CN114748515A - 植物乳杆菌st-iii在制备治疗自闭症的产品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及植物乳杆菌ST‑III在制备治疗自闭症的产品中的用途，所述植物乳杆菌ST‑III的保藏编号为CGMCC No.0847。所述植物乳杆菌ST‑III干预两周即可以减少重复刻板和焦虑行为，也可以增加社交时间比例，改善社交障碍；并且还可以改变肠道菌群组成，从而显著改善自闭症有关的肠道菌群结构。

Description

植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途。
背景技术
自闭症(也称孤独症)谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是一种以沟通障碍及社会交往障碍、兴趣狭窄及重复刻板动作等为主要特征的严重神经发育障碍性疾病。据报道，ASD的患病率在全球范围内持续增加，男性儿童发病率是女性儿童发病率的4-5倍。ASD目前被认为是遗传因素和环境风险因素相互作用后的结果，产前或产后接触化学品和药物、空气污染、压力、宫腔感染和饮食因素等都会增加ASD的发病风险。然而遗憾的是，ASD目前尚无可治愈的药物或手段，这给社会和家庭都带来了沉重的负担。
在ASD的多种合并症中，不同程度的胃肠道功能障碍和肠道微生物组改变是最常被报道的。ASD儿童患胃肠道疾病的可能性是正常儿童的3.5倍，包括慢性便秘、腹痛、腹泻、胃食管反流以及胃肠道炎症和肠神经系统异常等。他们也更容易出现烦躁、焦虑、社交退缩等问题，而在改善了胃肠道症状后，ASD患者病情的严重程度也有所减轻。许多研究发现肠道菌群紊乱与ASD的发生有一定的相关性，共生微生物通过其代谢产物、免疫功能、神经内分泌调节以及迷走神经等途径影响人类和小鼠的大脑神经发育，从而影响多种复杂的行为症状，包括社交、情感和焦虑样行为。有临床研究表明粪菌移植可以有助于自闭症行为的改善。现阶段对自闭症的研究主要集中在如何缓解自闭症相关症状上。通过益生菌和饮食干预来调节ASD患者的肠道微生物群已成为一种潜在的改善措施。
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)是一种乳酸杆菌，是少数可以定殖于人体胃肠道黏膜的益生菌之一，常被发现于植物类发酵食品，同时也是一种对肠道健康、代谢紊乱和精神健康具有多种有益影响的重要益生菌。植物乳杆菌ST-III是从中国传统泡菜中分离出来的益生菌菌株，此前研究报道具有调节血脂、抑制有害菌等作用。然而，关于植物乳杆菌ST-III对高等动物自闭症样行为是否具有改善作用的报道几乎没有。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗自闭症的产品通过以下方式治疗自闭症：减少患有自闭症的哺乳动物的焦虑行为、重复刻板行为、提高社交时间比例、提高肠道菌群的丰富度、均匀性、多样性，以及改善肠道菌群结构。
本发明还提供保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备提高肠道菌群丰富度、均匀性、多样性产品或改变肠道菌群结构中的用途。
如上所述，本发明的植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途，具有以下有益效果：植物乳杆菌ST-III干预两周即可以减少重复刻板和焦虑行为，特别是对雌性的前述行为有显著改善作用，也可以增加社交能力，改善社交障碍，特别是对于雄性的社交障碍具有显著改善作用；并且还可以改变肠道菌群组成，从而显著改善自闭症有关的肠道菌群结构。
附图说明
图1.ST-III益生菌干预前，雄性(上层A-D)和雌性(下层E-H)的TCS自闭症模型组小鼠与相应性别的正常对照组比较，三箱社交实验中的(A、E)社交时间比例图和旷场实验中的(B、F)理毛次数和(C、G)理毛时间图以及(D、H)停驻时间图
图2.ST-III益生菌干预后，雄性(上层A-C)和雌性(下层D-F)的TCS自闭症模型组小鼠与相应性别的PBS对照组比较，三箱社交实验的(A、D)社交时间比例图以及旷场实验中的(B、E)理毛次数和理毛时间图、(C、F)总行程距离、停驻时间和进入中心区的持续时间比例图
图3.粪便样本测序得到的ST-III益生菌干预组和PBS对照组微生物群的(A)丰富度、(B)多样性和(C)均匀度。
图4.分别对于(A)雄性和(B)雌性TCS自闭症模型小鼠，ST-III益生菌干预组与PBS对照组相比，基于Bray-Curtis距离的肠道菌群所有OTU的PCoA图
图5.ST-III益生菌干预组与PBS对照组相比，雌性TCS自闭症模型小鼠肠道菌群在(A)门、(B)科和(C)属水平上的组成差异
图6.ST-III益生菌干预组与PBS对照组相比，雄性TCS自闭症模型小鼠肠道菌群在(A)门、(B)科和(C)属水平上的组成差异
图7.肠道微生物群(科和属水平)与生物合成和代谢途径之间的相关性分析图：(A)雄性小鼠差异肠道菌群与途径的相关性，p<0.05，I：辅因子、载体和维生素生物合成；(B)雌性小鼠差异肠道菌群与途径的相关性，p<0.05，I：前体代谢物和能量的产生，II：氨基酸生物合成，III：核苷和核苷酸生物合成。
图8.肠道微生物群(科和属水平)与行为之间的相关性分析图：(A)肠道微生物群属水平与行为的相关性，p<0.05；(B)肠道微生物群科水平与行为的相关性，p<0.05；(C)METAcyc通路与行为之间的相关性，辅因子>0.35或<-0.35，p<0.05，I：前体代谢物和能量的产生。*进入中心区域的时间(Center duration，％)：在旷场实验中进入中心区域的持续时间比例，探头次数(Head explorations number)：旷场实验中在中心区域的探出头部的次数，探头时间(Head exploration time)：旷场实验中在中心区域探出头部的时间。
具体实施方式
本发明还提供保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症的产品中的用途。
所述植物乳杆菌ST-III为申请号CN03116377专利中公开的菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.0847，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏日期为2002年12月6日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
所述植物乳杆菌ST-III从泡菜汁和苜蓿汁中分离得到。
所述植物乳杆菌ST-III为革兰氏阳性菌，杆状。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗自闭症的产品通过以下方式治疗自闭症：减少患有自闭症的哺乳动物的焦虑行为、重复刻板行为、提高社交时间比例、提高肠道菌群的丰富度、均匀性、多样性，改善肠道菌群结构。
患有自闭症的哺乳动物选自啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述啮齿目动物选自鼠。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗自闭症的产品通过以下方式治疗自闭症：减少女性患者的焦虑行为、重复刻板行为；提高男性患者的社交时间比例；提高女性患者肠道菌群的丰富度、均匀性、多样性；提高患者肠道中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。
所述治疗自闭症的产品可以减少自闭症小鼠的焦虑行为和重复刻板行为。小鼠的焦虑行为例如为运动的行程距离减少，停驻时间增加。小鼠的重复刻板行为例如为与正常小鼠相比，自闭症小鼠的理毛次数明显更多。在一种实施方式中，所述治疗自闭症的产品可以减少雌性自闭症小鼠的焦虑行为和重复刻板行为。
所述改善自闭症的产品可以提高自闭症小鼠的社交能力。小鼠的社交障碍例如为与正常小鼠相比，自闭症小鼠更喜欢与陌生物体而不是陌生小鼠进行互动。在一种实施方式中，所述改善自闭症的产品可以提高雄性自闭症小鼠与陌生小鼠的社交时间比例。
自闭症患者的焦虑行为例如对特定事物(厕所、吸尘器、电梯和秋千等)表现出害怕、恐惧和反应过度等现象。自闭症患者的重复刻板行为是指重复一系列高频率、无明显目的和意义的行为，还包括狭窄的兴趣、难以接受事物的变化等，例如重复不断地玩水、翻书、捏胳膊、坚持拿某样东西、在固定的路线上走路、在固定的位置坐下、背时刻表等行为。
在本发明的某些实施方式中，所述改善自闭症的产品能够提高雌性自闭症模型小鼠肠道菌群的α多样性(包括ACE指数、Shannoneven指数和Shannon指数)和β多样性。
所述改变肠道菌群结构产品能提高患有自闭症的哺乳动物肠道中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。
本发明中所述有益菌是指对人体健康起到正面作用的细菌或真菌。有害菌是指能够致使人体发生疾病的细菌或真菌，会在肠道有益菌减少、免疫力低下时，使人体肠道内的正常菌群发生紊乱，同时产生大量有害物质，影响免疫系统或导致疾病发生。
在本发明的某些实施方式中，所述改善自闭症的产品，在属水平上，能够降低雌性自闭症小鼠有害菌Alistipes和Parabacteroides的丰度；提高雄性自闭症小鼠有益菌Paramuribaculum的丰度，降低有害菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis的丰度。
在本发明的某些实施方式中，在科水平上，提高雌性自闭症小鼠有益菌Lachnospiraceae的丰度，降低有害菌Rikenellaceae的丰度；降低雄性自闭症小鼠有害菌Streptococcaceae的丰度。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗自闭症的产品能够降低肠道菌群中与重复刻板行为改善负相关的菌和与焦虑行为改善负相关的菌。
在本发明的某些实施方式中，在属水平上，与重复刻板行为改善呈负相关的菌为Alistipes、Lactococcus和Staphylococcus；与焦虑行为改善呈正相关的菌为ClostridiumXlVb和Longibaculum；与焦虑行为改善呈负相关的菌为Alistipes和Tidjanibacter。
在科水平上，与重复刻板行为改善呈负相关，同时也与焦虑行为改善呈负相关的菌为Rikenellaceae和Staphylococaceae；与重复刻板行为改善呈正相关的菌为Sutterellaceae。
在科水平上，与社交时间比例正相关的菌为Christensenellaceae；与社交时间比例负相关的菌为Rhodobacteraceae。
在本发明的某些实施方式中，所述保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备治疗广谱抗菌剂所造成的自闭症的产品中的用途。
在本发明的某些实施方式中，所述广谱抗菌剂选自三氯生。
在本发明的某些实施方式中，所述保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备治疗三氯生所造成的自闭症的产品中的用途。
所述产品必然包括所述植物乳杆菌ST-III，并以所述植物乳杆菌ST-III作为前述功效的有效成分。
所述产品中，发挥功用的有效成分可仅为所述植物乳杆菌ST-III，亦可包含其他物质。
亦即，所述植物乳杆菌ST-III为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述产品的剂型无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾、粉剂等各种。在本发明的某些实施方式中，所述治疗自闭症的产品剂型为粉剂，即菌粉，所述菌粉中植物乳杆菌ST-III的浓度为1×108CFU/g～9×1011CFU/g。所述菌粉中植物乳杆菌ST-III的浓度选自以下中的任一项或多项：1×108CFU/g～5×108CFU/g、5×108CFU/g～1×109CFU/g、1×109CFU/g～5×109CFU/g、5×109CFU/g～1×1010CFU/g、1×1010CFU/g～5×1010CFU/g、5×1010CFU/g～1×1011CFU/g、1×1011CFU/g～5×1011CFU/g或5×1011CFU/g～9×1011CFU/g。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述啮齿目动物优选为鼠。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
在本发明的某些实施方式中，所述产品为药物，所述药物中还包括药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明还提供保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备提高肠道菌群丰富度、均匀性、多样性产品或改变肠道菌群结构产品中的用途。
肠道菌群ACE指数、Shannoneven和Shannon指数分别用于评价菌群丰富度、均匀性和多样性。
用ST-III干预三氯生造成的自闭症(TCS-ASD)模型小鼠，干预后雌性ASD小鼠的ACE指数较未干预组增加4％以上；Shannoneven指数增加5％以上；Shannon指数增加5％以上。
所述改变肠道菌群结构产品能提高肠道中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
在三氯生(TCS)诱导的ASD小鼠中使用植物乳杆菌ST-III菌粉进行口服干预有助于改善ASD核心异常行为和平衡小鼠肠道环境，同时，干预后的效果存在性别差异。而且植物乳杆菌ST-III干预仅需2周即可表现出明显的改善作用，比文献报道的其他菌株干预哺乳动物起作用的时间(至少3周)明显缩短。行为、肠道微生物群和通路之间的相关性分析表明，异常行为的改善与肠道微生物群的变化相关。肠道微生物群通过改变“氨基酸生物合成”、“降解/利用/同化”、“前体代谢物和能量的产生”以及“核苷和核苷酸生物合成”途径，帮助调节ASD小鼠的异常行为。
统计分析采用SPSS 23.0软件进行，用GraphPad Prism 7进行各种统计图的制作。所有数据均以均值±标准差表示,组间差异性比较采用独立样本t检验或单因素方差分析或kruskal-wallis检验。p<0.05被认为具有统计学意义。显著差异由*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示。
实施例1
植物乳杆菌ST-III菌粉的制备及其活菌计数：
将植物乳杆菌ST-III(CGMCC No.0847)在MRS液体培养基(
Figure BDA0003566268370000071
德国Merck公司，商品号：1106610500)中37℃培养18-24小时后富集菌体，添加冻干保护剂，通过冻干脱去水分，即得到植物乳杆菌ST-III菌粉，ST-III活菌计数为3×1011CFU/g。
干预动物时，将上述植物乳杆菌ST-III冻干菌粉悬浮于10mM PBS(pH7.2-7.4)中，活菌浓度为5×108CFU/mL。
实施例2
自闭症模型小鼠的建立：
小鼠适应：育龄期健康SPF级ICR小鼠饲养于标准动物房，恒定温度23℃，相对湿度50％-60％，12h/12h日/夜交替光照。小鼠适应1周后，于下午17:00将雌雄(雌性：雄性＝2:1)小鼠合笼过夜，次日上午9点分笼时检查雌鼠是否有阴栓存在。
TCS造模：将TCS溶于新鲜玉米油中，药物浓度为50mg/ml。将成功受孕的雌鼠随机分为2组，从怀孕第7天到断奶第21天，以TCS 50.0mg/kg的剂量或玉米油10mL/kg的剂量进行灌胃，并分别命名为TCS组和TCS-对照组。子代小鼠出生后6周-8周内进行行为学检测。与TCS-对照组对比后，筛选出具有明显自闭症样行为的小鼠为TCS-ASD模型小鼠并用于后续实验。
实施例3
TCS-ASD模型小鼠的行为学测试：
旷场实验：将受试小鼠放入50×50×40cm的开放场地并允许自由探索10min以适应环境。随即，打开摄像系统(1/3“SONY Super HAD CCD)记录小鼠接下来10min的总运动距离、中心区域停留时间以及理毛行为，并进行后续分析。
三箱社交实验：将一个60×40×22厘米的有机玻璃盒分成三个相互连接的小室(A、B、C)。小鼠首先在空场地适应10分钟，然后将小鼠限制在B室(中心室)中。在C室中放置一只匹配的，具有相同基因型、年龄、性别和治疗的陌生小鼠，而在A室中放置一个小物体。在接下来的10分钟内，让测试小鼠在三个小室内自由移动，头顶摄像头(1/3“SONY SuperHAD CCD)记录了被测小鼠与陌生小鼠的嗅觉交互时间。
受试小鼠按旷场实验和三箱社交实验的顺序进行行为学测试。每次测试结束后，轻轻取出受试小鼠放回笼子，然后用75％的酒精擦拭装置，待其干燥后进行下一只小鼠的测试。结果如图1所示。
在旷场实验中，进入中心区的持续时间和理毛行为，可以反映焦虑状态和重复刻板行为。与对照组小鼠相比，雄性TCS模型组小组理毛次数和理毛时间均显著增加，表现出明显的重复刻板行为，雌性TCS模型小鼠均有增加趋势，但没有统计学意义。雄性和雌性TCS模型组小鼠在中心区域的停留时间均显著减少(雄性p<0.05，雌性p<0.01，图略)，停驻时间(freezing time)均有下降趋势，但没有统计学意义。
在三箱社交实验中，与对照组相比，雄性TCS小鼠的社交时间比例显著减少，表现出明显社交障碍，而雌性TCS小鼠则显著增加。说明这种TCS造模方式在社交行为方面存在明显的性别差异。
实施例4
植物乳杆菌ST-III干预TCS-ASD模型小鼠，改善其自闭症行为：
总计40只TCS-ASD小鼠随机分成2组，分别为ST-III干预组和PBS对照组。每组20只，其中雌雄各10只。每只小鼠早晚各一次灌胃含有或不含有ST-III的PBS 400μL，持续干预2周。随即完成行为学测试，方法同实施例3。在干预期间，小鼠自由饮水进食。结果如图2所示。
三箱社交实验中，相比PBS组，ST-III干预雄性TCS-ASD小鼠的社交时间有显著增加(P<0.05)。表明植物乳杆菌ST-III能明显改善雄性TCS-ASD小鼠的社交行为。
旷场实验中，相比PBS组，ST-III干预雄性和雌性TCS-ASD小鼠进入中心区域的持续时间比例均没有显著差异；ST-III干预雌性小鼠的总行程距离显著增加(p<0.01)，停驻时间(freezing time)显著减少(p<0.05)，表明ST-III可改善雌性TCS-ASD小鼠的部分焦虑行为。正常小鼠有一种本能的理毛行为，但过度的理毛行为被认为是重复刻板行为。对小鼠的理毛行为进行了计数，结果表明，与PBS组相比，ST-III干预雌性小鼠的平均理毛时间(p<0.05)和理毛次数(p<0.01)均显著减少；ST-III干预雄性小鼠则均有下降趋势，但无统计学意义。表明ST-III对雌性TCS-ASD小鼠的焦虑行为和重复刻板行为具有显著改善作用。
实施例5
植物乳杆菌ST-III干预TCS-ASD模型小鼠，改善其肠道菌群：
样品采集和16S rRNA基因序列检测：收集小鼠粪便样本，-80℃保存至DNA提取。根据试剂盒的操作说明，使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从0.3g小鼠粪便中提取细菌基因组DNA。使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA完整性。对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。用于扩增V3-V4可变区的引物为341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。热循环步骤如下：95℃5min；95℃45s，55℃30s，72℃30s进行20个循环；最后72℃10min。每个样品的PCR扩增进行3次。使用2％琼脂糖凝胶回收各个样品PCR产物，并用AxyPrep DNA Gel Extraction kit(AXYGEN)进行纯化，Tris-HCl洗脱，使用2％琼脂糖凝胶电泳再次检测。应用分光光度法(QuantiFluorTM-ST,Promega)进行定量检测。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库并进行测序。
生物信息学分析：Alpha和Beta多样性分析分别反映微生物群落的丰富度、多样性和物种组成的相似性和差异关系。为了解样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息并进行后续分析，将序列按照97％相似度对非重复序列进行聚类，得到OTU代表序列。使用QIIME2(版本2021.4)对具有相同序列深度(每个样本26407个序列)的样本进行群落丰富度、均匀度和多样性分析(ACE,Chao,Shannoneven,Simpsoneven和Shannon)。在OTU水平上用Weight-UniFrac算法进行主坐标分析(Principal co-ordinates analysis,PCoA)评估物种组成的差异性。使用基于Bray-Curtis距离的ANOSIM评估组间细菌群落组成的多样性(ST-III发酵乳/牛奶)。基于Ribosomal Database Project数据库，使用在线软件RDP分类器在默认参数(80％阈值)下分类。为了确定各组中分类群的显著差异丰度，应用STAMP评估从门水平到物种水平的丰度，p值<1E-5。PICRUSt2用于预测微生物的功能分析。
如图3所示，相比PBS组，ST-III干预雌性TCS-ASD小鼠后其肠道菌群ACE指数增加了4.40％、Shannoneven指数增加了5.48％，以及Shannon指数增加了5.94％，提示丰富度、均匀性和多样性提高，增加的百分比的计算公式为：(ST-III组-PBS组)/PBS组*100％。
如图4所示，PCoA分析显示ST-III组和PBS组小鼠肠道菌群的构成存在显著差异，提示使用ST-III干预2周后可以改变雌性TCS-ASD小鼠的肠道菌群。
如图5所示，对于雌性TCS-ASD小鼠，ST-III组与PBS组相比，在门水平上，Bacteroidetes显著减少，而Firmicutes显著增加；在科水平上，Clostridiales_IncertaeSedis XIII、Lachnospiraceae和Ruminococcaceae显著增加，而Odoribacteraceae、Porphyromonadaceae、Rikenellaceae显著减少；在属水平上，Anaerotignum(一种产丁酸的厌氧菌属)、Clostridium XlVb、Flintibacter、Ihubacter、Kineothrix、Ruthenibacterium显著增加，而Alistipes、Limosilactobacillus、Odoribacter、Parabacteroides和Tidjanibacter显著减少。Lachnospiraceae可以促进短链脂肪酸乙酸和丁酸的产生，在为宿主提供能量、促进初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化和抑制促炎细胞因子的产生方面发挥重要作用，一般被认为是对人体健康有益的菌科。Lachnospiraceae丰度的增加表明有益菌的增加和肠道微生态环境的改善。Alistipes是一种致病菌，与肿瘤发生有关。研究发现，Alistipes能将色氨酸转化为吲哚，最终破坏体内的血清素平衡，这一特征可能与个体的焦虑样和抑郁样行为有关。一项新的研究发现，ASD儿童头发中的砷和汞含量显著升高，被认为可以作为ASD的生物标志物之一。砷和汞的含量被报道与肠道中Parabacteroides属的丰度显著相关，而ST-III益生菌的干预显著降低了雌性自闭症模型小鼠肠道中Parabacteroides的丰度。
如图6所示，对于雄性TCS-ASD小鼠，ST-III组与PBS组相比，在门水平上，Candidatus Saccharibacteria显著减少；在科水平上，Enterobacteriaceae和Streptococcaceae显著减少；在属水平上，Eisenbergiella、Paramuribaculum显著增加，而Escherichia/Shigella(通常被认为是致病菌)和Saccharibacteria genera_incertae_sedis显著减少。已有研究发现Streptococcaceae参与糖尿病代谢紊乱和结肠癌的发展，Saccaribacteria_genera_incertae_sedis丰度的增加也被报道常见于2型糖尿病小鼠中。雄性ST-III组中该科、属细菌丰度的减少被认为是一种有益变化。Paramuribaculum属于拟杆菌S24-7科，具有产生丙酸盐和丁酸盐的特性，增加肠道内短链脂肪酸的含量，通常被认为是一种有益菌。
为了研究ST-III菌粉改变自闭症模型小鼠肠道菌群结构可能的机制，本发明通过PICRUSt2软件进行功能丰度预测以分析样本微生物群落中的功能富集或减少，如图7所示。在雄性PBS组中，与“辅因子、载体和维生素生物合成”相关的功能通路与肠道菌群Streptococcaceae和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis的富集呈正相关。与“前体代谢物和能量产生”相关的功能通路与Enterobacteriaceae和Escherichia/Shigella的富集呈正相关。在雌性ST-III组中，Lachnospiraceae与“氨基酸生物合成”、“降解/利用/同化”和“前体代谢物和能量的产生”途径相关，与“核苷和核苷酸生物合成”途径呈负相关。ST-III益生菌干预后，不同性别的自闭症模型小鼠改变自闭症相关肠道内生态环境和菌群结构的通路有所差异。雄性小鼠可能通过“辅因子、载体和维生素生物合成”、“前体代谢物和能量产生”等相关功能途径的减少来改变；而雌性小鼠可能通过“氨基酸生物合成”、“降解/利用/同化”、“前体代谢物和能量的产生”和“核苷和核苷酸生物合成”等功能途径的富集来改变。
为了进一步了解小鼠肠道菌群结构改变与ASD相关行为之间的关系，本发明评估了肠道菌分类群(科和属)与行为学指标之间的相关性，如图8所示。在属水平上，理毛行为(频率和时间)与Alistipes和Lactococcus属的丰度呈正相关；停驻时间行为与Clostridium XlVb和Longibaculum属的丰度呈负相关；总运动距离与Alistipes和Tidjanibacter属的丰度呈负相关。在科水平上，社交时间比例与Christensenellaceae的丰度呈正相关，与Rhodobacteraceae的丰度呈负相关；理毛行为与Rikenellaceae和Staphylococaceae的丰度呈正相关，与Sutterellaceae的丰度呈负相关；总运动距离与Rikenellaceae的丰度呈负相关。
METAcyc通路与行为指数之间的系数关系如图8C所示。理毛行为与“辅因子、载体和维生素生物合成”途径呈正相关。总运动距离与“退化/利用/同化”路径呈正相关。
综上，与现有技术相比，本发明采用植物乳杆菌ST-III(CGMCC No.0847)，首次披露了植物乳杆菌ST-III具有改善三氯生(Triclosan，TCS)造模自闭症小鼠行为和肠道菌群的新用途，干预时间只需2周即可起作用，并且对不同性别的模型小鼠其改善作用有所差异。具体的，与缓冲溶液(PBS)对照组相比，植物乳杆菌ST-III干预两周即可以减少TCS-ASD自闭症模型小鼠的重复刻板和焦虑行为，特别是对雌性TCS-ASD模型小鼠有显著改善作用，也可以增加TCS-ASD自闭症模型小鼠的社交能力，改善自闭症小鼠的社交障碍，特别是对于雄性TCS-ASD模型小鼠社交障碍具有显著改善作用；并且还可以改变TCS-ASD小鼠的肠道菌群组成，从而显著改善自闭症有关的肠道菌群结构。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备治疗自闭症产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗自闭症的产品通过以下方式一项或多项治疗自闭症：减少患有自闭症的哺乳动物的焦虑行为、重复刻板行为、提高社交时间比例、提高肠道菌群的丰富度、均匀性、多样性或改善肠道菌群结构。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗自闭症的产品具有以下任一项或多项功能：
a)能够减少患有自闭症的哺乳动物的焦虑行为、重复刻板行为；
b)提高患有自闭症的哺乳动物的社交时间比例；
c)提高患有自闭症的哺乳动物肠道菌群的丰富度、均匀性、多样性；
d)提高患有自闭症的哺乳动物肠道中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗自闭症的产品具有以下任一项或多项功能：
a)降低肠道菌群中与重复刻板行为改善呈负相关的菌；
b)降低肠道菌群中与焦虑行为改善呈负相关的菌。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗自闭症的产品为药物、保健品或食品。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品为药物，所述药物中还包括药学上可接受的载体或辅料。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗自闭症的产品剂型为固体、液体、凝胶、半流质、气雾或粉剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述粉剂中植物乳杆菌ST-III的浓度为1×108CFU/g～9×1011CFU/g。
9.保藏编号为CGMCC No.0847的植物乳杆菌ST-III在制备提高肠道菌群丰富度、均匀性、多样性产品或改变肠道菌群结构产品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述提高肠道菌群丰富度、均匀性、多样性的产品能提高患有自闭症的哺乳动物肠道菌群的α多样性和/或β多样性，和/或，所述改变肠道菌群结构产品能提高肠道中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。
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