ES2824536T3 - Uso de comunidades microbianas para la salud humana y animal - Google Patents

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ES2824536T3 ES17703726T ES17703726T ES2824536T3 ES 2824536 T3 ES2824536 T3 ES 2824536T3 ES 17703726 T ES17703726 T ES 17703726T ES 17703726 T ES17703726 T ES 17703726T ES 2824536 T3 ES2824536 T3 ES 2824536T3
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lactobacillus
bacteria
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Sam Possemiers
Massimo Marzorati
De Wiele Tom Van
Ilse Scheirlinck
Den Abeele Pieter Van
Selin Bolca
Davide Gottardi
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Universiteit Gent
Microbial Resource Management Health NV MRM Health
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Universiteit Gent
Microbial Resource Management Health NV MRM Health
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Abstract

Una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatum.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de comunidades microbianas para la salud humana y animal
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a una mezcla de bacterias pertenecientes a al menos 6 o 7 especies bacterianas diferentes y específicas, preferiblemente para uso para prevenir o tratar trastornos gastrointestinales. Más preferiblemente, dicha mezcla de bacterias se cultivan juntas en un fermentador antes de administrar dicha mezcla a un sujeto para prevenir o tratar dicho trastorno.
Antecedentes de la técnica
El ecosistema intestinal humano y animal consta de una variedad de hábitats y nichos metabólicos diferentes que son colonizados por la denominada microbiota que contiene más de 1011 microorganismos por gramo de peso húmedo de contenidos, predominantemente anaerobios (Macfarlane y Macfarlane, 1997). Hoy en día se reconoce ampliamente que el microbioma intestinal humano o animal desempeña un papel crucial en la salud y el bienestar humanos al contribuir a la recolección de energía, modular el sistema inmunológico y establecer la resistencia a la colonización contra patógenos oportunistas (Fuller y Gibson, 1997; Cummings y Macfarlane, 1997). Existen pruebas de que la interacción de las bacterias y sus metabolitos con la capa de moco y/o con la pared intestinal es importante (Barnett et al. 2012). Aunque el microbioma intestinal generalmente es estable en el tiempo, su composición se ve alterada por perturbaciones externas, tales como cambios en la dieta, uso de antibióticos, aumento de la higienización, y estrés. Esto conduce a una condición desequilibrada en el tracto gastrointestinal, denominada disbiosis (Clemente et al.2012). La disbiosis se caracteriza por alteraciones moderadas o graves en la composición normal del microbioma intestinal, lo que provoca así la falta de especies microbianas clave, lagunas en funciones microbianas específicas y, como consecuencia, una modulación alterada de la actividad de la pared intestinal. Esto puede conducir a la colonización de microorganismos patógenos - que causan diarrea o enteritis necrosante (Sekirov et al., 2008). Una de las formas extremas de tal patogenia es la DACD (diarrea asociada a Clostridium difficile), para la cual la terapia clásica con antibióticos está cada vez más lejos de curar al paciente. Otras consecuencias de la disbiosis microbiana pueden ser una respuesta inmune comprometida - dando como resultado una inflamación crónica (Willing et al., 2009) o alergias alimentarias - o una mayor permeabilidad intestinal, malabsorción de nutrientes, o incluso bacteriemia. Los efectos adversos de la disbiosis sobre la funcionalidad microbiana y la fisiología de la pared intestinal pueden así socavar la salud humana. De hecho, el estreñimiento, IBS, IBD, pouchitis, síndrome metabólico, obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, trastornos mentales, deterioro de la función cognitiva, una enfermedad neurodegenerativa, diferentes tipos de cánceres (por ejemplo, cáncer de colon), inflamación del aparato reproductor femenino, DACD, reumatismo, o artritis reumatoide, están todos asociados con cambios en la actividad/composición de la microbiota intestinal. Por lo tanto, está claro que la disbiosis debe evitarse o remediarse en el momento de su aparición.
Cuando la disbiosis se asocia con la presencia de patógenos, una estrategia obvia para deshacerse de los microorganismos perjudiciales para la salud es la aplicación de agentes antibióticos. Sin embargo, el uso extendido e inadecuado de antibióticos de amplio espectro durante las últimas décadas ha aumentado drásticamente la resistencia a los antibióticos (Brandl et al., 2008). Además, los antibióticos también abordan los microorganismos intestinales autóctonos - muchos de los cuales cumplen funciones cruciales y brindan beneficios para la salud -, lo que empeora por lo tanto la condición de disbiosis. Como resultado, las últimas 2 décadas han visto un tremendo aumento en la investigación de alimentos funcionales, particularmente el desarrollo de productos prebióticos y probióticos. Aunque el concepto de prebiótico es atractivo porque se refiere a la modulación dietética de microorganismos intestinales autóctonos que ya están adaptados al hospedante (Van Loo et al., 1999), se utiliza principalmente de manera preventiva. Para una aplicación terapéutica, un microbioma intestinal gravemente alterado se beneficiaría más de la introducción de especies microbianas clave, en lugar de la provisión de sustratos que benefician a las especies promotoras de la salud que son menos abundantes o incluso están ausentes en un individuo enfermo. Una posible solución es la introducción de microorganismos viables que promueven la salud, denominados probióticos (Iannitti y Palmieri, 2010). Los productos probióticos se componen principalmente de 1 a un par de cepas microbianas no interconectadas (principalmente bacterias productoras de ácido láctico) con una funcionalidad específica. Sin embargo, la supervivencia de las cepas probióticas durante las duras condiciones del tracto digestivo superior es un desafío, y la competencia con el vasto microbioma autóctono suele ser insignificante. Sin embargo, el concepto de introducir nuevas especies en un ecosistema intestinal comprometido ha cobrado impulso en los últimos años mediante la aplicación de trasplantes de microbios fecales (FMT) (Khoruts et al., 2010). Esto implica la transferencia de una suspensión microbiana fecal de un donante sano a un receptor enfermo. Esta forma de bacterioterapia se aplica principalmente para tratar infecciones resistentes a los antibióticos, y tiene tasas de curación del 90% o más. Actualmente se está considerando el FMT para el tratamiento de muchas otras patologías que tienen su origen en la disbiosis gastrointestinal (enfermedad de Crohn, obesidad, síndrome del intestino irritable). FMT parece funcionar de manera eficiente donde fallan con frecuencia cepas probióticas individuales. Sin embargo, la naturaleza mal caracterizada de los trasplantes fecales conlleva riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas, y actualmente plantea dudas sobre su aplicabilidad generalizada en patologías menos agudas y potencialmente mortales (De Vrieze 2013).
A principios de 2013, una alternativa para los trasplantes de microbios fecales ingresó al campo con la publicación de un artículo científico (Petrof et al., 2013) y la solicitud de patente (WO2013037068 - Método para el tratamiento de trastornos del sistema gastrointestinal) sobre el uso de una mezcla sintética de microbios, que fueron aislados de un individuo en función de su cultivabilidad, como agente terapéutico para curar la DACD. Dicho producto también está compuesto por un conjunto conocido de microorganismos, lo que eliminaría las preocupaciones sobre la transmisión de enfermedades de los trasplantes fecales, cuando se respetan los criterios de QPS. Sin embargo, mezclar microorganismos no garantiza que interactúen entre sí y ocupen nichos funcionales que requieran redes microbianas. Por lo tanto, no se puede garantizar la estabilidad del producto, la estandarización y el rendimiento de funciones importantes.
En la solicitud de patente WO2014145958A2 (Composiciones microbianas basadas en redes y métodos), se propone administrar a un sujeto mamífero, que necesita una cantidad eficaz de una composición bacteriana terapéutica, una pluralidad de bacterias aisladas o una preparación bacteriana purificada. La pluralidad de bacterias aisladas o la preparación bacteriana purificada puede formar una denominada ecología de red. Las bacterias que pertenecen a esta preparación se seleccionan basándose en la información genómica, y se proporcionan al sujeto mamífero como un conjunto de cepas ensambladas libremente.
En una publicación de Becker et al. (2011) se describe una comunidad que consta de 8 cepas diferentes: Anaerostipes caccae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium longum, Blautia producta, Clostridium butyricum, Clostridium ramosum, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum. La comunidad se conoce como SIHUMIx (Microbiota Humana Simplificada extendida). Esta comunidad microbiana artificial se ensayó en estudios con ratas, comparando ratas inoculadas con SIHUMIx con ratas libres de gérmenes y asociadas con humanos convencionales. Los autores afirman que la comunidad es representativa de la microbiota asociada al colon humano en términos de composición y funcionalidad. La comunidad microbiana evolucionó según la edad de las ratas, pero alcanzó una composición estable con el tiempo.
Van den Abbeele et al. (2013) sugirió la posibilidad de crear una comunidad degradante de glicanos mediante el uso de fermentadores in vitro que pueden inocularse con especies clave importantes y una mezcla de microbios de alimentación cruzada. Después de la inoculación y estabilización, esta unidad de red microbiana para funciones específicas puede lograrse y producirse a gran escala.
Finalmente, Newton et al. (1998) hicieron uso de quimiostatos anaeróbicos para crear comunidades bacterianas definidas reproducibles que comprenden 14 especies diferentes sacarolíticas y fermentadoras de aminoácidos (es decir Bifidobacterium longum, Bif. adolescentis, Bif. pseudolongum, Bif. infantis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bact. vulgatus, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Escherichia coli, Clostridium perfringens, CI. butyricum, CI. innocuum, CI. Bifermentans) para estudiar el efecto de la bacteria reductora de sulfato (SRB) Desulfovibrio desulfuricans sobre otros organismos intestinales.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de diseñar mezclas alternativas y específicas de especies bacterianas que puedan usarse de manera eficaz para prevenir o tratar trastornos gastrointestinales. Además, se desconoce por completo si las mezclas preadaptadas se comportan terapéuticamente tan bien, peor o mejor en comparación con la administración de las mezclas poco ensambladas y no preadaptadas de la misma especie bacteriana.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de una unidad SHIME® que consta de estómago, intestino delgado y las tres regiones diferentes del colon. El medio nutricional líquido SHIME® y el jugo pancreático entran en los compartimentos que simulan el estómago y el intestino delgado, respectivamente. Después de un tiempo de residencia definido en estos compartimentos estériles, la suspensión pasa a tres compartimentos de colon consecutivos, los compartimentos de colon ascendente, transverso y descendente, cada uno caracterizado por distintos pH y tiempos de residencia. Estos compartimentos se inoculan con microbiota fecal humana. Todas las vasijas se mantienen anaeróbicas enjuagando el espacio superior con N2, se agitan continuamente, y se mantienen a 37°C.
Figura 2: Producción de butirato por 23 composiciones diferentes tras 24h de incubación (panel superior) y efecto sobre la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de las células Caco-2 cultivadas en presencia de células THP1 (panel inferior). Para esto último, las muestras recolectadas de las 23 incubaciones después de las 24 h se filtraron de forma estéril y se añadieron (1:5 v/v) durante 24 h al compartimiento apical de células Caco-2 cultivadas durante 14 días en insertos semipermeables y se colocaron encima de macrófagos derivados de THP1 estimulados con PMA (cocultivos). Se usó medio de crecimiento solo (DMEM) como control. Las células THP1 cultivadas en presencia de PMA durante 48 h inducen daño en las células Caco-2 según se mide por una disminución de TEER en el control de DMEM. Los valores de TEER se han normalizado a los valores medidos antes del cocultivo (0 h) y se expresan como porcentaje del valor inicial. La codificación de las diferentes composiciones fue la siguiente: MX-Y, en la que X = número de aislados presentes en la composición, e Y = composición única A, B, C, etc. con X aislados.
Figura 3: Producción de butirato tras 24 h y 48 h de incubación en medio nutricional SHIME® acondicionado mediante la composición completa de 7 especies o composiciones de 6 especies, en las que cada vez se omitió una de las 7 especies originales. Los resultados se presentan como el porcentaje de producción de butirato detectado en cada incubación con una composición de 6 especies, a diferencia de la composición que consta de las 7 especies. Las composiciones se denominan “Total” (las 7 especies) o “Total - X”, siendo X la especie omitida de la composición total. *: p < 0,05 en comparación con “Total” a las 24 h; #: p < 0,05 en comparación con “Total” a las 48 h.
Figura 4: Niveles (mM) de butirato, propionato y acetato producidos por la composición a lo largo de una incubación anaeróbica de 5 días en medio nutricional SHIME® acondicionado. La composición se produjo a través de la estrategia “Ensamblaje” (panel izquierdo) o la estrategia “Colaboroma” (panel derecho).
Figura 5: Evolución de los niveles (mM) de propionato (panel izquierdo) y butirato (panel derecho) durante un período de tiempo de 14 días en 3 ciclos de producción independientes de la composición a través de la estrategia “Colaboroma”. Tras el crecimiento inicial en un medio de cultivo apropiado, las cepas de la composición se mezclaron, se inocularon y se cultivaron durante 14 días por triplicado en una configuración SHIME®, que consistía en una única región de colon a un pH de 6,15-6,4.
Figura 6: Evolución de los niveles de AGCC expresados como % en moles de acetato, propionato y butirato a lo largo del tiempo, tras la producción de la composición mediante la estrategia alternativa “Colaboroma”. Tras el crecimiento inicial en un medio de cultivo apropiado, las cepas de la composición se mezclaron, se inocularon y se cultivaron durante 8 días por triplicado en fermentadores individuales operados en un modo de lote alimentado. A intervalos específicos de 16 h, el 40% (v:v) del medio de crecimiento se reemplazó por medio nutricional SHIME® acondicionado.
Figura 7: Producción (mM) de acetato, propionato, butirato y ácidos grasos totales de cadena corta (AGCC) en incubaciones de 24 h con (i) medio basal estéril (panel superior), o medio estéril provisto de (ii) microbiota derivada de una región del colon SHIME (panel central) o (iii) microbiota fecal (panel inferior). Se aplicaron diferentes tratamientos con la composición, producida a través de la estrategia de “Colaboroma”, que oscilan de 0% a 4% y 20% del volumen total de incubación.
Figura 8: Evolución de los niveles (mM) de acetato (panel superior), propionato (panel central) y butirato (panel inferior) en un experimento de recuperación de antibióticos en M-SHIME®. Tras la inducción de la disbiosis de la microbiota del colon derivada de SHIME® mediante la administración de un cóctel de antibióticos (40/40/10 mg/l de amoxicilina/ciprofloxacina/tetraciclina, respectivamente), la microbiota disbiosada se trató durante 5 días con la composición, producida ya sea mediante la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma” (día 1 = inicio de administración de la composición). Los resultados se expresan como el delta de los niveles de AGCC en el SHIME en cada punto temporal frente a los valores antes de la administración del antibiótico.
Figura 9: Niveles (mM) de acetato (panel superior), propionato (panel central) y butirato (panel inferior) en un experimento de recuperación de disbiosis asociada a IBD en el M-SHIME®. Se inocularon tres vasijas de colon SHIME® independientes con materia fecal de un paciente con colitis ulcerosa. Simultáneamente, se añadió una dosis única de la composición, producida mediante la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma”, a una vasija de colon SHIME respectiva. Un tercer experimento se realizó en paralelo como experimento de control sin la administración de la composición. La producción de acetato, propionato y butirato se siguió 1 y 2 días después de la administración de la composición.
Figura 10: Evolución de los niveles (% en moles) de acetato, propionato y butirato en un experimento de recuperación de antibióticos en ratones C57/BL6. Después de un período de control en el que los ratones fueron alimentados con una dieta estándar, se indujo la disbiosis de la microbiota intestinal añadiendo clindamicina (250 mg/l) al agua de bebida durante 5 días. Después de esto, los ratones (n = 10/grupo) fueron alimentados por sonda oral durante 5 días con disolución salina (sin control de intervención bacteriana; panel izquierdo), con la composición producida a través de la estrategia de “Colaboroma” (panel central), o con la composición extendida producida a través de la estrategia de “Colaboroma” (panel derecho). Se combinaron muestras fecales de ratones obtenidas del mismo grupo de intervención, y se cuantificaron los niveles de acetato, propionato y butirato.
Figura 11: Evolución del índice de actividad de la enfermedad (DAI) y cambio de peso en un experimento de colitis inducida por TNBS en ratones C57/BL6. Después de un período de aclimatación de 1 semana en el que los ratones fueron alimentados con una dieta estándar, se inició el experimento. Cada grupo (n = 9/grupo) se trató durante 5 días consecutivos mediante sonda oral. La dosificación preventiva de todos los tratamientos comenzó 1 día antes de la administración rectal de 2 mg de TNBS/EtOH al 50%, y duró 4 días después de la administración de TNBS, antes de sacrificar los ratones. Se incluyeron los siguientes tratamientos: TNBS disolución salina (control de TNBS vehículo); TNBS composición, producida a través de la estrategia de “Ensamblaje”, y TNBS composición, producida a través de la estrategia de “Colaboroma”. Se incluyó como control de vehículo un grupo convencional (sin tratamiento con TNBS pero tratado con disolución salina).
Figura 12: Evolución del índice de actividad de la enfermedad (DAI) en un experimento de colitis crónica inducida por DSS en ratones C57/BL6. Después de un período de aclimatación de 1 semana en el que los ratones fueron alimentados con una dieta estándar, se inició el experimento. Cada grupo (n = 10/grupo) se trató 3 veces por semana durante 8 semanas consecutivas, mediante sonda oral. La dosificación preventiva de todos los tratamientos comenzó 1 semana antes del primer ciclo de DSS. El primer ciclo de DSS comenzó en la semana 2 e incluyó una semana de administración de DSS (0,25% en agua de bebida) seguida de dos semanas de recuperación. Este primer ciclo fue seguido por un segundo ciclo de DSS idéntico. El tercer ciclo de DSS consistió en una semana de administración de DSS seguida de una semana de recuperación, después de la cual se sacrificaron los animales. Se incluyeron los siguientes tratamientos: DSS disolución salina (control de DSS vehículo); DSS composición, producida a través de la estrategia de “Colaboroma”. Se incluyó como control de vehículo un grupo convencional (sin tratamiento con DSS pero tratado con disolución salina).
Sumario de la invención
La presente invención se refiere en primer lugar a una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae,preferiblemente para uso para prevenir o tratar síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal.
En otras palabras, la presente invención se refiere a un método para prevenir o tratar síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente, en la que dicho trastorno gastrointestinal es una alteración de la función de barrera del intestino, diarrea, estreñimiento, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celiaquía, pouchitis, mucositis, infección del intestino, disbiosis de la microbiota intestinal, o cualquier combinación de los mismos.
La presente invención también se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dicho trastorno gastrointestinal se previene o trata mediante: a) estimulando el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas en el tracto intestinal, b) inhibiendo el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias patógenas en el tracto intestinal, c) aumentando relativamente la unión de bacterias no patógenas a la mucosa de la superficie gastrointestinal, d) reduciendo la captación incontrolada de antígenos, proinflamatorios, bacterias o productos bacterianos por el intestino, e) proporcionando actividad antiinflamatoria en la superficie intestinal, f) aumentando el funcionamiento de la barrera intestinal, g) produciendo metabolitos bacterianos, o h) cualquier combinación de a) a g).
La presente invención también se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que las bacterias que pertenecen a la especie Roseburia hominis se eliminan de dicha composición.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que las bacterias que pertenecen a la especie Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatus se añaden además a dicha composición.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente que comprende además uno o más prebióticos.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dichas bacterias se preadaptan haciéndolas crecer juntas en un fermentador antes de administrar dicha composición para prevenir o tratar dichos trastornos gastrointestinales.
A este respecto, la presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicho fermentador es un simulador dinámico del tracto gastrointestinal.
Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dichas bacterias se escogen de la lista de las siguientes cepas: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662, y/o cepas que muestran al menos 97% de identidad de secuencia con las secuencias de ARNr de 16S de al menos una de dichas cepas.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicha composición es una composición farmacéutica formulada como una forma administrada por vía rectal o una forma ingerible por vía oral.
A este respecto, la presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicha forma ingerible por vía oral es una cápsula, microcápsula, comprimido, gránulo, polvo, trocisco, píldora, suspensión o jarabe.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente que se incorpora en un alimento, bebida, complemento alimentario o nutracéutico.
La presente invención se refiere más específicamente a una composición como se describe anteriormente en la que dicha composición comprende entre 105 y 1011 unidades formadoras de colonias de bacterias.
Descripción de la invención
El microbioma intestinal comprende cientos de especies microbianas que coexisten dentro de diferentes sujetos y que interactúan entre sí y con el hospedante. Hoy en día, generalmente se cree que la microbiota intestinal desempeña un papel clave en la salud y las enfermedades humanas al regular las funciones metabólicas y la homeostasis inmunológica (Cénit et al, 2014). Varios estudios han investigado estas complejas comunidades microbianas intestinales en un intento de definir un “microbioma central”, lo que implica que todos los seres humanos comparten un número clave de especies o cepas esenciales que definen las capacidades funcionales de un microbioma intestinal sano (Kinross et al., 2011). Basado en este concepto (es decir, que todos los seres humanos están poblados por un microbioma central), la extensa bibliografía que está disponible sobre la composición y función de la microbiota intestinal (por ejemplo, especies clave, microbiota mucosal frente a luminal, bacterias del colon proximal frente a distal, etc.) y análisis del genoma funcional, se podría identificar una lista de candidatos microbianos que cubra las principales funcionalidades del complejo microbioma intestinal humano.
La presente invención se refiere en primer lugar a una selección específica de un subgrupo de especies bacterianas del microbioma intestinal humano que tienen un efecto particular y sorprendente. Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Fioseburia inulinivorans, Fioseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, preferiblemente para uso para prevenir o tratar síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal. La expresión “que consiste esencialmente en” indica que dicha composición puede incluir otras especies bacterianas y/u otros componentes siempre que no afecten negativamente al efecto (es decir, prevenir o tratar los síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal) de dicha composición. En una realización, una composición de la invención comprende bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
En otra realización, una composición de la invención consiste en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
Las especies bacterianas Faecalibacterium prausnitzii (Duncan et al. 2002), Butyricicoccus pullicaecorum (Eeckhaut et al. 2008), Roseburia inulinivorans (Duncan et al. 2006), Roseburia hominis (Duncan et al. 2006), Akkermansia muciniphila (Derrien et al. 2004), Lactobacillus plantarum (Walter 2008) y Anaerostipes caccae (Schwiertz et al. 2002) son especies bacterianas bien conocidas por un experto. Las expresiones “síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal” se refieren a problemas de salud en seres humanos y animales. El uso de la composición de la presente invención conduce más específicamente a la prevención/recuperación de la disbiosis que da como resultado una modulación positiva de la interacción entre las bacterias y la superficie intestinal. Como resultado, se obtiene un funcionamiento mejorado de la superficie intestinal: por ejemplo funcionamiento de barrera, hormonal, inmune. El inicio del efecto sobre la superficie intestinal es más rápido cuando se dosifica una “composición preadaptada” en comparación con un conjunto de las mismas cepas ensambladas de manera suelta (véase más adelante). Como se usa aquí, modular o mejorar la función de barrera, hormonal o inmune de la superficie intestinal pretende incluir la alteración de cualquier parámetro que afecte la homeostasis normal de la superficie intestinal y en particular su papel en la defensa de primera línea contra la invasión por patógenos, antígenos u otras sustancias nocivas y su función para producir sustancias (por ejemplo, moléculas inmunitarias, hormonas) que tienen influencias sistémicas en el hospedante. Dichos parámetros incluyen, pero no se limitan a:
- una estimulación del crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas en el tracto intestinal (por ejemplo, lactobacilos, bifidobacterias, bacterias productoras de butirato o propionato, otras);
- una inhibición del crecimiento y/o actividad de una o un número de bacterias patógenas en el tracto intestinal;
- un aumento relativo en la unión de bacterias no patógenas a la mucosa de la superficie intestinal;
- una reducción en la absorción incontrolada del intestino de antígenos, moléculas proinflamatorias, bacterias o productos bacterianos;
- modulación del tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y el sistema inmunológico sistémico del hospedante;
- producción de metabolitos bacterianos específicos (por ejemplo, propionato, butirato); y
- modulación de la producción de ciertas moléculas de señalización intestinal que modulan directa o indirectamente la homeostasis metabólica (por ejemplo, pro-glucagón, GLP-1, GLP-2, FIAF).
De este modo, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dicho trastorno gastrointestinal se previene o trata mediante: a) estimulando el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas en el tracto intestinal, b) inhibiendo el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias patógenas en el tracto intestinal, c) aumentando relativamente la unión de bacterias no patógenas a la mucosa de la superficie gastrointestinal, d) reduciendo la captación incontrolada de antígenos, moléculas proinflamatorias, bacterias o productos bacterianos por el intestino, e) proporcionando actividad antiinflamatoria en la superficie intestinal, f) aumentando el funcionamiento de la barrera intestinal, g) produciendo metabolitos bacterianos, o h) cualquier combinación de a) a g).
Las afecciones de salud que pueden estar asociadas con trastornos gastrointestinales generales incluyen - pero no se limitan a -: estreñimiento, síndrome del intestino irritable (IBS), enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), disbiosis de la microbiota intestinal, mucositis, síndrome metabólico, obesidad, diabetes, una enfermedad cardiovascular, síndrome de fatiga crónica, una enfermedad mental, deterioro de la función cognitiva, una enfermedad neurodegenerativa, una forma de cáncer, una enfermedad autoinmune, deterioro del funcionamiento inmunológico, reumatismo, artritis reumatoide, inflamación del aparato reproductor femenino, infección de patógenos (bacterias, virus y hongos). Los ejemplos de enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero no se limitan a, ELA, demencia, enfermedad de Alzheimer, de Parkinson y de Huntington. Los ejemplos de tipos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y particularmente cáncer colorrectal. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, dermatitis atópica, celiaquía, psoriasis y lupus.
En base a la observación de que las composiciones de la presente invención potencian la interacción y/o actividad de bacterias no patógenas en la capa mucosa del epitelio gastrointestinal, se prevé que dichas preparaciones sean particularmente útiles para mejorar la función de barrera de la superficie intestinal, tal como por ejemplo para prevenir o reducir la captación incontrolada del intestino de antígenos, moléculas proinflamatorias, bacterias patógenas o productos bacterianos. Una de esas indicaciones, con una barrera mucosal deteriorada, es la enfermedad inflamatoria intestinal. Como es generalmente aceptado que, en las Enfermedades Inflamatorias Intestinales, la lesión de la mucosa con una resolución alterada de las lesiones es uno de los elementos clave que conducen a estas indicaciones crónicas, las composiciones de la presente invención tienen un efecto beneficioso en dicha indicación. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de las composiciones de la presente invención en la prevención y el tratamiento de afecciones asociadas con una función de barrera deteriorada y caracterizadas por la captación incontrolada del intestino de antígenos, moléculas proinflamatorias, bacterias patógenas o productos bacterianos.
Las “enfermedades inflamatorias del intestino”, también denominadas “enfermedades crónicas del colon”, como se usan aquí, incluyen cualquier afección caracterizada por una inflamación persistente de la mucosa en diferentes niveles del tracto gastrointestinal, tal como por ejemplo síndrome inflamatorio del intestino, mucositis, úlceras gástricas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cáncer colorrectal y pouchitis.
Como generalmente se reconoce que la mucositis se caracteriza esencialmente por la inflamación de la superficie de la mucosa que recubre la boca y el tracto gastrointestinal, típicamente como un evento adverso de la quimioterapia y radioterapia o trasplante de células madre, también se debe considerar que la aplicación de las composiciones de la presente invención tiene un efecto beneficioso en dicha indicación. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de las composiciones de la presente invención en la prevención y el tratamiento de afecciones asociadas con la mucositis. La mucositis puede ocurrir en cualquier parte del tracto gastrointestinal. En caso de que ocurra en la cavidad bucal, se suele denominar mucositis oral.
También debe contemplarse que la aplicación de las composiciones de la presente invención proporcione protección contra la invasión por antígenos que provocan reacciones alérgicas, por lo que dichos alérgenos pueden comprender determinadas sustancias alimentarias, productos químicos y otras moléculas. De este modo, en una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de composiciones en la prevención y el tratamiento de afecciones asociadas con la invasión por antígenos que causan reacciones alérgicas (por ejemplo, alergias alimentarias, asma, eccema).
Además, también se prevé que la aplicación de las composiciones influya tanto en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) como en el sistema inmunológico sistémico. Entre otros efectos, esto puede dar como resultado una disminución de la expresión de citocinas proinflamatorias y una mayor producción de factores inmunorreguladores y una actividad mejorada de los linfocitos. Por lo tanto, se prevé que dichas composiciones sean particularmente útiles para mejorar el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunológico del hospedante.
En otro aspecto de la invención, basado en la observación de que las composiciones de la presente invención modulan la barrera epitelial y subsiguientemente disminuyen la inflamación crónica, se prevé que dichas composiciones sean particularmente útiles para controlar y mejorar la homeostasis metabólica. Los efectos no limitantes de dichas preparaciones sobre la homeostasis metabólica incluyen el control de la ingesta de alimentos y el metabolismo de grasas y glucosa, la mejora de la secreción de insulina y la sensibilidad y el control de la síntesis y metabolismo del colesterol. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de las composiciones de la presente invención en el manejo de la ingesta de alimentos, la inducción de la saciedad, el control del peso, la prevención y el tratamiento de afecciones asociadas con una homeostasis metabólica alterada, tales como obesidad y diabetes tipo 2.
Basándose en la observación de que la composición de la presente invención disminuye varios factores de riesgo causales establecidos de enfermedades cardiovasculares (ECV), se debe contemplar en otro aspecto de la invención que dichas composiciones son particularmente útiles para la prevención de ECV. Técnicamente, la ECV se refiere a cualquier enfermedad que afecte al sistema cardiovascular, pero se suele utilizar para referirse a las relacionadas con la aterosclerosis. Esta última es un síndrome que afecta a los vasos sanguíneos arteriales, una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, en gran parte debido a la acumulación de glóbulos blancos de macrófagos y promovida por lipoproteínas de baja densidad. El desarrollo de ECV depende de múltiples mecanismos, y se han identificado varios factores de riesgo causales claros. Estos factores incluyen, pero no se limitan a, colesterol LDL elevado, triglicéridos plasmáticos, enfermedades metabólicas (obesidad, diabetes, ...), inflamación crónica y estrés oxidativo. Especialmente, los dos últimos factores son de suma importancia. La aterosclerosis se desarrolla cuando las LDL se oxidan (LDL-ox) por los radicales libres, particularmente los radicales libres de oxígeno, en situaciones de estrés oxidativo. La respuesta excesiva del sistema inmunológico, en caso de inflamación crónica, al daño causado por LDL-ox promueve aún más la expansión de la enfermedad. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de las composiciones de la presente invención en la prevención o el tratamiento de la ECV.
En un aspecto adicional, dado el efecto beneficioso de las composiciones de la presente invención sobre la adherencia de la microbiota normal a la capa mucosal, se prevé que la aplicación de las composiciones proporcione protección contra la adhesión e invasión de la mucosa por patógenos. Los ejemplos de patógenos incluyen, pero no se limitan a Bacillus anthracis; Bacillus cereus; Bordetella pertussis; Borrelia burgdorferi; Brucella abortus; Brucella canis; Brucella melitensis; Brucella suis; Campylobacter jejuni; Chlamydia pneumonía; Chlamydia trachomatis; Chlamydophila psittaci; Clostridium botulinum; Clostridium difficile; Clostridium perfringens; Clostridium tetani; Corynebacterium diphtheria; Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC); Enteropathogenic E. coli; E. coli O157:H7; Francisella tularensis; Haemophilus influenza; Helicobacter pylori; Legionella pneumophila; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes; Mycobacterium leprae; Mycobacterium tuberculosis; Mycoplasma pneumonia; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningitides; Pseudomonas aeruginosa; Rickettsia rickettsia; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Shigella sonnei; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus saprophyticus; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pneumonia; Streptococcus pyogenes; Treponema pallidum; Vibrio cholera; Yersinia pestis; Candida spp.; Norovirus (Virus de Norwalk); Hepatitis A; virus que inducen viruela, gripe, paperas, sarampión, varicela, ébola y rubéola. De este modo, en una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de las composiciones de la presente invención en la prevención y el tratamiento de afecciones asociadas con la adhesión e invasión de la mucosa por patógenos; en particular en el tratamiento y prevención de la diarrea adquirida y la diarrea del viajero.
De este modo, la presente invención se refiere a un método para prevenir o tratar síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
La expresión “sujeto que necesita” se refiere a un ser humano o un animal no humano que tiene un trastorno gastrointestinal como se describe anteriormente.
La expresión “una cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a un mínimo de la cantidad total combinada de las 7 especies bacterianas que es capaz de ejercer su efecto profiláctico o terapéutico. Las 7 especies de bacterias se enumeran a continuación: Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
Sin embargo, “una cantidad terapéuticamente eficaz” también puede referirse a un mínimo de una cantidad total combinada de 6 especies de bacterias enumeradas a continuación: Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
Dependiendo de la aplicación final, dicha cantidad total combinada puede ser el resultado de cantidades iguales de cada una de las 7 especies bacterianas, o cantidades desiguales de las 7 especies bacterianas, en las que cada especie individual de las 7 especies bacterianas tiene una abundancia mínima de 0,0001% de la cantidad total combinada, más preferiblemente una abundancia mínima de 0,001% de la cantidad total combinada, y lo más preferible una abundancia mínima de 0,01% de la cantidad total combinada. Si así - por ejemplo - 6 especies tienen una abundancia de 10,00% de la cantidad total combinada, entonces la 7a especie tiene una abundancia de 40,00% de la cantidad total combinada. Dependiendo de la aplicación final, dicha cantidad total combinada oscila entre una dosis diaria de 102 y 1014 células bacterianas, preferiblemente oscila entre una dosis diaria de 103 y 1013 células bacterianas, más preferiblemente oscila entre una dosis diaria de 104 y 1012 células bacterianas, y lo más preferible oscila entre una dosis diaria de 105 y 1011 células bacterianas.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que las bacterias que pertenecen a la especie Roseburia hominis se eliminan de dicha composición. El término “eliminan” se refiere en particular a obtener una composición de 6 especies bacterianas como se indica más adelante en la sección de Ejemplos sin añadir o eliminar la especie Roseburia hominis como una 7a especie.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que las bacterias que pertenecen a la especie Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatus se añaden además a dicha composición.
La especie bacteriana Escherichia coli (Rath et al. 1999), Enterococcus faecium (Schleifer et al. 1984), Lactobacillus mucosae (Roos et al. 2000), Bifidobacterium adolescentis (Scharek et al. 2000), Bifidobacterium longum (Bahaka et al. 1993), Bacteroides thetaiotaomicron (Scharek et al. 2000) y Bacteroides vulgatus (Rath et al. 1999) son especies bacterianas bien conocidas por un experto. La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente, que comprende además uno o más prebióticos.
El término “prebiótico” se refiere a cualquier producto químico que induzca el crecimiento o la actividad de microorganismos (por ejemplo, bacterias) que contribuyan al bienestar de su hospedante. Por lo tanto, los prebióticos pueden influir o alterar la composición de los organismos en el microbioma intestinal. Sin embargo, en principio, es un término más general que también puede referirse a otras áreas del cuerpo. Los prebióticos típicos - pero no limitativos - son compuestos de fibras no digeribles que pasan al menos parcialmente sin digerir a través de la parte superior del tracto gastrointestinal y estimulan el crecimiento o la actividad de bacterias ventajosas que colonizan el intestino grueso actuando como sustrato para ellas.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dichas bacterias se cultivan juntas en un fermentador antes de administrar dicha composición para prevenir o tratar dichos trastornos gastrointestinales. Las últimas composiciones también se conocen (véase más adelante) como la “estrategia de Colaboroma” o como la “estrategia de Colaboroma alternativa”. Por el contrario, las composiciones en las que dichas bacterias no crecen juntas en un fermentador antes de la administración se denominan (véase más adelante) “estrategia de Ensamblaje”.
A este respecto, la presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicho fermentador es un simulador dinámico del tracto gastrointestinal. En este caso específico, las últimas composiciones también se denominan (véase más adelante) como la “estrategia de Colaboroma”.
El SHIME® (Simulador del Ecosistema Microbiano Humano) es un modelo in vitro dinámico del tracto gastrointestinal humano que está compuesto por cinco vasijas de doble camisa, que simulan el estómago, el intestino delgado y las tres regiones del colon (colon ascendente, transversal y descendente), con un tiempo de retención total de 72 h (Fig. 1). Tres veces al día, se añadieron 140 ml de alimento SHIME® y 60 ml de jugo pancreático a los compartimentos del estómago y del intestino delgado, respectivamente (Van den Abbeele et al., 2010). Después de un período inicial de estabilización de 2 semanas - lo que permite que la microbiota se adapte a las condiciones in vitro impuestas -, se inició el procedimiento de aislamiento. De este modo, las cepas microbianas seleccionadas de la presente invención pueden inocularse en reactores de una sola etapa (estrategia de colaboroma alternativa) o de múltiples etapas, o simuladores dinámicos del tracto gastrointestinal (por ejemplo, SHIME® o M-SHIME®, estrategia de colaboroma) en condiciones estandarizadas representativas para el tracto GI. En consecuencia, la invención se refiere a un reactor que comprende una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a 6 o 7 o hasta 14 especies como se define aquí y se enumeran adicionalmente a continuación:
- que comprende una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o
- que comprende una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o
- que comprende una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a la especie Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatus.
En una realización preferida, este reactor que comprende dicha composición se encuentra en condiciones estandarizadas representativas para el tracto GI como se define a continuación.
Los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas incluyen, pero no se limitan a: pH (intervalo entre 1,5 y 8); disponibilidad de fuentes de carbono (ya sea hidratos de carbono o proteínas o una combinación de los mismos); tiempo de retención en un reactor específico (intervalo entre 10 min y 200 h); disponibilidad de oxígeno (intervalo entre 0 y 8 g/l); disponibilidad de micronutrientes; presencia/ausencia de antibióticos; concentración de sales biliares (intervalo entre 0 y 20 mM); presencia de metales pesados; presencia de factores del hospedante como moléculas inmunes. En una realización preferida, los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas comprenden el pH, el tiempo de retención en un reactor específico y la concentración de sales biliares, todo como se definió anteriormente aquí. Dependiendo de la complejidad del colaboroma, se necesita un período de 1 a 15 días para obtener un colaboroma funcionalmente estable. En promedio, para desarrollar un colaboroma compuesto de 7 a 14 miembros, es suficiente un tiempo entre 3 y 10 días para obtener un colaboroma funcionalmente estable (dependiendo de las condiciones ambientales). Por tanto, se puede obtener una composición como se define aquí después de haber sido entrenada o cultivada durante un tiempo entre 3 y 10 días en condiciones en las que el pH, el tiempo de retención en un reactor específico y la concentración de sales biliares se han establecido como se define aquí. Tal procedimiento permite la producción de una composición o colaboroma que es funcionalmente estable.
Dentro del contexto de la invención, “un colaboroma funcionalmente estable” es una composición como se define aquí que todavía comprende el número inicial diferente de especies de bacterias después de al menos 3 o 5 o 10 días de cultivo.
En un aspecto adicional, se proporciona un reactor que opera en condiciones estandarizadas representativas para el tracto GI, que comprende: intervalo de pH entre 1,5 y 8; disponibilidad de fuentes de carbono; tiempo de retención entre 10 min y 200 h; disponibilidad de oxígeno entre 0 y 8 g/l; disponibilidad de micronutrientes; presencia/ausencia de antibióticos; concentración de sales biliares entre 0 y 20 mM; presencia de metales pesados; presencia de factores del hospedante como moléculas inmunes. En una realización, dicho reactor es tal que los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas comprenden pH, tiempo de retención en un reactor específico y concentración de sales biliares como se define en el párrafo anterior. En una realización, tal reactor comprende una composición de 5 y 20 miembros de bacterias distintos, o 6 a 14 miembros de bacterias distintos o 5 a 15 miembros de bacterias distintos. En una realización preferida, tal composición reside durante un tiempo entre 3 y 14 días o 3 y 10 días en tal reactor para obtener un colaboroma funcionalmente estable.
La invención se refiere más específicamente a la composición y uso de un conjunto de cepas microbianas, con características funcionales específicas y preadaptadas para funcionar juntas con el fin de prevenir o tratar problemas de salud en seres humanos y animales y obtener un inicio bioterapéutico más rápido y una mayor eficiencia en comparación a un conjunto débilmente ensamblado de las mismas cepas (= “estrategia de ensamblaje”). Este conjunto de microorganismos preadaptados para funcionar juntos toma el nombre de “estrategia de colaboroma” o “estrategia de colaboroma alternativa”.
En otras palabras, la invención se refiere a composiciones preadaptadas de conjuntos de cepas microbianas preferiblemente para uso para disminuir significativamente el tiempo de inicio bioterapéutico y/o aumentar significativamente el efecto del tratamiento de la disbiosis en comparación con un conjunto débilmente ensamblado de las mismas cepas microbianas.
La expresión “disminuir significativamente el tiempo de inicio bioterapéutico” significa que, al estar preadaptado, el conjunto de microorganismos puede ejercer su funcionalidad al menos un 5% más rápido (en una escala temporal), preferiblemente al menos un 10% más rápido, más preferiblemente al menos un 20% más rápido, y lo más preferible al menos un 30% más rápido en comparación con un conjunto de las mismas cepas débilmente ensamblado. Cualquier valor por debajo del 5% se considera fisiológicamente no relevante.
La expresión “aumentar significativamente el efecto del tratamiento” significa que, al estar preadaptado, el conjunto de microorganismos puede ejercer su funcionalidad con al menos un 5% más de eficacia, preferiblemente al menos un 10% más eficiente, más preferiblemente al menos un 20%, y lo más preferible al menos un 30% más eficiente. La eficacia depende del criterio de valoración para el que se ha diseñado el conjunto de microorganismos. Las posibles funcionalidades incluyen, pero no se limitan a, la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC); mejora en la permeabilidad de la barrera intestinal; disminución/aumento de citocinas proinflamatorias; aumento de citocinas antiinflamatorias; disminución de la concentración de patógenos (al menos 0,5 log); disminución de la producción de gas; estimulación de receptores específicos de la pared intestinal; etc. Cualquier valor por debajo del 5% se considera fisiológicamente no relevante.
Por lo tanto, la presente invención se refiere más específicamente a un método para prevenir o tratar la disbiosis de seres humanos y animales que lo necesiten, que comprende administrar una cantidad terapéutica de una composición preadaptada de un conjunto de cepas microbianas a dichos seres humanos o animales, en el que dicho tratamiento da como resultado un inicio bioterapéutico más rápido y/o una mayor eficiencia en comparación con la administración de un conjunto débilmente ensamblado de las mismas cepas microbianas.
Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente en la que dichas bacterias se escogen de la lista de las siguientes cepas: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662, y/o cepas que muestran al menos 97% de identidad de secuencia con las secuencias de ARNr de 16S de al menos una de dichas cepas.
Las cepas indicadas anteriormente que tienen los números de acceso LMG P-29362, LMG P-29360, LMG P-29365, LMG P-29364, LMG P-29361, LMG P-29366 y LMG P-29359 se han depositado en BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica.
Las cepas indicadas anteriormente que tienen los números de acceso DSMZ 17677, LMG24109, DSMZ 16841, DSMZ 16839, DSMZ 22959, ZJ316 y DSMZ 14662 se han depositado en colecciones públicas, se han descrito de forma intensiva, y son accesibles a los expertos en todo el mundo.
Además, debe quedar claro que las variantes de cada una de dichas cepas que muestran al menos 97% (es decir, 97, 98, 99%) de homología de secuencia con la secuencia de ARNr 16S de cada una de dichas cepas correspondientes también son parte de la presente invención. Un ejemplo para determinar dicha “homología” de secuencia se describe, por ejemplo, por Eeckhaut et al. (2008). Como se usa aquí, la expresión “ARNr de 16S” se refiere a una secuencia de ácido nucleico de alrededor de 1542 nucleótidos que es un componente de la subunidad ribosómica procariota pequeña (30S). Se sabe que el ARNr de 16S actúa como un andamio que define las posiciones de las proteínas ribosómicas. La secuencia de ARNr de 16S se usa comúnmente para estudios filogenéticos, ya que se sabe que es una secuencia altamente conservativa. El análisis comparativo de las secuencias de ARNr de 16S de miles de organismos ha demostrado la presencia de secuencias distintivas de oligonucleótidos. Como se usa aquí, el término “homología” se refiere a la similitud de secuencia de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, en general, si dos ácidos nucleicos tienen secuencias idénticas, muestran un 100% de homología. Un cambio en la secuencia nucleotídica de uno de los ácidos nucleicos reduce el porcentaje de homología. En general, el porcentaje de homología cuantifica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico.
La identidad de secuencia u homología de secuencia se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. Por lo general, las identidades o similitudes de secuencia se comparan en toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La “similitud” entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservativos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La “identidad” y la “similitud” se pueden calcular fácilmente mediante diversos métodos, conocidos por los expertos en la técnica. En una realización preferida, la identidad de secuencia se determina comparando la longitud total de las secuencias como se identifican aquí.
Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), públicamente disponibles de n Cb I y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Un algoritmo más preferido utilizado es EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align). Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos usando EMBOSS son espacio abierto 10,0, espacio extendido 0,5, matriz Blosum 62. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleico usando EMBOSS son espacio abierto 10,0, espacio extendido 0,5, matriz completa de ADN (matriz de identidad de ADN).
Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, la persona experta también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos “conservativas”, como será evidente para el experto. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amidas es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustituciones conservativas de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparaginaglutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita aquí son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto de las secuencias descritas y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son las siguientes: Ala por ser; Arg por lys; Asn por gln o his; Asp por glu; Cys por ser o ala; Gln por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn o gln; Ile por leu o val; Leu por ile o val; Lys por arg; gln o glu; Met por leu o ile; Phe por met, leu o tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp o phe; y Val por ile o leu.
Es bien sabido por un experto en la técnica que las secuencias de ARNr de 16s se pueden depositar en línea, por ejemplo en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), y que pueden recuperarse basándose en su número de acceso único para uso como secuencia de ARNr de 16S de referencia en la evaluación de la homología de secuencia, como lo describen por ejemplo Eeckhaut et al. (2008). Los números de acceso de GenBank para las secuencias de ARNr de 16S de 7 especies bacterianas de la composición se enumeran a continuación. Estos números de acceso se pueden utilizar para recuperar las respectivas secuencias de ARNr de 16S a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ para la evaluación de la homología de secuencia.
Figure imgf000012_0001
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicha composición es una composición farmacéutica formulada como una forma administrada por vía rectal o una forma ingerible por vía oral.
A este respecto, la presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente en la que dicha forma ingerible por vía oral es una cápsula, microcápsula, comprimido, gránulo, polvo, trocisco, píldora, suspensión o jarabe.
La presente invención se refiere además a una composición como se describe anteriormente que se incorpora en un alimento, bebida, complemento alimentario o nutracéutico.
De este modo, la presente invención se refiere a una composición como se describe anteriormente que se usa como alimento, complemento alimentario o medicina para un ser humano, un animal terrestre doméstico o de granja no humano o un animal acuático. La composición puede así introducirse en alimentos, alimentos funcionales, complementos alimentarios, cosméticos, formulaciones nutracéuticas, composición probiótica o sustancia farmacéutica. Un alimento es típicamente un material comestible compuesto principalmente de uno o más de los macronutrientes proteína, hidrato de carbono y grasa. Un alimento también puede contener uno o más micronutrientes tales como vitaminas o minerales.
El término alimento, como se usa aquí, también cubre una bebida. Ejemplos de alimentos en los que se puede incorporar la composición incluyen barras de aperitivo, cereales, panecillos dulces, magdalenas, galletas, pasteles, pastas, vegetales procesados, dulces, formulaciones probióticas que incluyen yogures, bebidas, líquidos a base de aceite vegetal, líquidos a base de grasa animal, dulces congelados, y quesos. Los alimentos preferidos incluyen yogures, quesos y otros productos lácteos. Los ejemplos de bebidas incluyen refrescos, jarabes, zumos, mezclas de bebidas secas, y bebidas nutritivas. Un nutracéutico es un ingrediente alimentario, complemento alimentario o producto alimentario que se considera que proporciona un beneficio médico o para la salud, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades. Un alimento funcional es un alimento que normalmente se comercializa como un beneficio para la salud más allá de proporcionar una nutrición pura al consumidor.
La invención también proporciona un probiótico que comprende una composición discutida aquí. Un probiótico es típicamente un suplemento vivo que puede mejorar la microbiota intestinal. Dichos probióticos pueden administrarse particularmente a los seres humanos, pero también a los animales domésticos y de granja y a los organismos acuáticos. El probiótico puede comprender además uno o más excipientes o aromatizantes aceptables, que son adecuados para la ingestión por parte de un ser humano o un animal.
La composición de la invención puede usarse en la producción de composiciones farmacéuticas. De este modo, la invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una composición de la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones que comprenden compuestos de la invención pueden presentarse en diversas formas, por ejemplo en forma de comprimido, cápsula o polvo. Ejemplos de excipientes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen diluyentes (por ejemplo, almidón, derivados de celulosa o derivados de azúcar), un estabilizador (por ejemplo, excipientes higroscópicos tales como sílice o maltodextrina), un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio), un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de fosfato), un aglutinante, revestimiento, conservante o agente de suspensión. Los excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención se refiere más específicamente a una composición como se describe anteriormente en la que dicha composición comprende un total entre 105 y 1011 unidades formadoras de colonias de bacterias de la presente invención.
Aquí y en sus reivindicaciones, el verbo “comprender” y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además, el verbo “consistir” puede ser reemplazado por “consistir esencialmente en”, lo que significa que una composición como se define aquí puede comprender componente o componentes adicionales a los específicamente identificados, no alterando dicho o dichos componentes adicionales la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. De este modo, el artículo indefinido “un” o “una” normalmente significa “al menos uno”.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1. Establecimiento de la composición de la presente invención
1.1 Aislamiento de bacterias para la composición
Se seleccionó a un donante joven y sano sin exposición previa a la terapia con antibióticos para inocular el modelo SHIME®. Al controlar varios parámetros operativos del modelo SHIME® (Fig. 1, Van den Abbeele et al., 2010), se pueden enriquecer y seleccionar redes de microbiota intestinal que tienen un impacto beneficioso en la salud humana, tal como la microbiota involucrada en la fermentación de la fibra dietética, el metabolismo de los ácidos biliares, la degradación de la lactosa, etc. La configuración SHIME® se utilizó para el aislamiento de cepas bacterianas con diferentes propiedades funcionales, tales como degradadoras de fibra (por ejemplo Bifidobacterias, Bacteroides), fermentativas (por ejemplo Escherichia coli) o productoras de lactato (por ejemplo, lactobacilos, pediococos y enterococos), productoras de butirato (por ejemplo, Anaerostipes caccae, Butyricicoccus pullicaecorum, Faecalibacteruim prausnitzii, Roseburia hominis, Roseburia inulinivorans, Clostridium butyricum) y productoras de propionato (por ejemplo Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila). Para ello se seleccionaron medios selectivos tales como LAMVAB (lactobacilos; Hartemink et al. 1997), RB (bifidobacterias; Hartemink et al. 1996), medio de enterococo (enterococos; Possemiers et al. 2004), TBX (Escherichia coli; Le Bon et al. 2010), BBE (grupo de Bacteroides fragilis; Livingston et al. 1978), medio mínimo de mucina ((Akkermansia; Derrien et al. 2004), M2GSC (productores de butirato; Barcenilla et al. 2000) o medio SHIME mínimo que contiene lactato (productores de butirato), medio SHIME mínimo que contiene succinato y fucosa (productores de propionato), medios mínimos enriquecidos con sulfato (reductores de sulfato), medio SHIME mínimo que contiene arabinoxilano, y placas de agar sangre (Prevotella). Además del SHIME, también se aislaron bacterias directamente de una muestra fecal reciente de un donante sano, utilizando la misma estrategia.
En la práctica, se prepararon diluciones diez veces mayores de muestras recogidas de los compartimentos colónicos del SHIME o muestras fecales homogeneizadas, y se extendieron sobre placas de agar con la composición de medio específica como se describe anteriormente. Las placas se incubaron a 37°C teniendo en cuenta las respectivas condiciones de crecimiento de los diferentes grupos bacterianos. Tras la incubación, se recogieron aproximadamente 30 colonias por grupo bacteriano y se incubaron en los respectivos medios de cultivo líquidos en condiciones apropiadas. Las concentraciones de ácidos grasos de cadena corta en los cultivos durante la noche se analizaron usando cromatografía de gases como se describe en Possemiers et al. (2004). Además, se utilizó una muestra de los cultivos líquidos para el análisis filogenético. El ADN se extrajo como se describe en Possemiers et al. 2004, y las secuencias de ARNr de 16S casi completas se amplificaron para cada aislado usando los cebadores eubacterianos universales fD1 y rD1 (Weisburg et al. 1991). Tras la purificación, las muestras de ADN se enviaron para su secuenciación. Las secuencias obtenidas se alinearon con las secuencias existentes para la identificación de cada aislado utilizando la caja de herramientas BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1.2 Diseño de la composición de la presente invención
Para combinar diferentes cepas bacterianas en redes microbianas funcionales reales, se utilizaron los cultivos puros aislados del reactor SHIME® y fecales (como se describe en el ejemplo 1.1). Además, los cultivos puros se obtuvieron de colecciones de cultivos tales como BCCM/LMG (http://bccm.belspo.be) y DSMZ (www.dsmz.de).
Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los productos finales de la fermentación de las fibras dietéticas por la microbiota intestinal, y se sabe que ejercen varios efectos beneficiosos sobre la salud del hospedante. Los principales AGCC producidos son acetato, butirato y propionato en un relación molar aproximada de 60:20:20. Mientras que el acetato puede ser absorbido por el intestino y utilizado como sustrato energético por el hospedante, el butirato actúa como principal fuente de energía para el epitelio intestinal y tiene efectos protectores comprobados contra la inflamación y el cáncer de colon. El propionato tiene una actividad local similar en el intestino en comparación con el butirato, pero también se transporta al hígado, en el que se demostró que tiene efectos positivos para reducir el colesterol y efectos sobre el control glucémico.
Teniendo en cuenta las importantes y diversas funciones fisiológicas de los AGCC, la alteración de esta función microbiana intestinal (por ejemplo, en trastornos gastrointestinales) puede tener un impacto significativo en la salud del hospedante. En consecuencia, en este ejemplo, se realizó un cribado para diseñar una composición que pueda inducir la producción total de AGCC más alta y las relaciones relativas de producción de AGCC más interesantes. Para esto último, el butirato se consideró el más interesante entre los diferentes AGCC producidos. Además, se evaluó el efecto de las diferentes composiciones sobre la integridad de la barrera intestinal mediante un cocultivo de células epiteliales e inmunes.
En la práctica, un total de 20 aislados con los perfiles de fermentación más interesantes, obtenidos de la ronda de aislamiento y selección como se describe en 1.1 (denominada “Aislado-X”) u ordenados de colecciones de cultivo, se recuperaron de sus lotes de glicerol y se cultivaron bajo sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento para obtener suspensiones homogéneas de las cepas bacterianas.
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Los aislamientos se combinaron en números que oscilan de 2 a 10 en un conjunto de 98 experimentos de cribado iniciales individuales. Para cada experimento, la fermentación se inició en botellas de incubación estériles que contenían medio nutricional SHIME® esterilizado ajustado a pH 6,8 con KH2PO4/K2HPO4 e inundadas con nitrógeno. Después, el medio esterilizado se inoculó con 10% (v/v) de inóculo mixto que consiste en volúmenes iguales de la especie seleccionada. Las botellas de incubación se inundaron con nitrógeno para asegurar condiciones anaerobias, y se incubaron a 37°C (90 rpm). Las muestras se analizaron después de 24 h para determinar la producción de AGCC. Las composiciones con la producción de butirato más alta se seleccionaron entonces y se usaron posteriormente en el experimento final con 23 conjuntos diferentes de bacterias (denominadas MX-Y, en las que X = número de aislados presentes en la composición, e Y = composición única A, B, C, etc. con X aislados).
Figure imgf000015_0001
Estas 23 combinaciones se incubaron nuevamente como se describe anteriormente. Después de 24 h, las muestras se recolectaron para el análisis de AGCC y para combinación con el modelo de co-cultivo de células Caco-2 y THP1, como se describe en Possemiers et al. (2013). El criterio de valoración del último experimento fue la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) como medida de los efectos protectores hacia la función de barrera intestinal.
La Fig. 2 describe los niveles de butirato obtenidos tras 24 h de incubación de las 23 composiciones diferentes, así como su efecto sobre los valores de TEER. Se observó una fuerte variación tanto en los niveles de butirato como en los efectos sobre el funcionamiento de la barrera intestinal, y las combinaciones con los niveles más altos de butirato no necesariamente indujeron los efectos protectores más altos en los niveles de TEER, como lo muestran las diferentes clasificaciones. Sorprendentemente, una composición de 7 aislados diferentes (denominada como M7-B en la Fig. 2) se clasificó en primer lugar en ambos niveles de butirato después de 24 h y especialmente en los efectos protectores hacia la función de barrera intestinal. Esta composición contenía 6 aislados del SHIME y un cultivo obtenido de una muestra fecal humana. La secuenciación del gen de ARNr de 16S y la comparación de la secuencia con la base de datos NCBI BLAST revelaron que M7-B estaba compuesto por nuevos aislados SHIME de Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae y de un nuevo aislado fecal de Butyricicoccus pullicaecorum. Curiosamente, los nuevos aislados estaban todos presentes en al menos una de las otras composiciones mostradas en la Fig. 2, pero ninguna de las otras composiciones alcanzó la misma eficacia con respecto a la producción de butirato y la protección de los valores de TEER. Esto muestra que el efecto observado no está relacionado con una de las especies específicas presentes en la composición, sino que solo la combinación específica de estas 7 bacterias conduce a los sorprendentes resultados positivos.
Los 7 nuevos aislados se depositaron en la colección de bacterias BCCM/LMG (Gante, Bélgica), con números de acceso: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia hominis LMG P-29364, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Lactobacillus plantarum LMG P-29366 y Anaerostipes caccae LMG P-29359.
Como evidencia experimental adicional de la sorprendente sinergia entre los 7 aislados y la necesidad de presencia de cada una de las especies, se montó un experimento en el que cada vez se retiró (es decir, se eliminó) uno de los aislados de la composición original de 7 aislados. En la práctica, la fermentación se inició nuevamente en botellas de incubación estériles que contenían medio nutricional SHIME® esterilizado ajustado a pH 6,8 con KH2PO4/K2HPO4 e inundadas con nitrógeno. Después, el medio esterilizado se inoculó con 10% (v/v) de inóculo mixto que consiste en volúmenes iguales de 6 de los 7 aislados. La composición completa de 7 aislados actuó como control, lo que dio como resultado un total de 8 incubaciones paralelas. Las botellas de incubación se inundaron con nitrógeno para asegurar condiciones anaerobias, y se incubaron a 37°C (90 rpm). Las muestras se analizaron después de 24 h y 48 h para determinar la producción de butirato. Como se muestra en la Fig. 3, la eliminación de solo una especie de la composición original disminuyó significativamente los niveles de producción de butirato después de 24 h para todas las composiciones de 6 especies por debajo del 80% de la producción de butirato de la composición original. También después de 48 h de incubación, los niveles de butirato fueron significativamente menores para todas las composiciones de 6 especies, con la excepción de la composición que excluye Roseburía hominis. Esto confirma que todos los aislados de la composición son esenciales para alcanzar todo el potencial de la composición. Como solo la composición que excluye Roseburía hominis todavía dio como resultado una funcionalidad similar de la composición completa después de 48 h de incubación, también se puede considerar - como segunda mejor opción - el uso de la composición de 6 especies, que consiste esencialmente en Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburía inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae.
1.3. Producción de la composición de la presente invención
Una composición formada por las especies Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae se produce utilizando 3 estrategias diferentes. Estas estrategias incluyen 1) cultivar las especies de la composición por separado, seguido de mezclarlas juntas, 2) cultivar las especies de la composición juntas en un fermentador de múltiples etapas (es decir, el modelo SHIME® in vitro como se describe anteriormente), y 3) cultivar las especies de la composición juntas en un fermentador de una sola etapa.
En la primera estrategia (= la estrategia de “ensamblaje”), las especies seleccionadas se recuperaron de sus lotes de glicerol y se cultivaron en sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento para obtener suspensiones homogéneas de las cepas bacterianas. Para evaluar su actividad funcional, se creó un inóculo mixto que consiste en volúmenes iguales de las especies seleccionadas. Este inóculo se añadió al 10% (v/v) a botellas de incubación estériles que contenían medio nutricional SHIME® esterilizado ajustado a pH 6,8 con KH2PO4/K2HPO4. Las botellas de incubación se inundaron con nitrógeno para asegurar condiciones anaerobias, y se incubaron a 37°C (90 rpm). A intervalos específicos de 16 h, el 40% (v:v) del medio de crecimiento se reemplazó con medio nutricional SHIME® acondicionado. El medio nutricional SHIME® acondicionado se preparó incubando 700 ml de alimento SHIME® normal (pH 2) durante 1 hora a 37°C, después de lo cual se añadieron 300 ml de jugo pancreático (pH 6,8) - suplementado con 25 g/l de NaHCO3, 23,6 g/l de KH2PO4 y 4,7 g/l de K2HPO4 -. Las muestras se analizaron durante un período de 5 días para la producción de AGCC (Fig. 4). Los niveles de butirato alcanzaron 7 mM tras 24 h de incubación del conjunto y un máximo de 14 mM después de 5 días.
En la segunda estrategia (es decir, la estrategia de “Colaboroma”, o la estrategia “en la que dichas bacterias se cultivan juntas en un simulador dinámico del tracto gastrointestinal antes de la administración”), las especies seleccionadas se recuperaron de sus lotes de glicerol y se cultivaron en sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento para obtener suspensiones homogéneas de las cepas bacterianas. Después, las cepas se mezclaron e inocularon por triplicado en una configuración SHIME® (Van den Abbeele et al., 2010) que consiste en una única región de colon a un pH de 6,15­ 6,4. Se implementó un período de adaptación de dos semanas para crear una composición funcional de colaboroma. La necesidad y relevancia de tal período de adaptación queda claramente demostrada por la evolución de los perfiles de AGCC durante el cultivo de la composición de las especies seleccionadas (Fig. 5). Inicialmente, la composición requiere tiempo para adaptarse entre sí y volverse activa en la conversión de los sustratos suministrados en AGCC. Sin embargo, cuatro a seis días después de la inoculación, la producción de AGCC por la composición comenzó a estabilizarse, y se midieron niveles altos de butirato. En el último día de incubación (día 14), cada una de las incubaciones por triplicado dio como resultado una composición funcional muy similar, estable y fuertemente activa, alcanzando los niveles de butirato 19 mM.
Cuando el Colaboroma estabilizado se congeló a -80°C como lote de glicerol y se descongeló posteriormente para uso como inóculo de la misma manera que para la estrategia de ensamblaje, los niveles de butirato -sorprendentemente - aumentaron más rápido y alcanzaron niveles 25% más altos en las mismas condiciones de incubación que para el ensamblaje de especies individuales (Fig. 4). Los niveles de butirato ya alcanzaron 12 mM tras 24 h de incubación del montaje, y ya se alcanzó un máximo de 19 mM después de 2 días.
En la tercera estrategia, la producción de dicha composición se llevó a cabo utilizando un enfoque optimizado de fermentador de una sola etapa, operado en modo de lote alimentado (es decir, la estrategia alternativa de “Colaboroma”, o la estrategia “en la que dichas bacterias se cultivan juntas en un fermentador antes de la administración”). Las especies seleccionadas se recuperaron de sus lotes de glicerol y se cultivaron en sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento para obtener suspensiones homogéneas de las cepas bacterianas. La fermentación se inició en botellas de incubación estériles que contenían alimento SHIME® esterilizado ajustado a pH 6,8 con KH2PO4/K2HPO4 e inundadas con nitrógeno. Después, el medio esterilizado se inoculó con 10% (v/v) de inóculo mixto que consiste en volúmenes iguales de las especies seleccionadas. Las botellas de incubación se inundaron con nitrógeno para asegurar condiciones anaerobias, y se incubaron a 37°C (90 rpm). A intervalos específicos de 16 h, el 40% (v:v) del medio de crecimiento se reemplazó con medio nutricional SHIME® acondicionado. El medio nutricional SHIME® acondicionado se preparó incubando 700 ml de alimento SHIME® normal (pH 2) durante 1 hora a 37°C, después de lo cual se añadieron 300 ml de jugo pancreático (pH 6,8) - suplementado con 25 g/l de NaHCO3, 23,6 g/l de KH2PO4 y 4,7 g/l de K2HPO4 -.
Como se muestra en la Fig. 6, la producción total de AGCC y la relación de AGCC producida por la composición fue estable después de 6 ciclos de reemplazo. Cuando se volvió a inocular con la misma estrategia que se describió anteriormente, el Colaboroma estabilizado condujo a una producción maximizada de AGCC (la relación acetato/propionato/butirato fue de alrededor de 14/12/74) 2 días antes en comparación con el mismo conjunto de especies en la estrategia de ensamblaje, y una producción de butirato un 25% superior.
Ejemplo 2: Experimentos in vitro
2.1 Efecto de la adición de la composición funcional a comunidades intestinales microbianas complejas
Este experimento demuestra que la composición funcional es activa cuando se inocula en una comunidad intestinal microbiana mixta, en la que existe una fuerte competencia por los sustratos colónicos con los miembros de esta comunidad intestinal compleja que se estima que consta de 500 a 1000 especies microbianas. Para abordar este problema, se realizó un experimento en pequeñas botellas de incubación utilizando la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae y producida a través de la estrategia de Colaboroma del ejemplo 1.3. Se lavó una concentración creciente de la composición preadaptada (0, 4 y 20%) en PBS, y se añadió a tres medios diferentes:
1) Medio basal estéril [2 g/l de peptona, 2 g/l de extracto de levadura, 2 ml/l de Tween 80, 10 p/l de vitamina K1, 500 mg/l de L-cisteína HCl, 100 mg/l de NaCl, 40 mg/l de K2HPO4, 40 mg/l de KH2PO4, 10 mg/l de MgSO4.7H2O, 6,7 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,5 mg/l de resazurina, 50 mg/l de hemina (50 mg/l) - pH 5,5] almidón 6 g/l
2) Medio basal suspensión fecal al 20% (preparada como se describe en De Boever et al., 2000);
3) Medio basal suspensión de colon SHIME® al 20%, que contiene la microbiota completa.
La concentración creciente del consorcio productor de butirato preadaptado de 0% a 4% y 20% dio como resultado un aumento proporcional de los niveles absolutos de butirato (Fig. 7). Esto no solo se observó en medio estéril, sino también en medios complementados con una microbiota mixta derivada tanto de una muestra fecal como de una región del colon SHIME®. De este modo, este experimento demuestra que la composición no solo es activa cuando está presente en un entorno colónico no competitivo, sino que también da como resultado niveles más altos de butirato cuando se administra a una microbiota mixta en la que muchos microbios intestinales compiten por los mismos nutrientes. Además, no solo aumentó la producción de butirato, sino que también aumentó fuertemente la producción de propionato. La combinación de estos aumentos y la disminución de acetato en la incubación estipulan que la composición puede modular los perfiles de fermentación microbiana generales en un perfil más beneficioso para la salud.
2.2 Eficiencia de la composición funcional para restaurar las funciones metabólicas de una comunidad microbiana intestinal disbiosada inducida por antibióticos
Se cree que el uso de antibióticos causa importantes alteraciones de la comunidad de la microbiota intestinal. Se ha demostrado que una composición microbiana disbiosada es más susceptible a infecciones por patógenos. Además, una serie de enfermedades gastrointestinales se han correlacionado con una composición microbiana disbiosada, tales como las enfermedades inflamatorias del intestino, lo que subraya la importancia de un microbioma intestinal sano. La recuperación de la composición taxonómica y especialmente de la funcionalidad después de la ingesta de antibióticos a largo plazo suele tardar tres meses en alcanzar el estado previo al tratamiento, una comunidad microbiana intestinal saludable (Panda et al., 2014). Una disminución en el tiempo de recuperación después de la exposición a la terapia con antibióticos podría reducir así el riesgo de infecciones graves y promover la salud del hospedante en general. En ese sentido, la actividad funcional observada de la composición seleccionada podría ser una estrategia prometedora para mejorar la restauración de las comunidades microbianas tras la disbiosis inducida por antibióticos y reducir los riesgos de infección.
En este ejemplo, la disbiosis inducida por antibióticos se modeló en el modelo SHIME® in vitro dosificando los antibióticos adecuados. El objetivo de este experimento fue evaluar la recuperación de los perfiles típicos de metabolitos “sanos” en los entornos de colon intestinal simulado tras la administración de la composición funcional. Además, el experimento tuvo como objetivo diferenciar la efectividad de la composición, cuando se produce a través de la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma” (véase ejemplo 1.3). El experimento se realizó nuevamente con la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae. Para imitar mejor el perfil completo de funcionalidad del microbioma intestinal, la composición se complementó además en este experimento específico con Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatus
En la práctica, las vasijas SHIME® (pH 6,15-6,40) se inocularon con materia fecal y se dejaron estabilizar durante 14 días (configuración M-SHIME® - Van den Abbeele et al., 2012). Después de un período de control de 2 semanas, la microbiota del colon derivada de SHIME® se trató con un cóctel de antibióticos (40/40/10 mg/l de amoxicilina/ciprofloxacina/tetraciclina, respectivamente) para inducir la disbiosis. Un día después, la microbiota disbiosada se trató durante 5 días con la composición funcional, producida mediante la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma”. El criterio de valoración del estudio fue evaluar la recuperación de los perfiles típicos de metabolitos de AGCC “sanos” en los entornos de colon intestinal simulado. Se incluyó una vasija SHIME® de control para simular la recuperación espontánea de la actividad metabólica de la comunidad intestinal después de la exposición a antibióticos, sin la administración de la composición. Los resultados se expresan como el delta de los niveles de AGCC en el SHIME en cada punto de tiempo frente a los valores antes de la administración del antibiótico (Fig. 8).
Tras el tratamiento con antibióticos de las vasijas SHIME®, se observó una caída significativa en la producción de acetato, propionato y butirato. Este hallazgo confirma la alteración de la comunidad microbiana intestinal. La recuperación del perfil de metabolitos (en términos de producción de AGCC) al estado de pretratamiento se muestra en la Fig. 8 como la evolución de acetato, propionato y butirato durante un período de 5 días. Esto muestra que la recuperación de la funcionalidad fue lenta en la situación de control (sin administración de la composición), y no se pudo observar una recuperación completa para el acetato y el propionato en 5 días. Curiosamente, el tratamiento con la composición dio como resultado una recuperación más rápida en comparación con la condición de control para los 3 AGCC. Además, mientras que la composición de la estrategia de Ensamblaje indujo la recuperación completa de propionato y butirato después de 5 días y 3 días, respectivamente, la composición de la estrategia de Colaboroma indujo una recuperación más rápida en oposición a la estrategia de Ensamblaje con recuperación completa de propionato y butirato después de 4 días y 2,5 días, respectivamente. Finalmente, la estrategia de Colaboroma también dio como resultado un aumento de la actividad final, con mayores niveles de propionato y butirato en contraposición a la estrategia de Ensamblaje. Estos resultados enfatizan el potencial de la composición para la recuperación de la disbiosis microbiana mediada por antibióticos. Además, este hallazgo demuestra claramente que la preadaptación a través de la estrategia de Colaboroma da como resultado una recuperación más eficiente de la producción de AGCC microbianos después de la exposición a antibióticos en comparación con la estrategia de Ensamblaje.
2.3: Eficiencia de la composición funcional para restaurar las funciones metabólicas de una comunidad microbiana intestinal disbiosada en Enfermedades Inflamatorias Intestinales
Las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) se han asociado con interacciones alteradas entre el hospedante y el microbio, que al menos se relaciona parcialmente con un estado de disbiosis de la microbiota intestinal. Este último, por ejemplo, incluye una menor abundancia de butiril CoA:acetato CoA transferasa y propionato cinasa (Vermeiren et al., FEMS 2011), lo que a su vez afecta negativamente a la producción de una capacidad de producción equilibrada de AGCC. Dados los importantes efectos de los AGCC sobre el desarrollo y mantenimiento intestinal normales, la restauración de la composición y funcionalidad de la microbiota en términos de producción de AGCC puede tener un impacto positivo en los síntomas asociados con la IBD. En ese sentido, la actividad funcional observada de la composición seleccionada podría ser una estrategia prometedora para mejorar la restauración de las comunidades microbianas en la disbiosis de la IBD como base para la restauración y el mantenimiento de una barrera intestinal sana.
En este ejemplo, la disbiosis asociada a la IBD se modeló en el modelo M-SHIME® in vitro, como se describe anteriormente (Vigsnaes et al. 2013). El objetivo de este experimento fue evaluar la recuperación de la microbiota en términos de perfiles de AGCC en el entorno del colon intestinal simulado tras la administración de la composición funcional. Además, el experimento tuvo como objetivo diferenciar la efectividad de la composición, cuando se produce a través de la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma” (véase el ejemplo 1.3). El experimento se realizó nuevamente con la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Fioseburia inulinivorans, Fioseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae.
En la práctica, las vasijas SHIME® (pH 6,15-6,40) se inocularon con material fecal de un paciente con colitis ulcerosa (configuración M-SHIMe® - Van den Abbeele et al., 2012). Simultáneamente, se añadió una dosis única de la composición funcional, producida mediante la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma”, a la región del colon para simular la administración. Se realizó un tercer experimento en paralelo como experimento de control sin administración de la composición. La producción de acetato, propionato y butirato se siguió 1 y 2 días después de la administración de la composición.
Los resultados se presentan en la Fig. 9: la administración de la composición, producida en la estrategia de Ensamblaje, dio como resultado un aumento de la producción de AGCC (principalmente acetato y butirato) el día 1, pero este efecto ya no era evidente el día 2. Esto indica que la composición es funcionalmente activa en el entorno del microbioma de IBD. Curiosamente, el efecto sobre la producción de propionato y butirato fue mucho más pronunciado tras la administración de la composición de la estrategia de Colaboroma, con un aumento de 4 y 3 veces en la producción de propionato y butirato, respectivamente, en comparación con el control de IBD. En contraste con la composición de la estrategia de Ensamblaje, el efecto aún fue pronunciado en d2 y coincidió con una menor producción de acetato (indicación de un aumento de la alimentación cruzada y, por lo tanto, una mejor interconexión). Estos resultados enfatizan el potencial de la composición para la recuperación de la disbiosis microbiana asociada a la IBD. Además, este hallazgo demuestra claramente que la preadaptación a través de la estrategia de Colaboroma da como resultado una recuperación más eficiente de la producción de AGCC microbianos en condiciones de IBD en comparación con la estrategia de Ensamblaje.
2.4: Eficiencia de la composición funcional para inhibir el crecimiento de Clostridium difficile vegetativa en un ensayo de simulación in vitro
En este ejemplo, se realizó un ensayo de exposición a Clostridium difficile con el objetivo de evaluar si la composición funcional no solo es funcionalmente activa en condiciones intestinales, sino que también puede proteger el entorno intestinal frente a infecciones. En tal ensayo de exposición, la composición se expuso a células de Clostridium difficile (Cdif) vegetativas para evaluar su capacidad para inhibir el crecimiento de Cdif en condiciones gastrointestinales simuladas. Además, el experimento tuvo como objetivo diferenciar la efectividad de la composición, cuando se produce a través de la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma” (véase el ejemplo 1.3). El experimento se realizó nuevamente con la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae.
En la práctica, un lote glicerólico de Clostridium difficile (LMG 21717T) se descongeló e inoculó en una botella que contenía caldo de Medio Clostridial Reforzado (RCM) que se inundó con nitrógeno para asegurar condiciones anaerobias. La botella se incubó en una incubadora con agitación (90 rpm) durante 24 horas, y se inoculó de nuevo 10% del cultivo desarrollado en caldo RCM. Después de 24 h de crecimiento, el cultivo de C. difficile homogeneizado se dividió en alícuotas (por triplicado) en botellas (10% v:v) que contenían:
1) Medio basal (blanco);
2) Medio basal que contiene la composición de la estrategia de Ensamblaje;
3) Medio basal que contiene la composición de la estrategia de Colaboroma;
4) Medio basal que contiene suspensión de colon SHIME®.
Las botellas se incubaron a 37°C en una incubadora con agitación (90 rpm). En momentos regulares, se recogió una muestra y se congeló inmediatamente a -802C antes de cuantificar C. difficile mediante un ensayo de qPCR basado en la detección y cuantificación del gen de la triosa fosfato isomerasa. Para ello, se extrajo ADN genómico según Boon et al. (2003). La reacción de amplificación incluyó oligonucleótidos directo e inverso: 5’-TATGGACTATGTTGTAATAGGAC-3’ (directo) y 5’-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3’ (inverso). La cuantificación absoluta del producto de PCR se obtuvo mediante la creación de un patrón estándar.
En este ensayo de simulación in vitro controlado, se observó crecimiento de C. difficile en el medio basal tras 48 h de incubación, lo que confirma la validez del blanco en el ensayo de simulación in vitro. La suspensión de colon SHIME® (como simulación de un trasplante fecal real) mostró la mayor inhibición del crecimiento de C. difficile tras 48 h de incubación (es decir, 58%). Curiosamente, se obtuvo un resultado similar para la composición de la estrategia de Colaboroma, que muestra aproximadamente 53% de inhibición del crecimiento de C. difficile. El efecto más bajo se observó cuando se añadió la composición de la estrategia de Ensamblaje (es decir, 23% de inhibición del crecimiento). Este experimento demuestra claramente que C. difficile es inhibida de forma significativa en su crecimiento por la composición, y que esta inhibición es más pronunciada en caso de preadaptación de la composición a través de la estrategia de Colaboroma.
2.5: Efecto de la composición funcional sobre los biomarcadores del hospedante del funcionamiento de la barrera intestinal y la inmunidad intestinal
Los ejemplos 2.1 a 2.3 mostraron que la composición es funcionalmente activa en condiciones intestinales complejas y puede restaurar los perfiles de metabolitos intestinales, con la mayor actividad en el caso de la producción a través de la estrategia de Colaboroma. Esto, a su vez, puede influir de forma beneficiosa en el epitelio intestinal y, por tanto, en el funcionamiento de la barrera intestinal y la inmunidad local.
Para evaluar esa posibilidad, este ejemplo describe la combinación de muestras recogidas de los experimentos anteriores en un modelo celular de cocultivo establecido de enterocitos (células Caco-2) y macrófagos (THP1) (Possemiers et al. 2013). En este modelo, la estimulación de las células THP1 con LPS da como resultado un aumento de la producción de citocinas proinflamatorias, que a su vez tienden a alterar la capa de enterocitos creando la denominada condición de intestino permeable. El efecto sobre el intestino permeable se mide evaluando el efecto de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) [medida para determinar la eficacia de la barrera intestinal] y la producción de citocinas inflamatorias, en comparación con una condición de control.
En la práctica, las muestras recogidas el día 1 del experimento M-SHIME del ejemplo 2.3 se combinaron con el modelo de co-cultivo de intestino permeable.
2.6: Impacto de las variaciones en la identidad de la cepa sobre la actividad funcional de la composición
Para evaluar si el sorprendente efecto sinérgico entre los 7 aislados en la composición es específico de la cepa, o también si se puede alcanzar con otras cepas de la misma especie, se realizó un experimento adicional. En este ejemplo, se producen dos composiciones diferentes mediante la estrategia de “Colaboroma” (véase el ejemplo 1.3).
Mientras que la composición 1 contiene los aislados específicos descritos en el ejemplo 1.2, la composición 2 está compuesta de cepas de la misma especie obtenidas de colecciones de cultivos:
• Composición 1: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia hominis LMG P-29364, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Lactobacillus plantarum LMG P-29366 y Anaerostipes caccae LMG P-29359
• Composición 2: Lactobacillus plantarum ZJ316, Faecalibacterium prausnitzii (DSMZ 17677), Butyricicoccus pullicaecorum (LMG 24109), Roseburia inulinivorans (DSMZ 16841), Roseburia hominis (DSMZ 16839), Akkermansia muciniphila (Ds Mz 22959) y Anaerostipes caccae (DSMZ 14662)
En la práctica, las especies seleccionadas se recuperaron de sus lotes de glicerol y se cultivaron en sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento para obtener suspensiones homogéneas de las cepas bacterianas. Después, las cepas se mezclaron en la Composición 1 y la Composición 2, respectivamente, y cada una de ellas se inoculó por triplicado en una configuración SHIME® (Van den Abbeele et al., 2010) que consiste en una única región de colon, a un pH de 6,15-6,4. Los perfiles de producción de butirato se siguieron durante un período de 14d.
Curiosamente, la dinámica en la producción de butirato fue muy similar para ambas Composiciones, con fuertes fluctuaciones iniciales, seguidas de la estabilización de los niveles de butirato después de aproximadamente 6 días. Al final del experimento (d14), los niveles de butirato para la Composición 1 alcanzaron 19,3 mM, mientras que los niveles para la Composición 2 fueron 18,8 mM. Esto muestra que el efecto sinérgico observado en la composición del ejemplo 1.2 podría replicarse utilizando diferentes cepas obtenidas de la misma especie.
Ejemplo 3: Experimentos in vivo
3.1: Modelo de ratón de alteración de la microbiota gastrointestinal inducida por antibióticos
El objetivo del experimento en este ejemplo fue evaluar si la composición funcional también puede restaurar, en un marco in vivo, la capacidad metabólica del microbioma intestinal después de la disbiosis inducida por antibióticos.
En este ejemplo, se usó la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae, y se produjo a través de la estrategia de “Colaboroma” del Ejemplo 1.3. Además, para evaluar la necesidad de una imitación más completa del perfil de funcionalidad completo del microbioma intestinal, se realizó un experimento adicional en el que la composición se complementó aún más con Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatus (denominada “composición ampliada”).
En la práctica, la “composición” y la “composición extendida” se prepararon de forma reciente según la estrategia de Colaboroma, se lavaron dos veces en PBS (en una cámara anaeróbica para asegurar condiciones anaerobias), se concentraron en 100 pl, y se administraron a los ratones mediante sonda oral tan pronto como sea posible. Se adquirieron ratones (C57/BL6) de al menos 5 semanas de edad, se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y se alimentaron con una dieta estándar. Los experimentos con ratones se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité de Ética de Ensayos con Animales de la Universidad de Gante, Bélgica. Para inducir la disbiosis inducida por antibióticos, se dosificó el antibiótico clindamicina en el agua de bebida a una concentración de 250 mg/l. Después de 5 días de tratamiento con antibióticos, el contenido del estómago de los ratones se neutralizó con NaHCO3, después de lo cual los ratones (10 ratones por grupo) se alimentan por sonda oral durante 5 días consecutivos con:
1) la composición en disolución salina;
2) la composición extendida en disolución salina, y
3) disolución salina (Control).
Se incluye un grupo convencional (sin tratamiento con antibióticos pero tratado con disolución salina) como control para excluir la variabilidad derivada del procedimiento de alimentación por sonda. Durante el experimento, se recolectaron muestras fecales (aprox. 100 mg/ratón) y se almacenaron a -80°C para análisis futuros.
Los perfiles de AGCC, obtenidos de muestras fecales de ratones reunidas procedentes de los mismos grupos, demuestran que 5 días de tratamiento con antibióticos reducen significativamente la producción de butirato y propionato hasta el punto de que solo queda acetato (Fig. 10). Como se muestra en la Fig. 10, la recuperación espontánea de las funciones metabólicas es lenta y solo comenzó unos 5 días (d 10) después del último tratamiento antibiótico, aunque las relaciones molares de los tres AGCC principales (acetato, propionato y butirato) no volvieron sin embargo al estado previo a los antibióticos. Sin embargo, cuando se trató a los ratones con la composición o la composición extendida de la estrategia de Colaboroma, la recuperación del metabolismo del butirato comenzó aproximadamente 3 días (d8) después del tratamiento con antibióticos. Además, la actividad metabólica de los ratones tratados con ambas composiciones mostró una recuperación casi completa 5 días después de la última dosis de antibióticos (d10), con buena producción tanto de propionato como de butirato. La composición extendida contenía una mayor diversidad de productores de acetato y propionato en comparación con la composición, lo que también se refleja por el perfil de fermentación ligeramente diferente en el d10 del experimento. En conclusión, este ejemplo proporciona una confirmación in vivo de que la composición funcional es eficaz para obtener una recuperación más rápida y potente de los perfiles metabólicos intestinales tras la disbiosis inducida por antibióticos. Además, las variaciones en las combinaciones de especies exactas en la composición permiten ajustar el resultado final a perfiles metabólicos específicos.
3.2: Modelo de ratón TNBS para la inflamación
El modelo de TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico) es un modelo de uso común para la colitis que imita algunas de las características de la enfermedad de Crohn (Scheiffele et al. 2001), incluyendo la pérdida de peso, diarrea sanguinolenta y engrosamiento de la pared intestinal. En histopatología, TNBS causa inflamación transmural en parches del intestino con la formación de úlceras profundas, características clásicas que se encuentran en pacientes con EC. Esto hace que el modelo de TNBS sea un buen candidato para la evaluación in vivo de la capacidad de la composición funcional para prevenir y/o restaurar el daño a la mucosa intestinal en la IBD, y ayudar a mantener/desarrollar una barrera intestinal saludable.
En este ejemplo, la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Fioseburia inulinivorans, Fioseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae, se utilizó para evaluar los efectos beneficiosos tras la evaluación en el modelo de TNBS. Además, el experimento tuvo como objetivo diferenciar la efectividad de la composición, cuando se produce a través de la estrategia de “Ensamblaje” o la estrategia de “Colaboroma” (véase el ejemplo 1.3). La colitis se provocó en los animales por instilación rectal de TNBS, un agente sensibilizante de la mucosa diluido en etanol. La administración de etanol es un requisito previo para romper la barrera de la mucosa colónica y permitir la penetración de TNBS en la lámina propia. TNBS hapteniza las proteínas microbianas localizadas del colon y del intestino para que se vuelvan inmunogénicas, desencadenando de ese modo las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas del hospedante.
En la práctica, se alojaron ratones C57BL6/J machos de 8 a 10 semanas de edad en una habitación con temperatura controlada a 20°C con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. Los animales tenían libre acceso al agua y a un pienso comercial. Los ratones se asignaron al azar entre las jaulas para evitar los efectos de las jaulas. Después de 1 semana de aclimatación, se inició el experimento. Cada grupo (n = 9/grupo) se trató durante 5 días consecutivos mediante sonda oral. La dosificación preventiva de todos los tratamientos comenzó 1 día antes de la administración de 2 mg de TNBS/EtOH al 50% por vía rectal y duró 4 días después de la administración de TNBS antes de sacrificar a los ratones. Se incluyeron los siguientes tratamientos:
1) TNBS la composición de la estrategia de Ensamblaje en disolución salina;
2) TNBS la composición de la estrategia de Colaboroma en disolución salina, y
3) TNBS disolución salina (Control).
Se incluye un grupo convencional (sin tratamiento con TNBS pero tratado con disolución salina) como control para excluir la variabilidad derivada del procedimiento de alimentación por sonda. Como criterio de valoración del estudio, se monitorizó diariamente la Actividad de la Enfermedad (antes del tratamiento diario) midiendo el peso corporal, la pérdida de sangre fecal (ColoScreen) y el aspecto general.
Los resultados de este ejemplo se presentan en la Fig. 11. No se observaron efectos sobre el peso ni la Actividad de la Enfermedad para el grupo de control de Vehículo (disolución salina) sin TNBS, mientras que el grupo de control que recibió TNBS mostró una pérdida de peso inmediata en el d1 del 8% y un fuerte aumento de la Actividad de la Enfermedad. Tanto la pérdida de peso como la Actividad de la Enfermedad se restauraron parcialmente al final del estudio. Curiosamente, se observó un potente efecto protector de la composición tanto sobre la pérdida de peso como sobre la Actividad de la Enfermedad, aunque el alcance de este efecto protector dependía de la estrategia de producción de la composición. Si bien se observó una protección leve inicial en d1 para la estrategia de Ensamblaje, como se muestra en una menor pérdida de peso y Actividad de la Enfermedad, este efecto protector ya no se observó en los siguientes días de estudio. Por el contrario, la administración de la composición producida mediante la estrategia de Colaboroma condujo a un potente efecto preventivo frente a la pérdida de peso y la Actividad de la Enfermedad en d1, en comparación con el control de TNBS, y una restauración más rápida y completa al final del estudio, como se muestra por el retorno de la actividad de la enfermedad al nivel del control del Vehículo. En conclusión, este ejemplo proporciona una confirmación in vivo de que la composición funcional es eficaz para obtener una prevención más fuerte y una recuperación más rápida y potente de la inflamación intestinal y de la Actividad de la Enfermedad tras la inducción de colitis inducida por TNBS. Además, este hallazgo demuestra claramente que la preadaptación a través de la estrategia de Colaboroma da como resultado una actividad más eficiente en comparación con la estrategia de Ensamblaje.
3.3: Modelo de ratón de DSS para la inflamación
El modelo de DSS crónico es un modelo de uso común para la colitis que imita algunas de las características de la enfermedad de Crohn, incluyendo la pérdida de peso y la diarrea sanguinolenta. En histopatología, la administración crónica de DSS causa inflamación del intestino con cambios arquitectónicos típicos tales como distorsión de las criptas, infiltración (sub)mucosal de células inflamatorias y fibrosis, características que se encuentran en pacientes con EC. Esto hace que el modelo de DSS sea un buen candidato para la evaluación in vivo de la capacidad de la composición funcional para prevenir y/o restaurar el daño a la mucosa intestinal en la IBD y ayudar a mantener/desarrollar una barrera intestinal saludable.
En este ejemplo, la composición, que contiene Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Fioseburia inulinivorans, Fioseburia hominis, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae, y producida mediante la estrategia de “Colaboroma” (véase el ejemplo 1.3), se utiliza para evaluar los efectos beneficiosos tras la evaluación en el modelo de DSS crónico. La colitis se provoca en los animales mediante la administración repetida de DSS en el agua de bebida (exposición al 0,25%). El experimento se realiza durante un total de 8 semanas, con 3 ciclos de administración y recuperación de DSS.
En la práctica, los ratones C57BL6/J machos de 6 semanas de edad se alojan en una habitación con temperatura controlada a 20°C con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. Los animales tienen libre acceso al agua y a un pienso comercial. Los ratones se asignan al azar entre las jaulas para evitar los efectos de las jaulas. Después de 1 semana de aclimatación, se inicia el experimento. Cada grupo (n = 10/grupo) se trata 3 veces por semana durante 8 semanas consecutivas, mediante sonda oral. La dosificación preventiva de todos los tratamientos comienza 1 semana antes del primer ciclo de DSS. El primer ciclo de DSS comienza en la semana 2, e incluye una semana de administración de DSS (0,25% en agua de bebida) seguida de dos semanas de recuperación. Este primer ciclo es seguido por un segundo ciclo de DSS idéntico. El tercer ciclo de DSS consiste en una semana de administración de DSS, seguida de una semana de recuperación, después de la cual se sacrifican los animales. Se incluyen los siguientes tratamientos:
1) control sin DSS
2) DSS la composición de la estrategia de Colaboroma en disolución salina (3 veces/semana), y
3) DSS disolución salina (control de DSS).
Como criterio de valoración del estudio, se monitorizó el índice de Actividad de la Enfermedad (DAI) durante cada ciclo de DSS, tres veces por semana (antes del tratamiento diario) monitorizando el peso corporal, la pérdida de sangre fecal (ColoScreen) y el aspecto general. Como se muestra en la Fig. 12, no se observaron efectos sobre el DAI para el grupo de control con Vehículo (disolución salina) sin DSS, mientras que el grupo de control que recibió DSS mostró un fuerte aumento en el DAI en cada ciclo de administración. Curiosamente, se observó un potente efecto protector (DAI aproximadamente 25% menor en cada ciclo) de la composición sobre la Actividad de la Enfermedad. Esto demuestra además que la composición funcional es eficaz para obtener un fuerte efecto protector de la inflamación intestinal y de la Actividad de la Enfermedad tras la inducción de colitis inducida por DSS.
Ejemplo 3.5: Modelo de mucositis
La mucositis es un término clínico que se utiliza para describir el daño a las membranas mucosas después de las terapias contra el cáncer. Ocurre en todo el tracto gastrointestinal (GT) (incluyendo la boca) y el tracto genitourinario, y en menor medida en otras superficies mucosales. Su gravedad y duración varían según la dosis y el tipo de fármaco utilizado.
La importancia de la mucositis es que limita la dosis de quimioterapia. El epitelio de la cripta GI es particularmente vulnerable a la toxicidad quimioterapéutica, incluyendo los síntomas náuseas y vómitos, dolor abdominal, distensión, y diarrea, debido a los efectos directos de los citotóxicos en la mucosa. El modelo de rata de mucositis intestinal inducida por 5-fluorouracilo (5FU) se estableció por Keefe et al. para la evaluación de los efectos de la quimioterapia en el tracto GI, y ahora es uno de los modelos más ampliamente utilizados para investigar la mucositis inducida por quimioterapia en ratas (Keefe 2004).
En este ejemplo, la composición, que comprende Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Foseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila y Anaerostipes caccae, se utilizó como base para el experimento y se produjo mediante la estrategia de “Colaboroma” del Ejemplo 1.3. La mucositis se induce mediante una única dosis intraperitoneal de 5FU.
En la práctica, se asignó aleatoriamente un total de 30 ratas a un grupo de control o experimental según un punto de tiempo específico. Todas las ratas de los grupos experimentales recibieron una única dosis intraperitoneal de 5FU (150 mg de 5FU/kg de peso corporal). Las ratas de los grupos de control recibieron tratamiento con el vehículo disolvente (dimetilsulfóxido). Después de la administración de los fármacos de quimioterapia, se evaluaron los criterios de valoración del estudio, tales como la mortalidad, la diarrea, y el estado clínico general, cuatro veces por período de 24 h. Se sacrificaron subgrupos de ratas por desangrado y dislocación cervical a las 24, 48 y 72 h después de la administración del fármaco. Los criterios de valoración primarios de interés fueron la evolución del peso, la diarrea y el bienestar general (puntuación de enfermedad). Los criterios de valoración secundarios incluyeron la histología de las muestras intestinales y el análisis de la microbiota mucosal intestinal y de las heces.
Para evaluar el efecto de la composición sobre la prevención o reducción de los síntomas evaluados, a parte de las ratas se administró durante 8 días consecutivos la composición mediante sonda oral. La dosificación preventiva comenzó 5 días antes de la administración de 5FU y duró 3 días después de la administración de 5FU o hasta que se sacrificaron las ratas. Los animales del control no recibieron la composición.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron y Bacteroides vulgatum.
2. Una composición según la reivindicación 1, que se utiliza para prevenir o tratar síntomas asociados con un trastorno gastrointestinal.
3. Una composición para uso según la reivindicación 2, en la que dicho trastorno gastrointestinal es una alteración de la función de barrera del intestino, diarrea, estreñimiento, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, celiaquía, pouchitis, mucositis, una infección del intestino, disbiosis de la microbiota intestinal, y cualquier combinación de los mismos.
4. Una composición para uso según las reivindicaciones 2-3, en la que dicho trastorno gastrointestinal se previene o trata mediante: a) estimulando el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas en el tracto intestinal, b) inhibiendo el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias patógenas en el tracto intestinal, c) aumentando relativamente la unión de bacterias no patógenas a la mucosa de la superficie gastrointestinal, d) reduciendo la captación incontrolada de antígenos, moléculas proinflamatorias, bacterias o productos bacterianos por el intestino, e) proporcionando actividad antiinflamatoria en la superficie intestinal, f) aumentando el funcionamiento de la barrera intestinal, g) produciendo metabolitos bacterianos, o h) cualquier combinación de a) a g).
5. Una composición que consiste esencialmente en bacterias que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum y Anaerostipes caccae, o que pertenecen a las especies Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatum, y uno o más prebióticos.
6. Una composición según las reivindicaciones 1-2 y 5, en la que dichas bacterias se cultivan juntas en un fermentador antes de administrar dicha composición para prevenir o tratar dichos trastornos gastrointestinales.
7. Una composición según la reivindicación 6, en la que dicho fermentador es un simulador dinámico del tracto gastrointestinal.
8. Una composición según la reivindicación 1, en la que dichas bacterias se escogen de la lista de las siguientes cepas: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans l Mg P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662, o cepas que muestran al menos 97% de identidad de secuencia con las secuencias de ARNr de 16S de al menos una de dichas cepas.
9. Una composición según las reivindicaciones 1-2 y 5 a 8, en la que dicha composición es una composición farmacéutica formulada como una forma administrada por vía rectal o una forma ingerible por vía oral.
10. Una composición según la reivindicación 9, en la que dicha forma ingerible por vía oral es una cápsula, microcápsula, comprimido, gránulo, polvo, trocisco, píldora, suspensión o jarabe.
11. Una composición según la reivindicación 10, que se incorpora en un alimento, bebida, complemento alimentario, o nutracéutico.
12. Una composición según las reivindicaciones 1-2 y 5-11, en la que dicha composición comprende entre 105 y 1011 unidades formadoras de colonias de bacterias.
13. Un reactor que comprende una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y 5­
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