WO2024049207A1 - 신규 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도 - Google Patents

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endoplasmic reticulum
culture medium
lysate
inflammatory
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강기성
임채연
맹재영
조성은
성민희
이원석
이동호
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • Microbiome refers to the microorganisms that exist in a specific environment and their entire genetic information, and refers to a collection of genomes that represent the entire genetic information of a single organism. Therefore, the human microbiome refers to the microorganisms living inside and outside the human body and their entire genetic information.
  • the human body lives in a symbiotic relationship with many microorganisms, and in particular, the intestines are the optimal environment for microorganisms to consume nutrients and form systematic communities, so the largest number of microorganisms exist.
  • Intestinal microorganisms supply nutrients that cannot be produced by the host's own enzymes alone and are deeply related to the host's metabolism and immune system, while also preventing various diseases such as irritable bowel syndrome, obesity, atopy, depression, rheumatoid arthritis, autism spectrum disorder, and dementia. It is reported that it is related to the outbreak.
  • intestinal health has been worsening due to an imbalance in the intestinal microbiota due to Western eating habits and indiscriminate use of antibiotics.
  • Research on intestinal microorganisms and various diseases has highlighted the importance of intestinal microorganisms and is raising interest. .
  • endoplasmic reticulum is a nano-sized substance of about 20 to 200 nm produced and excreted by cells, and can move freely between cells.
  • the endoplasmic reticulum contains membrane lipids, membrane proteins, DNA and RNA, and it is known that these genetic materials act as a complex to transfer toxic factors between cells and play a role in regulating inflammation and immune responses. From single-celled organisms to multicellular organisms, information exchange between cells is an essential process of life. Recently, endoplasmic vesicles have been recognized as mediators of information exchange between cells, and methods of using vesicles as drug carriers are being developed.
  • One aspect is a strain of Roseburia hominis belonging to the genus Roseburia , deposited under accession number KCTC 14978BP, and Agathobacter sp., deposited under accession number KCTC 14941BP. It provides an Agathobacter rectalis strain belonging to or a Christensenella minuta strain belonging to the Christensenella genus ( Christensenella sp.) deposited with the accession number KCTC 14979BP.
  • Another aspect is to provide endoplasmic reticulum derived from the strain, lysate of the strain, or culture medium.
  • Another aspect is a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising.
  • Another aspect is a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • a Roseburia hominis strain an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain
  • an endoplasmic reticulum derived from the strain a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • the goal is to provide health functional foods for improving intestinal health, including:
  • Another aspect is a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infections comprising.
  • Another aspect is a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • a Roseburia hominis strain an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain
  • an endoplasmic reticulum derived from the strain a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • Another aspect requires a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture of the strain, or a mixture thereof.
  • a Roseburia hominis strain an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium of the strain, or a mixture thereof is used to treat an inflammatory disease.
  • a composition for preventing or treating bacterial infections is used to treat an inflammatory disease.
  • the Roseburia hominis strain may be a strain containing 16S rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • the Agatobacter lectalis strain may be a strain containing 16S rRNA of SEQ ID NO: 2.
  • the Christensenella minuta strain may be a strain containing 16S rRNA of SEQ ID NO: 3.
  • the strain may have anti-inflammatory and/or antibacterial activity.
  • the strain inhibits the production of nitric oxide in inflammation-induced cells, suppresses the expression of inflammatory cytokines (e.g., TNF- ⁇ or IL-6), or inhibits bacterial proliferation (e.g., C. difficile ). It may be suppressing.
  • the strain reduces inflammatory factors induced by C. difficile , such as pro-inflammatory cytokines (e.g., TNF, or CCL2), or reduces anti-inflammatory cytokines (e.g., IL-10). ) may increase.
  • Another aspect provides the Roseburia hominis strain, the Agatobacter lectalis strain or the Christensenella minuta strain, the endoplasmic reticulum derived from the strain, the lysate, the culture medium, the extract of the culture medium, or a mixture thereof. do.
  • the strain is as described above.
  • vesicle refers to particles secreted from cells and released into the extracellular space, including exosomes, ectosomes, microvesicles, and microparticles. , exosome-like vesicles, etc.
  • Extracellular vesicles can reflect the state of the secreting cell of origin (donor cell), exhibit various biological activities depending on which cell they are secreted from, and play an important role in intercellular interactions by transferring genetic material and proteins between cells. can do.
  • cell-derived substances containing the endoplasmic reticulum cause disease or stimulate immune cells to fight against disease, and have the effect of helping humans break down and absorb substances that cannot be digested through the metabolic process of microorganisms. there is.
  • the endoplasmic reticulum is a membrane-structured endoplasmic reticulum that is divided into an inside and an outside, and contains cell membrane lipids, plasma membrane proteins, nucleic acids, and cytoplasmic components, and is larger than the original cell. may be small.
  • the endoplasmic reticulum may be isolated from cell lysate of a culture medium of a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain, or a Christensenella minuta strain.
  • the extracellular vesicles may have a diameter of 10 nm to 400 nm.
  • it may be 10 nm to 400 nm, 10 nm to 350 nm, 10 nm to 300 nm, or 10 nm to 250 nm.
  • the term “culture” may be used interchangeably with “culture supernatant,” “conditioned culture,” or “conditioned medium,” and may be used interchangeably with Roseburia hominis strains, Agatobacter lectalis strains, or Christensenella minu. It may refer to the entire medium containing the strain, its metabolites, extra nutrients, etc. obtained by culturing the strain for a certain period of time in a medium that can supply nutrients so that other strains can grow and survive in vitro. Additionally, the culture medium may refer to a culture medium obtained by removing the bacterial cells from the bacterial culture medium obtained by culturing the strain.
  • the liquid from which the bacteria have been removed from the culture medium is also called “supernatant", and the culture medium is left alone for a certain period of time and only the liquid in the upper layer excluding the part that has settled in the lower layer is taken, the bacteria are removed through filtration, or the culture medium is centrifuged and the lower layer is removed. It can be obtained by removing the precipitation and taking only the upper liquid.
  • the "bacteria” refers to the strain itself of the present invention, and includes the strain itself isolated and selected from a skin sample, etc., or a strain isolated from the culture medium by culturing the strain. The bacterial cells can be obtained by centrifuging the culture medium and taking the part that sinks to the lower layer. Alternatively, since they sink to the lower layer of the culture medium by gravity, they can be obtained by leaving them still for a certain period of time and then removing the upper liquid.
  • the culture medium may include the culture medium itself, its concentrate, or freeze-dried product obtained by cultivating the strain, or the culture supernatant obtained by removing the strain from the culture medium, its concentrate, or freeze-dried product.
  • the culture medium may be obtained by culturing the strain in an appropriate medium (e.g., R2A medium or TSA medium) at any temperature above 10°C or below 40°C for a certain period of time, for example, 4 to 50 hours. .
  • an appropriate medium e.g., R2A medium or TSA medium
  • the culture supernatant of the strain may be obtained by centrifuging or filtering the strain culture medium to remove the strain.
  • the concentrate may be obtained by concentrating the strain culture medium itself, or the supernatant obtained after filtering the culture medium using centrifugation or a filter.
  • lysate may refer to a product obtained by breaking the cell wall of the strain itself using chemical or physical force.
  • culture extract means extracted from the culture medium or its concentrate, and may include extract, diluted or concentrated liquid of the extract, dried product obtained by drying the extract, or their crude or purified product, and fractions thereof. You can.
  • Another aspect is disease improvement using a Roseburia hominis strain, an Agatobacter lectalis strain or a Christensenella minuta strain, an endoplasmic reticulum derived from the strain, a lysate of the strain, a culture medium, an extract of the culture medium, or a mixture thereof. , provides preventive or therapeutic use.
  • the term “treat” may mean curing inflammation or bacterial infection in a shorter time compared to natural healing.
  • the treatment may include amelioration and/or alleviation of inflammation or bacterial infection. Additionally, the treatment may mean healing and/or recovery of symptoms caused by inflammation or bacterial infection.
  • prevention refers to partially or completely delaying or preventing the onset or recurrence of a disease, disorder, or its secondary symptoms, preventing the acquisition or re-acquisition of a disease or disorder, or preventing the development or recurrence of a disease or disorder. It refers to a method of reducing the risk of acquisition. For example, the prevention refers to all actions that suppress or delay the occurrence of inflammation or bacterial infection by administering the composition according to the present invention.
  • Uses of the strain may include preventing, ameliorating, or treating inflammatory diseases (anti-inflammatory activity), preventing, ameliorating, or treating bacterial infections (antibacterial activity), or preventing or improving intestinal health.
  • inflammatory diseases anti-inflammatory activity
  • bacterial infections antibacterial activity
  • the inflammatory disease may include inflammation of the digestive system (gastrointestinal tract, etc.), inflammation within the eye, inflammation within the oral cavity, inflammation of the respiratory system including the lungs, inflammation of the skin, inflammation within the cardiovascular system, inflammation of the brain, inflammation within the ear, etc. there is.
  • the inflammatory diseases include inflammatory bowel diseases (IBD); irritable bowel syndrome; Behcet's disease; enteritis, Crohn's disease; ulcerative colitis; vasculitis; mucositis; stomatitis; peri-implantitis; periodontitis; pulpitis; gingivitis; Pneumonia; dermatitis; atopic dermatitis; contact dermatitis; CREST syndrome; dermatitis herpetiformis; dermatomyositis; systemic scleroderma; erythema nodosum; Henoch-Schonlein purpura; Hidradenitis suppurativa; Lichen planus; Majeed syndrome; Schnitzler syndrome; psoriasis; eczema; acne; mouth ulcers; uveitis; pharyngitis; tonsillitis; otitis, including otitis media; psoriatic arthritis; synovitis; mening
  • the improvement in intestinal health may be helpful in beneficial proliferation and suppression of harmful bacteria in the intestines, helpful in intestinal health by regulating immunity, or helpful in facilitating bowel movements.
  • antibacterial agent refers to an agent that (i) inhibits, reduces, or prevents the growth of bacteria; (ii) inhibits or reduces the ability of bacteria to cause infection in a subject; or (iii) refers to a substance capable of inhibiting or reducing the ability of bacteria to multiply or remain infective in the environment.
  • the bacterial infection may include infections caused by gram-positive bacteria or gram-negative bacteria.
  • the bacterial infection includes Clostridioides , Helicobactor , Escherichia , Salmonella , Staphylococcus , Streptococcus , and Haemophilus ( Haemophilus , Klebsiella , Moraxella , Enterobacter , Proteus , Serratia , Pseudomonas , Acinetobacter , Citrobacter ( It may include infections caused by bacteria belonging to the genera Citrobacter , Stenotrophomonas , Bacteroides , Prevotella , and Fusobacterium . More specifically, the bacterial infection is Clostridioides difficile infection (CDI), or Clostridioides difficile associated disease (CDAD), for example, Clostridioides difficile associated diarrhea ( Clostridioides difficile associated diarrhea.
  • CDI Clostridioides difficile infection
  • CDAD Clo
  • the composition is 0.00001% by weight to 80% by weight, for example, 0.00001% by weight to 60% by weight, 0.00001% by weight to 40% by weight, 0.00001% by weight to 30% by weight, 0.00001% by weight to 20% by weight, based on the total weight of the composition.
  • % 0.00001% to 10% by weight, 0.00001% to 5% by weight, 0.05% to 60% by weight, 0.05% to 40% by weight, 0.05% to 30% by weight, 0.05% to 20% by weight, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight It may include % to 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium.
  • the term "included as an active ingredient” means that the strain of the present specification, the endoplasmic reticulum derived from the strain, the lysate of the strain, the culture medium, or the extract of the culture medium are added to the extent that the above-mentioned effects can be exhibited, This means that it is formulated into various forms by adding various ingredients as sub-ingredients for drug delivery and stabilization.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • Types of pharmaceutically active ingredients that can deliver the active ingredient into the subject include anticancer agents, contrast agents (dyes), hormones, antihormones, vitamins, calcium agents, mineral agents, saccharides, organic acid agents, protein amino acid agents, detoxifiers, and enzymes.
  • Preparations metabolic preparations, diabetic preparations, tissue revitalization preparations, chlorophyll preparations, dye preparations, tumor preparations, tumor treatment drugs, radiopharmaceuticals, tissue cell diagnostic agents, tissue cell therapeutic agents, antibiotic preparations, antivirals, combination antibiotic preparations, chemistry Therapeutics, vaccines, toxins, toxoids, antitoxins, leptospira serum, blood products, biological agents, analgesics, immunogenic molecules, antihistamines, allergy medications, non-specific immunogenic agents, anesthetics, stimulants, psychotropic agents, small molecule compounds, nucleic acids, It may include aptamers, antisense nucleic acids, oligonucleotides, peptides, siRNA, and micro RNA.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, disintegrant, binder, lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate anhydride, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition When formulating the pharmaceutical composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao, Liurinji, glycerogeratin, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition contains carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, and low molecular weight proteins to increase stability or absorption. Alternatively, other stabilizers may be used as agents.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form.
  • Oral dosage forms may be granules, powders, solutions, tablets, capsules, dry syrup, or combinations thereof.
  • Parenteral dosage forms may be injectable.
  • the composition may be a health functional food composition.
  • the health functional food composition can be used alone or with other foods or food ingredients, such as the strain or its culture medium, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw materials.
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the health food composition also contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, and carbonated beverages. It may contain the carbonating agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, or a combination thereof.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may have, for example, an softening lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, essence, pack, gel, ampoule, or skin-adhesive type cosmetic formulation.
  • Ingredients included in the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient, for example, conventional auxiliaries and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances. may include.
  • composition may be a composition for external skin application.
  • the external skin agent may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the skin external preparations include ingredients commonly used in external skin preparations such as cosmetics and medicines, such as aqueous ingredients, oil-based ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, and fragrances. , colorants, various skin nutrients, or a combination thereof may be appropriately mixed according to need.
  • the skin external preparations include metal sequestrants such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belafamil, licorice extract, glablidin, and calin.
  • metal sequestrants such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belafamil, licorice extract, glablidin, and calin.
  • Hot water extract of fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytylitinic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbate glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars such as trehalose can also be appropriately mixed.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition of a subject comprising treating or administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • the subject's condition may be a condition related to inflammation, or a condition related to bacterial infection.
  • Administration can be done by methods known in the art. Administration may be administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. You can. The administration may be administered systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of an improvement in a condition related to inflammation or a condition related to bacterial infection.
  • the administration of the composition according to one embodiment is 0.00001 mg to 1,000 mg, for example, 0.00001 mg to 500 mg, 0.00001 mg to 100 mg, 0.00001 mg to 50 mg, 0.00001 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg per day.
  • 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration can be once a day or more than twice within the range of clinically acceptable side effects, and can be administered at one or two or more locations, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration can be from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate period.
  • the dosage per kg is the same as for humans, or the above dosage is converted into, for example, the volume ratio (e.g., average value) of the organs (heart, etc.) between the target animal and human.
  • One dose can be administered.
  • the new strain and the endoplasmic reticulum derived therefrom have effects that can be useful in preventing, improving, or treating inflammation-related conditions or bacterial infections.
  • Figure 1 is a graph showing the amount of nitric oxide produced according to cell processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment
  • N negative control
  • P untreated control
  • EV endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 2 is a graph showing the protein expression levels of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-6, and CCL2) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) upon cellular processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • N negative control
  • P untreated control
  • EV endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 3 is a graph showing the cytotoxicity results of the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 4 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B, BBH030: Endoplasmic reticulum of Example 1 strain, Type strain: Endoplasmic reticulum of Roseburia hominis standard strain.
  • Figure 5 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH030 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Roseburia hominis standard strain.
  • Figure 6 is a graph showing the culture rate of C. difficile in the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment;
  • C. difficile Clostridioides difficile
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • Figure 7 is a graph showing the protein expression levels of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-6, and CCL2) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) upon cellular processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • N negative control
  • P untreated control
  • EV endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 8 is a graph showing the cytotoxicity results of the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 9 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • Figure 10 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • Figure 11 is a graph showing the amount of nitric oxide produced according to cell processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 12 is a graph showing the protein expression levels of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-6, and CCL2) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) upon cellular processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • N negative control
  • P untreated control
  • EV endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 13 is a graph showing the cytotoxicity results of the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Figure 14 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH037 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Christensenella minuta standard strain.
  • Figure 15 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH037 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Christensenella minuta standard strain.
  • feces collected from a healthy person was mixed with 10 ml of 1 x PBS (Phosphate buffer saline) and then vortexed to suspend the feces. It was then filtered through a cell strainer to remove undigested food and small particle substances. The filtered fecal suspension was serially diluted and spread at 10 -6 to 10 -8 on an M2SGC or BHIs (Brain Heart Infusion + Supplement) Plate, and the bacteria were selected after culturing at 37°C for more than 3 days.
  • PBS Phosphate buffer saline
  • PCR amplification was performed on the colonies for which culture was completed, and the nucleotide sequence of the 16S rRNA region determined among the isolated and cultured microbial colonies was compared to other colonies registered with the BLAST program provided on the U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI) website. Strains were compared and analyzed.
  • Roseburia hominis BBH030 with 99% homology was isolated.
  • the selected Roseburia hominis BBH030 strain was deposited with the Korea Center for Biological Resources on May 18, 2022 and given the accession number KCTC 14978BP.
  • the Roseburia hominis BBH030 strain has the 16S rRNA sequence of SEQ ID NO: 1 (complementary DNA).
  • Agathobacter rectalis BBH034 As a result of comparative analysis , Agathobacter rectalis BBH034 with 99% homology was isolated.
  • the selected Agathobacter rectalis BBH034 strain was deposited at the Korea Center for Biological Resources on April 13, 2022 and received accession number KCTC 14941BP.
  • the Agathobacter rectalis BBH034 strain has a 16S rRNA sequence of SEQ ID NO: 2 (complementary DNA).
  • Christensenella minuta BBH037 As a result of comparative analysis , Christensenella minuta BBH037 with 99% homology was isolated.
  • the selected Christensenella minuta BBH037 strain was deposited at the Korea Center for Biological Resources on May 18, 2022 and given accession number KCTC 14979BP.
  • the Christensenella minuta BBH037 strain has the 16S rRNA sequence of SEQ ID NO: 3 (complementary DNA).
  • the endoplasmic reticulum of the strain isolated in the above example was isolated.
  • the isolated strain was cultured in broth for 2 days at 37°C under anaerobic conditions ( Roseburia hominis BBH030 YCFA broth; Agathobacter rectalis BBH034 PYG broth; Christensenella minuta BBH037 GAM broth). Afterwards, the culture was centrifuged at 5000 xg for 20 minutes to remove bacterial debris.
  • the anti-inflammatory activity of the endoplasmic reticulum of the strain isolated in Example 2 was analyzed.
  • Mouse macrophage Raw264.7 cells were cultured in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin) for 5 days. Cultured at 37°C in the presence of % CO 2 . Afterwards, 300 ⁇ L of the Raw 264.7 cells were dispensed into a 48-well plate at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/well, and cultured in a CO 2 incubator at 37°C for 24 hours.
  • DMEM Dynabecco Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 U/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin
  • the pro-inflammatory cytokine inhibitory activity and anti-inflammatory cytokine promoting activity of the endoplasmic reticulum of the above strain were measured. Specifically, Raw264.7 cells treated with LPS in the same manner as above were treated with the endoplasmic reticulum at a concentration of 1 Afterwards, the protein expression of the pro-inflammatory cytokines TNF, IL-6, and CCL2 and the protein expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 of the cells were measured using an ELISA kit (BD bioscience, USA) according to the manufacturer's instructions. Absorbance was measured at 450 nm, and the results are shown in Figures 2, 7, and 12 for each strain, respectively.
  • Figures 1 and 11 are graphs showing the amount of nitric oxide produced according to cell processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • the endoplasmic reticulum of the strain significantly reduced the amount of NO production in inflammation-induced cells compared to the untreated control group.
  • Figures 2, 7, and 12 are graphs showing the protein expression levels of pro-inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines upon cellular processing of the endoplasmic reticulum of a strain according to an embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • the endoplasmic reticulum of the strain significantly reduced pro-inflammatory cytokines compared to the untreated control group and significantly increased anti-inflammatory cytokines compared to the untreated control group.
  • strain according to one embodiment can be usefully used for preventing, improving, or treating inflammatory diseases, especially inflammatory bowel disease or irritable bowel syndrome.
  • Example 1 The antibacterial activity of the strain isolated in Example 1 was analyzed.
  • the endoplasmic reticulum was isolated by the method of Example 2.
  • C. difficile was cultured in BHIs or PYG broth for 48 hours, adjusted to an OD of 0.5, and C. difficile was inoculated at a ratio of 10% into the endoplasmic reticulum of the strain of the above example, and then cultured under anaerobic conditions for 1 day. Afterwards, the culture rate of C. difficile was measured spectrophotometrically.
  • Figure 6 is a graph showing the culture rate of C. difficile in the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment;
  • C. difficile Clostridioides difficile
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment was found to significantly reduce the growth rate of C. difficile .
  • the endoplasmic reticulum of the standard strain did not reduce the growth rate of C. difficile or appeared to reduce the growth rate less than the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment.
  • the strain according to one embodiment and/or the endoplasmic reticulum derived therefrom have antibacterial activity against bacteria, for example, Gram-negative bacteria, and that the activity is higher than that of the standard strain.
  • these results indicate that the strain and/or endoplasmic reticulum derived therefrom according to one embodiment is useful for preventing, improving, or treating Clostridioides difficile infection (CDI), or irritable bowel syndrome resulting therefrom. This means that it can be used effectively.
  • CDI Clostridioides difficile infection
  • Figures 3, 8, and 13 are graphs showing the cytotoxicity results of the endoplasmic reticulum of the strain according to one embodiment; N: negative control, P: untreated control, EV: endoplasmic reticulum of Example 2.
  • Example 1 The effect of the endoplasmic reticulum of the strain isolated in Example 1 on controlling inflammatory cytokines induced by Clostridioides difficile toxin B was confirmed.
  • mouse macrophage Raw264.7 cells were treated with Clostridioides difficile toxin B ( C. difficile toxin B) in an amount of 10 ng/ml in the same manner as in Experimental Example 1, and then incubated at 37°C for 4 days. It was cultured for some time. Afterwards, the endoplasmic reticulum of the Roseburia hominis standard strain (KCTC5845), Agatobacter lectalis standard strain (KCTC5835), or Christensenella minuta standard strain (KCTC15498) and the strain of Example 1 was mixed with 1 After treatment at a concentration of 1 It is shown in Figure 14.
  • Clostridioides difficile toxin B C. difficile toxin B
  • the relative concentrations of the pro-inflammatory cytokines TNF, IL-6, and CCL2, and the anti-inflammatory cytokine IL-10 in the cells were measured by absorbance at 450 nm using an ELISA kit (BD bioscience, USA) according to the manufacturer's instructions. was measured, and the results are shown for each strain in Figures 5, 10, and 15, respectively.
  • Figure 4 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B, BBH030: Endoplasmic reticulum of Example 1 strain, Type strain: Endoplasmic reticulum of Roseburia hominis standard strain.
  • Figure 9 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • Figure 14 is a graph showing the cytotoxicity results when the endoplasmic reticulum of the strain and Clostridioides difficile toxin B were treated together according to one embodiment;
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH037 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Christensenella minuta standard strain.
  • Figure 5 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH030 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Roseburia hominis standard strain.
  • Figure 10 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH034 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Agatobacter lectalis standard strain.
  • Figure 15 is a graph showing the activity of reducing inflammation induced by Clostridioides difficile of the endoplasmic reticulum of a strain according to one embodiment
  • C. difficile toxin B Clostridioides difficile toxin B
  • BBH037 Endoplasmic reticulum of Example 1 strain
  • Type strain Endoplasmic reticulum of Christensenella minuta standard strain.
  • the endoplasmic reticulum of the strain contains proinflammatory cytokines TNF, IL-6, and CCL2 increased by Clostridioides difficile toxin B compared to the standard strain. It was found that it significantly decreased and the anti-inflammatory cytokine IL-10 was significantly increased compared to the standard strain.
  • strain and/or the endoplasmic reticulum derived therefrom has significant anti-inflammatory activity, preventing, improving, and preventing Clostridioides difficile infection (CDI) or irritable bowel syndrome resulting therefrom. Or it means that it can be usefully used for treatment.
  • CDI Clostridioides difficile infection

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Abstract

신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 소포체 및 이들의 항염증 및/또는 항균 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 신규 균주 및 이의 유래의 소포체에 의하면, 염증 관련 상태, 또는 박테리아 감염의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

신규 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 소포체 및 이들의 항염증 및/또는 항균 용도에 관한 것이다.
마이크로바이옴(Microbiome)은 특정 환경에 존재하고 있는 미생물들과 이들의 유전정보 전체를 말하는 것으로, 단일 생명체의 유전정보 전체를 뜻하는 게놈 (Genome) 들의 집합체를 의미한다. 따라서 인체 마이크로바이옴(Human Microbiome)은 인간 몸체 안팎에 서식하고 있는 미생물들과 그들의 유전정보 전체를 의미한다.
인간의 몸은 많은 미생물과 공생관계를 이루며 살아가며 특히 장내에는 미생물이 영양분을 섭취하고 체계적인 군집을 형성하기에 최적의 환경으로 가장 많은 미생물이 존재한다. 장내 미생물은 숙주가 지닌 효소만으로는 생성할 수 없는 영양분을 공급하고 숙주의 대사 및 면역 체계와 깊은 연관을 지니는 한편 과민성대장증후군, 비만, 아토피, 우울증, 류마티스 관절염, 자폐 스펙트럼 장애, 치매 등 다양한 질병의 발생과 관련되어 있다고 보고되고 있다.
최근에는 서구적인 식습관과 무분별한 항생제 사용으로 장내 미생물총(Microbiota)의 불균형이 일어나 장 건강이 악화되고 있으며, 장내미생물과 다양한 질병에 대한 연구로 인해 장내 미생물에 대한 중요성이 부각되고 관심이 대두되고 있다.
한편 소포체는 세포가 생성하여 배출하는 20 내지 200 nm 정도의 나노사이즈의 물질로, 세포 간 이동이 자유롭다. 또한 소포체는 막지질, 막단백질, DNA나 RNA 등을 포함하고 이러한 유전물질들이 복합체로 작용하여 세포와 세포 사이에 독성 인자를 전달하고 염증과 면역반응 조절 등의 역할을 한다고 알려져 있다. 단세포 생물에서 다세포 생물에 이르기까지 세포 간 정보교환은 생명현상의 필수적인 과정이며, 최근에는 소포체가 세포 간 정보교환의 매개체로 인식되어 있어 소포를 응용하여 약물 운반체로 활용하는 방법들이 개발되고 있다.
이에, 인간의 장내 유래 신규 미생물, 및 이의 유래의 소포체를 이용한 질병의 개선, 예방, 또는 치료를 위한 물질의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 수탁번호 KCTC 14978BP로 기탁된, 로제부리아 속(Roseburia sp.)에 속하는 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 수탁번호 KCTC 14941BP로 기탁된, 아가토박터 속(Agathobacter sp.)에 속하는 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 수탁번호 KCTC 14979BP로 기탁된, 크리스텐세넬라 속(Christensenella sp.)에 속하는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 또는 배양액을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 장 건강의 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 염증성 질환 또는 박테리아 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 염증성 질환 또는 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 수탁번호 KCTC 14978BP로 기탁된, 로제부리아 속(Roseburia sp.)에 속하는 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 수탁번호 KCTC 14941BP로 기탁된, 아가토박터 속(Agathobacter sp.)에 속하는 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 수탁번호 KCTC 14979BP로 기탁된, 크리스텐세넬라 속(Christensenella sp.)에 속하는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주를 제공한다.
상기 로제부리아 호미니스 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 균주일 수 있다. 상기 아가토박터 렉탈리스 균주는 서열번호 2의 16S rRNA를 포함하는 균주일 수 있다. 상기 크리스텐세넬라 미누타 균주는 서열번호 3의 16S rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
상기 균주는 항염증 및/또는 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 균주는 염증 유발된 세포에서 산화 질소의 생성을 억제하거나, 염증성 사이토카인(예를 들면, TNF-α 또는 IL-6)의 발현을 억제하거나, 박테리아의 증식(예를 들면, C. difficile)을 억제하는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 C. difficile에 의해 유도된 염증 인자, 예를 들면, 전염증성 사이토카인(예를 들면, TNF, 또는 CCL2)를 감소시키거나, 항염증성 사이토카인(예를 들면, IL-10)을 증가시키는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 “소포체(vesicle)”는 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 입자를 의미하는 것으로서, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle), 마이크로입자(microparticle), 엑소좀 유사 소포체 (exosome like vesicle) 등의 다수의 상이한 종을 포함할 수 있다. 세포밖 소포체는 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영할 수 있으며, 어떤 세포에서 분비되었는가에 따라 다양한 생물학적 활성을 나타내고, 세포들 사이에 유전 물질과 단백질을 옮기면서 세포 간 상호작용에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 소포체를 포함하는 세포 유래 물질들은 질병을 일으키거나 또는 면역세포를 자극하여 질병에 대항하게 하며, 미생물의 대사과정을 통해 사람이 소화시키지 못하는 물질들을 분해하여 흡수할 수 있도록 도와주는 효과가 있다. 상기 소포체는 막 구조 소포체로 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid), 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세포보다 크기가 작은 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 소포체는 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주의 배양액의 세포 파쇄물로부터 분리된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 10 nm 내지 400 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 350 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 250 nm 일 수 있다.
본 명세서에서 용어“배양액”은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 상기 균주를 적절한 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSA 배지) 에서 10 ℃초과 또는 40 ℃미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물의 질병 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "치료 (treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 염증 또는 박테리아 감염증 등이 치유되는 것을 의미할 수 있다. 상기 치료는 염증 또는 박테리아 감염증의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 염증 또는 박테리아 감염증으로부터 유발되는 증상의 치유 및/또는 회복을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “예방(prevention)”은 질환, 장애, 또는 그의 부수적 증상의 발병 또는 재발을 부분적으로 또는 완전히 지연시키거나 방지하거나, 질환 또는 장애의 획득 또는 재획득을 막거나, 질환 또는 장애의 획득의 위험을 감소시키는 방법을 말한다. 예를 들어, 상기 예방은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증 또는 박테리아 감염증의 발생을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
상기 균주의 용도는 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료(항 염증 활성), 박테리아 감염증의 예방, 개선, 또는 치료(항균 활성), 또는 장 건강의 예방 또는 개선을 포함할 수 있다.
상기 염증성 질환은 소화기계(위장관 등)의 염증, 안 내 염증, 구강 내 염증, 폐를 포함하는 호흡계의 염증, 피부의 염증, 심장혈관계 내 염증, 뇌의 염증, 귀 내 염증 등을 포함할 수 있다.
더욱 상세하게는 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 베체트 병(Behcet's disease); 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease); 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 혈관염(vasculitis); 점막염(mucositis); 구내염(stomatitis); 임플란트 주위염(peri-implantitis); 치주염(periodontitis); 치수염(pulpitis); 치은염(gingivitis); 폐렴; 피부염(dermatitis); 아토피 피부염(atopic dermatitis); 접촉성 피부염(contact dermatitis); CREST 증후군; 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis); 피부근염(dermatomyositis); 전신성 공피증(systemic scleroderma); 결절성 홍반(erythema nodosum); 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura); 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa); 편평태선(Lichen planus); 마지드 증후군(Majeed syndrome); 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome); 건선(psoriasis); 습진(eczema); 여드름(acne); 구강염(mouth ulcers); 포도막염(uveitis); 인두염(pharyngitis); 편도염(tonsillitis); 중이염을 포함하는 이염(otitis); 관절염(psoriatic arthritis); 활액막염(synovitis); 수막염(meningitis); 뇌염(encephalitis); 비커스테프 뇌염(Bickerstaff's encephalitis) 뇌척수염(encephalomyelitis); 척추염(spondylitis); 골수염(osteomyelitis); 길리안 바레 증후군(Guillain-barre syndrome); 척수염(myelitis); 시속신경수염(neuromyelitis optica); 방광염(cystitis); 감염 또는 상처 부위에 급성 염증; 신염(nephritis); 및 사구체신염(glomerulonephritis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 상기 장 건강의 개선은 장내 유익증식 및 유해균 억제에의 도움, 면역을 조절하여 장 건강에의 도움, 또는 배변활동 원할에의 도움인 것일 수 있다.
용어 "항균제"는 본원에서 사용될 때, (i) 박테리아의 성장을 억제, 감소 또는 방지하거나; (ii) 박테리아가 대상에서 감염을 발생시키는 능력을 억제 또는 감소시키거나; 또는 (iii) 박테리아가 환경에서 증식하거나 감염성을 유지하는 능력을 억제 또는 감소시키는 것이 가능한 물질을 가리킨다.
상기 박테리아 감염증의 예시는 그람 양성균 또는 그람 음성균에 의한 감염증을 포함할 수 있다. 상세하게는, 상기 박테리아 감염증은 클로스트리디오이데스(Clostridioides), 헬리코박터(Helicobactor), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 해모필루스(Haemophilus), 클레브시엘라(Klebsiella), 모락셀라(Moraxella), 엔테로박터(Enterobacter), 프로테우스(Proteus), 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 시트로박터(Citrobacter), 스테노프로포모나스(Stenotrophomonas), 박테로이드(Bacteroides), 프레보텔라(Prevotella), 푸소박테리움(Fusobacterium) 속에 속하는 박테리라에 의한 감염증을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 박테리아 감염증은 클로스트리디오이데스 디피실 감염증(CDI), 또는 클로스트리디오이데스 디피실 관련 질환(CDAD: Clostridioides difficile associated disease), 예를 들면, 클로스트리디오이데스 디피실 관련 설사(Clostridioides difficile associated diarrhea)를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.00001 중량% 내지 60 중량%, 0.00001 중량% 내지 40 중량%, 0.00001 중량% 내지 30 중량%, 0.00001 중량% 내지 20 중량%, 0.00001 중량% 내지 10 중량%, 0.00001 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다.
용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 활성 성분을 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 염증과 관련된 상태, 또는 박테리아 감염과 관련된 상태일 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 염증과 관련된 상태, 또는 박테리아 감염과 관련된 상태의 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.00001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.00001 mg 내지 500 mg, 0.00001 mg 내지 100 mg, 0.00001 mg 내지 50 mg, 0.00001 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 균주 및 이의 유래의 소포체에 의하면, 염증 관련 상태, 또는 박테리아 감염의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 따른 산화질소의 생성량을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 2는 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 전염증성 사이토카인(TNF, IL-6 및 CCL2) 및 항염증성 사이토카인(IL-10)의 단백질 발현양을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 3은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 4는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH030: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 로제부리아 호미니스 표준 균주의 소포체.
도 5은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH030: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 로제부리아 호미니스 표준 균주의 소포체.
도 6은 일 구체예에 따른 균주의 소포체에서의 C. difficile의 배양율을 나타낸 그래프이다; C. difficile: 클로스트리디오이데스 디피실, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 7은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 전염증성 사이토카인(TNF, IL-6 및 CCL2) 및 항염증성 사이토카인(IL-10)의 단백질 발현양을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 8은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 9는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 10은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 11은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 따른 산화질소의 생성량을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 12는 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 전염증성 사이토카인(TNF, IL-6 및 CCL2) 및 항염증성 사이토카인(IL-10)의 단백질 발현양을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 13은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
도 14는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH037: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 크리스텐세넬라 미누타 표준 균주의 소포체.
도 15은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH037: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 크리스텐세넬라 미누타 표준 균주의 소포체.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
건강한 사람의 분변으로부터 균주를 분리 및 동정하기 위해 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 건강한 사람에게서 수집한 분변 1g과 1 x PBS(Phosphate buffer saline) 10 ml을 혼합 후 Vortexing 하여 분변을 현탁하였다. 그런 뒤 소화되지 않은 음식 및 작은 입자 물질 등을 제거하기 위하여 Cell strainer로 여과하였다. 여과된 분변 현탁액을 연속희석(Serial dilution)하여 M2SGC 또는 BHIs(Brain Heart Infusion + Supplement) Plate에 10-6~10-8으로 Spreading하였고 37℃에 3일 이상 배양 후 균을 선별하였다. 배양이 완료된 집락에 대해 PCR 증폭을 수행하였고, 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였다.
비교 분석 결과 상동성 99%의 Roseburia hominis BBH030을 분리하였다. 선별된 Roseburia hominis BBH030 균주를 2022년 05월 18일자로 한국생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14978BP를 부여받았고, Roseburia hominis BBH030 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.
비교 분석 결과 상동성 99%의 Agathobacter rectalis BBH034을 분리하였다. 선별된 Agathobacter rectalis BBH034 균주를 2022년 04월 13일자로 한국생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14941BP를 부여받았고, Agathobacter rectalis BBH034 균주는 서열번호 2(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.
비교 분석 결과 상동성 99%의 Christensenella minuta BBH037을 분리하였다. 선별된 Christensenella minuta BBH037 균주를 2022년 05월 18일자로 한국생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14979BP를 부여받았고, Christensenella minuta BBH037 균주는 서열번호 3(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.
실시예 2. 소포체의 분리
상기 실시예에서 분리된 균주의 소포체를 분리하였다.
구체적으로, 소포체를 제조하기 위해, 상기 분리된 균주를 broth에서 37℃, 혐기 조건에서 2일간 배양하였다(Roseburia hominis BBH030 YCFA broth; Agathobacter rectalis BBH034 PYG broth; Christensenella minuta BBH037 GAM broth). 이후에 배양액을 5000 x g으로 20분 동안 원심분리하여 균의 잔해를 제거하였다. 이후에, 0.45 μm 필터로 여과하고 다시 0.22 μm 필터로 여과한 뒤 원심분리 튜브(Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)를 사용하여 100 kda 이상의 물질을 농축하였고 상기 분리된 균주의 소포체를 분리하였다.
실험예 1. 항염증 활성 분석
상기 실시예 2.에서 분리된 균주의 소포체의 항염증 활성을 분석하였다.
먼저, 항염증 활성을 평가하기 위해, 산화 질소(NO) 생성량 감소를 측정하였다. 마우스 대식세포 Raw264.7 세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% 항생제 (100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)를 포함하는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)으로 5% CO2　존재 하에서 37℃로 배양하였다.　이후에, 상기 Raw 264.7 세포를 48웰 플레이트에 5×104세포/웰의 농도로 300 μL씩 분주하고, CO2 배양기에서 37℃ 및 24 시간 동안 배양하였다.　웰 상층액을 버리고 염증　유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS) 10 μg/ml가 첨가된 배지를 분주한 후 4 시간 동안 추가 배양하였다. LPS가 들어있는 상층액을 버리고 상기 소포체를 1 X 103 내지 1 X 107 particles/ml의 농도로 배지에 첨가하여 처리한 다음 37℃에서 16시간 배양하였다. 이후에, 웰 상층액 중 50 μL와 Griess 시약 50 μL를 섞어서 실온에서 10분간 반응시킨 후 플레이트 리더기로 540 nm에서 흡광도 측정하여 산화 질소의 생성량을 측정하였고, 그 결과를 균주별로 각각 도 1 및 도 11에 나타내었다.
또한, 상기 균주의 소포체의 전염증성 사이토카인 억제 활성 및 항염증성 사이토카인 촉진 활성을 측정하였다. 구체적으로, 상기와 동일한 방법으로 LPS 처리된 Raw264.7 세포에 상기 소포체를 1 X 103 내지 1 X 108 particles/ml의 농도로 처리한 다음 37℃에서 16시간 배양하였다. 이후에, 상기 세포의 전염증성 사이토카인인 TNF, IL-6 및 CCL2의 단백질 발현 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 단백질 발현을 ELISA kit (BD bioscience, 미국)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 균주별로 각각 도 2, 도 7 및 도 12에 나타내었다.
도 1 및 도 11은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 따른 산화질소의 생성량을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 소포체는 염증 유발된 세포의 NO 생성량을 무처리 대조군 대비 유의하게 감소시킨 것을 알 수 있었다.
도 2, 도 7 및 도 12는 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 처리에 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 단백질 발현양을 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 소포체는 전염증성 사이토카인을 무처리 대조군 대비 현저하게 감소시키고, 항염증성 사이토카인을 무처리 대조군 대비 유의하게 증가시킴을 알 수 있었다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 질환, 특히 염증성 장질환 또는 과민성대장증후군의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 항균 활성 분석
상기 실시예 1.에서 분리된 균주의 항균 활성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예의 균주의 소포체의 C. difficile에 대한 항균 활성을 분석하기 위해, 실시예 2의 방법으로 소포체를 분리하였다. C. difficile을 BHIs 또는 PYG broth에서 48시간 배양 한 후 OD 0.5로 맞춘 뒤 상기 실시예의 균주의 소포체에 C. difficile을 10%의 비율로 접종한 후, 1일 동안 혐기적 조건에서 배양하였다. 이후에 C. difficile의 배양율을 Spectrophotometrically 방법으로 측정하였다. 또한, 실시예 1의 균주와 항균 효과를 비교하기 위해 아가토박터 렉탈리스 표준 균주(KCTC5835의 소포체도 상기와 같은 방법으로 클로스트리디오이데스 디피실에 대한 항균 활성을 분석하였다. 상기 분석 결과는 균주별로 각각 도 6에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 균주의 소포체에서의 C. difficile의 배양율을 나타낸 그래프이다; C. difficile: 클로스트리디오이데스 디피실, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 소포체는 C. difficile의 생장율을 현저하게 감소시키는 것을 알 수 있었다. 반면, 표준 균주의 소포체의 경우에는 C. difficile의 생장율을 감소시키지 않거나 일 구체예에 따른 균주의 소포체보다 생장율을 덜 감소시키는 것으로 나타났다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 균주 및/또는 그의 유래의 소포체가 박테리아, 예를 들면, 그람 음성균에 대한 항균 활성을 가지고 표준 균주에 비해 그 활성이 높음을 의미한다. 특히, 이러한 결과는 일 구체예에 따른 균주 및/또는 그의 유래의 소포체는 클로스트리디오이데스 디피실 감염증(Clostridioides difficile infection, CDI), 또는 그로 인해 나타나는 과민성 대장증후군의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 3. 세포 독성 실험
상기 실시예 2.에서 분리된 균주의 소포체의 세포 독성 실험을 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Abbkine, 중국)을 이용하였다.
구체적으로, Raw264.7 세포를 48웰 플레이트에 5×104세포/웰의 농도로 300 μL씩 분주하고, CO2 배양기에서 37℃ 및 24 시간 동안 배양하였다.　웰 상층액을 버리고 염증　유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS) 10 μg/ml가 첨가된 배지를 분주한 후 4 시간 동안 추가 배양하였다. LPS가 들어있는 상층액을 버리고 상기 소포체를 1 X 103 내지 1 X 108 particles/ml의 농도로 배지에 첨가하여 처리한 다음 37℃에서 16시간 배양하였다. 이후에, 상층액을 제거하고 CCK-8 용액이 10% 포함된 배지를 각 웰에 300 μl씩 처리하고 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, 살아있는 세포의　미토콘드리아에 존재하는 숙신산 탈수소효소 (succinate dehydrogenase)에 의하여 생성된 수용성　포르마잔　(formazan)의 농도를 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였고, 그 결과를 균주별로 각각 도 3, 도 8 및 도 13에 나타내었다.
도 3, 도 8 및 도 13은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다; N: 음성 대조군, P: 무처리 대조군, EV: 실시예 2의 소포체.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 소포체는 세포 독성이 관찰되지 않음을 알 수 있었다.
실험예 4. 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B에 의해 유도된 염증의 감소 활성 분석
상기 실시예 1에서 분리된 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 조절 효과를 확인하였다.
먼저, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 마우스 대식세포 Raw264.7 세포에 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B(C. difficile toxin B)를 10 ng/ml의 양으로 처리한 다음 37℃의 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이후에, 로제부리아 호미니스 표준 균주(KCTC5845), 아가토박터 렉탈리스 표준 균주(KCTC5835) 또는 크리스텐세넬라 미누타 표준 균주(KCTC15498)와 실시예 1의 균주의 소포체를 1 X 103 내지 1 X 108 particles/ml의 농도로 처리한 후, 37℃의 조건에서 16시간 동안 배양하였고, 세포 생존율을 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 균주별로 각각 도 4, 도 9 및 도 14에 나타내었다.
또한, 상기 세포에서 전염증성 사이토카인인 TNF, IL-6 및 CCL2, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 상대적 농도를 ELISA kit (BD bioscience, 미국)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 균주별로 각각 도 5, 도 10 및 도 15에 나타내었다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH030: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 로제부리아 호미니스 표준 균주의 소포체.
도 9는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 14는 일 구체예에 따른 균주의 소포체와 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B를 함께 처리한 경우의 세포독성 결과를 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH037: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 크리스텐세넬라 미누타 표준 균주의 소포체.
도 5은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH030: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 로제부리아 호미니스 표준 균주의 소포체.
도 10은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH034: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 아가토박터 렉탈리스 표준 균주의 소포체.
도 15은 일 구체예에 따른 균주의 소포체의 클로스트리디오이데스 디피실에 의해 유도된 염증의 감소 활성을 나타낸 그래프이다; C. difficile toxin B: 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B, BBH037: 실시예 1 균주의 소포체, Type strain: 크리스텐세넬라 미누타 표준 균주의 소포체.
도 4, 도 9 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주와 표준 균주의 소포체 모두에서 세포독성은 확인되지 않았다.
또한, 도 5, 도 10 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 소포체는 클로스트리디오이데스 디피실 독소 B에 의해 증가한 전염증성 사이토카인 TNF, IL-6 및 CCL2을 표준 균주 대비 유의하게 감소시키고, 항염증성 사이토카인 IL-10을 표준 균주 대비 현저하게 증가시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 균주 및/또는 그의 유래의 소포체는 현저한 항염 활성을 가져, 클로스트리디오이데스 디피실 감염증(Clostridioides difficile infection, CDI), 또는 그로 인해 나타나는 과민성 대장증후군의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생물자원센터(국외)
수탁번호 : KCTC 14978BP
수탁일자 : 20220518
Figure PCTKR2023012912-appb-img-000001
기탁기관명 : 한국생물자원센터(국외)
수탁번호 : KCTC 14941BP
수탁일자 : 20220413
Figure PCTKR2023012912-appb-img-000002
기탁기관명 : 한국생물자원센터(국외)
수탁번호 : KCTC 14979BP
수탁일자 : 20220518
Figure PCTKR2023012912-appb-img-000003

Claims (19)

  1. 수탁번호 KCTC 14978BP로 기탁된, 로제부리아 속(Roseburia sp.)에 속하는 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 수탁번호 KCTC 14941BP로 기탁된, 아가토박터 속(Agathobacter sp.)에 속하는 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 수탁번호 KCTC 14979BP로 기탁된, 크리스텐세넬라 속(Christensenella sp.)에 속하는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 16S rRNA를 포함하는 것인 균주.
  3. 청구항 1의 균주 유래의 소포체.
  4. 청구항 1의 균주의 파쇄액.
  5. 청구항 1의 균주의 배양액.
  6. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염증성 활성을 갖는 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 활성을 갖는 것인 조성물.
  8. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 염증성 질환은 소화기계의 염증성 질환인 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease); 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 장 건강의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 박테리아 감염증은 클로스트리디오이데스 디피실 감염증(CDI)인 것인, 약학적 조성물.
  15. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  16. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  17. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 박테리아 감염증의 예방 또는 치료 방법.
  18. 로제부리아 호미니스 균주, 아가토박터 렉탈리스 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도.
  19. 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 균주, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis) 균주 또는 크리스텐세넬라 미누타(Christensenella minuta) 균주, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 균주의 파쇄액, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도.
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