CN112386614B - 植物乳杆菌ma2在制备预防或改善阿尔茨海默症药物或食品方面中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症的药物或食品方面中的应用。本发明提供了一种植物乳杆菌MA2在预防或改善阿尔茨海默症药物及食品中的应用，以植物乳杆菌MA2活菌作为有效成分，制成医学及食品上可接受的剂型，可显著改善阿尔茨海默症，提高该菌株的应用价值。

Description

植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症药物或食品 方面中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症药物或食品方面中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种以进行性认知障碍和记忆损伤为主的神经系统退行性疾病，是老年痴呆症最常见的一种形式。AD的病理特征表现为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。临床上主要表现为记忆障碍、失语、失认、视空间技能损害、执行功能障碍。随着我国老龄化程度的加剧，AD会成为影响老年人健康的主要疾病之一，有效预防和治疗AD成为摆在面前的重要课题。

现代医学对AD的发病机制进行了多年的研究，但是由于其病因复杂，该病的发病机制至今仍不明确。目前主要的抗AD药物有乙酰胆碱酯酶抑制剂(如多奈哌齐)和N-甲基-D天冬氨酸受体(NMDA受体)拮抗剂(如美金刚)，但上述药物价格昂贵，长期服用有一定的副作用，且只能延缓，却不能控制或逆转患者病情。

近几年来,随着肠道菌群-肠-脑轴的研究越来越深入，人们逐渐认识到肠道菌群对脑肠轴信号传递具有主导作用。益生菌作为一类能够定植于宿主肠道并对机体产生有益作用的活性微生物，很可能对神经系统疾病的防治提供新的途径与思路。植物乳杆菌MA2(Lactobacillus plantarum MA2),分离自西藏农家Kefir粒,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保存编号为CGMCC No.3005。目前对植物乳杆菌MA2的研究主要有发酵剂的制备、发酵制品及降血脂功能的研究，如申请号为CN200910069088.1的专利公开了一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法；李骞等人研究了植物乳杆菌MA2发酵剂的制备方法；申请号为CN201210084747.0的专利公开了乳酸菌发酵芹菜泡菜的制备方法。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服服用现有阿尔茨海默症药物后产生的副作用的不足之处，提供一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症药物或食品方面中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症的药物或食品方面中的应用。

而且，所述植物乳杆菌MA2(Lactobacillus plantarum MA2),分离自西藏农家Kefir粒，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCCNo.3005。

而且，所述药物或食品以植物乳杆菌MA2活菌为有效成分，制成医学上及食品中能接受的剂型。

而且，所述阿尔茨海默症的病理特征包括β-淀粉样蛋白的增多、神经元和突触丧失、神经炎症、肠道菌群紊乱。

而且，所述神经炎症包括：TLR4-MyD88炎症信号通路明显激活，炎性相关因子iNOS的相对转录水平升高。

而且，所述肠道菌群紊乱包括：与炎症相关的金黄杆菌属(Chryseobacterium)增加以及有益菌属减少。

而且，所述有益菌属包括普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)。

而且，所述植物乳杆菌MA2能够通过增加脑组织中神经元细胞的数量、减少Aβ1-42的含量、抑制神经炎症信号通路TLR4-MyD88的激活以及以及平衡肠道菌群来改善AD。

一种预防或改善阿尔茨海默症的药物或食品，所述药物或食品包括有效量的植物乳杆菌MA2活菌及医学上、食品中能够接受的辅料。

而且，所述药物或食品的剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和饮剂。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明提供了一种植物乳杆菌MA2在预防或改善阿尔茨海默症药物及食品中的应用，以植物乳杆菌MA2活菌作为有效成分，制成医学及食品上可接受的剂型，可显著改善阿尔茨海默症，提高该菌株的应用价值。

2、本发明利用行为学模型，对饲喂植物乳杆菌MA2活菌制剂一个月后的斑马鱼进行T迷宫实验，观察斑马鱼空间记忆的改善情况。T迷宫实验中对各组斑马鱼的潜伏期进行检测，结果显示：与模型组相比，MA2组第四天的潜伏期明显缩短。说明本发明提供的植物乳杆菌MA2可改善AD斑马鱼的空间记忆能力。

3、本发明对饲喂植物乳杆菌MA2活菌制剂一个月后的斑马鱼进行脑部神经元细胞退行性病变的观察、Aβ1-42含量的检测。与AD斑马鱼相比，植物乳杆菌MA2干预使得斑马鱼脑部神经元细胞排列较清晰，神经元细胞数量增加，细胞核结构较清晰；Aβ1-42含量降低。说明本发明提供的植物乳杆菌MA2活菌制剂对AD特征病理有显著的改善作用。

4、本发明对饲喂植物乳杆菌MA2活菌制剂一个月后的斑马鱼进行神经炎症TLR4-MyD88信号通路的分析。与模型组相比，植物乳杆菌MA2干预使得MyD88及其下游信号分子相对转录水平显著下降，对炎症信号通路起到负调控的作用。说明本发明提供的植物乳杆菌MA2活菌制剂对AD神经炎症有显著的改善作用。

5、本发明对饲喂植物乳杆菌MA2活菌制剂一个月后的斑马鱼进行肠道菌群分析。植物乳杆菌MA2干预使得炎症性金黄杆菌属(Chryseobacterium)明显减少，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)等有益菌属增加。说明本发明提供的植物乳杆菌MA2活菌制剂对AD引起的肠道菌群紊乱有一定的改善作用。

6、本发明对饲喂植物乳杆菌MA2活菌剂三个月后的AD大鼠模型进行β-淀粉样蛋白浓度、乙酰胆碱酯酶活性的检测。与模型组相比，植物乳杆菌MA2干预能够降低β-淀粉样蛋白浓度及乙酰胆碱酯酶活性。说明本发明提供的植物乳杆菌MA2活菌制剂对AD特征病理有显著的改善作用。

附图说明

图1为本发明中各组斑马鱼T迷宫潜伏期结果图：其中，数据是以均值±S.D；**表示与空白组相比，差异极显著P<0.01，*表示与空白组相比，差异显著，p<0.05；^#表示与模型组相比，差异显著，P<0.05；

图2为本发明中各组斑马鱼脑区HE染色结果图：其中，A：空白组；B：模型组；C：植物乳杆菌MA2组；

图3为本发明中各组斑马鱼脑组织中Aβ1-42的含量结果图：其中，数据是以均值±S.D；**表示与空白组相比，差异极显著P<0.01，*表示与空白组相比，差异显著，p<0.05；^##表示与模型组相比，差异极显著，P<0.01；

图4为本发明中各组斑马鱼脑组织中LPS的水平图；其中，数据是以均值±S.D；**表示与空白组相比，差异极显著P<0.01，^##表示与模型组相比，差异极显著，P<0.01；

图5为本发明中各组斑马鱼脑区小胶质细胞标志物离子通道相关钙衔接蛋白(Iba-1)表达结果图(免疫组化染色，×400)；

图6为本发明中各组斑马鱼脑区Iba-1表达量统计图结果图：其中，数据是以均值±S.D；**表示与空白组相比，差异极显著P<0.01，*表示与空白组相比，差异显著，p<0.05；

图7为本发明中各组斑马鱼脑区TLR4-MyD88炎症信号通路关键因子的相对转录水平结果图；其中，数据是以均值±S.D；**表示与空白组相比，差异极显著P<0.01，*表示与空白组相比，差异显著，p<0.05；^#表示与模型组相比，差异显著，P<0.05；^##表示与模型组相比，差异极显著，P<0.01；

图8为本发明中饲喂植物乳杆菌MA2对斑马鱼肠道菌群在门(a)、科(b)、属(c)分类学组成影响图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症的药物或食品方面中的应用。

较优地，所述植物乳杆菌MA2(Lactobacillus plantarum MA2),分离自西藏农家Kefir粒，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCCNo.3005。

较优地，所述药物或食品以植物乳杆菌MA2活菌为有效成分，制成医学上及食品中能接受的剂型。

较优地，所述阿尔茨海默症的病理特征包括β-淀粉样蛋白的增多、神经元和突触丧失、神经炎症、肠道菌群紊乱。

较优地，所述神经炎症包括：TLR4-MyD88炎症信号通路明显激活，炎性相关因子iNOS的相对转录水平升高。

较优地，所述肠道菌群紊乱包括：与炎症相关的金黄杆菌属(Chryseobacterium)增加以及有益菌属减少。

较优地，所述有益菌属包括普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)。

较优地，所述植物乳杆菌MA2能够通过增加脑组织中神经元细胞的数量、减少Aβ1-42的含量、抑制神经炎症信号通路TLR4-MyD88的激活以及以及平衡肠道菌群来改善AD。

一种预防或改善阿尔茨海默症的药物或食品，所述药物或食品包括有效量的植物乳杆菌MA2活菌及医学上、食品中能够接受的辅料。

较优地，所述药物或食品的剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和饮剂。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

实施例1

染毒液的配制：将结晶氯化铝配置成5mg/L的母液，用养殖液将母液稀释成200μg/L的染毒液，用稀盐酸调节pH至6.4。每天需更换三分之一的染毒液，并且清理鱼缸一次，除去鱼缸中的粪便及杂物，染毒期为30天。

实施例2

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。利用T迷宫实验观察各组斑马鱼的空间记忆。

T迷宫实验是将测试斑马鱼从T迷宫起点开始自由活动，4min内观察并记录测试鱼从起点到第一次进入营养丰富区(EC区)的时间(即第一次潜伏期，以斑马鱼在EC区停留超过20s视为进入EC区)，结果见图1。图1显示：随着时间的延长，各组斑马鱼的潜伏期在第三天和第四天明显缩短，但下降的程度明显小于空白组。但是，MA2干预组第四天的潜伏期与模型组相比明显缩短，且显著区别于模型组。

实施例3

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取脑，并将其置于10％福尔马林溶液中固定24h以上用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，染色结果见图2。图2显示：模型组斑马鱼神经元细胞排列松散，分布不均匀，数量明显减少，细胞核结构不清晰。植物乳杆菌MA2干预后斑马鱼脑区病变较模型组明显改善，神经元细胞排列较清晰，神经元细胞数量增加，细胞核结构较清晰，说明益生菌MA2具有一定的神经元保护作用。

实施例4

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取脑备用。采用双抗体夹心法测定斑马鱼脑部β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)水平，结果见图3。图3显示：模型组Aβ1-42的含量最高，与空白对照组相比具有极显著差异。植物乳杆菌MA2干预后，脑组织中的Aβ1-42的含量有所降低，说明植物乳杆菌MA2对斑马鱼脑区Aβ1-42有一定的清除作用。

实施例5

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取脑备用。采用双抗体夹心法测定斑马鱼脑部脂多糖(LPS)水平，结果见图4。图4显示：与空白组相比，模型组脑组织中LPS水平显著升高。植物乳杆菌MA2干预后，脑组织中LPS水平显著降低，区别于模型组。说明植物乳杆菌MA2可以降低LPS进入大脑的水平。

实施例6

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取脑，并将其置于10％福尔马林溶液中固定24h以上。固定好的斑马鱼脑组织用于免疫组化检测小胶质细胞的活化，染色结果如图5、Iba-1表达量结果如图6。图5、图6显示：模型组小胶质细胞呈典型的激活状态，胞体增大，细胞形态呈圆形或无定形且IBA1阳性细胞数也明显多。植物乳杆菌MA2干预后小胶质细胞数明显减少，说明植物乳杆菌MA2可以明显抑制斑马鱼脑区小胶质细胞的活化。

实施例7

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取脑。利用RT-qPCR技术检测植物乳杆菌MA2对神经炎症通路TLR4-MyD88的影响，结果如图7。图7显示：与空白组相比，模型组的髓样分化应答因子88(MyD88)、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)、诱导核因子

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)相对表达量显著升高；植物乳杆菌MA2干预组显著区别于模型组，显著下调了MyD88、TRAF6、

iNOS的相对表达量。说明AD斑马鱼脑中TLR4/MyD88炎症信号通路被激活，从而刺激TRAF6和NF-κB的转录活性，导致促炎介质iNOS的表达。而植物乳杆菌MA2干预使得MyD88及其下游信号分子相对转录水平显著下降，对炎症信号通路起到负调控的作用。

实施例8

以斑马鱼为实验材料，将成年斑马鱼分为空白对照组、模型组、植物乳杆菌MA2组，每组各40条。除空白组外，其余两组用实施例1的染毒液染毒30天，同时，MA2组用植物乳杆菌MA2菌粉制剂(1×10⁹CFU/缸/天)干预30天。行为学实验结束后，禁食12h，开始处理实验斑马鱼，用0.02％的三卡因麻醉，冰上快速解剖取肠，收集斑马鱼的肠道内容物。将各组斑马鱼的肠道内容物送到杭州谷禾信息技术有限公司，进行16SrRNA基因高通量测序，检测斑马鱼肠道菌群多样性。结果如图8所示，图8分别表示为：斑马鱼肠道菌群在门(a)、科(b)、属(c)三个分类水平中的丰度。结果显示：植物乳杆菌MA2可以降低斑马鱼肠道中金黄杆菌属(Chryseobacterium)等炎症细菌的丰度，增加普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)等有益细菌属的丰度。说明植物乳杆菌MA2可以改善斑马鱼的肠道微生态。

结论：植物乳杆菌MA2可以通过增加脑组织中神经元细胞的数量、减少Aβ1-42的含量、抑制神经炎症信号通路TLR4-MyD88的激活以及以及平衡肠道菌群来改善AD。

注意：本发明使用SPSS分析各实验组间的差异。本发明所呈现的所有数据均以平均值±标准差(SD)表示。若P＜0.05，则差异被认为是统计学上显著的。**表示与空白组相比，差异极显著，P<0.01，*表示与空白组相比，差异显著，p<0.05；##表示与模型组相比，差异极显著，P<0.05，#表示与模型组相比，差异显著。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌MA2在制备预防或改善阿尔茨海默症的药物方面中的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌MA2 (Lactobacillus plantarum MA2) , 分离自西藏农家Kefir粒，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC No.3005；

所述药物为预防或改善斑马鱼的阿尔茨海默症的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物以植物乳杆菌MA2活菌为有效成分，制成医学上能接受的剂型。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述阿尔茨海默症的病理特征包括β-淀粉样蛋白的增多、神经元和突触丧失、神经炎症、肠道菌群紊乱。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述神经炎症包括：TLR4-MyD88炎症信号通路明显激活，炎性相关因子iNOS的相对转录水平升高。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肠道菌群紊乱包括：与炎症相关的金黄杆菌属（Chryseobacterium）增加以及有益菌属减少。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述有益菌属包括普雷沃氏菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌MA2能够通过增加脑组织中神经元细胞的数量、减少Aβ1-42的含量、抑制神经炎症信号通路TLR4-MyD88的激活以及以及平衡肠道菌群来改善AD。

8.一种预防或改善阿尔茨海默症的药物，其特征在于：所述药物包括有效量的植物乳杆菌MA2活菌及医学上能够接受的辅料；所述植物乳杆菌MA2，分离自西藏农家Kefir粒，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC No.3005。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和饮剂。

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