CN116925975B

CN116925975B - 一种Akkermansia muciniphila及其产品和应用

Info

Publication number: CN116925975B
Application number: CN202311047614.0A
Authority: CN
Inventors: 马新; 任大勇; 喻扬; 郁雪平; 赵欣
Original assignee: Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd
Current assignee: Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority date: 2023-08-18
Filing date: 2023-08-18
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2043-08-18
Also published as: CN116925975A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种Akkermansia muciniphila及其产品和应用。所述的Akkermansia muciniphila为AKK PROBIO，保藏编号为CGMCCNo.20955。本发明的AKK PROBIO的耐受性好，安全性高，适应症广且治疗效果好，能够对结肠炎、结直肠癌、阿尔茨海默症、痛风性关节炎等疾病起到预防和治疗作用，具有很好的临床应用前景。

Description

一种Akkermansia muciniphila及其产品和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种Akkermansia muciniphila及其产品和应用。

背景技术

生活在人体的特定部位中或上的所有微生物生命的总和称为人类微生物组。DNA测序技术促进了肠道、皮肤、泌尿生殖道和肺的微生物组的更深入分析，揭示了与宿主粘膜表面共生驻留的微生物作用。微生物组的组成和活性对宿主具有显著的代谢、营养和免疫作用。微生物组从出生开始在宿主内进化，不断微调以维持与宿主免疫系统的稳态平衡。这种进化受宿主因素（例如适应性和先天免疫应答)、外部因素（例如饮食、药物和毒素暴露）以及疾病的影响。

胃肠道微生物的种类和数量都占据人体较大比例，其中大约100万亿个微生物驻留在肠道中，这些微生物高度适应于在复杂的群落结构内存活，微生物组在不同个体中具有较大差异。当将患有疾病（例如炎性肠病）的患者与健康个体进行比较时，这种可变性甚至更明显，表明微生物组内某些微生物的失衡（即生态失调）可能导致异常的炎症和代谢反应。通过调节胃肠道微生物的组成可以对部分疾病起到一定治疗效果。例如，已经通过口服施用某些益生菌如乳杆菌和双歧杆菌在鼠模型中治疗呼吸道炎症。

Akkermansia muciniphila（A.muciniphila），简称为AKK，有时也被称为嗜粘蛋白阿克曼氏菌，是一种从人类粪便中分离出来的椭圆形革兰氏阴性细菌。是人类肠道共生菌，并可以依靠肠粘液层的黏蛋白生存。人体内的共生菌可以通过多种途径提供有利的帮助，包括从帮助消化食物到形成健康免疫系统等多种方式。Akkermansia muciniphila作为一种肠道共生菌，已经被发现具有多种功能。

如申请号为CN202310386672.X的中国专利中公开了一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用，其中，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；通过大量实验证明，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的活菌、灭活菌、菌体裂解液具有防治肿瘤的作用，且当其余免疫检查点抑制剂如PD-1抗体或CTLA-4抗体等联用时，可显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。但该菌株抑瘤效果一般，抑瘤率较低。

再如申请号为JP2022568622的专利中公开了新的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AK32菌株和含有该菌株的用于预防或治疗肠损伤的组合物。嗜粘蛋白阿克曼氏菌AK32菌株不仅能够增加动物模型肠隐窝的高度和杯状细胞的数量，而且促进与肠上皮细胞增殖相关的基因表达，并且在肠组织和类器官的再生和生长中是有效的。因此，其对于生产食品、药物、肠调节、益生菌、益生菌等是有效的。但是其实际改善程度较低，对于临床应用作用范围较窄。

现有技术中还公开了Akkermansia muciniphila的多种其他适应症，如：肥胖、糖尿病、心血管代谢疾病、渐冻症、认知功能障碍等。在一些现有技术中对Akkermansia muciniphila治疗相关疾病的机制也进行了研究。但现有技术中的Akkermansia muciniphila，如前所述，对于相关疾病的治疗作用仍有较大的提升空间，且不断扩大相关菌种的种质资源库，也有利于后期进行疾病类型扩展的研究。另外，现有技术中的菌种功能相对较为单一，筛选出集多种治疗作用于一身的Akkermansia muciniphila，可以使其更好更方便地服务于临床。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对健康人粪便标本进行分离筛选，获得了一株Akkermansia muciniphila，对该菌株进行了多项性能检测，并开展了多项应用方向的研究，以期扩大微生物种质资源库。

一方面，本发明提供了一种Akkermansia muciniphila。

所述的Akkermansia muciniphila为AKK PROBIO，保藏编号为CGMCC No. 20955，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的Akkermansia muciniphila通过粘蛋白培养基分离得到。

所述的Akkermansia muciniphila的16S序列为SEQ ID NO.1；

所述的Akkermansia muciniphila在BHI培养基37℃厌氧培养7d，平板形态为菌落浅黄色，圆形，表面湿润，半透明，边缘整齐。在BHI培养基37℃厌氧培养4d，显微镜镜检为菌体呈杆状，大小为0.5-0.9μm × 0.7-3.8μm，单个或成对排列，革兰氏阴性。

本发明的AKK PROBIO，在一些表述中也被称为AKK. pro或AKKP。

另一方面，本发明提供了前述的Akkermansia muciniphila的培养方法。

所述的培养方法中至少包括将前述的Akkermansia muciniphila接种于培养基进行培养。

具体地，所述的接种的方式包括但不限于：平板画线法、斜面接种法、倾注培养法、穿刺接种法、液体接种法中的任意一种或多种。

所述的接种的接种量可以是0.1%-20%，在一些情况下也可以是更高或者更低的接种量。具体地，所述的接种量可以是1%-20%、2%-20%、1%-15%、1%-10%、1%-5%、1%-8%、5%-15%、5%-10%、5%-8%、8%-10%、8%-15%、5%-12%、2%-7%。

具体地，所述的培养基可以是固体培养基、半固体培养基或液体培养基，更具体可以是现有技术中已经公开的任意适宜的培养基类型，也可以是在现有技术公开的培养基类型上进行进一步改进以提高菌株性能的培养基，还可以是现有技术中所未公开的但能够用于前述Akkermansia muciniphila培养的培养基。

所述的培养基中包括但不限于：脑心浸液、黏蛋白、氨基酸或其盐、葡萄糖或其衍生物、维生素、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、硫化钠、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、胆汁、动物血中的一种或多种。

所述的动物血包括但不限于牛血、羊血、猪血、鸡血、鸭血；优选为羊血。

作为优选，所述的培养基为BHI培养基，其形态可以是固体或液体。可以是成品培养基也可以是自配培养基，其中的成分可根据需要行常规调节。

当所述的BHI培养基为固体培养基，其中包括琼脂，还包括但不限于但不限于以下成分的任一或多：脑心浸出液、蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、葡萄糖、无机盐；优选地，所述的无机盐可以是氯化钠或磷酸氢二钠中的任一或任二。

当所述的BHI培养基为液体培养基，其中包括但不限于以下成分的任一或多：脑心浸出液、蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、葡萄糖、无机盐；优选地，所述的无机盐可以是氯化钠或磷酸氢二钠中的任一或任二。

所述的培养基中还可以包括粘蛋白。

在一些表述中，所述的培养基可以包括基础培养基和添加物，所述的基础培养基可以是现有技术中常见的通用培养基，如BHI培养基，所述的添加物可以是本领域常见或不常见的其他成分，如动物血，动物血与培养基的体积比可以是1%-10%，具体可以是1%-5%、5%-10%、1%-8%、2%-10%、4%-8%、5%-8%，优选为5%-10%，进一步优选为5%或10%。在本发明的一些实施例中，培养基包括BHI培养基和羊血，羊血与BHI培养基的体积比可以是1%-10%，具体可以是1%-5%、5%-10%、1%-8%、2%-10%、4%-8%、5%-8%，优选为5%-10%，进一步优选为5%或10%。

本发明所提供的Akkermansia muciniphila的培养条件中包括温度、氧含量，在一些情况下还可能包括光照、二氧化碳含量、pH、湿度、搅拌条件、通风条件、振荡条件、培养基更换条件、培养天数、抗性条件等。

优选地，所述的培养条件中的温度可以是35-40℃，具体可以是35-39℃、35-38℃、35-37℃、35-36℃、36-40℃、36-39℃、36-38℃、36-37℃、37-40℃、37-39℃、37-38℃、38-40℃、38-39℃、39-40℃、36.5-38.5℃、35.5-37.5℃、37-38.5℃或37-37.5℃。进一步优选为36-38℃，更进一步为37℃。

优选地，所述的培养为厌氧培养，所述的培养条件中的氧含量可以是0-8%，具体可以是0-7%、0-6%、0-5%、0-4%、0-3%、0-2%、0-1%、0-5.5%、0-3.5%、0-2.5%、0-0.5%、1%-8%、1%-5%、1%-2%或0.5%-2%。

再一方面，本发明提供了前述的Akkermansia muciniphila的制备物。

所述的制备物包括但不限于：活菌、死菌、发酵液、发酵液上清、发酵液沉淀、冻干粉、细胞裂解液、分泌物中的一种或多种。

所述的制备物可以通过前述培养方法得到的培养物进行制备获得。

作为示例，所述的活菌可以通过前述的培养物通过离心、过滤或其他常规手段获得的活细胞。

作为示例，所述的死菌可以是经过灭活的菌体，所述的灭活的方法包括但不限于：高温灭活、辐射灭活或者化学灭活中的任意一种或多种。

具体地，所述的高温灭活可以是干热灭活或湿热灭活；所述的辐射灭活可以是光辐射或电离辐射，所述的光辐射可以是紫外或红外辐射，所述的电离辐射包括但不限于微波辐射；所述的化学灭活包括但不限于气体灭菌或液体灭菌，所述的气体灭菌采用气态杀菌剂进行，如臭氧、甲醛，所述的液体灭菌采用液体杀菌剂完成。

作为示例，所述的发酵液可以通过前述的培养方法获得，根据本领域一般认知，包括将菌种接种于液体培养基，在一定条件下进行培养后获得液体培养物即为发酵液。

作为示例，所述的发酵液上清或发酵液沉淀为通过前述的发酵液经过离心分离获得。在一些情况下，所述的发酵液上清或发酵液沉淀中包括所述的Akkermansia muciniphila的菌体。所述的离心分离条件可以是高速离心也可以是低速离心，可以是常温、低温或高温。

作为示例，所述的冻干粉为将前述的培养液进行冻干获得。所述的冻干粉中一般还包括冻干保护剂。所述的冻干保护剂包括但不限于：pH缓冲剂、填充剂、糖类、非离子表面活性剂、配体等。所述的pH缓冲剂包括但不限于Tris、氨基酸或其盐、柠檬酸或其盐、醋酸或其盐中的任意一种或多种。所述的填充剂包括但不限于甘露醇、甘氨酸、牛血清白蛋白中的任意一种或多种。所述的糖类可以是双糖，如蔗糖或海藻糖中的任意一种或多种。所述的非离子表面活性剂包括但不限于吐温，所述的吐温可以吐温-20、吐温-60、吐温-80等。所述的冻干保护剂中还可以包括抗氧化剂等。所述的冻干保护剂具体还可以包括白蛋白、聚乙二醇等。

作为示例，所述的细胞裂解液可以是对前述培养物培养得到的菌体进行裂解获得。所述的裂解可以是物理裂解，也可以是化学裂解。所述的物理裂解包括但不限于：研磨、超声破碎等。所述的化学裂解包括但不限于化学试剂裂解、酶解，所述的酶解可以是水解酶或氧化酶。所述的裂解还可以是通过增加细胞内压强使细胞自行破裂。

作为示例，所述的分泌物可以是蛋白质、糖类或者脂质。

又一方面，本发明提供了前述的Akkermansia muciniphila或制备物在制备食品、药品、保健品、菌剂、食品添加剂、保健品添加剂或医药原料中的应用。

所述的药品可以用于预防或治疗肿瘤或其并发症。

所述的肿瘤包括但不限于实体瘤或非实体瘤。

所述的实体瘤包括但不限于运动系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、神经系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、生殖系统肿瘤和/或内分泌系统肿瘤。

优选地，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤中的任意一种或多种。

所述的药品还可以用于预防或治疗肥胖、糖尿病、心血管疾病、炎症、渐冻症、阿尔兹海默症等疾病或以上疾病的并发症。

所述的炎症包括但不限于急性炎症或慢性炎症。所述的炎症包括但不限于关节炎、肠胃炎、肝炎、筋膜炎、肾炎、口炎、膀胱炎、盆腔炎、宫颈炎、角膜炎、结膜炎、鼻炎、中耳炎、肺炎、气管炎中的任意一种或多种。

在一些分类下，所述的药品可以用于预防或治疗认知功能障碍，如前所述的阿尔兹海默症。

所述的保健品可以用于维持肠道菌群平衡、维持体型、维持血压、维持血脂、保护记忆力、抗氧化、调节代谢、调节免疫。

又一方面，本发明提供了包括前述的Akkermansia muciniphila或制备物的产品。

所述的产品包括但不限于食品、药品、保健品、菌剂、食品添加剂、保健品添加剂或医药原料。

优选为药品，所述的药品中还包括药学上可接受的辅料。

所述的药学上可接受的辅料包括但不限于：赋形剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂、抗氧化剂中的任意一种或多种。

作为优选，所述的药品为内用剂型或外用剂型。

所述的内用剂型包括但不限于片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、散剂、丸剂、糖浆剂、泡腾剂中的任意一种。

所述的外用剂型包括但不限于乳液剂、膏剂、喷雾剂、搽剂、栓剂、洗剂、泡沫剂、凝胶剂中的任意一种。

优选地，所述的药品中Akkermansia muciniphila的活菌数不低于1×10⁸CFU/g或1×10⁸CFU/mL。

进一步优选地，所述的药品中Akkermansia muciniphila的活菌数不低于1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。具体地，所述的Akkermansia muciniphila的活菌数不低于1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，如不低于1×10⁹CFU/g（CFU/mL）、2×10⁹CFU/g（CFU/mL）、3×10⁹CFU/g（CFU/mL）、4×10⁹CFU/g（CFU/mL）、5×10⁹CFU/g（CFU/mL）、6×10⁹CFU/g（CFU/mL）、7×10⁹CFU/g（CFU/mL）、8×10⁹CFU/g（CFU/mL）、9×10⁹CFU/g（CFU/mL）、10×10⁹CFU/g等，该数值范围内的其他点值均可选择。

优选地，所述的药品中Akkermansia muciniphila的活菌数为1×10⁸-1×10¹²CFU/g或1×10⁸-1×10¹²CFU/mL。具体可以是：1×10⁸-1×10⁹CFU/g（CFU/mL）、1×10⁸-1×10¹⁰CFU/g（CFU/mL）、1×10⁸-1×10¹¹CFU/g（CFU/mL）、1×10⁹-1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、1×10⁹-1×10¹¹CFU/g（CFU/mL）、1×10⁹-1×10¹⁰CFU/g（CFU/mL）、1×10¹⁰-1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、1×10¹⁰-1×10¹¹CFU/g（CFU/mL）、1×10¹¹-1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、5×10⁸-1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、8×10⁸-1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、7×10⁹-2×10¹¹CFU/g（CFU/mL）或9×10¹⁰-6×10¹¹CFU/g（CFU/mL）。

进一步优选地，所述的药品中Akkermansia muciniphila的活菌数为1×10⁹-1×10¹²CFU/g或1×10⁹-1×10¹²CFU/mL。

本领域技术人员可以根据实际的应用，结合相关领域的辅料与本发明提供的Akkermansia muciniphila或其制备物进行组合，这是本领域技术人员行常规筛选可以实现的。

本发明的有益效果：

本发明通过筛选获得一株Akkermansia muciniphila，为AKK PROBIO，菌株疏水性在60 min时达到30%以上；自聚集性在20 h时趋于稳定，保持在52%左右；具有很好的胃肠液耐受能力和胆盐耐受能力，在胃液中在240 min时存活率在85%左右，肠液中240 min时存活率在80%以上。

AKK PROBIO其在具有较好的安全性基础上，对多种疾病具有预防和治疗效果。

AKK PROBIO对小鼠结直肠癌有明显的调节作用，可以在一定程度上缓解AOM/DSS诱导的小鼠体重下降、结直肠长度缩短，脾脏和肝脏指数的升高，有效减少CRC小鼠的肿瘤数目和直肠组织的破坏程度；可以显著降低小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、iNOS和NF-κB的表达水平；在基因层面上可显著下调结肠组织中p50、p52、p65和IκBβ的mRNA表达水平，上调结肠组织中caspase-9、Bid和Bim的mRNA表达水平，降低肠道炎症程度，影响结直肠癌的发生发展。

AKK PROBIO对小鼠阿尔茨海默症具有缓解作用，连续4d的Morris水迷宫训练后，服用AKK PROBIO的小鼠逃避潜伏期缩短，找到平台的路径也明显缩短。通过上调Aβ降解酶IDE、抑炎因子IL-4和IL-10的水平达到清除Aβ的目的，从而起到缓解APP/PS1双转基因小鼠阿尔兹海默症的作用。

AKK PROBIO在痛风性关节炎小鼠模型中，低剂量下即能对痛风性关节炎起到治疗作用，高剂量下治疗效果更好。

以上表明，本发明的AKK PROBIO的耐受性好，安全性高，适应症广且治疗效果好，具有很好的临床应用前景。

保藏说明：

菌株编号：AKK PROBIO；

分类命名：Akkermansia muciniphila；

保藏编号：CGMCC No. 20955；

保藏时间：2020年10月26日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

附图中，各组别名称指代含义如下：

Normal=正常组，Control=AOM/DSS诱导结直肠癌模型组，Aspirin=阿司匹林药物（67mg/kg）处理组，AKKP-L=低浓度嗜黏蛋白阿克曼菌处理组（10⁸CFU/kg），AKKP-H=高浓度嗜黏蛋白阿克曼菌处理组（10⁹CFU/kg），mAKK PRO=灭活AKK PRO组，Blank=空白对照组，DSS=DSS诱导的溃疡性结肠炎模型组（DSS模型组）。

图1为AKK PROBIO菌落形态（上）和显微镜镜检形态（下）。

图2为AKK PROBIO的系统发育树（邻位连接法，neighbor joining method，NJ法）。

图3为AKK PROBIO对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的生理指标的影响。其中：（a）体重，（b）摄食量，（c）DAI评分，（d）肝脏指数，（e）结肠长度。

图4为AKK PROBIO对结直肠癌小鼠体重的影响。

图5为AKK PROBIO对结直肠癌小鼠结直肠组织的影响，分别为结直肠长度、结直肠重量与长度比值、肿瘤数目；a-d不同字母表示根据邓肯检验有显著差异（p<0.05）。

图6为AKK PROBIO对小鼠脏器的影响，分别为脾脏指数、肝脏指数、肾脏指数；a-d不同字母表示根据邓肯检验有显著差异（p<0.05），NS表示各组之间无显著差异（p＞0.05）。

图7为小鼠直肠组织病理切片。

图8为小鼠血清中的细胞因子水平（ IL-1β、IL-6、IFN-γ，iNOS和NF-κB ），a-d不同字母表示根据邓肯检验有显著差异（P<0.05）。

图9为小鼠结肠组织炎症通路相关基因mRNA相对表达水平（p50、p52、p65、IκBβ），a-c不同字母表示根据邓肯检验有显著差异（P<0.05）。

图10为小鼠结肠组织细胞凋亡通路相关基因mRNA相对表达水平（caspase-9、Bid和Bim），a-c不同字母表示根据邓肯检验有显著差异（P<0.05）。

图11为AKK PROBIO疏水性验证结果。

图12为AKK PROBIO自聚集性验证结果。

图13为AKK PROBIO在人工胃液中的存活率。

图14为AKK PROBIO在人工肠液中的存活率。

图15为急性毒性实验中小鼠体重变化、摄食变化、血糖变化结果。

图16为急性毒性实验中小鼠甘油三酯（TG）含量、胆固醇（TC）含量、胆汁酸（TBA）含量检测结果。

图17为急性毒性实验中小鼠葡萄糖（GLU）水平检测结果。

图18为急性毒性实验中小鼠总蛋白（TP）水平检测结果。

图19为急性毒性实验中小鼠谷丙转氨酶（GPT）酶活力检测结果。

图20为急性毒性实验中小鼠谷草转氨酶酶（GOT）活力检测结果。

图21为急性毒性实验中小鼠肌酐（GRE）含量检测结果。

图22为急性毒性实验中小鼠尿素氮（BUN）浓度检测结果。

图23为急性毒性实验中小鼠肝脏（Liver）及肾脏（Kidney）的病理学切片。

图24为亚慢性毒性试验小鼠的血糖变化。

图25为亚慢性毒性试验小鼠肝脏的胆汁酸水平。

图26为APP/PS1双转基因小鼠（阿尔茨海默症）Morris水迷宫实验分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1菌株分离

一、试剂准备

粘蛋白培养基通过溶液1和溶液2配制，其中：

溶液1：氯化钙1.1g，氯化镁1.0g，磷酸氢二钠5.3g，氯化钠3g，磷酸氢二钾4g，碳酸氢钠2g，硫化钠 2.5g，定容至100mL，高压蒸汽灭菌备用；

溶液2：粘蛋白（sigama，货号M1778，CAS号84082-64-4）溶液。

粘蛋白液体培养基的制作：取200mL无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中加入2mL溶液1及30-40mL溶液2，用电动移液器吸取 5mL 的液体分装于15mL的离心管中，拧松管盖放置厌氧罐中3d后拧紧管盖，4℃密封保存。

粘蛋白固体培养基的制作：在粘蛋白液体培养基的基础上加入20g/L的琼脂粉；倒入无菌平皿中，每个平皿20mL ；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。

脑心浸出液(Brain Heart Infusion, BHI，OXOID，货号CM1032B)固体培养基倒入无菌平皿中，置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。

二、样品稀释及富集培养

收集健康人粪便标本1-2g，立即接种于9mL生理盐水中，记为10^-1；继续向下稀释5个梯度，记为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；从10^-2稀释管中吸取500μL，加入4.5mL粘蛋白液体培养基中；将10^-3-10^-6按同样的方法接种粘蛋白液体培养基，每个梯度接种2管，将富集管放置于37℃厌氧恒温培养箱培养3d。

三、固体平板分离培养

选择浑浊的富集管；在浑浊的液体管中选择比较均一、悬浊、没有沉淀、结块或丝状物的富集管进行固体平板的分离培养，稀释10^-1-10^-6，分别涂布在粘蛋白固体培养基和BHI固体培养基上，每个稀释度涂布3个平皿，将固体平板至于37℃恒温厌氧培养箱中，培养5d。

四、生理生化与16S鉴定及保存

（1）通过VITEK® 2 ANC 鉴定卡（生物梅里埃中国，货号：21347）开展厌氧菌的生理生化鉴定。鉴定结果如下：

符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。

（2）将培养好的固体平板取出，在强灯光下，挑取周围无杂菌、直径在1mm以内、乳白色、粘稠状菌落，以无菌操作接种于9mL BHI液体培养基中，置于37℃厌氧恒温培养箱培养48小时，同步进行16S鉴定：

鉴定引物为常规引物，正向引物为27F(5’→3’)：SEQ ID NO.2，反向引物为1492R(5’→3’)：SEQ ID NO.3；

鉴定PCR体系：27F引物溶液1μL，1492R引物溶液1μL，2×PCR MasterMix（预混液）12μL，无菌水10μL，模板1μL；

PCR反应条件：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min。

筛选得到一株嗜黏蛋白的新菌AKK PROBIO，其16S序列为SEQ ID NO.1。NCBI比对后鉴定结果分类命名为Akkermansia muciniphila，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20955。与现有部分菌株的比对结果如下：

AKK PROBIO与相关种的16S rDNA序列系统发育树如图2所示。采用MEGA软件，邻位连接法显示AKK PROBIO与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示自展值（Bootstrap值）大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。

发酵液于25%甘油管冷冻保藏。

AKK PROBIO于BHI培养基37℃厌氧培养7 d，平板形态为菌落浅黄色，圆形，表面湿润，半透明，边缘整齐。AKK PROBIO于BHI培养基37℃厌氧培养4 d，显微镜镜检为菌体呈杆状，大小为0.5-0.9μm × 0.7-3.8μm，单个或成对排列，革兰氏阴性。见图1。

实施例2AKK PROBIO的培养

（1）采用固体平板培养，培养基成分为：BHI+5%羊血，培养基配制方法为：按成品要求称取一定体积所需的BHI粉末；以20g/L的比例加入琼脂粉末；定容至相应体积，121℃，20min灭菌；灭菌完成后冷却至53℃（手握不烫）时加5%无菌脱纤维羊血，摇匀倾注15-20mL至平皿备用；

AKK PROBIO的培养温度设为37℃，培养条件：完全厌氧。

（2）采用液体培养（发酵液培养），培养基为BHI，培养温度：37℃，培养条件：8层纱布完全厌氧培养，具体包括以下步骤：

一级：取一支2mL甘油管，以10%的接种量接种至含有9mL BHI试管中，37℃厌氧培养24-48h；

二级：取一级发酵试管，以5%的接种量接种至含有90mL BHI的三角瓶中，37℃厌氧培养24h；

三级：取二级三角瓶发酵液，以5%的接种量接种至含有300mL BHI的三角瓶中，37℃厌氧培养13h，20%甘油管-80℃冷冻保藏。

实施例3AKK PROBIO改善葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎

动物及其管理：雄性C57BL/6J小鼠（6-10周龄，体重18-24g）购自北京华阜康生物科技有限公司，涉及小鼠的程序严格按照国际动物护理标准进行，并经由吉林农业大学动物保护机构和管理委员会批准。进行1周的适应性培养，室温（25℃±1℃）光照12 h黑暗12h循环下将小鼠进行培养。

动物实验设计：在小鼠的饮用水中加入5.0% (wt/vol) DSS (分子量为36,000-50,000)，持续3天以诱导结肠炎。从服用DSS第一天开始，每天灌胃嗜粘性阿克曼氏菌（活菌或灭活，浓度为1×10¹⁰CFU/mL），持续9天。将C57BL/6J小鼠随机分为4组：对照组、DSS模型组（DSS）、AKK PRO组、灭活AKK PRO组（mAKK PRO）。观察每组小鼠生理指标。

生理指标：生理指标用于评估小鼠的健康状况，将每只小鼠的个体得分合并，生成疾病活动指数（DAI），包括体重变化、摄食量和粪便稠度。评分标准见表1。小鼠实施安乐死后，测量每组小鼠的结肠长度，测量各组小鼠肝脏的重量，并根据以下公式计算免疫器官指数：肝脏指数=肝脏重量（mg）/体重（g）[Wang, X., et al., Troxerutin ImprovesDextran Sulfate Sodium-Induced Ulcerative Colitis in Mice. J Agric Food Chem,2021. 69(9): p. 2729-2744.]。

表1 疾病活动指数（DAI）评分表

统计学分析：

采用GraphPad对数据进行统计分析，所有数据均以平均±标准差（SD）表示。两组间的统计学意义采用t检验，多组的比较采用双向方差分（ANOVA），P＜0.05表示差异具有显著性。

结果分析：

（1）摄入嗜粘性阿克曼氏菌可显著减轻DSS诱导的结肠炎小鼠生理损伤

为了确定嗜粘性阿克曼氏菌是否对结肠炎有改善作用，用5.0% DSS，在添加或不添加嗜黏性阿克曼氏菌的情况下诱导急性结肠炎。

由图3所知：

同时用DSS和嗜粘性阿克曼氏菌治疗的小鼠比模型组小鼠体重（a)和摄食量(b)降低的更少，DAI得分更低(c)；

同时，免疫器官指数的增加和结肠长度的减少表明炎症增加，结果显示，DSS组的免疫器官指数显著增加（P＜0.05），但在嗜黏性阿克曼氏菌处理后显著下降(d)；

DSS组小鼠的结肠长度显著降低（P＜0.05），但在摄入嗜黏性阿克曼氏菌后显著增加（P＜0.05）（e）。

上述结果表明嗜黏性阿克曼氏菌可显著改善结肠炎小鼠的生理损伤。

实施例4AKK PROBIO干预AOM/DSS诱导结直肠癌小鼠的效果

本实施例采用的部分实验试剂来源如下：

氧化偶氮甲烷（AOM），Sigma-Aldrich；葡聚糖硫酸钠（DSS），MP Biomedicals；阿司匹林肠溶片，拜耳医药保健有限公司；白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、γ干扰素（IFN-γ）、诱导型NO合酶（iNOS）、核因子κB（NF-κB）ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；无核酸酶水（RNase-Free water），北京索莱宝科技有限公司；实时荧光定量预混液（qPCR SYBR Green Master Mix），上海翊圣生物科技有限公司；总RNA抽提试剂盒（TrizolReagent）、反转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit），赛默飞（Thermo Fisher Scientific）；其余试剂均为国产生化试剂或分析纯。

本实施例采用的部分仪器与设备如下：

6D45415正置显微镜，日本奥林巴斯仪器有限公司；Bioprep-24生物样品均质仪、Nano-300微量分光光度计，杭州奥盛仪器有限公司；A200梯度PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；VLBL0TD1多功能酶标仪、实时荧光定量PCR仪（StepOnePlus Real-Time PCRSystem），赛默飞世尔科技（苏州）有限公司。

实验动物及分组处理：

SPF级雄性C57BL/6小鼠，6周龄，购于重庆莱彼特生物科技有限公司。饲养于室温25 ± 2℃、相对湿度50 ± 5%、12 h光照/12 h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养1周后随机分为5组：正常组、模型组、阿司匹林阳性对照组、AKK PROBIO低浓度（AKKPL）组和AKKPROBIO高浓度（AKKPH）组。实验过程中小鼠自由摄食和饮水，实验造模第一天对模型组、阿司匹林组、AKKP组按照10 mg/kg进行AOM腹腔注射，并分别在第2周、第5周、第8周喂饲2.5%DSS水溶液。正常组和模型组小鼠每日灌胃无菌生理盐水；阿司匹林组小鼠按67 mg/kg灌胃阿司匹林溶液；AKKPL组和AKKPH组小鼠分别按1×10⁸CFU/kg和1×10⁹CFU/kg的剂量进行灌胃，持续10周。在实验过程中观察各组小鼠的饮食、活动、精神，毛发情况及小鼠的粪便性状，每周称量小鼠的体重并记录。实验结束后，通过眼球取血并脱脊椎处死小鼠，解剖取小鼠大肠、脾脏、肝脏、肾脏组织待测。

（1）脏器指标的测定

小鼠解剖后，取出大肠、脾脏、肝脏、肾脏组织并称重，通过公式计算小鼠脏器指数，同时测量小鼠结直肠长度和记录小鼠结直肠肿瘤发生数量。脏器指数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）。

（2）直肠组织病理学观察

小鼠直肠于组织固定液中固定24 h后，移入95%的乙醇中脱水，再放入二甲苯中置换出组织中的酒精使直肠组织透明化，然后进行石蜡包埋，经切片机切片后用H&E染色并固定，即制成厚度为2-3 μm的小鼠直肠病理组织切片，并在正置显微镜下进行观察。

（3）小鼠血清中炎症相关因子水平测定

通过眼球收集全血，在4000 r/min、4℃离心10 min，分离出上层血清。根据ELISA试剂盒说明书，测定小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、iNOS和NF-κB的水平。

（4）小鼠结肠组织中炎症和细胞凋亡相关基因的表达水平测定

取50 mg左右结肠组织用生理盐水清洗干净后于装有6颗氧化锆珠的匀浆管中，加入500 μL Trizol试剂对组织中的RNA进行提取。通过微量分光光度计对RNA的纯度和浓度进行测定。A260/A280作为核酸检测的指示值，其比值位于1.8~2.0之间表明RNA纯度较高，可进行后续试验。然后通过反转录生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反应体系，其余试剂包括qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、无菌蒸馏水7 μL和上、下游引物各1 μL。qRT-PCR扩增反应条件：95℃、10 s，60℃、30 s，40个循环；95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s。以Eef2为内参基因，根据公式2^-△△Ct计算各目的基因的mRNA相对表达量。表2为本实验中用到的引物序列。

表2 引物序列

（5）数据分析

实验中所有结果表示为平均值±标准偏差，同时采用IBM SPSS 27.0软件中单因素方差法检验各组实验结果间在P<0.05水平上是否有显著差异。

（6）实验结果

6.1 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠体重的影响：

正常组小鼠体格健康，活动自如，毛色黝黑有光泽，进食饮水均正常，无腹泻及便血，其余4组小鼠出现出现稀便、脱肛、血便、体重下降等情况。如图4所示，为各组小鼠的体重变化的统计图。给予浓度为2.5%DSS期间，造模各组小鼠的体重出现下降趋势，停止后各组小鼠的体重呈现逐渐增加的趋势。实验期末，造模各组小鼠的体重均显著低于正常组小鼠体重，其中模型组小鼠的体重下降的最低，而阿司匹林和AKKP干预组小鼠体重有所回升。与正常组相比，其余4组小鼠实验期末的体重具有显著性差异（P<0.05）。结果表明，AOM/DSS会引起小鼠体重下降，阿司匹林和AKKP干预能够在一定程度上缓解小鼠体重下降。

6.2 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠结直肠的影响：

如图5所示，为各组小鼠结直肠的变化。小鼠结直肠发生炎症时，小鼠结直肠长度有一定程度的缩短，从结直肠长度可以分析结直肠炎症情况。与正常组相比，其余4组结直肠长度较短（P<0.05）。与模型组相比，阿司匹林组和AKKP组的结直肠长度较长（P<0.05）。由上可知，AKKP干预可缓解小鼠结直肠的缩短。

正常组小鼠结直肠重量与小鼠结直肠长度的比值为2.81 ± 0.34，模型组为4.34± 0.35，阿司匹林组为3.17 ± 0.50，AKKPL组和AKKPH组分别为3.18 ± 0.31和2.97 ±0.18。模型组与正常组、阿司匹林组、AKKP组相比具有显著性（P<0.05）。由此说明，AKKP干预可以降低小鼠结直肠重量与小鼠结直肠长度的比值。

与正常组相比，其余4组的结直肠肿瘤发生数量明显较多（P<0.05）。与模型组相比，阿司匹林组和AKKP组的结直肠肿瘤发生数量较少（P<0.05）。结果表明，AKKP干预可以有效减少小鼠肠道肿瘤数目。

6.3 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠脾脏、肝脏和肾脏指数的影响：

脏器指数是生物医学研究的基本指标之一，也是研究的重要依据。如图6所示，为各组小鼠脾脏和肝脏指数的统计图。与正常组相比，模型组小鼠的脾重和肝重显著增加（P<0.05），差异具有统计学意义。与模型组相比，阿司匹林组和AKKP组脾重和肝重均减轻，差异有统计学意义（P<0.05）。5组小鼠肾脏组织结构如常，且各组之间无显著性差异（P>0.05）。可见，AKKP可以有效缓解AOM/DSS造成结直肠癌的脾脏和肝脏指数的升高。

6.4 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠直肠组织病理学形态的影响

如图7所示，正常组小鼠直肠组织黏膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐，无溃疡。模型组观察到直肠粘膜严重侵蚀，几乎所有的隐窝都被破坏，杯状细胞急剧减少，出现炎性细胞浸润，腺体紊乱，并观察到严重溃疡。阿司匹林组、AKKPL组、AKKPH组小鼠直肠黏膜未见明显糜烂，隐窝相对完整，腺体排列整齐，杯状细胞较为完整。组织学结果表明，AKKP有效降低AOM/DSS诱导小鼠对直肠的组织病理损伤。

6.5 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠血清炎症因子水平的影响

细胞因子是免疫细胞及某些非免疫细胞合成的一类小分子蛋白质，可以与相应受体结合来调控免疫应答[Minxuan X, Sun Y, Dai X, et al. Fisetin attenuates highfat diet-triggered hepatic lipid accumulation: A mechanism involving liverinflammation overload associated TACE/TNF-α pathway [J]. Journal ofFunctional Foods, 2019, 53, 7-21.]，介导炎症并参与组织修复[Bamias G, ArseneauK O, Cominelli F. Cytokines and Mucosal Immunity. Curr. Opin[J].Gastroenterol,2014,30, 547–552.]。结肠粘膜和巨噬细胞的中性粒细胞浸润分泌大量促炎细胞因子，并在炎症期间抑制抗炎细胞因子的分泌，从而加剧炎症状态[Shukla P K,Chaudhry K K, Mir H, et al. Chronic Ethanol Feeding Promotes Azoxymethane andDextran Sulfate Sodium-Induced Colonic Tumorigenesis Potentially by EnhancingMucosal Inflammation[J]. BMC Cancer 16,2016.]。如图8所示为CRC模型小鼠血清中相关促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、iNOS和NF-κB的水平测定结果。

IL-1β作为促炎因子能够促进炎症细胞的活化和聚集，增加上皮和内皮细胞的通透性，加剧肠粘膜的炎症，并介导炎症中的痛觉过敏[Park J S, Choi J, Hwang S H, etal.Cottonseed Oil Protects against Intestinal Inflammation in Dextran SodiumSulfate-Induced Inflammatory Bowel Disease[J]. Med. Food 2019,22, 672–679.]。模型组小鼠血清中的IL-1β含量最高，正常组、阿司匹林组和AKKP组小鼠血清中的IL-1β含量均低于模型组，且存在显著性差异（P<0.05）。由此说明AKKP可明显降低CRC小鼠血清中的IL-1β的水平。

IL-6是多效性的炎症调节因子，作为白介素家族中最有代表性的一员，最早是在白细胞中发现的传递细胞信号的因子，其参与炎症反应、免疫调节介导癌症发生[曾心雨.双歧杆菌制剂对ERAS路径下老年结直肠癌患者术后恢复的影响研究[D].湖南师范大学,2021.]。与正常组相比，模型组小鼠血清中的IL-6含量最高，两者之间存在显著差异（P<0.05）。阿司匹林组和AKKP组小鼠血清中的IL-6含量均降低，但各组间不存在显著性差异（P>0.05）。由此说明AKKP可明显降低CRC小鼠血清中的炎症因子。

INF-γ是一种二聚糖蛋白，可严重影响肠上皮细胞的结构和功能，增加肠黏膜的通透性[Zingoni A, Sornasse T, Cocks BG, et al. Cross-talk between activatedhuman NK cells and CD4 T cells via OX40-OX40 ligand interactions.[J].Immunol,2004,173:3716–3724.]。研究表明，IFN-γ水平在肠道炎症中增加，从而发挥免疫调节作用[Ferrier L, Mazelin L, Cenac N, et al.Stress-induced disruption ofcolonic epithelial barrier: role of interferon-gamma and myosin light chainkinase in mice[J]. Gastroenterology 125 795–804. 2003]。与正常组相比，模型组小鼠血清中的IFN-γ含量最高，两者之间存在显著差异（P<0.05），阿司匹林组和AKKP组小鼠血清中的IFN-γ含量与模型组相比均降低（P<0.05），且AKKPH组与正常组含量相近，组间无显著差异（P>0.05）。

iNOS是一种信使分子，它可以产生一氧化氮（NO），当DSS引起体内炎症时，大量的NO表达会加剧炎症，促进iNOS的高表达[Pan Y, Ning Y, Hu J, et al. The PreventiveEffect of Lactobacillus plantarum ZS62 on DSS-Induced IBD by RegulatingOxidative Stress and the Immune Response[J]. Oxid Med Cell Longev,2021.]。模型组小鼠血清中的iNOS含量最高，正常组、阿司匹林组和AKKP组小鼠血清中的iNOS含量与模型组相比均降低，且与模型组存在显著差异（P<0.05）。

NF-κB作为结直肠癌的发生发展的指标之一，参与细胞对刺激的反应，其水平异常升高，与炎症、癌症、自身免疫疾病等多种因素相关，能够反映CRC患者病情[师鑫鹏, 罗晓勇, 李朝萍, 等.西妥昔单抗联合化疗治疗对耐药晚期结直肠癌患者近期疗效及血清NF-κB、EGFR、HER-2水平的影响[J].实用中西医结合临床, 2021, 21(19): 92-93.]。模型组小鼠血清中的NF-κB含量最高，正常组、阿司匹林组和AKKP组小鼠血清中的NF-κB含量与模型组相比均降低（P<0.05），且AKKPH组与阿司匹林组含量相近，组间无显著差异（P>0.05）。

6.6 AKK PROBIO对结直肠癌模型小鼠结肠组织中相关因子mRNA表达水平的影响

1）结肠组织中炎症通路相关因子的mRNA表达水平

NF-κB由五种转录因子组成，这些转录因子调节参与多种生物过程的各种基因的表达。这些过程包括炎症、细胞发育和分化、细胞周期进程、细胞迁移等[Wei H, Prabhu L,Hartley AV, et al. Gene Expression and Regulation in Mammalian Cells—Transcription from General Aspects. IntechOpen; London, UK: 2018. Methylationof NF-κB and its Role in Gene Regulation; p. 291.]。NF-κB家族的成员包括RelA/ p65、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50/p105）和NF-κB2（p52/p100）。研究表明，在AOM/DSS的诱导下，小鼠的NF-κB信号通路被激活，其表现为体内炎症水平升高。因此可以通过抑制NF-κB信号通路，保护小鼠免受炎症刺激，干预CRC的发生发展。

图9为p50、p52、p65和IκBβ的mRNA表达水平。

模型组小鼠结肠组织中p50和IκBβ的mRNA表达水平最高，阿司匹林组和AKKPH组小鼠结肠组织中p50和IκBβ的mRNA相对表达量均显著降低（P<0.05），且高浓度组小鼠结肠组织中p50和IκBβ相对表达量与正常组之间无显著差异（P>0.05）。

模型组小鼠结肠组织中p52和p65的mRNA表达水平最高，正常组、阿司匹林组和AKKP组小鼠结肠组织中p52和p65的mRNA相对表达量均显著降低（P<0.05），且AKKPH组小鼠结肠组织中p52和p65相对表达量与阿司匹林组之间无显著差异（P>0.05）。

2）结肠组织中细胞凋亡通路相关因子的mRNA表达水平

细胞凋亡的机制很复杂，涉及许多信号通路。细胞凋亡可以通过半胱天冬酶介导的外在或内在途径在细胞中触发，主要由称为半胱天冬酶（半胱氨酸，天冬氨酸特异性蛋白酶）的蛋白酶家族执行[Li J, Yuan J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene.2008;27:6194–6206.]。半胱天冬酶是细胞凋亡机制的核心，因为它们既是细胞死亡的引发剂（caspase-2、-8、-9和-10，主要负责细胞凋亡途径的开始）和执行剂（caspase-3、-6和-7，负责细胞成分的明确切割）[Thomberry NA, Laxebnik Y. Caspases: enemies within.Science. 1998;281:1312–1316.]。内在途径受到细胞内蛋白B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族的密切调节。Bid是Bcl-2家族的促凋亡成员，被发现在CRC细胞中直接受miR-20a调节，从而诱导线粒体细胞凋亡[Huang G, Chen X, Cai Y, Wang X, Xing C. miR-20a-directedregulation of BID is associated with the TRAIL sensitivity in colorectalcancer. Oncol. Rep. 2017;37:571–578.]。Bim介导的内在细胞凋亡调节CRC细胞的凋亡[Drury LJ, Wendt MK, Dwinell MB. CXCL12 chemokine expression and secretionregulates colorectal carcinoma cell anoikis through Bim-mediated intrinsicapoptosis. PLoS One. 2010;5:e12895.]。

图10为caspase-9、Bid和Bim的mRNA表达水平。模型组小鼠结肠中caspase-9、Bid和Bim的mRNA相对表达量最低，正常组、阿司匹林组和AKKP组小鼠结肠组织中caspase-9、Bid和Bim的mRNA相对表达量均显著升高（P<0.05），且AKKP组的mRNA表达量呈浓度依赖趋势，随着AKKP灌胃浓度的升高，AKKPH组小鼠结肠中caspase-9、Bid和Bim的mRNA表达量均显著增加（P<0.05）。由此说明给CRC小鼠灌胃AKKP可提高结肠组织中caspase-9、Bid和Bim的mRNA表达，进而降低肠损伤程度。

以上结果表明，AKK PROBIO对小鼠结直肠癌有明显的调节作用，可以在一定程度上缓解AOM/DSS诱导的小鼠体重下降、结直肠长度缩短，脾脏和肝脏指数的升高，有效减少CRC小鼠的肿瘤数目和直肠组织的破坏程度；可以显著降低小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、iNOS和NF-κB的表达水平；在基因层面上可显著下调结肠组织中p50、p52、p65和I κBβ的mRNA表达水平，上调结肠组织中caspase-9、Bid和Bim的mRNA表达水平，降低肠道炎症程度，影响结直肠癌的发生发展。综上，AKK PROBIO对结直肠癌具有较好的干预作用。

实施例5AKK PROBIO（AKK. pro）安全性评价

（1）疏水性

基于细菌粘附碳氢化合物的能力，对菌株AKK PROBIO进行细胞表面疏水性的测定。使用二甲苯进行细菌对碳氢化合物的粘附测试（BATH），并做了一些修改。具体地，BHI培养基中在37℃下培养菌株过夜。通过离心（4℃；8000 rpm；10 min）收集细胞，洗涤两次，并重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7），使吸光度（OD600 nm）调至0.5，以使细菌数量标准化。然后，加入等体积的二甲苯，涡旋5 min，使两相体系充分混合。在室温下孵育15、30和60分钟后，小心移除水相，并使用分光光度计测量其在600 nm处的吸光度。使用以下公式计算对碳氢化合物的亲和力（疏水性）：

其中，P0和P1分别是用烃提取前后的吸光度值。

结果见图11，结果表明，AKK PROBIO的疏水性随时间的上升而上升，在60 min时达到30%以上。

（2）自聚集

如上所述制备菌株AKK PROBIO的细胞悬浮液，并在37℃孵育。将吸光度（OD600nm）调节至0.5。然后在37 ℃下培养细菌悬液，并在4、8、12、16、20和24小时检测其在600 nm处的吸光度。使用以下公式计算自聚集百分比：

。

结果见图12，结果表明，菌株的自聚集性随时间的上升而上升，在20 h时趋于稳定，保持在52%左右。

（3）胃肠液耐受

配制胃液（5M HCl，2g/L NaCl，3.2g/L胃蛋白酶，pH 2.0）和肠液（6.8g/L KH₂PO₄，10g/L胰酶，0.1M NaOH，pH 8.0），随后使用0.22μm的无菌过滤器过滤灭菌。将5mL BHI液体培养基中活化两次后的AKK PROBIO于4000rpm离心10min收集菌体，无菌生理盐水清洗2次并重悬于5mL生理盐水。1:1（v/v）将菌液与无菌人工胃液或肠液混匀，摇匀后置于恒温培养箱中37℃培养，分别于0h，3h测定活菌数，并按公式（1）计算AKK PROBIO在人工胃液或肠液中的存活率。

结果见图13-14，图13表明，菌株在胃液中的存活率随时间的延长呈下降趋势，在240 min时存活率在85%左右；图14表明，菌株在肠液中的存活率整体上呈下降趋势，在240min时存活率在80%以上。

（4）生物膜形成能力

AKK PROBIO在37℃胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，货号：HB4114）中培养过夜。然后，在4℃下以8000rpm离心10 min收获细菌细胞，用PBS洗涤两次，并重新悬浮在以下培养基中：不含葡萄糖的TSB培养基和添加0.25%、1%和2.5%葡萄糖的TSB培养基。取三份200 L的每种细菌悬液，装入96孔板中，未接种的培养基为阴性对照，在37℃下培养24 h。将每个孔中的培养基吸出，并用无菌生理盐水洗涤三次，以除去未附着的细胞。剩余的附着细胞用每孔200 μL的甲醇固定。15分钟后，将孔中液体吸出并晾干。然后用每孔200 μL的2%结晶紫染色5分钟。然后用无菌生理盐水洗涤三次，以去除多余的染料。将平板风干后，将贴壁细胞重悬于160 μL的33%（V/V）冰醋酸中，然后测量其600 nm处的吸光度。临界值（ODC）定义为阴性对照的平均OD值。根据OD值，菌株被分类为非生物膜生产者（OD≤ODC）、弱（OD0<OD≤2×ODC）、中等（2×ODC<OD≤4×ODC）或强生物膜生产者（4×ODC<OD）。

结果见表3：

表3 AKK PROBIO的生物膜形成

表3数据表明，在含有不同浓度葡萄糖（0%、0.25%、1%和2.5%）的TSB中，37℃孵育24小时后。临界值（ODC）定义为阴性对照的平均OD值。根据OD值，将菌株分为非粘附NA（OD≤ODC）、弱粘附WA（ODC<OD≤2×ODC）、中度粘附MA（2×ODC<OD≤4×ODC）和SA强粘附（4×ODC<OD）。通过对菌株生物膜形成能力的测定，判定该菌株的生物膜形成能力为弱性。

（5）毒理学评价

5.1细菌回复突变试验

使用的细菌菌株是Salmonella typhimuriumTA97a（国家典型培养物保藏中心NTCC，506391），TA98（国家典型培养物保藏中心NTCC，506392），TA100（国家典型培养物保藏中心NTCC，506395）、TA1535（国家典型培养物保藏中心NTCC，506396）和Escherichia coliWP2 uvrA（齐氏生物科技有限公司，货号：6-1705）。为了制备给药制剂，使用蒸馏水作为载体制备测试项目的悬浮液（100 mg/mL）。测试项目（菌株AKK PROBIO）有可能以多种方式影响测试结果，从而使研究无效。因此，测试项目样本中的细菌是通过机械手段去除的。在混合制剂的过程中，使测试项目的任何可溶性组分溶解在载体中后，通过离心（4 ℃；8000 rpm；10 min）除去残留的细菌。离心后，除去上清液，用0.22 μm过滤器无菌过滤，然后制备较低浓度的制剂，并处理试验细菌菌株。

基于所进行的初步实验的结果，进行了初始突变研究（平板掺入法）和确认性突变研究（预培养程序）。验证性突变研究在15.81、50、158.1、500、1581和5000 μg/平皿下进行检测，最高浓度为现行法规指南推荐的最大浓度。阳性对照包括溶于由蒸馏水或二甲基亚砜溶解的敌克松、叠氮钠、甲基磺酸甲酯、2-氨基芴。通过每次试验中的平板实验检查试验细菌细胞的存活率。如果回复子数量出现与剂量相关的增加，则认为试验项目具有致突变性，和/或；在具有或不具有代谢活化的至少一个菌株中发生针对至少一个剂量组的可再现的生物学相关的阳性反应。如果在Salmonella typhimuriumTA98、TA100和Escherichia coliWP2 uvrA菌株中逆转次数比阴性对照的逆转率高两倍以上，则认为这种增加具有生物学相关性；在Salmonella typhimuriumTA97a和TA1535菌株中，逆转次数比阴性对照的逆转率高三倍以上。

结果见表4。

表4

注：阳性对照1-4的药物分别为：敌克松、甲基磺酸甲酯、叠氮钠、2-氨基芴。

细菌回复突变试验结果显示，该菌株无致突变性。

5.2 急性毒性

为了评估菌株AKK PROBIO的急性毒性，将SPF级昆明小鼠（7周龄，雌雄各半，体重10-18g）随机分成四组(n=8)。每组通过经口灌胃给予含1×10⁹、5×10¹⁰或5×10¹¹CFU/天的菌株AKK PROBIO悬浮液（0.5mL，以生理盐水为溶剂）或0.5 mL/天生理盐水1天，分别记为氯化钠溶液组（Saline）、低剂量组（Low dosage）、中剂量组（Medium dosage）、高剂量组（Highdosage），在7-10天内每天观察一般情况和体重。在实验期结束时，采集血样用于血液学和血清生物化学分析（参照实施例4）。对各组的所有动物进行主要器官和组织的组织病理学检查（参照实施例4）。

小鼠体重变化、摄食变化、血糖变化结果见图15。结果表明，小鼠通过急性灌胃高、中、低剂量的AKK.pro，未出现死亡现象。受试组小鼠每天的体重变化与对照生理盐水组之间无显著性差异。在急性灌胃期间，每天受试小鼠的摄食量变化与对照生理盐水组小鼠之间无显著性差异。在急性灌胃期间，每天受试小鼠的血糖变化与对照生理盐水组小鼠之间无显著性差异。

小鼠血常规结果见表5：

表5 灌胃高、中、低剂量AKK.pro小鼠血常规

表5中数据表明急性灌胃组与对照生理盐水组小鼠的各项血液指标无显著差异。

小鼠甘油三酯（TG）含量、胆固醇（TC）含量、胆汁酸（TBA）含量检测结果见图16。结果表明，肝脏中，受试小鼠肝脏中甘油三酯水平均极显著低于其对照生理盐水组小鼠；血清中甘油三酯水平在受试小鼠与对照小鼠中无显著差异。试小鼠与其对照组小鼠的胆固醇水平、胆汁酸水平在血清和肝脏中均无显著性差异。

受试小鼠与其对照组小鼠的葡萄糖（GLU）水平在血清和肝脏中均无显著性差异，见图17。受试小鼠与其对照组小鼠的总蛋白（TP）水平在血清和肝脏中均无显著性差异，见图18。受试小鼠与其对照组小鼠的谷丙转氨酶（GPT）酶活力在血清和肝脏中均无显著性差异，见图19。受试小鼠与其对照组小鼠的谷草转氨酶酶（GOT）活力在血清和肝脏中均无显著性差异，见图20。受试小鼠与其对照组小鼠的肌酐（GRE）含量在血清中均无显著性差异，见图21。受试小鼠与其对照组小鼠的尿素氮（BUN）浓度在血清中均无显著性差异，见图22。

脏器指数对比结果表明，受试小鼠与其对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、大脑、睾丸、肺、胃及肠等主要器官重量基本无显著性差异。

小鼠肝脏及肾脏的病理学切片见图23。受试小鼠与其对照组小鼠的肝脏和肾脏无显著病理损伤。

5.3 亚慢性毒性试验

将动物随机分为4组：第1组（雌雄各半）（生理盐水，0 CFU/kg体重/天）、第2组（雌雄各半）（9.2×10⁸CFU/kg体重/天）、第3组（雌雄各半）（27.6×10⁸CFU/kg体重/天）和第4组（雌雄各半）（92×10⁸CFU/kg体重/天）。每天制备新的菌悬液。通过连续90天口服灌胃，剂量体积为5 mL/kg体重。每日记录临床体征，每周进行一次详细的临床观察。每周记录1次体重、食物消耗量和饮水量。在实验期结束时，采集血样用于血液学和血清生化分析（参照实施例4）。对所有动物进行了尸检，并记录了主要器官的重量。对各组所有动物的主要器官和进行了组织病理学检查（参照实施例4）。

小鼠葡萄糖耐量检测方法：

在实验开始前，小鼠需要禁食12-16小时，但仍有水供给。葡萄糖溶液准备：准备葡萄糖溶液，一般使用2g/kg体重的25%的葡萄糖溶液，根据小鼠体重计算所需的葡萄糖量。

测定基础血糖：在实验开始前，使用血糖仪或其他血糖测定方法测量小鼠的基础血糖水平。通常在小鼠尾部静脉血中测量。

葡萄糖负荷给药：将葡萄糖溶液通过灌胃给予小鼠。

血糖测定：在给药后的一定时间间隔内，在0、15、30、60、90和120分钟，取小鼠尾部静脉血使用血糖仪测定方法测量小鼠血糖水平。

小鼠胰岛素耐量检测方法：

胰岛素溶液准备：准备合适浓度的胰岛素溶液，一般使用胰岛素注射液，每只小鼠根据0.5 U/kg体重计算所需的胰岛素量。胰岛素注射：将胰岛素溶液通过皮下注射的方式给予实验组小鼠。对照组小鼠不进行此处理。血糖测定：在给药后的一定时间间隔内，在0、15、30、60、90和120分钟，取小鼠尾部静脉血使用血糖仪测定方法测量小鼠血糖水平。

试验结果为：鼠通过连续90天灌胃高、中、低剂量的AKK.pro，未出现死亡现象。受试组小鼠每周的体重变化与对照生理盐水组之间无显著性差异。在连续灌胃期间，每周受试小鼠的摄食量变化与对照生理盐水组小鼠之间无显著性差异。在连续灌胃期间，每周中剂量灌胃小鼠的血糖变化与对照生理盐水组小鼠之间存在显著差异，其他组与对照组之间无显著性差异（见图24）。灌胃组与对照生理盐水组小鼠的各项血液指标无显著差异。受试小鼠与其对照组小鼠的甘油三酯水平、胆固醇水平在肝脏和血清中均无显著性差异。灌胃中剂量小鼠与其对`照组小鼠的胆汁酸水平在肝脏中具有显著性差异（图25），而其他组与对照组在血清和肝脏中均无显著性差异。受试小鼠与其对照组小鼠的葡萄糖水平、总蛋白含量、谷丙转氨酶酶活力、谷草转氨酶酶活力在血清和肝脏中均无显著性差异。受试小鼠与其对照组小鼠的肌酐含量、尿素氮浓度在血清中均无显著性差异。受试小鼠与其对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、大脑、睾丸、肺、胰腺、胃及肠等主要器官重量基本无显著性差异。受试小鼠与其对照组小鼠的肝脏和肾脏无显著病理损伤。受试小鼠与其对照组小鼠的血糖调节能力无显著性差异（葡萄糖耐量及胰岛素耐量）。

（6）药物敏感性分析

参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）方法[CLSI. Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing; 26th ed. CLSI supplement M100S. Wayne, PA, USA:Clinical and Laboratory Standards Institute; 2016.]，对AKK PROBIO进行药物敏感性测定。

质控菌株选择脆弱拟杆菌ATCC 25285。

主要试剂与培养基：

布鲁氏琼脂培养基、布鲁氏肉汤培养基：购自BD公司；厌氧产气袋：购自三菱公司；羊血：购自上海康润生物科技有限责任公司；氯化血红素：购自国药；维生素K1：购自Sigma；氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、四环素：购自中检院；莫西沙星、氯霉素：购自European Pharmacopoeia。

用CLSI推荐的琼脂稀释法，测定AKK PROBIO对氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、四环素、莫西沙星、氯霉素的敏感性，使用CLSI推荐的微量肉汤稀释法对质控菌株脆弱拟杆菌ATCC 25285进行测定。

药敏试验结果：

由表6可见，待测菌株AKK PROBIO对氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、四环素、莫西沙星、氯霉素均敏感。

表6 AKK PROBIO药敏试验结果

实施例6AKK PROBIO对APP/PS1双转基因小鼠阿尔茨海默症的缓解作用

20只12月龄APP/PS1双转基因小鼠（杭州子源实验动物科技有限公司，MJ0324-058批）随机分为APP组，APP+AKK组共2组，每组10只；另取10只同窝野生型C57 BL/6J小鼠做空白，为WT组。于12月龄开始对所有小鼠分别实施灌胃和注射，持续30d（灌胃条件见表7）。全部实验结束后，小鼠眼眶静脉取血，脱颈处死，分别取小鼠部分脑、肝脏和结肠组织于4％多聚甲醛中，剩余组织放置-80℃超低温冰箱储存。

表7 灌胃组别与剂量

DDW：双蒸水。AKK PROBIO菌悬液配制：取5 mL AKK PROBIO冻存菌液进行活化培养，4000 r/min离心10 min，清洗2次，清洗完成后添加5 mL的生理盐水，形成浓度为1*10⁹CFU/mL的菌悬液。

（1）给药结束后，首先进行为期4d的Morris水迷宫实验。水迷宫由一个圆形水池(直径120 cm)组成，并均等分为四个象限。实验时，提前两小时将小鼠搬入实验室，提前熟悉环境。调节水温21-22℃左右，再将牛奶倒入水池中，使其呈乳白色。第1-3天为训练期，将小鼠面向池壁提示物方向分别从一、二、三、四象限轻轻放入水中，记录1 min 游泳轨迹，没有在规定时间内找到平台的小鼠则需要引导至平台上，每只小鼠每天每个象限训练1次，连续训练3d。第4天为实验期，每只小鼠随机选取一个象限放入池中，记录60 s内寻找平台所需时间，即逃避潜伏期，并以视频采集系统记录每只小鼠的游泳轨迹；若小鼠入水后60 s内未能找到平台，逃避潜伏期记录为60 s。

（2）AD小鼠海马组织Aβ、炎症因子和趋化因子水平的测定

海马组织Aβ蛋白表达分析：

将海马组织在1 mL RIPA（Thermofisher，Waltham，MA，USA）和10 μL PMSF（Thermofisher）中匀浆，并在4°C下以12000 xg离心5 min。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermofisher）对蛋白质进行定量。将蛋白质样品与样品缓冲液（Thermofisher）以4：1混合，并在95°C加热5 min，然后将样品点入SDS-PAGE凝胶胶孔中并于100 V下进行跑胶。将SDS-PAGE凝胶上的条带转移到PVFD膜上，用5%脱脂奶封闭PVDF膜1 h，然后在4°C下与一抗（Thermofisher）孵育过夜，洗膜后加入抗体（Thermofisher）并孵育1小时。使用westernECL substrate（Thermofisher）进行化学发光后于iBright（Thermofisher）上获得图像，用于后续分析。

炎症因子和趋化因子水平的测定：

取海马组织用PBS匀浆后吸取上清液进行实验。Elisa检测试剂盒说明书检测海马组织中IL-4（白介素-4，南京建成生物工程研究所，货号：H005-1-2），IL-10（白介素-10，南京建成生物工程研究所，货号：H009-1-2），CCL2（趋化因子配体2，南京建成生物工程研究所，货号：H318-1）和CXCL1（CXC趋化因子配体1，南京建成生物工程研究所，货号：H306-1）的水平。

（3）数据分析

平行进行三次组织样品的测量，然后计算平均值。使用SPSS软件（SPSS v.25 forWindows, IBM Software Group, Chicago, IL, USA）对数据进行平均和分析。使用Duncan（邓肯）多范围检验通过单因素方差分析评估各个组平均值之间的差异。p<0.05的差异被认为具有统计学意义。

（4）实验结果

Morris水迷宫结果分析如图26。各组小鼠经过连续4d的Morris水迷宫训练后，逃避潜伏期呈现递减趋势。与APP组相比，APP+AKK PROBIO组小鼠逃避潜伏期缩短，找到平台的路径也明显缩短。

AD小鼠炎症指标分析见表8，WT组海马组织中的CXCL1和CCL2水平是四组中最低的，IL-4和IL-10水平是四组中最高的。而APP组IL-4和IL-10水平是四组中最低的，CXCL1和CCL2水平是四组中最高的。APP+AKK组的CXCL1和CCL2水平与APP组相比都呈下降的趋势，IL-4和IL-10水平与APP组相比都呈上升的趋势。说明AKK PROBIO可通过上调Aβ降解酶IDE、抑炎因子IL-4和IL-10的水平达到清除Aβ的目的，从而起到缓解APP/PS1双转基因小鼠阿尔兹海默症的作用。

表8 AD小鼠中炎症指标的含量

a-d，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异（p<0.05）。

实施例7AKK PROBIO在痛风性关节炎小鼠模型中的功能验证

实验动物：

6周龄雄性BALB/c 小鼠(20-22g)50只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

药品和试剂：

尿酸钠盐（2,6,8-三羟基嘌呤），硫酸氨基葡萄糖购自美国Sigma公司；；IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购自美国Thermo Fisher 公司；骨髓过氧化物酶(MPO) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、还原型谷胱甘肽(GSH) 活性检测试剂盒、丙二醛(MDA) 含量测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。

实验分组与样品处理：

小鼠被随机分为5组，分别为正常组、模型组、硫酸氨基葡萄糖（阳性对照）组、Akk低浓度实验（Akk-L）组、Akk高浓度实验（Akk-H）组，每组10只。正常组和模型组小鼠每日按0.1 mL/10 g.bw剂量灌胃蒸馏水，硫酸氨基葡萄糖组小鼠按195 mg/kg.bw剂量灌胃硫酸氨基葡萄糖，Akk -L和Akk-H组小鼠分别按10⁸CFU/kg.bw和10⁹CFU/kg.bw灌胃Akk实验菌，持续7天。然后所有实验小鼠被异氟烷麻醉后，正常组小鼠的右爪胫跗关节( 踝关节) 内被注射50μL的PBS溶液。将尿酸钠盐50 mg 加入PBS缓冲液1 mL 中配置成混悬液，除空白组外其余小鼠右爪胫跗关节( 踝关节) 内被注射50μL混悬液诱导痛风性关节炎。小鼠苏醒后，继续按前7日灌胃样品的剂量继续灌胃对应样品7日。

（1）小鼠踝关节组织氧化状态测定：

称量0.1g小鼠踝关节组织，并将其加入到含有0.9mL生理盐水的肝组织中进行混合。随后，将混合后的组织样本以4000 rpm的转速进行离心，离心时间为10 min，以获取上清液。接下来，使用MPO、SOD、GSH和MDA检测试剂盒来测定组织匀浆上清液中的相关指标。结果见表9：

表9小鼠踝关节组织的MPO、SOD、GSH酶活力和MDA水平

a-c，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异（p<0.05）。

（2）小鼠血清炎症细胞因子测定：

取出的小鼠全血样本在4℃下以4000 rpm的转速离心10min获到上层血清。采用IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒测定血清相关炎症指标。结果见表10：

表10小鼠血清的IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α的细胞因子水平

以上结果表明，AKK PROBIO在低剂量下即能对痛风性关节炎起到治疗作用，高剂量下治疗效果更好。

以上实施例仅用于解释说明本发明的技术方案，不用于限制本发明。本领域技术人员在以上公开的技术方案的基础上进行常规手段的替代和改进，不脱离本发明精神的，都在本发明所保护的范围内。

Claims

1.一种Akkermansia muciniphila，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 20955。

2.权利要求1所述的Akkermansia muciniphila的培养方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的Akkermansia muciniphila接种于培养基进行培养。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基为固体培养基、半固体培养基或液体培养基。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基为BHI培养基；所述的培养的条件为35-40℃，厌氧培养。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的培养条件为37℃，厌氧培养。

6.权利要求1所述的Akkermansia muciniphila的制备物，其特征在于，所述的制备物为活菌、死菌、发酵液、冻干粉中的一种或多种，所述的冻干粉中包括所述的Akkermansia muciniphila的菌体。

7.权利要求1所述的Akkermansia muciniphila或权利要求6所述的制备物在制备食品、药品、保健品、菌剂或医药原料中的应用。

8.包括权利要求1所述的Akkermansia muciniphila或权利要求6所述的制备物的产品，其特征在于，为食品、药品、保健品、菌剂或医药原料。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，为药品，所述的药品中还包括药学上可接受的辅料；所述的药学上可接受的辅料包括：赋形剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂、抗氧化剂中的任意一种或多种。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述的药品的剂型为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、散剂、丸剂、糖浆剂、泡腾剂、乳液剂、膏剂、喷雾剂、搽剂、栓剂、洗剂、泡沫剂、凝胶剂中的任意一种。