CN117653673A - 一株能够缓解机体衰老症状的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够缓解机体衰老症状的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开了植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661在延缓机体衰老中的作用。所述延缓衰老包括：缓解衰老小鼠的改善认知损伤；改善氧化应激水平；增加骨质量；改善脑神经细胞状况；促进短链脂肪酸的表达；降低衰老标志基因和神经炎症基因的表达；改善肠道菌群；改善肠道屏障损伤。植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解衰老症状的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株能够缓解机体衰老症状的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能够缓解机体衰老症状的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
机体的衰老通常被认为是随着年龄增长和机体细胞的保护作用机制逐渐减少而引起机体整体功能逐渐退化的一种现象。近几十年来，生育率的急剧下降和寿命的延长正在导致世界人口以有史以来最快的速度老龄化，世界卫生组织报告，到2030年，全世界六分之一的人将达到60岁或以上。而衰老将会严重影响人们的生命质量——老年群体机体功能衰退、各脏器生理储备功能下降，对外界各种刺激的承受能力也会下降。研究证明，衰老过程中，脑部的功能及组织会发生变化而导致认知能力的下降，并可能会进一步发展为阿尔茨海默病等神经疾病。同时，随着年龄的增长，成骨细胞和破骨细胞等骨细胞数量会减少、细胞功能会下降，进而导致机体的骨量和骨强度下降。衰老过程中的骨变化增大了机体患骨质疏松等骨疾病及出现骨损伤的风险。衰老时，肠道免疫系统的功能也会出现下降，这会导致患慢性便秘、肠道感染等肠道疾病的风险增加。研究也已经表明，肠道菌群随年龄的变化而存在着动态变化，人体衰老的过程中，处于平衡状态的肠道菌群逐渐被打破并进一步影响肠道菌群的组成、多样性及稳定性。与衰老相关的疾病的发生将大大影响人们的正常生活。实现和维持“健康老龄化”、提高老年人的健康状况具有重要意义。
益生菌是促进健康的微生物，其对机体产生的有益作用及作用机理已经得到了广泛的研究。目前，大量研究证明益生菌可改善衰老。益生菌可调节与年龄相关的肠道微生物群失衡而具备缓解衰老的作用。并且益生菌对肠道菌群的调节会影响肠道菌群相关的活性代谢物的水平而产生更进一步的缓解衰老的有益作用。此外，益生菌也被报道可提高机体的抗氧化能力，氧化应激会加速机体的衰老，机体抗氧化能力的提高可有效的抗衰。衰老也与免疫功能下降和炎症增加有关，益生菌干预可以改善一些与年龄相关的免疫学特征改变进而起到改善衰老的作用。益生菌可能是一种有效的抗衰老手段。目前，植物乳杆菌已经被广泛报道具有缓解机体衰老症状的作用。研究报道，植物乳杆菌FEED8可缓解D-半乳糖导致的小鼠氧化应激而延缓衰老。此外，专利CN115873761A报道植物乳杆菌具备缓解衰老小鼠的组织氧化应激和组织损伤的作用，并可改善衰老小鼠的运动状况。专利CN113717883A也报道植物乳杆菌可调节小鼠衰老基因的表达、改善小鼠氧化应激状况、减少肠道屏障损伤而对小鼠具有延缓衰老、改善健康的作用。此外，还有专利CN115948281A报道称植物乳杆菌可通过调节肠道菌群和短链脂肪酸而对D-半乳糖诱导的衰老小鼠产生有益作用。这些报道表明了植物乳杆菌具有缓解机体衰老的作用。但是，这些报道也反映出了多数植物乳杆菌功能较为单一、无法从多个方面共同作用来延缓衰老的缺陷。故而，寻找到一株可从多方面改善机体健康、延缓衰老的植物乳杆菌是十分有意义的。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株缓解衰老症状的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，并且提供其应用。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661，所述植物乳杆菌CCFM8661保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5494，保藏日期为2011年11日29日，已公开于公开号为CN102586148A的专利申请文件中。
所述植物乳杆菌CCFM8661具有如下特征：
菌体特征：革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约2-4μm长，0.5-1.0μm宽，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。
菌落特征：在MRS培养基上能够形成明显的菌落，直径在0.3-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。
生长特性：该菌株的最低生长温度为20℃，最高生长温度为40℃，在温度30-37℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和2.5，最适生长初始pH为6.0。
本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661在制备缓解机体衰老症状的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于以下至少一方面：
(1)改善认知损伤；
(2)改善氧化应激水平；
(3)增加骨质量；
(4)改善脑神经细胞状况；
(5)促进短链脂肪酸的表达；
(6)降低衰老标志基因和神经炎症基因的表达；
(7)改善肠道菌群；
(8)改善肠道屏障。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品和保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有植物乳杆菌的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品还含有填充剂、载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体，辅料包含填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、麦芽糊精、乳糖、蔗糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
本发明的一种实施方式中，所述产品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明还提供了植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解机体衰老症状的保健品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述保健品用于以下至少一个方面：
(1)抗氧化；
(2)改善记忆；
(3)改善骨密度；
(4)调节肠道菌群。
本发明的一种实施方式中，所述保健品包括含植物乳杆菌CCFM8661的乳制品或发酵制品。
有益效果：
1、本发明将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661用于延缓机体衰老，所述延缓衰老的作用具体体现在：
(1)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知能力损伤及焦虑、抑郁情况。
(2)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的脑部氧化应激水平：降低丙二醛(MDA)水平，增加超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)的水平。
(3)显著促进D-半乳糖诱导的衰老小鼠的脑部的谷胱甘肽二硫化物还原酶(GSR)基因、血红素氧合酶1(HO-1)基因、蛋白激酶B-α(Akt1)基因及Klotho基因的表达。
(4)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肝部氧化应激水平：提高总抗氧化能力(T-AOC)及SOD水平。
(5)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的骨骼质量下降：降低了血清BALP、TRACP-5b及β-CTx的水平。
(6)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的脑神经损伤：显著减少了海马体小胶质细胞的激活以及海马体神经元细胞的损伤。
(7)显著提高了D-半乳糖诱导的衰老小鼠肠道中乙酸、戊酸的含量。
(8)显著下调了衰老标志基因及神经炎症因子的表达。
(9)显著调节了D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肠道菌群，包括使D-半乳糖暴露小鼠的肠道菌群组成更趋向于正常小鼠，上调厚壁菌(Firmicutes)/拟杆菌(Bacteroidetes)的比例，上调瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)等有益菌的丰度，下调副萨特氏菌属(Parasutterella)等有害菌的丰度。
(10)显著缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肠道屏障损伤：显著提高了Occludin、ZO-1和ZO-2蛋白的基因表达水平。
因此，植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解衰老症状的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。
2、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是可纳入食品应用的一种益生菌。本发明的植物乳杆菌以及有效成分为植物乳杆菌CCFM8661。
附图说明
图1为新物体识别实验结果。
图2为Y迷宫实验结果。
图3为旷场实验结果。
图4为衰老小鼠脑部的MDA、GSH及SOD的水平/酶活。
图5为衰老小鼠脑部GSR、HO-1、Klotho及Akt1的基因表达情况。
图6为衰老小鼠肝部的GSH及T-AOC水平。
图7为衰老小鼠的骨血清生化指标：BALP、TRACP-5b及β-CTx。
图8为衰老小鼠的脑神经细胞的状况：图a为海马CA2和CA3区免疫组化Iba1阳性细胞的代表性照片(比例尺100μm)；图b为海马DG区免疫组化Iba1阳性细胞的代表性照片(比例尺50μm)；图c为小鼠海马CA3区神经元细胞状况(HE染色，标尺100μm)。
图9为衰老小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸及戊酸)水平。
图10为衰老小鼠脑部衰老标志基因(p16、p21及p53)和神经炎症因子表达情况。
图11为小鼠肠道菌群的β多样性及厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度。
图12为小鼠肠道菌群属水平的菌群组成、丰度差异及显著差异菌的相对丰度。
图13为衰老小鼠的肠道屏障指标Occludin、Claudin1、ZO-1及ZO-2的基因相对表达量。
图中所有柱形图均为平均值±标准误。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的8周雄性ICR小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。下述实施例中涉及的D-半乳糖购自美国Sigma化学有限公司。下述实施例中涉及的T-AOC、GSH、MDA和SOD检测试剂盒购自南京建诚生物技术研究所。下述实施例中涉及的BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司。下述实施例中涉及的小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5(TRACP-5b)，β-骨胶原交联(β-CTx)和骨碱性磷酸酶(BALP)的ELISA试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司。下述实施例中涉及的FastDNA Spin Kit for Feces购自MP Biomedicals公司，TIANgel Mini Purification Kit购自天根生物技术有限公司。下述实施例中涉及的细胞/组织中总RNA提取试剂(Trizol法)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
下述实施例中使用的植物乳杆菌CCFM8661，分类学命名为Lactobacillusplantarum，已于2011年11日29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5494，已公开于公开号为CN102586148A的专利申请文件中。植物乳杆菌的分类学命名已于2022年更新为Lactiplantibacillusplantarum。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖20、乙酸钠2、酵母粉5、柠檬酸氢二铵2、K2PO4·3H2O 2.6、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO40.05、吐温80 1、琼脂20，pH6.8。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖20、乙酸钠2、酵母粉5、柠檬酸氢二铵2、K2PO4·3H2O 2.6、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO40.05、吐温80 1，pH6.8。
下述实施例中涉及的植物乳杆菌菌悬液的制备方法如下：
将植物乳杆菌划线至MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液接种至MRS液体培养基中(接种量2％～4％(v/v))，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心3min，得到植物乳杆菌菌体；将植物乳杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于生理盐水中，使菌浓度为5×109CFU/mL。
下述实施例中涉及的实验方法如下：
1、实时荧光定量PCR分析(基因表达分析)
采用TRIzol法提取海马体及结肠的总RNA，并测量组织总RNA的浓度与纯度。对提取的总RNA进行逆转录并作为PCR扩增的模板。根据表1的引物序列，以GAPDH为内参基因，通过实时定量聚合酶链反应测定脑部Akt1、p65、Klotho、HO-1、Gsr基因及衰老标志基因p16、p53的表达水平。
表1实时定量PCR所用引物序列
2、行为学测试
(1)新物体识别
小鼠在实验装置内熟悉环境10min。在实验装置内放置2个相同物体(距离边界10cm)，在距物体等长度处放入小鼠，进行物体认识5min并记录小鼠对物体的探索情况(探索次数、探索时间及距离)。2个小时后，将两个相同物体中的一个物体替换成一个不同的物体放入装置中，放入小鼠再次进行物体探索并记录。每只小鼠测试完成后，采用75％乙醇清理测试环境。指标的数据处理如下：
认知指数＝NT/(NT+OT)
辨别指数＝(NT—OT)/(NT+OT)
NT：探索新物体的时间；OT：探索旧物体的时间。
(2)Y迷宫
Y迷宫为黑色的三个臂组成，每个臂长35厘米，高20厘米，宽7.5厘米。测试时，将小鼠放置于三个臂的连接处，让其可自由穿梭于各个臂，记录小鼠在臂内的出入次数及出入顺序。每只小鼠测试完成后，采用75％乙醇清理测试环境。自发轮流行为评分为计算为：
自发轮流行为评分＝n/(N-2)*100
n：连续进入3个不同臂的次数，即轮替数；N：总进臂次数，即最大轮替次数。
(3)旷场实验
试验在一个观察箱(40×40×35cm)中进行，所有老鼠可以自由活动。每只小鼠在箱体中心释放，记录小鼠在10min内的行动轨迹及运动时间。每只小鼠测试后，采用75％乙醇清理测试环境。探索行为评分定义为区域中心探索时间与非中心区域探索时间之比。
3、数据统计分析
数据以平均值±SEM表示。用SPSS26.0软件进行单因素方差分析，比较各组间指标的差异，采用GraphPad Prism 9.5作图。
实施例1植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠的认知损伤
植物乳杆菌CCFM8661菌悬液的制备：
将植物乳杆菌CCFM8661划线至MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液接种至MRS液体培养基中(接种量2％～4％(v/v))，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心3min，得到植物乳杆菌CCFM8661菌体；将植物乳杆菌CCFM8661菌体经生理盐水洗涤后重悬于生理盐水中，使菌浓度为5×109CFU/mL。
实验动物处理：24只SPF级8周龄雄性ICR小鼠饲养在所有小鼠饲养于25±2℃、相对湿50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，并可自由进食进水。在新环境适应1周后，小鼠随机分为3组：对照组(Control)，模型组(Model)及植物乳杆菌CCFM8661干预组(CCFM8661)。除对照组外，其余两组小鼠皮下注射D-半乳糖(500mg/kg体重/d)，连续2个月，注射量为每只小鼠200μL。植物乳杆菌CCFM8661干预组每天灌胃给予109CFU的活菌，对照组与模型组灌胃给予无菌生理盐水，每次给予200μL，持续2个月。试验期间，每周监测小鼠的体重；药物及益生菌干预完成后，进行行为学测试一周；在干预结束后的第二天收集粪便。
为了分析益生菌对小鼠空间记忆和学习能力的影响，在药物/益生菌处理8周后进行了多项多项运动试验，包括新物体识别实验、Y迷宫和旷场实验。检测结果见图1-3。
新物体识别测试根据动物对熟悉物体和新物体的探索时间长短来评价被测试动物的记忆能力，是短期记忆的衡量标准。在新物体识别测试中，与对照组相比，模型组(D-半乳糖干预)的小鼠的认知指数及判别指数显著下降，而在植物乳杆菌CCFM8661干预的情况下，D-半乳糖暴露并不会对小鼠的认知指数和判别指数造成下降(认知指数：对照组平均0.5947；模型组平均0.4497；CCFM8661干预组平均0.5983；判别指数：对照组平均0.1893；模型组平均-0.1007；CCFM8661干预组平均0.1966)。
Y迷宫中测试是对空间记忆的快速简单测试。在Y迷宫实验中，所有组别的小鼠最大轮流次数并没有显著差异，但是D-半乳糖诱导的衰老小鼠在Y迷宫中轮替数明显下降，植物乳杆菌CCFM8661干预则会缓解D-半乳糖暴露导致的轮替数下降的问题(轮替数：对照组平均33.50，模型组平均19.50，CCFM8661干预组平均27.50)。同时也发现D-半乳糖导致衰老的小鼠自发轮流行为评分显著下降，而在植物乳杆菌CCFM8661干预则会显著的提高小鼠的自发轮流行为评分(发轮流行为评分：对照组平均57.88，模型组平均41.58，CCFM8661干预组平均61.25)。
旷场实验可评估基本的运动活动和焦虑样行为。在旷场实验中，发现各组小鼠的运动速度、运动距离及进出中心区域的频率并不存在显著差异，但是D-半乳糖暴露将会显著的降低小鼠在中心区域的探索时间及探索行为评分，植物乳杆菌CCFM8661会显著的缓解这一现象，即D-半乳糖暴露导致小鼠探索时间减少及探索行为评分下降(探索时间占比：对照组平均22.57％；模型组平均14.54％；CCFM8661干预组平均22.08％；探索行为评分：对照组平均0.3151；模型组平均0.1720；CCFM8661干预组平均0.2927)。
上述结果表明，相比于正常小鼠，D-半乳糖诱导衰老的小鼠的认知、记忆能力及自发探索性会显著的下降，而植物乳杆菌CCFM8661会改善D-半乳糖诱导的认知、记忆衰退问题。
实施例2植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠组织的氧化应激水平
实验设置参考实施例1，实验结束后，对小鼠的组织氧化指标进行测定：取0.1g脑或肝组织，加入生理盐水0.9mL中。将混合物研磨破碎，在4℃、6000转/分的条件下离心10分钟，收集上清液进行指标测定。组织的SOD、MDA、GSH及总抗氧化能力指标及组织的蛋白浓度测定按试剂盒方法进行。
1、植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠脑部氧化应激的影响
植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠脑部氧化应激具有缓解作用，结果见图4、表1。D-半乳糖暴露后，脑部的MDA、GSH水平出现了显著的变化(MDA变为对照组的1.1639倍，GSH变为对照组的0.8606倍)。植物乳杆菌CCFM8661处理逆转了脑MDA、GSH的变化(MDA是对照组的0.94144倍，GSH是对照组的1.0493倍)。与对照组相比，D-半乳糖暴露没有显著影响脑部SOD的水平，但是植物乳杆菌CCFM8661干预一定程度上上调了衰老小鼠的脑SOD水平。
表2植物乳杆菌CCFM8661对小鼠脑氧化指标的影响(平均值±标准差)
组别 GSH(μmol/g蛋白质) SOD(U/mg蛋白质) MDA(μmol/g蛋白质)
对照组 3.47±0.28b 51.37±2.52ab 3.74±0.21a
模型组 2.99±0.25a 48.66±5.47a 4.35±0.24b
CCFM8661干预组 3.64±0.31b 54.60±3.23b 3.52±0.33a
2、植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠脑部基因表达的影响
为了进一步阐明益生菌改善学习记忆能力的机制，进行了qPCR，结果见图5。与对照组相比，衰老小鼠脑部的Klotho基因、谷胱甘肽二硫化物还原酶(GSR)基因及血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)基因的mRNA表达显著下降，而蛋白激酶B-α(Akt1)基因的表达出现了下调，但是不具备显著差异(造模组的Klotho、GSR、HO-1及Akt1的表达水平变为对照组的0.67、0.9163、0.8633及0.9525倍)。当小鼠口服植物乳杆菌CCFM8661时，上述4个基因的表达均恢复到与对照组相同的水平，并与模型组均存在显著的差异(CCFM8661对照组的Klotho、GSR、HO-1及Akt1的表达水平变为对照组的0.8968、1.101、1.057及1.093倍)。证明植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠脑部基因表达的具有促进作用，可能缓解衰老导致的损伤。
3、植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠肝部氧化应激的影响
对于肝的影响结果见图6、表2。D-半乳糖暴露导致肝部的GSH水平及总抗氧化能力显著下降，证明D-半乳糖诱导衰老会导致肝部的氧化应激水平升高。对D-半乳糖诱导的衰老小鼠施加植物乳杆菌CCFM8661干预，发现小鼠肝部的总抗氧化能力T-AOC显著上升，但是肝GSH的水平没有任何改变。证明植物乳杆菌CCFM8661可以缓解衰老小鼠肝部氧化应激。
表3植物乳杆菌CCFM8661对衰老小鼠肝部氧化应激的影响(平均值±标准差)
注：同列不同字母上标的值表示差异显著(P<0.05)，下同。
实施例3植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠的骨质量
实验设置参考实施例1，实验结束后，取小鼠血清，按Elisa试剂盒方法测定BALP(特异性碱性磷酸酶)、TRACP-5b(抗酒石酸酸性磷酸酶5b)及β-CTx(I型胶原C端肽)的浓度，结果见图7、表3。经过两个月的D-半乳糖干预，对照组与造模组的血清BALP、TRACP-5b及β-CTx的水平存在着显著差异，证明D-半乳糖诱导衰老会导致骨质量下降。在D-半乳糖干预的同时进行植物乳杆菌CCFM8661处理，发现植物乳杆菌CCFM8661将小鼠血清中的BALP、TRACP-5b及β-CTx水平降低到了与对照组相似的程度。证明物乳杆菌CCFM8661可以缓解衰老小鼠的骨质损伤。
表4植物乳杆菌CCFM8661对小鼠骨质量的影响(平均值±标准差)
组别 TRACP-5b(ng/mL) BALP(ng/mL) β-CTx(pg/mL)
对照组 0.73±0.13a 0.44±0.10a 612.25±134.18a
模型组 1.19±0.17b 0.71±0.11b 848.50±94.11b
CCFM8661干预组 0.65±0.16a 0.34±0.10a 567.25±177.78a
实施例4植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠的脑神经细胞状况
实验设置参考实施例1，实验结束后，取小鼠脑组织进行石蜡包埋及切片，进行HE染色及免疫组化(采用Iba1标记小胶质细胞)分析，结果如图8。免疫组化分析(图8a和图8b)显示D-半乳糖诱导小胶质细胞活化，这些活化的小胶质细胞表现出肥厚、高度分支的状态。植物乳杆菌CCFM8661处理后，小胶质细胞活性降低，结构改善。我们还分析了小鼠海马CA3区神经元的状态(图8c)。D-半乳糖作用下，小鼠海马CA3区神经元细胞减少，细胞形态发生改变。植物乳杆菌CCFM8661干预后，小鼠神经元细胞数量增加，结构改善。结果表明植物乳杆菌CCFM8661可改善D-半乳糖暴露引起的海马区神经元损伤。
实施例5植物乳杆菌CCFM8661促进衰老小鼠肠道短链脂肪酸的表达
实验设置参考实施例1，实验结束后，收集小鼠粪便。将50mg粪便样品用饱和氯化钠浸泡，用5％(v/v)硫酸酸化，浸泡样品30min后采用组织研磨机破碎，以充分提取短链脂肪酸。乙醚提取后离心取上清并加入无水硫酸钠脱水，再次离心取上清进行检测。采用相色谱-质谱仪进行检测。结果发现(见图9、表4)，相比于正常的小鼠，D-半乳糖诱导的衰老小鼠肠道中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸及戊酸的水平均出现了显著的下降。植物乳杆菌CCFM8661干预显著的回调了乙酸、戊酸的水平。证明植物乳杆菌CCFM8661可促进衰老小鼠肠道中乙酸、戊酸的产生。
表5植物乳杆菌CCFM8661对小鼠粪便短链脂肪酸的影响(平均值±标准差)
组别 乙酸 丙酸 丁酸 异丁酸 戊酸
对照组 71.38±13.51a 22.78±5.58a 24.02±7.34b 4.03±1.09b 2.29±0.76b
模型组 39.68±10.22b 13.61±2.62b 12.76±4.59a 2.45±0.58a 0.85±0.35a
CCFM8661组 57.78±8.79a 15.85±4.82b 12.72±4.60a 3.63±0.65ab 1.90±0.78b
注：单位均为μmol/g粪便。
实施例6植物乳杆菌CCFM8661降低衰老标志基因的表达与神经炎症基因的表达
实验设置参考实施例1，实验结束后，检测大脑中的衰老标志基因，结果见图10。D-半乳糖暴露后，p16、p21蛋白表达显著上升，p53蛋白表达上升但无显著性(表5)。植物乳杆菌CCFM8661干预后，三者的含量均有所下降，但无显著差异性。分析mRNA表达水平，发现D半乳糖暴露导致p53和p16的基因表达显著上升(p16表达变为对照组的2.248倍，p51表达变为对照组的1.376倍)，但益生菌干预可显著下调p16的基因表达(CCFM8661干预组p16表达为对照组的1.618倍，p51为对照组的1.281倍)。结果证明植物乳杆菌CCFM8661可以降低衰老标志基因的表达。
检测脑组织中的神经炎症基因，结果表明，D半乳糖诱导的衰老小鼠神经炎症水平显著上升(TNF-α、IL-1β及IL-6的分别变为对照组的1.485、1.473、1.564倍)。植物乳杆菌CCFM8661干预显著下调了TNF-α和IL-1β的水平(TNF-α、IL-1β及IL-6的分别变为对照组的1.207、1.197、1.268倍)。结果证明植物乳杆菌CCFM8661可以降低衰老小鼠的神经炎症。结果见图10。
表6植物乳杆菌CCFM8661对小鼠脑衰老基因表达的影响(平均值±标准差)
组别 p16(mg/g蛋白质) p21(ng/g蛋白质) p53(ng/g蛋白质)
对照组 8.49±0.85a 2723.50±10.97a 1554.21±4.99
模型组 10.63±1.68b 2743.03±16.48b 1567.25±15.13
CCFM8661干预组 9.11±1.75ab 2726.72±15.11ab 1561.27±13.70
实施例7植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠的肠道菌群
实验设置参考实施例1，实验结束后，收集小鼠粪便，按照试剂盒方案(Fast DNAStool kit,MPBiomedicals,CA,USA)从样品中提取粪便中的细菌总DNA，提取的DNA在16SrRNA的V3-V4区扩增(通用引物，341F/806R)。扩增包括95℃初始变性阶段5分钟，随后是95℃30秒、52℃30秒和72℃30秒的30个循环，最后是72℃的延伸步骤。循环后，在72℃下延长5分钟，然后在4℃下保持反应。回收得到的DNA并进行纯化(TIANgel Mini PurificationKit,TIANGEN,Beijing,China)。按照Qubit dsDNA测定试剂盒(Life Technologies,CA,USA)的说明，将DNA定量并以等浓度混合。使用TruSeq DNA LT样品制备试剂盒(Illumina,CA,USA)生成文库，并对样品进行条形码编码，最后在Illumina MiSeq PE300平台上按照制造商的协议进行配对端测序。数据使用Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME)进行分析。根据DADA2方法去噪嵌合，从Silva-132-99数据库中选择的OTU基于97％的核苷酸同源性标准。β-多样性采用主坐标分析(PCoA)显示的Bray-Curtis距离计算，差异采用排列多元方差分析(permutation multivariate analysis ofvariance,perMANOVA)确定。在属水平上，用STAMP分析(Welch's t-test,two-sided,P<0.05)计算组间差异。
结果见图11，D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肠道菌群显著不同于正常小鼠，但植物乳杆菌CCFM8661干预后小鼠的肠道菌群构成更趋向于正常小鼠。随着个体年龄的增长，拟杆菌门的比例增加，厚壁菌门的丰度下降，导致厚壁菌/拟杆菌比下降。植物乳杆菌CCFM8661显著的上调了厚壁菌/拟杆菌的比值，更利于健康(厚壁菌/拟杆菌比值：对照组平均1.800，模型组平均1.088，CCFM8661干预组平均3.375)。
健康老年人中瘤胃球菌科和普雷沃氏菌的含量更高，老年人中瘤胃球菌科的生物多样性也更高，这表明它们对长寿和健康有潜在的好处。植物乳杆菌CCFM8661干预可显著上调瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)等有益菌的丰度，下调副萨特氏菌属(Parasutterella)等有害菌的丰度，改善了肠道菌群。结果见图12、表6。
表7植物乳杆菌CCFM8661对小鼠部分肠道细菌的影响(平均值)
(数据以相对丰度表示，单位％)
实施例8植物乳杆菌CCFM8661改善衰老小鼠的肠道菌群
实验设置参考实施例1，实验结束后，取小鼠结肠，以四种紧密连接蛋白作为代表，通过qPCR测定它们的相对表达量来分析衰老小鼠的肠道屏障变化，结果见图13。经过测定，发现D-半乳糖诱导的衰老小鼠结肠部位的紧密连接蛋白的基因表达显著下降(造模组的Occludin、Claudin、ZO-1及ZO-2的表达水平变为对照组的0.6673、0.4709、0.7506及0.7335倍)。在植物乳杆菌CCFM8661干预过后，衰老小鼠的Occludin、ZO-1和ZO-2蛋白的基因表达水平显著上升，并与Control组相比并无显著差异(CCFM8661干预组的Occludin、Claudin、ZO-1及ZO-2的表达水平变为对照组的0.8655、0.6213、0.9180及0.8828倍)。植物乳杆菌CCFM8661干预在一定程度上上调了Claudin1蛋白表达水平。证明植物乳杆菌CCFM8661可以缓解衰老小鼠的肠道屏障损伤。
实施例9植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM8661划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经5000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM8661菌粉。
其中，保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
实施例10植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备发酵乳，具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM8661划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经5000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM8661菌粉。
将植物乳杆菌CCFM8661菌粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂；将糖添加至鲜奶中至浓度为50g/L，得到混合液；将混合液在65℃、20MPa的条件下进行均质后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03％(v/w)的接种量将发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16h，得到发酵乳；将发酵乳于42℃下放置4h进行凝乳后，在4℃下冷藏24h进行后熟，得到发酵乳成品。
其中，保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
实施例11植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备牛奶，具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM8661划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经5000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM8661菌粉；将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加植物乳杆菌CCFM8661菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到牛乳。
其中，保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
实施例12植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM8661划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经5000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得植物乳杆菌CCFM8661的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
实施例13植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM8661划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经5000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM8661菌粉；
其中，所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。称取植物乳杆菌CCFM8661菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
实施例14植物乳杆菌CCFM8661的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM8661可用于制备益生菌固体饮料，具体制备过程如下：
按照以下重量百分比称量原料：60％植物乳杆菌CCFM8661菌粉，25％海藻糖，10％麦芽糊精，5％低聚果糖；将海藻糖、低聚果糖和麦芽糊精分别过40目筛后备用：将过筛后的海藻糖、低聚果糖和麦芽糊精加入流化床中，使用100g/L低聚果糖溶液作为粘合剂进行喷雾造粒，结束造粒后对所得的颗粒进行干燥、筛分处理，取20-60目颗粒得造粒体：按照配比，将植物乳杆菌CCFM8661与造粒体混合均匀，得总混料：将总混料分装成2g/袋的小包装，获得菌浓≥5亿CFU/g的直饮式益生菌固体饮料成品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661在制备缓解机体衰老症状的药品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品中，植物乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药品用于以下至少一方面：
(1)改善认知损伤；
(2)改善氧化应激水平；
(3)增加骨质量；
(4)改善脑神经细胞状况；
(5)促进短链脂肪酸的表达；
(6)降低衰老标志基因和神经炎症基因的表达；
(7)改善肠道菌群；
(8)改善肠道屏障。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药品还含有填充剂、载体和/或辅料。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述载体包括微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、赋形剂和/或矫味剂，所述填充剂包括淀粉、麦芽糊精、乳糖、蔗糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
8.植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解机体衰老症状的保健品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保健品用于以下至少一个方面：
(1)抗氧化；
(2)改善记忆；
(3)改善骨密度；
(4)调节肠道菌群。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述保健品包括含植物乳杆菌CCFM8661的乳制品或发酵制品。
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