CN116270756A - 嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其药物组合物在改善和治疗神经退行性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌在改善和/或治疗神经退行性疾病中的应用，特别是保藏编号为CGMCC No.22793的AM06和保藏编号为CGMCCNo.22794的AM02菌株，可以改善阿尔兹海默症大鼠的学习记忆能力、减少脑组织炎症反应，改善帕金森大鼠的行为，提高DA、DOPAC、HVA水平，增强协调能力，改善SOD1突变体的转基因小鼠的运动障碍能力。

Description

嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其药物组合物在改善和治疗神经退行 性疾病中的应用

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，具体涉及嗜黏蛋白阿克曼氏菌在改善和/或治疗神经退行性疾病中的应用。

背景技术

神经退行性疾病是一类由神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而引起神经系统功能障碍的疾病，包括阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateral sclerosis,ALS)、神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinosis,NCL)、额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia,FLTD)等多种类型。除了少数家族性神经退行性疾病有明确的致病基因外，大多数疾病的发病机制尚不清楚，因此缺乏有效的治疗手段。

阿尔茨海默症(AD)是最常见的神经退行性疾病，表现为进行性的认知功能障碍和行为损害，包括记忆障碍、语言和运动能力减退、人格和行为异常等多方面症状。这些症状主要是由于大量神经元死亡及神经突触的丢失引起的。脑中Aβ积累产生的淀粉样斑块和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结是AD的典型病理特征，也被认为是引起神经细胞死亡的可能原因。阿尔茨海默病发病机制尚未明确，通常认为与自由基损伤、炎症反应、神经毒性损伤等相关，且脑神经缺血缺氧同样会引起认知功能异常。目前，尚无特效药物彻底根治老年痴呆，治疗手段仍以改善症状、阻止痴呆的进一步发展、维持残存的脑功能、减少并发症为主要原则，主要治疗药物包括下面两大类：1)胆碱酯酶抑制剂，通过抑制乙酰胆碱酯酶，增加中枢神经系统的乙酰胆碱浓度和活性，多用于治疗轻-中度AD患者，对患者认知功能、情绪、行为症状和日间生活功能有适度改善。常用药物有如下3种：多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏。2)兴奋性氨基酸受体拮抗剂，如盐酸美金刚片。

帕金森病(PD)是仅次于AD第二高发的神经退行性疾病，主要症状为震颤麻痹。PD的发病原因为中脑黑质多巴胺能神经元的死亡，但除了少部分家族性PD是由几种相关基因突变引起的之外，大部分散发型PD的发病机制目前尚不清楚。α-突触核蛋白的积累和路易小体(Lewy bodies)的出现是PD的典型病理特征，提示蛋白质稳态出现异常。目前帕金森主要的治疗方法有药物治疗以及手术治疗。帕金森病主要的治疗药物包括美多芭，还有一些受体激动剂包括森福罗、泰舒达、MAO-B抑制剂、咪多吡、安坦、其中金刚烷胺等药物的选择比较多，但是酯类药物治疗是帕金森病主要的治疗方法。药物治疗虽然可以暂时缓解病情，但是一旦渡过药物蜜月期，西药的药物刺激性和副作用会对身体产生一定的影响。长期服用美多芭，森福罗等药物，身体会产生抗药性，从而引发剂末现象和开关反应。长期的用药产生的副作用会使身体僵硬感加深，也会引起血压增高，血小板减少等不良现象，身体的不适感会加深，长期服用弊大于利。

亨廷顿病(HD)是一种huntingtin基因突变导致的遗传性神经退行性疾病，症状包括运动协调和认知受损、肌张力障碍以及舞蹈样动作等，因此也常被称为亨廷顿舞蹈症。目前的治疗主要是对症治疗，缺乏有效的疾病修饰治疗药物。理想的患者管理包括由不同专业医护人员组成的团队。唯一被FDA批准的治疗药物是突触囊泡单胺转运体抑制剂丁苯那嗪。其他在研的治疗方法包括脑深部电刺激术(DBS)治疗和氘化丁苯那嗪分子。

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)又叫运动神经元病或“渐冻病”，主要症状为进行性运动神经元丢失及肌无力和肌萎缩，通常导致病人在发病后3～5年内死亡。大部分ALS病人的发病机制目前尚不清楚。萎缩侧索硬化症现今尚无根治方法。然而，有一些治疗方法可以帮助控制症状，预防不必要的并发症。治疗药物包括：利鲁唑(Rilutek)、依达拉奉(Radicava)、巴氯芬(Baclofen)、地西泮(Diazepam)、苯海索(Benzhexol Hydrochloride)、阿米替林(Amitriptyline Hydrochloride)。

研究发现，人体中存在着连接肠道和大脑神经的通道，且与肠道菌群密切相关，这被称为肠道菌群-肠-脑轴，肠道菌群可以通过肠-脑轴调控神经炎症以及消化道症状，是肠道和大脑双向信息交流的重要参与者，不仅可以通过分泌神经递质，也可以通过免疫和神经突触对机体神经功能产生重大影响。深入研究肠道菌群与神经免疫系统及复杂神经退行性疾病的相互作用机制，可为神经退行性疾病的预防和治疗提供新思路。

益生菌是一类活性微生物，对人体的免疫、发育和营养吸收有着积极的作用，它们大量定植于人体的消化系统并改善宿主微生态平衡。益生菌对许多疾病的治疗具有有益作用。例如，鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌可以改善氨苄青霉素给药引起的小鼠微生物群改变和认知障碍。一项随机双盲临床试验显示乳酸杆菌亚种组合(即嗜酸、酪蛋白、双歧杆菌和发酵菌)可以一定程度改善AD患者的认知功能。在多种动物模型中，乳酸杆菌和双歧杆菌可以减少焦虑和抑郁相关症状的发生，并对记忆、学习和认知产生积极影响。同时，一些临床试验与动物模型获得的结果一致，这为益生菌治疗神经精神疾病提供了更多支持。因此，益生菌可能是AD、PD等神经退行性疾病的潜在治疗方法。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌是定殖在胃肠道黏液层中的可以特异性的降解黏蛋白的严格厌氧的革兰氏阴性菌，2004年由Derrien利用黏蛋白培养基首次从人体粪便中分离出来，在人类肠道普遍定殖，是人类肠道微生物中最丰富的成员之一，约占总量的3％～5％，在各种疾病的治疗过程中发挥着重要作用，有望成为下一代益生菌。因此，开发嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗神经退行性疾病的微生态制剂是有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供嗜黏蛋白阿克曼氏菌在改善和/或治疗神经退行性疾病中的应用，特别是保藏编号为CGMCC No.22793的AM06和保藏编号为CGMCC No.22794的AM02菌株，可以改善阿尔兹海默症大鼠的学习记忆能力、减少脑组织炎症反应，改善帕金森大鼠的行为，提高DA、DOPAC、HVA水平，增强协调能力，改善SOD1突变体的转基因小鼠的运动障碍能力。

本发明第一方面，提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌在制备改善和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌是保藏编号为CGMCCNo.22793的AM06和保藏编号为CGMCC No.22794的AM02菌株中的至少一种。

在一些实施例中，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌是活菌、形态结构完整的灭活菌、形态结构不完整的灭活菌、菌体裂解液、细菌培养上清中的一种，两种或更多种。

在一些实施例中，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病中的至少一种。

在一些实施例中，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。所述药物的施用对象为人或动物。

在一些实施例中，所述药物还包含药学上可接受的载体。

在一些实施例中，所述药物的给药途径为注射给药或者口服给药。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其他可改善和/或治疗神经退行性疾病的药物；

所述其他可改善和/或治疗治神经退行性疾病的药物包含治疗阿尔兹海默症的药物、治疗帕金森症的药物、治疗肌萎缩侧索硬化症的药物、治疗亨廷顿病中的至少一种；

所述治疗阿尔兹海默症的药物包括多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀中的一种，两种或者更多种；

所述治疗帕金森的药物包括抗胆碱能药、金刚烷胺、多巴胺(例如多巴丝肼)、DR激动剂、单胺氧化酶-B抑制剂、COMT抑制剂中的至少一种；

所述治肌萎缩侧索硬化症的药物包括依达拉奉、巴氯芬、地西泮、苯海索、阿米替林和利鲁唑中的至少一种；

所述治疗亨廷顿病的药物选自丁苯那嗪。

在一个实施方案中，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌为保藏编号为CGMCCNo.22793的AM06，或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02嗜黏蛋白阿克曼氏菌，或嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835中的至少一种。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02与多奈哌齐的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗阿尔兹海默症。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02与多巴丝肼的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗帕金森症。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02与依达拉奉的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗肌萎缩侧索硬化症。

第三方面，本发明还提供上述组合物在制备改善和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本申请发明人意外地发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌特别是保藏编号为CGMCCNo.22793的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和CGMCC No.22794的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02可以改善阿尔兹海默症大鼠的学习记忆能力、降低hs-CRP、TNF-α、IL-4的水平，减少脑组织炎症反应，改善帕金森大鼠的行为，提高DA、DOPAC、HVA水平，增强协调能力，改善SOD1突变体的转基因小鼠的运动障碍能力，提高四肢协调能力和肌肉力量等。

此外，本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02还可以与其他治疗药物联用，且联用时可产生协同增效作用，更显著地缓解和/或治疗AD、PD或ALS等神经退行性疾病。

附图说明

图1为采用实施例1方法培养得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02的菌落特征图；

图2为采用实施例1方法培养得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06的菌落特征图；

图3为采用实施例1方法培养得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02进行革兰氏染色后的显微镜观察图；

图4为采用实施例1方法培养得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06进行革兰氏染色后的显微镜观察图。

菌株保藏信息

1)AM02:

分类命名：Akkermansia muciniphila，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京路朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年6月28日，保藏编号：CGMCC No.22794。

2)AM06:

分类命名：Akkermansia muciniphila，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京路朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年6月28日，保藏编号：CGMCC No.22793。

本申请中“更多种”表示三种或三种以上。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本申请中的全部技术与科学术语具有如本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养

将嗜黏蛋白阿克曼氏菌种划线接种于GlcNAc血红素BHA平板，厌氧培养3天。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。

菌落特征：嗜黏蛋白阿克曼氏菌在上述培养基上培养3天后，呈现圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落，参见图1和图2。

显微镜下形态：嗜黏蛋白阿克曼氏菌进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，椭圆形、单个或成链状排列，参见图3和图4。

选取单个菌落接种于添加了GlcNAc的BHI肉汤中进行发酵培养48小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速16000×g，离心30min，去上清，收集沉淀物，即得嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌泥。分别培养得到AM02、AM06、ATCC BAA-835嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

实施例2嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗阿尔兹海默症的测试

1.实验方法

(1)模型制备

选取140只SD健康雄性大鼠，月龄7～9个月，体重220～238g，适应性喂养一周。随机选取120只大鼠建立阿尔兹海默症模型：使用45mg/kg亚硝酸钠以及120mg/kg D-半乳糖对大鼠进行颈背部皮下注射，每天1次，连续干预至大鼠表现为痴呆状态。大鼠抓耳挠腮等自主活动增多、出现痴呆表现视为建模成功。

(2)分组与给药

将阿尔兹海默症模型大鼠随机分为12组，每组10只。具体分组情况如下：

a)单独治疗组

模型组，阳性药组(多奈哌齐，0.88mg/kg·d)；

AM02活菌组(10¹⁰CFU/只)；AM06活菌组(10¹⁰CFU/只)；

BAA-835活菌组(10¹⁰CFU/只)，AM02灭活菌组(10¹⁰cell/只)，

AM06灭活菌组(10¹⁰cell/只)，BAA-835灭活菌组(10¹⁰cell/只)。另选用10只健康大鼠作为正常对照组。

b)联用药治疗组

AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组，AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组，AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组。此外，还设置多奈哌齐单独组进行对照，给药量为0.88mg/kg·d。

c)给药：正常对照组、模型组每日灌胃0.5mL生理盐水；各给药组给予相应剂量药物。以相应药物每天灌胃1次，连续灌胃4周。

实验过程和实验研究均遵循中国实验动物学会动物伦理委员会制定的原则和要求。

(3)Morris水迷宫实验

实验内容包括适应水迷宫(第1天)、定位航行实验(第2～5天)和空间探索实验(第6天)。实验前1d将大鼠放置在实验室进行适应，消除恐惧心理。定位航行实验：每只大鼠每天共进行4次，头面向池壁，分别从水池4个不同象限边缘的中点放入水中：大鼠找到平台后，让其在平台上停留10s，即为逃避潜伏期；若大鼠在90s内仍然没有找到水面之下的平台，引导其找到平台，并在平台上停留10s；记录大鼠的运动轨迹及找到平台时游过的距离。空间探索实验在第6天进行，撤掉平台，将大鼠由定位航行实验平台所在象限的对侧放入，并记录大鼠90s内在目标象限(定位航行实验放置平台的象限)所游的距离、在水池中所游的总距离及穿越目标象限次数。以90s内在目标象限游泳距离占总距离的百分比和穿越目标象限次数作为空间学习与记忆的评价指标。

(4)酶联免疫法检测血清中IL-4、hs-CRP、TNF-α水平

行为实验完成后，取眼球血并在4℃下以3000r/min离心2min，分离出血清。

取50mm碳酸盐包缓冲液对抗原进行稀释，将其加入聚苯乙烯的反应孔中，加盖处理后，在温度4℃的条件下放置24h，次日洗涤3次后，抛干，在每孔中均加入稀释液(pH值为7.4，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1mL，并加入阳性和阴性对照标本，在温度为42℃的条件下放置60min，将液体移除并洗涤3次后，抛干，在每孔中加入IL-4、hs-CRP、TNF-α抗体0.1mL，再次放置60min，将液体移除并洗涤3次，抛干，并在每孔中加入低物液(0.1mol/L Na₂HPO₄，0.05mol/L枸橼酸)混匀，加入0.1mL邻苯二胺，遮光20min，再次加入2mol/L H₂SO₄ 0.05mL放置各孔内，终止反应。使用酶标仪检测A450值，分析IL-4、hs-CRP、TNF-α水平。

(5)数据统计

应用SPSS20.0软件进行统计学处理，结果以(x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2.实验结果

1)Morris水迷宫

通过Morris水迷宫实验检测AD大鼠学习记忆能力。

表1各组大鼠学习记忆能力比较(x±s，n＝10)

与模型组比较，^*表示具有统计学差异(P<0.05)，^**表示具有极显著差异(P<0.01)；

与BAA-835活菌组比较，^a表示具有显著差异(P<0.05)，^aa表示具有极显著差异(P<0.01)；与BAA-835灭活菌组比较，^b表示具有显著差异(P<0.05)，^bb表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，^c表示具有显著差异(P<0.05)，^cc表示具有极显著差异(P<0.01)。

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06活菌组比较，^d表示具有显著差异(P<0.05)，^dd表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02活菌组比较，^e表示具有显著差异(P<0.05)，^ee表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06灭活菌组比较，^f表示具有显著差异(P<0.05)，^ff表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02灭活菌组比较，^g表示具有显著差异(P<0.05)，^gg表示具有极显著差异(P<0.01)。

各组大鼠到达平台时间、穿越平台次数、90s内在目标象限游泳距离占总距离的百分比体现了大鼠的学习记忆能力水平。由表1可以看出，与模型组相比，正常对照组具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，说明阿尔兹海默症大鼠造模成功；多奈哌齐组、嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02活菌或灭活菌单独给药组和联用给药组均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。与标准株BAA-835相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02的活菌和灭活菌单独治疗组的效果均有显著提高，且具有统计学差异(P<0.05)。与阳性组(多奈哌齐)相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02与多奈哌齐联用组治疗效果有更显著的提高，且具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。与AM02和AM06活菌组分别比较，AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组大鼠到达平台时间明显缩短(P<0.05或P<0.01)，穿越平台次数、90s内在目标象限游泳距离占总距离的百分比方面显著增加(P<0.01或P<0.05)；与AM06、AM02灭活菌组分别比较，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组大鼠到达平台时间明显缩短(P<0.05或P<0.01)，穿越平台次数、90s内在目标象限游泳距离占总距离的百分比方面显著增加(P<0.01或P<0.05)。

2)检测IL-4、hs-CRP、TNF-α水平

阿尔兹海默症症状的发生发展通常伴随着机体脑组织炎症反应，许多促炎细胞因子(如TNF-α)都是神经炎症的关键因素。hs-CRP、TNF-α、IL-4是临床较为常用的评价机体炎症反应的指标。hs-CRP是一种主要由肝脏组织合成的C反应蛋白，是一种广谱的机体炎症反应的标志物。TNF-α是一种多功能炎症细胞因子，能够刺激IL-6、IL-8等因子的生成，从而使机体产生持续存在的炎症反应。IL-4能够刺激肥大细胞释放炎症介质，与机体炎症反应密切相关，主要发挥抑制大鼠脑组织炎症反应的作用，从而发挥干预效果。

表2各组大鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-4水平比较(x±s，n＝10)

与模型组比较，^*表示具有统计学差异(P<0.05)，^**表示具有极显著差异(P<0.01)；

与BAA-835活菌组比较，^a表示具有显著差异(P<0.05)，^aa表示具有极显著差异(P<0.01)；与BAA-835灭活菌组比较，^b表示具有显著差异(P<0.05)，^bb表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，^c表示具有显著差异(P<0.05)，^cc表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06活菌组比较，^d表示具有显著差异(P<0.05)，^dd表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02活菌组比较，^e表示具有显著差异(P<0.05)，^ee表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06灭活菌组比较，^f表示具有显著差异(P<0.05)，^ff表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02灭活菌组比较，^g表示具有显著差异(P<0.05)，^gg表示具有极显著差异(P<0.01)。

小鼠正常组及给药物体内的hs-CRP、TNF-α、IL-4检测结果如表2所示。与模型组相比，正常对照组的hs-CRP、TNF-α、IL-4各项指标均具有极显著差异(P<0.01)，表明造模成功；多奈哌齐组、嗜黏蛋白阿克曼氏菌单独给药组和联用给药组均下调hs-CRP、TNF-α、IL-4水平，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。与标准株BAA-835比较，AM06和AM02的活菌和灭活菌可以显著降低hs-CRP、TNF-α、IL-4水平，具有统计学差异(P<0.05)。与多奈哌齐单独给药组相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02与多奈哌齐联用组具有统计学差异(P<0.05)，显著降低了炎性细胞因子的水平。与AM02和AM06活菌组分别比较，AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM06活菌(10¹⁰CFu/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组下调hs-CRP、TNF-α、IL-4水平，具有统计学差异(P<0.05)；与AM06、AM02灭活菌组分别比较，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组下调hs-CRP、IL-4水平，具有统计学差异(P<0.05)。因此，嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02的活菌和灭活菌均能够下调炎症因子hs-CRP、TNF-α、IL-4水平，从而发挥抑制大鼠脑组织炎症反应的作用，起到干预效果。将AM06和AM02与多奈哌齐联合使用，具有协同增效作用，可以进一步提高炎症治疗效果，即缓解和/或治疗阿尔兹海默症。

综上可以看出，嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02对阿尔兹海默症模型大鼠进行干预，能够提升阿尔兹海默症大鼠学习记忆能力，减轻脑组织炎症反应。嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02在改善和治疗阿尔兹海默症方面具有较好的潜力，且可以与其他治疗药物协同作用治疗阿尔兹海默症时，效果显著。

实施例3嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗帕金森症的测试

1.实验方法

(1)模型制备

清洁级雄性SD大鼠150只，体重(200±20)g，适应性喂养一周。经检查无旋转行为后，随机选取140只大鼠，以水合氯醛麻醉，于脑立体定位仪上固定。将头顶部皮肤沿中线做切口约1.5cm，根据《大鼠脑立体定位图谱》精确定位，并于前囟后4.4mm、矢状缝旁1.3mm处钻孔。将6-OHDA溶液抽入微量注射器后固定于脑立体定位仪，缓慢将药物注入右侧纹状体内8.5mm处。停针10min，缓慢退出微量注射器，缝合皮肤并以每天2U的剂量经腹腔注入庆大霉素，连续3天，预防感染，回笼常规饲养。术后第30天，大鼠以0.5mg/kg的剂量腹腔注射阿朴吗啡诱发旋转行为，记录大鼠30min内逆时针转圈圈数。平均旋转圈数达7r/min以上的认为是造模成功。

(2)分组和给药

将帕金森模型大鼠随机分为12组，每组10只。具体分组情况如下：

a)单独治疗组

分组：模型组，阳性药组(多巴丝肼，100mg/kg)，AM02活菌组(10¹⁰CFU/只)，AM06活菌组(10¹⁰CFU/只)，BAA-835活菌组(10¹⁰CFU/只)，AM02灭活菌组(10¹⁰cell/只)，AM06灭活菌组(10¹⁰cell/只)，BAA-835灭活菌组(10¹⁰cell/只)。选取10只健康大鼠作为正常对照组。

b)联用药治疗组

分组包括：AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多巴丝肼(100mg/kg)联用组，AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多巴丝肼(100mg/kg)联用组，AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多巴丝肼(100mg/kg)联用组，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多巴丝肼(100mg/kg)联用组。

c)给药：正常对照组、模型组每日灌胃2mL生理盐水；各给药组给予相应剂量药物。以相应药物每天灌胃1次，连续灌胃24天。

实验过程和实验研究均遵循中国实验动物学会动物伦理委员会制定的原则和要求。

(3)行为学评价

结束给药后2h，按0.5mg/kg的剂量对大鼠腹腔注射阿朴吗啡，诱发大鼠旋转行为。记录各组大鼠第5min到30min内旋转圈数，计算转圈频率。观察药物对帕金森病模型大鼠行为学的改善情况。

(4)血清生化指标的检测

各组大鼠经行为学评价后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉。腹主动脉采血，4℃、3500r·min^-1离心10min，取血清分装-80℃冻存。高效液相色谱法检测血清中神经递质多巴胺(DA)、3，4二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)水平。

(5)数据统计

应用SPSS20.0软件进行统计学处理，结果以(x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2.实验结果

(1)行为学评价

对各组大鼠的行为学进行记录，统计结果如表3所示。与正常对照组相比，模型组PD大鼠的侧向转圈频率显著增加，说明造模成功。给药24d后，与模型组比较，多巴丝肼组、嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02各组大鼠侧向转圈频率显著减少(P＜0.05或P＜0.01)。与标准株BAA-835的活菌或灭活菌组比较，AM06、AM02活菌组和灭活菌组均具有显著性(P＜0.05)，说明改善转圈行为的效果更好。与多巴丝肼组比较，AM06和AM02联用多巴丝肼组均具有极显著性差异(P＜0.01)。与AM02和AM06活菌组分别比较，AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组均能显著减少大鼠转圈频率，具有统计学差异(P<0.01)；与AM06、AM02灭活菌组分别比较，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组可以显著减少大鼠转圈频率，具有统计学差异(P<0.01)，AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组具有协同作用，可以极大程度地调节大鼠的转圈行为。

表3各组大鼠转圈行为(x±s)

/>

“-”表示无转圈行为；

与模型组比较，^*表示具有统计学差异(P<0.05)，^**表示具有极显著差异(P<0.01)；

与BAA-835活菌组比较，^a表示具有显著差异(P<0.05)，^aa表示具有极显著差异(P<0.01)；与BAA-835灭活菌组比较，^b表示具有显著差异(P<0.05)，^bb表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，^c表示具有显著差异(P<0.05)，^cc表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06活菌组比较，^d表示具有显著差异(P<0.05)，^dd表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02活菌组比较，^e表示具有显著差异(P<0.05)，^ee表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06灭活菌组比较，^f表示具有显著差异(P<0.05)，^ff表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02灭活菌组比较，^g表示具有显著差异(P<0.05)，^gg表示具有极显著差异(P<0.01)。

(2)DA、DOPAC、HVA含量检测

多巴胺丢失可导致运动功能出现症状，也就是帕金森症中常见的协调功能受损。

表4各组大鼠血清中DA、DOPAC、HVA水平

/>

与模型组比较，^*表示具有统计学差异(P<0.05)，^**表示具有极显著差异(P<0.01)，^***表示具有极显著差异(P<0.001)；

与BAA-835活菌组比较，^a表示具有显著差异(P<0.05)，^aa表示具有极显著差异(P<0.01)；与BAA-835灭活菌组比较，^b表示具有显著差异(P<0.05)，^bb表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，^c表示具有显著差异(P<0.05)，^cc表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06活菌组比较，^d表示具有显著差异(P<0.05)，^dd表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02活菌组比较，^e表示具有显著差异(P<0.05)，^ee表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06灭活菌组比较，^f表示具有显著差异(P<0.05)，^ff表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02灭活菌组比较，^g表示具有显著差异(P<0.05)，^gg表示具有极显著差异(P<0.01)。

大鼠体内的DA、DOPAC、HVA水平检测结果如表4所示。与正常对照组相比，模型组大鼠血清中的DA、DOPAC、HVA水平明显下降，表明造模成功。

与模型组相比，多巴丝肼、嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02单独给药组、嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02分别与多巴丝肼联用组均能提高大鼠血清中的DA、DOPAC、HVA水平(P<0.05、P<0.01或P<0.001)，结果见表4。其中，AM06、AM02活菌和灭活菌组与标准株BAA-835相比，在提高大鼠体内的DA、DOPAC、HVA水平方面具有统计学差异(P<0.05)；联用组与多巴丝肼单独组相比具有显著的差异(P<0.05)。与AM02和AM06活菌组分别比较，AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组均能显著增加大鼠血清中DA、DOPAC、HVA水平，具有统计学差异(P<0.05)；与AM06、AM02灭活菌组分别比较，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)、AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+多奈哌齐(0.88mg/kg·d)联用组均能显著增加大鼠血清中DA、DOPAC、HVA水平，具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。可见，联用组产生了协同增效的作用，极大程度地提高了大鼠血清中的DA、DOPAC、HVA水平，能更好地改善大鼠运动协调功能，缓解和/或治疗帕金森症症状，具有较好的应用潜力。

实施例4嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗肌萎缩侧索硬化的测试

1.实验方法

(1)模型小鼠准备

SOD1^G93A小鼠是一种携带多拷贝的人源SOD1突变体的转基因小鼠，这种mSOD1基因能够使人源SOD1基因中93号位的甘氨酸变为丙氨酸，导致ALS发生。转基因小鼠购自美国Jackson laboratory(B6SJL-Tg－SOD1*G93A-1Gur/J,Stock no.002726)。通过将购买的转基因雄鼠和相同背景的野生型雌鼠进行交配、培育、繁殖，后代会出现野生型的正常小鼠和表现出ALS症状的SOD1^G93A转基因小鼠，通过标准PCR技术鉴定出阳性鼠。

(2)分组和给药

将表现ALS症状的SOD1^G93A转基因小鼠随机分为12组，每组10只。具体分组情况如下：

a)单独治疗组

分组：模型组，阳性药组(依达拉奉，100mg/kg)，AM02活菌组(10¹⁰CFU/只)，AM06活菌组(10¹⁰CFU/只)，BAA-835活菌组(10¹⁰CFU/只)，AM02灭活菌组(10¹⁰cell/只)，AM06灭活菌组(10¹⁰cell/只)，BAA-835灭活菌组(10¹⁰cell/只)。另选择10只野生型的正常小鼠作为对照组。

b)联用药治疗组

分组包括：AM02活菌(10¹⁰CFU/只)+依达拉奉(15mg/kg)联用组，AM06活菌(10¹⁰CFU/只)+依达拉奉(15mg/kg)联用组，AM02灭活菌(10¹⁰cell/只)+依达拉奉(15mg/kg)联用组，AM06灭活菌(10¹⁰cell/只)+依达拉奉(15mg/kg)联用组。

c)给药：正常对照组、模型组每日灌胃2mL生理盐水；各给药组给予相应剂量药物。以相应药物每天灌胃1次，连续灌胃24天。

实验过程和实验研究均遵循中国实验动物学会动物伦理委员会制定的原则和要求。

(3)行为学检测方法

SOD1^G93A转基因小鼠在12至14周龄时发病，表现为运动障碍、运动神经元退化及神经胶质细胞的过度激活等，在19至23周龄时瘫痪并死亡。对12周龄小鼠进行爪抓力、爬杆、转棒和旷场测试。

(a)四肢抓力实验

通过小鼠四肢抓力的测试来评估小鼠的发病情况及四肢肌肉的损伤程度。将小鼠轻放于握力板中央台上，轻轻拉动小鼠尾部，促使小鼠抓住握力板，待小鼠用力抓住握力网时及时水平后拉，等到仪器出现最大抓力的数值时，记录数据。给药开始以后，每两周测试一次小鼠的抓力值，每只小鼠重复测量三遍，取三次结果中的最大数值作为小鼠的最大抓力值。

(b)爬杆实验

使用爬杆测试来评估小鼠四肢的运动及协调能力和肌肉力量。自制长约50cm，直径大约为1cm的木杆，杆上缠有医用纱布以增加木杆摩擦力。木杆垂直放于水平的桌面上，抓住小鼠尾巴使小鼠的头朝下，其四肢抓住杆顶，放开小鼠尾巴后，开始计时，保证小鼠在不受外力的作用下向下爬行，记录小鼠从杆顶爬到底部平台的时间(统一以后肢着地为准)。小鼠在给药前连续训练该行为学3天，每只小鼠进行三次重复试验，剔除不达标的小鼠。给药开始后，每两周测试一次行为学，测试结果的最大值不超过15秒，超过15秒的数值按15秒记录。计算小鼠三次爬杆时间的平均值作为最终的爬杆时间。

(c)转棒试验

运用Rotarod仪器(直径4cm，20rpm)对小鼠运动能力进行评估。前7天，每天让小鼠在转棒上练习5min，连续跑步3次，使小鼠习惯转棒运动，并得到其运动能力的基线值。从77日龄开始，记录小鼠在转棒上运动的时间(不超过5min)，每次重复3次，记录最好的成绩。之后每2天进行1次转棒运动。

(d)旷场测试

旷场测试主要统计小鼠在敞箱内5min的自主爬行总路径，可以评估小鼠的运动自主性和运动能力。旷场设备的明暗箱大小为200mm x 200mm x 200mm。将实验小鼠置于明暗箱中，用高清摄像头追踪并记录小鼠在箱中5min的活动轨迹。运用旷场实验视频分析系统记录小鼠活动轨迹图，并对爬行总路径进行统计。

(4)数据统计

应用SPSS20.0软件进行统计学处理，结果以(x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2.实验结果

ALS模型小鼠发病时，表现为运动障碍、运动神经元退化及神经胶质细胞的过度激活等。对各组小鼠进行行为学检测，结果如表5。

表5各组小鼠行为学检测结果

与模型组比较，^*表示具有统计学差异(P<0.05)，^**表示具有极显著差异(P<0.01)；

与BAA-835活菌组比较，^a表示具有显著差异(P<0.05)，^aa表示具有极显著差异(P<0.01)；与BAA-835灭活菌组比较，^b表示具有显著差异(P<0.05)，^bb表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，^c表示具有显著差异(P<0.05)，^cc表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06活菌组比较，^d表示具有显著差异(P<0.05)，^dd表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02活菌组比较，^e表示具有显著差异(P<0.05)，^ee表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06灭活菌组比较，^f表示具有显著差异(P<0.05)，^ff表示具有极显著差异(P<0.01)；

与嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM02灭活菌组比较，^g表示具有显著差异(P<0.05)，^gg表示具有极显著差异(P<0.01)。

由表5可以看出，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠爪抓力明显减弱，爬杆时间增多，说明爬行速度变慢，在转棒上的停留时间明显减少，在敞箱内自主爬行总路程明显减少，说明ALS小鼠造模成功。

使用握力计测量小鼠抓握力量，可评估小鼠神经损伤及四肢肌肉损伤程度。与模型组相比，各单独给药组和联合给药组小鼠抓握力量有一定程度的增加(P<0.05或P<0.01)，说明给药依达拉奉和嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02可以改善或治疗ALS症状。与标准嗜黏蛋白阿克曼氏菌BAA-835相比，本发明的AM06和AM02具有明显更优的治疗效果(P<0.05)；AM06和AM02联用依达拉奉组与AM06，AM02及依达拉奉单独作用组相比，显著地增强了小鼠的爪抓力，具有协同增效作用(P<0.05)。

爬杆可以测试小鼠爬行速度，同时可以评估小鼠肢体协调能力。通过表5的数据可以看出，与模型组相比，小鼠在给药后，各单独给药组和联合给药组小鼠爬行速度有一定程度的提升，且AM06和AM02明显优于BAA-835治疗效果(P<0.05)。联合给药组与AM06，AM02及依达拉奉单独作用组相比爬行速度明显更快(P<0.05)。

在小鼠的平衡、协调和肌力方面，通过转棒测试对小鼠进行评估。由表5结果可以看出，与模型组相比，小鼠在给药后，各单独给药组和联合给药组小鼠在转棒上的停留时间有明显提升(P<0.05或P<0.01)，且AM06和AM02明显优于BAA-835治疗效果(P<0.05)。联用给药组停留时间明显长于单独给药组(AM06，AM02和依达拉奉单独组)(P<0.05)，并体现出一定的协同效果。

旷场测试统计小鼠在敞箱内5min的自主爬行总路径，可以评估小鼠的运动自主性和运动能力。与模型组相比，各单独给药组和联合给药组小鼠总爬行路程明显增多(P<0.05或P<0.01)，且AM06和AM02明显优于BAA-835治疗效果(P<0.05)。联合给药组停留时间明显长于AM06，AM02及依达拉奉单独给药组(P<0.05)，体现出一定的协同效果。

由上结果可知，本发明的AM06和AM02菌株具有更为显著的提高小鼠协调能力，与依达拉奉联用，具有协同增效作用，可以更进一步地提高治疗效果。

综上，本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌AM06、AM02及其药物组合物可以改善和治疗神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症。并且与其他药物联用具有协同增效作用。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.嗜黏蛋白阿克曼氏菌在制备改善和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌是保藏编号为CGMCC No.22793的AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02菌株中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌是活菌、形态结构完整的灭活菌、形态结构不完整的灭活菌、菌体裂解液、细菌培养上清中的一种，两种或更多种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病中的至少一种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。

5.一种药物组合物，所述药物组合物包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其他可改善和/或治疗神经退行性疾病的药物；

所述其他可改善和/或治疗治神经退行性疾病的药物包含治疗阿尔兹海默症的药物、治疗帕金森症的药物、治疗肌萎缩侧索硬化症的药物、治疗亨廷顿病中的至少一种；

所述治疗阿尔兹海默症的药物包括多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀中的一种，两种或者更多种；

所述治疗帕金森的药物包括抗胆碱能药、金刚烷胺、多巴胺、DR激动剂、单胺氧化酶-B抑制剂、COMT抑制剂中的至少一种；

所述治肌萎缩侧索硬化症的药物包括依达拉奉、巴氯芬、地西泮、苯海索、阿米替林和利鲁唑中的至少一种；

所述治疗亨廷顿病的药物选自丁苯那嗪。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌为保藏编号为CGMCC No.22793的AM06，或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02嗜黏蛋白阿克曼氏菌，或嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02与多奈哌齐的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗阿尔兹海默症。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02与多巴丝肼的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗帕金森症。

9.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为保藏编号为CGMCC No.22793的AM06或保藏编号为CGMCC No.22794的AM02与依达拉奉的组合物，所述药物组合物用于缓解和/或治疗肌萎缩侧索硬化症。

10.权利要求5-9任一项所述的药物组合物在制备改善和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

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