CN111413503A - 骨桥蛋白作为靶分子在调节高脂饮食引起的肥胖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨桥蛋白作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用。通过抑制或敲除OPN基因，以调节与长链脂肪酸代谢相关的肠道菌群，从而减少脂肪在机体中的累积；通过移植来源于OPN抑制型机体的肠道菌群后，在长期高脂饮食过程中不会出现明显的脂肪堆积或肥胖症的出现。

Description

骨桥蛋白作为靶分子在调节高脂饮食引起的肥胖中的应用

技术领域

本发明涉及一种以骨桥蛋白作为靶分子用于调节高脂饮食引起的肥胖。

背景技术

肥胖是代谢综合征的一种表现形式，是一种危害人类生活质量和健康的代谢性疾病，可能导致血压、胆固醇及甘油三酯水平升高、胰岛素抵抗，严重的可能引发II型糖尿病、脂肪肝、呼吸系统疾病以及心脑血管疾病等。随着人们物质生活水平的不断提高，肥胖正逐渐成为世界范围内影响公共健康的主要问题之一。据统计，截至2017年全球已有三分之一人口体重超标，且肥胖人群数量呈现逐年上升趋势。目前的研究表明，导致肥胖的因素有很多，主要包括过度饮食、缺乏运动、精神状况、遗传因素以及其他疾病等。其中，长期摄入高脂、高热量食物等不健康、不合理的饮食结构是引起肥胖的主要因素。此外，近年来也有研究表明，肠道菌群可以影响肥胖的发生发展：通过粪菌移植可以使受体鼠出现与供体鼠相似的胖瘦体形；肠道菌群紊乱可导致肠壁完整性被破坏，引起小鼠发生代谢炎症和胰岛素抵抗；肠道菌群可以通过代谢产生短链脂肪酸，而肠道菌群紊乱可能导致肥胖小鼠缺乏短链脂肪酸进而减弱其对宿主能量代谢的调节作用。

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种由巨噬细胞、T细胞、肝细胞、平滑肌细胞、内皮和外皮细胞等多种细胞表达和分泌的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛存在于多种体液和组织中，并在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。根据现有的研究可知，OPN除了与系统性炎症、自身免疫性疾病或恶性肿瘤等疾病有关，有少量报道认为OPN与动脉粥样硬化、胰岛素抗性相关。巨噬细胞通过分泌OPN使其进一步地在脂肪组织中累积，从而引起脂肪组织炎症和胰岛素抵抗。而导致动脉粥样硬化等心脑血管疾病的主要原因也是由于巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的浸润，并与血管壁细胞相互作用引起血管壁的炎性病症。这些研究表明了OPN主要通过对免疫细胞以及其它细胞因子进行调控进而影响了肥胖及肥胖相关疾病的发生发展。即，上述与肥胖或肥胖相关疾病的研究主要涉及到的机制是OPN参与了疾病发生发展过程中的炎症反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供骨桥蛋白作为靶分子在调节高脂饮食引起的肥胖中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用。

作为本发明应用的改进：通过抑制或敲除OPN基因，以调节与长链脂肪酸代谢相关(密切相关)的肠道菌群，从而减少脂肪在机体中的累积。

作为本发明应用的进一步改进：所述与长链脂肪酸代谢相关的肠道菌群包括Dorea属、Peptostreptococcus属、Parabacteroides属以及Streptobacillus属。

作为本发明应用的进一步改进：通过移植来源于OPN抑制型机体的肠道菌群后，在长期高脂饮食过程中不会出现明显的脂肪堆积或肥胖症的出现。

本发明首先提供了OPN作为调节高脂饮食条件下引起肥胖症的靶点。

经本发明研究发现，体内的OPN水平与高脂饮食引起的肥胖密切相关。根据本发明的实验发现：实验动物在敲除OPN基因后即使长期摄入高脂饲料也未见明显肥胖症状，体现在体重未出现异常增高以及过量的长链脂肪酸可以随粪便排出等方面。

进一步地，本发明发现体内OPN水平显著地影响了高脂饮食过程中实验动物的与长链脂肪酸代谢相关的肠道菌群。根据本发明的实施例，在实验动物长期摄入高脂饲料后与正常饮食组动物相比具有明显不同的肠道菌群结构，当敲除OPN基因后可以进一步改变高脂饮食实验动物的肠道菌群而对正常饮食的实验动物没有明显影响。此外，本发明还发现在高脂饮食过程中实验动物肠道的Dorea属、Peptostreptococcus属、Parabacteroides属以及Streptobacillus属等菌群与肥胖密切相关。

更进一步的，本发明提供了一种通过粪菌移植有效调节高脂饮食引起的肥胖症的方法。根据本发明的实施例，实验动物在移植了来源于OPN抑制型动物的肠道菌群后，明显重建或改善了原有肠道菌群结构，同时在后续长期的高脂饮食条件下也未见明显的肥胖症出现。

需要强调的是：现有技术中已公开的与肥胖或肥胖相关疾病的研究主要涉及到的机制是OPN参与了疾病发生发展过程中的炎症反应，这与本发明中所述的OPN调控了高脂饮食过程中与脂代谢相关肠道菌群进而改善高脂饮食引起的肥胖症具有本质区别。

本发明具有如下技术优势：

本发明证实了机体内的OPN水平可以影响在长期高脂饮食过程中机体出现的肥胖症。在敲除了OPN基因后可以显著地改善肠道菌群结构，促进多余的长链脂肪酸随粪便排出体外，从而使机体抵抗由高脂饮食引起的肥胖症，而这种效果同时还可以通过粪菌移植的方式在另一机体中实现。本发明证实了OPN可以作为一种有效调节由高脂饮食引起的肥胖症的重要靶点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为测定了不同饮食条件下小鼠体内OPN水平。其中，图1A为血浆中OPN水平，图1B为肝脏组织中OPN水平。“ND”代表正常饮食，“HFD”代表高脂饮食，“WT”代表野生型小鼠。

图2为比较OPN基因对于高脂饮食条件下小鼠体重的影响。“ND”代表正常饮食，“HFD”代表高脂饮食，“WT”代表野生型小鼠，“KO”代表OPN基因敲除型小鼠。

图3为测定测定高脂饮食条件下野生型小鼠与OPN基因敲除型小鼠粪便中长链脂肪酸(Long-chain fatty acid，LCFA)总量。“HFD”代表高脂饮食，“WT”代表野生型小鼠，“KO”代表OPN基因敲除型小鼠。

图4为通过主坐标分析(Principal components analysis，PCoA)比较不同饮食条件下野生型小鼠和OPN基因敲除小鼠肠道菌群组成的差异性。“ND”代表正常饮食，“HFD”代表高脂饮食，“WT”代表野生型小鼠，“KO”代表OPN基因敲除型小鼠。

图5为四种具有代表性的肠道菌属与小鼠粪便中长链脂肪酸含量的相关性分析。“HFD”代表高脂饮食。

图6为四种具有代表性的肠道菌属与小鼠体重的相关性分析。

图7为高脂饮食条件下的受体鼠(Recipient)在粪菌移植后腹部脂肪的累积情况。其中，“Recipient(HFD)”代表受体鼠为高脂饮食条件喂养，“Donor(HFD)”代表供体鼠为高脂饮食喂养，“WT”代表野生型，“KO”代表OPN基因敲除型。

图8为测定粪菌移植受体鼠(Recipient)在高脂饮食条件下的体重(Bodyweight)、血清总胆固醇(Total cholesterol，TC)含量、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量以及高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)含量。其中，“Recipient(HFD)”代表受体鼠为高脂饮食条件喂养，“Donor(HFD)”代表供体鼠为高脂饮食喂养，“WT”代表野生型，“KO”代表OPN基因敲除型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：敲除OPN编码基因可以抵抗高脂饮食引起的肥胖症

在本实施例中，首先在实验动物中评价了OPN与高脂饮食引起肥胖的相关性。将10只4周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为两组，分别在高脂饮食或正常饮食条件下喂养24周后测定血浆以及肝脏中的OPN含量。结果如图1所示，高脂饮食条件下小鼠血浆(图1A)及肝脏组织(图1B)中OPN水平明显高于正常饮食组。

进一步地，比较了OPN基因敲除小鼠与野生型小鼠在高脂饮食或正常饮食条件下体重的变化情况。分别选取10只4周龄C57BL/6小鼠以及OPN基因敲除小鼠，以正常饮食或高脂饮食喂养24周，每4周称量一次小鼠体重并记录。体重变化结果如图2所示，可以看出小鼠体重随其生长而逐渐升高，但是高脂饮食组的野生型小鼠的体重高于其它组的小鼠，且具有显著差异，而高脂饮食组的OPN基因敲除型小鼠的体重变化情况则与正常饮食组的野生型或OPN基因敲除型小鼠基本相同。

OPN基因敲除的C57BL/6小鼠，购自Jackson公司(巴尔港，缅因州，美国)。

在本实施例中进一步测定了不同饮食条件下小鼠粪便中的长链脂肪酸总含量。分别取50mg的高脂饮食喂养24周的野生型、OPN基因敲除型小鼠粪便，并将其溶解在内标溶液(C17：0脂肪酸甲酯)中，加入甲酯试剂反应，萃取正己烷溶剂，然后干燥。将样品进一步溶解在50μL正己烷中进行GC分析。利用GC Solution软件通过内标法对总脂肪酸进行定量和定性。结果如图3所示，可以看出在相同的、长时间的高脂饮食过程中OPN基因敲除型小鼠随粪便排出的长链脂肪酸含量多于野生型小鼠且具有显著性差异。

以上结果说明，人体与小鼠中的OPN水平与高脂饮食引起的肥胖呈正相关，当敲除OPN基因后可以加快脂质排泄或减少吸收，使小鼠可以抵抗由高脂饮食引起的肥胖。

实施例2：OPN可以调控高脂饮食过程中小鼠的肠道菌群

在本实施例中，分别选取高脂饮食或正常饮食喂养24周的野生型、OPN基因敲除型小鼠粪便，对其中的菌群进行16S rRNA测序并对其进行生物多样性以及菌群与脂代谢产物相关性分析。结果如图4所示，可以看出与正常饮食组小鼠相比，长期高脂饮食组具有明显不同的肠道菌群结构。此外，OPN对于正常饮食组小鼠的肠道菌群没有明显影响，而在高脂饮食组中敲除OPN基因后可以进一步改变小鼠肠道菌群。

此外，在本实施例中还提供了四个属(Genera)水平的与高脂饮食过程中脂代谢相关的肠道细菌，分别为Dorea属、Peptostreptococcus属、Parabacteroides属、Streptobacillus属。通过对高脂饮食组小鼠粪便中的肠道菌群丰度与长链脂肪酸含量以及小鼠体重分别进行相关性分析，结果如图5、图6所示，可以看出这四个属的细菌丰度与粪便中长链脂肪酸含量均呈负相关，与小鼠体重呈正相关。

以上结果说明了OPN可以调控高脂饮食过程中实验动物的肠道菌群，而对于正常饮食的实验动物则没有明显影响。在这些肠道菌群中，Dorea属、Peptostreptococcus属、Parabacteroides属以及Streptobacillus属与脂代谢(长链脂肪酸代谢)密切相关，可以减少长链脂肪酸的排泄从而增加实验动物体重。

实施例3：粪菌移植可以改善由高脂饮食引起的肥胖

在本实施例中提供了一种通过粪菌移植改善由高脂饮食引起的肥胖的方法。选取4周龄的野生型C57BL/6在正常饮食的情况下接受混合抗生素(包含氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑以及万古霉素)治疗2周。

取高脂饮食条件下的野生型或OPN基因敲除型小鼠粪便(约20mg)重悬于200μL无菌PBS缓冲液中，并将其分别移植到经混合抗生素治疗的野生型小鼠中，每日一次并持续一周(移植方式参照已公开发表于《Intermittent fasting promotes white adiposebrowning and decreases obesity by shaping the gut microbiota》的方法)。经粪菌移植后，供体鼠与受体鼠均采用高脂饲料进行喂养，16周后测定小鼠身体及肠道菌群变化情况。结果如图7所示，在相同高脂饮食条件下，接受野生型供体鼠粪菌移植的受体鼠腹部出现了脂肪堆积，而接受OPN基因敲除型供体鼠粪菌移植的受体鼠即使在长期摄入高脂饲料后腹部也未出现明显的脂肪组织。

进一步地，对受体鼠测定了体重、血清总胆固醇含量、甘油三酯含量以及高密度脂蛋白含量。结果如图8所示，可以看出移植野生型供体鼠粪便的受体鼠体重显著高于OPN基因敲除型供体鼠粪便移植组的小鼠(图8A)，此外，血清总胆固醇含量(图8B)、甘油三酯含量(图8C)以及高密度脂蛋白含量(图8D)也均高于OPN基因敲除型移植组。

以上结果说明，OPN基因敲除型实验动物肠道菌群可以通过粪菌移植的方式用于改善由高脂饮食引起的实验动物出现的肥胖症。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.骨桥蛋白作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用。

2.根据权利要求1所述的骨桥蛋白作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用，其特征是：通过抑制或敲除OPN基因，以调节与长链脂肪酸代谢相关的肠道菌群，从而减少脂肪在机体中的累积。

3.根据权利要求2所述的骨桥蛋白作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用，其特征是：所述与长链脂肪酸代谢相关的肠道菌群包括Dorea属、Peptostreptococcus属、Parabacteroides属以及Streptobacillus属。

4.根据权利要求1～3任一所述的骨桥蛋白作为靶分子在调节由高脂饮食引起的肥胖症中的应用，其特征是：通过移植来源于OPN抑制型机体的肠道菌群后，在长期高脂饮食过程中不会出现明显的脂肪堆积或肥胖症的出现。

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