nt.
thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta-g luca nes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et in u line, Clostridium butyricum et beta-g I u ca nes, Clostridium butyricum et 2' fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus faecium et beta-glucanes, Enterococcus faecium et inuline, Enterococcus faecium et 2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et GOS/FOS, Enterococcus faecium et l' amidon résista nt.
8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle la combinaison étant préférentiellement choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, contenant au moins un excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
10. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit au moins un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous forme de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide, dans laquelle ledit probiotique et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique pour (i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, et/ou (ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
12. Aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition selon l'une quelconque des revendications 1 à
11, ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
11, ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
13. Aliment pour nouveau-né animal comprenant ladite composition selon l' une quelconque des revendications 1 à 11 et une base lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
14. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à
11, à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, ledit probiotique et ledit prébiotique de la composition étant administrée de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
11, à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, ledit probiotique et ledit prébiotique de la composition étant administrée de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
15. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à
11, pour la fabrication d' un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
11, pour la fabrication d' un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
16. Méthode de traitement ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant une administration d' une composition selon l' une des revendications 1 à 11 à une truie en gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
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