CN107384828B - 阿克曼氏粘细菌培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿克曼氏粘细菌培养基及其制备方法，其中，阿克曼氏粘细菌培养基包括：磷酸二氢钾0.4g/L、磷酸氢二钠0.53g/L、氯化铵0.3g/L、氯化钠0.3g/L、氯化钙0.11g/L、六水合氯化镁0.1g/L、碳酸氢钠4g/L、刃天青0.5mg/L、酸痕量溶液1mL/L、碱痕量溶液1mL/L、维生素溶液1mL/L、脑心浸液培养基37g/L、低聚木糖1.5g/L、环糊精5g/L、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清30g/L。本发明制备的培养基能解决阿克曼氏粘细菌生长缓慢的问题，且能显著提高阿克曼氏粘细菌的生长速度和菌液浓度。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程领域。更具体地说，本发明涉及一种阿克曼氏粘细菌培养基及其制备方法。
背景技术
阿克曼氏粘细菌，又叫嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)，是一种从人体肠道中发现的疣微菌门的一种代表细菌，革兰氏阴性，严格厌氧。近年来的许多研究表明，阿克曼氏粘细菌和人类的许多代谢疾病有一定的关联。
阿克曼氏粘细菌对肥胖症和二型糖尿病有一定的预防和防治作用，它的丰度与人类的体重、Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病成负相关。
阿克曼氏粘细菌能降低饮食诱导的体重增加和脂肪量的形成，同时与腰围，体重和体质指数呈负相关，表明了阿克曼氏粘细菌和体重减少有关。与此同时，阿克曼氏粘细菌能够改善饮食诱导的肥胖症以及与肥胖相关的一系列代谢性疾病，在遗传肥胖的瘦素缺乏的小鼠和高脂饲料喂养的小鼠肠道中，阿克曼氏粘细菌的丰度是降低的，而在饲料中添加了益生元之后，发现阿克曼氏粘细菌又还原到了原来的基础水平，并且改善了代谢内毒素血症以及高脂肪饮食引起的与肥胖有关的一系列代谢紊乱，同时，益生元的添加也减少了机体的脂肪总量和体重，说明益生元对肥胖症及其相关的代谢紊乱具有重要的积极作用。
阿克曼氏粘细菌在健康人群的微生物菌群中占到了3-5％，它的丰度与人类的Ⅱ型糖尿病成负相关。阿克曼氏粘细菌在葡萄糖耐受群体中的丰度比前驱糖尿病群体中要高，因此，前驱糖尿病可能是Ⅱ型糖尿病的一个标志。女性产后早期是微生菌群感应并诱发保护自身免疫糖尿病的关键时刻，阿克曼氏粘细菌可能会发挥潜在的重要保护作用。
但阿克曼氏粘细菌生长缓慢，在一般培养基中需要培养7天甚至更久，这使得对它的深入研究有一定的困难，不利于研究工作的开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿克曼氏粘细菌培养基及其制备方法，以解决阿克曼氏粘细菌生长缓慢的问题，通过筛选生长刺激因子，使得培养基能显著提高阿克曼氏粘细菌的生长速度和菌液浓度。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种阿克曼氏粘细菌培养基，包括：
其中，
酸痕量溶液包括：
碱痕量溶液包括：
维生素溶液包括：
一种阿克曼氏粘细菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、向混合器中加入一定量的蒸馏水；
步骤二、将基础培养基的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤三、将生长刺激因子的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤四、向混合器中添加蒸馏水至各组分达到设定的浓度。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明的培养基使得阿克曼氏粘细菌的生长速度由原来的5-6天降为24-36h，极大的缩短了培养时间，且菌液OD600nm值也由0.0697升到了0.7197，极大地促进了阿克曼氏粘细菌的生长，对以后的深入研究具有重大意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的将所有单种生长刺激因子以单一水平添加到基础培养基中的生长曲线图；
图2为图1中环糊精、低聚半乳糖、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和诺维信蛋白酶酶解鸡蛋清对应的生长曲线的放大图；
图3为本发明所述的培养基优化前后的生长曲线图；
图4为本发明所述的培养基优化前后的菌落计数图；
图5为图1中除低聚木糖、环糊精、低聚半乳糖和索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清外的其他生长因子对应的生长曲线的放大图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种阿克曼氏粘细菌培养基，包括：
其中，
酸痕量溶液包括：
碱痕量溶液包括：
维生素溶液包括：
培养基中，除上述组分外，余量为水。
一种阿克曼氏粘细菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、向混合器中加入一定量(能使之后加入的组分溶解，又不超过水的总量即可，因而可多可少)的蒸馏水；
步骤二、将基础培养基的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤三、将生长刺激因子的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤四、向混合器中添加蒸馏水至各组分达到设定的浓度。
配制时，将基础培养基、生长刺激因子和水混合即可。
具体地，当需要配置1L培养基时，包括以下步骤：
步骤1)、用大烧杯量取800mL蒸馏水；
步骤2)、将基础培养基的各组分(具体的量通过浓度换算得到)常温下添加到烧杯中进行混合；
步骤3)、将生长刺激因子的各组分(具体的量通过浓度换算得到)添加到烧杯中进行混合；
步骤4)、添加蒸馏水配平培养基至1L。
一、生长刺激因子的确定
一)、生长刺激因子的初筛
初筛的生长刺激因子有：
低聚糖类：低聚木糖、环糊精、棉籽糖、聚葡萄糖、水苏糖、低聚甘露糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆寡糖、海藻糖、菊粉、低聚龙胆糖、新琼寡糖、低聚壳聚糖、褐藻胶低聚糖；
氨基酸类：精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸；
蛋白质类：索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清，诺维信碱性蛋白酶酶解鸡蛋清；
药物类：盐酸二甲双胍；
目的：初筛选出三种对阿克曼氏粘细菌生长最好的生长刺激因子。
具体方法如下：
将上述所有单种生长刺激因子以单一水平添加到基础培养基中，对照组设为未添加生长刺激因子的基础培养基(见实施例1)，其中，低聚木糖设为1.5g/L和2.5g/L两种浓度。
将对数期阿克曼氏粘细菌分别以4％的接菌量，即1mL菌液接入到25mL添加了各种生长刺激因子后的基础培养基和未添加生长刺激因子的基础培养基中，37℃厌氧培养。
每24h测一次菌液OD600nm值，各生长刺激因子水平及其所测OD600nm值，见表1，并根据所测OD值绘制生长曲线，见图1。
表1各生长刺激因子水平及其所测OD600nm值
由表1和图1可知，阿克曼氏粘细菌在添加低聚木糖、低聚半乳糖、环糊精和索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清这四种生长刺激因子的基础培养基中的生长速度较其他组快，且菌液浊度也较高。阿克曼氏粘细菌在添加低聚木糖的基础培养基中的生长速度又比在其他培养基中要快得多，菌液浊度也要高很多。同时，除上述四种生长刺激因子外的其他生长刺激因子的单一作用不太明显，故首先确定低聚木糖作为最终的一种生长刺激因子。为了在一个较高的生长水平上对其他生长刺激因子进行筛选，使其他生长刺激因子的效果更明显一些，就需要稍微减弱低聚木糖的影响，即降低低聚木糖的浓度，因此将低聚木糖作为一种基础成分添加到基础培养基中，并使其浓度为1.5g/L，从而使阿克曼氏粘细菌能够生长到较高的水平，以便于索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清、环糊精和低聚半乳糖进行接下来的复筛试验。
二)、生长刺激因子的复筛
以索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清、环糊精和低聚半乳糖三种生长刺激因子进行正交试验，由于不能保证三种组合一定比两种组合效果要好，故同时将初筛选出的三种生长刺激因子再进行两两组合，将正交试验筛选出的最佳组合与两两组合结果进行比较，最终选出最优的组合，每种生长刺激因子设为三个水平。
复筛时，将三种生长刺激因子或两两组合的生长刺激因子分别加入含1.5g/L的低聚木糖的基础培养基中，将对数期阿克曼氏粘细菌分别以4％的接菌量，即1mL菌液接入到25mL添加了各组生长刺激因子后的基础培养基中，37℃厌氧培养。由于基础培养基中添加了低聚木糖后，菌体生长速度大幅提升，故每隔12h测一次菌液OD600nm值。
1、以上述三种生长刺激因子进行正交试验。
索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清、环糊精和低聚半乳糖水平，见表2；正交设计，见表3；正交试验结果，见表4；正交试验结果及直观分析，见表5；方差分析，见表6。
表2三种生长刺激因子水平
表3三种生长刺激因子正交设计
| A索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清 | B环糊精 | C低聚半乳糖 | 空列 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 |
表4正交试验结果
| 组合 | 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h |
| 1 | 0 | 0.0417 | 0.2373 | 0.5467 | 0.6307 | 0.6500 | 0.6657 | 0.6540 |
| 2 | 0 | 0.0373 | 0.1663 | 0.4267 | 0.5623 | 0.5873 | 0.6100 | 0.6027 |
| 3 | 0 | 0.0403 | 0.1353 | 0.3537 | 0.5173 | 0.5523 | 0.5760 | 0.5743 |
| 4 | 0 | 0.0460 | 0.2233 | 0.5427 | 0.6293 | 0.6360 | 0.6503 | 0.6413 |
| 5 | 0 | 0.0430 | 0.1643 | 0.4380 | 0.5650 | 0.5783 | 0.6007 | 0.5963 |
| 6 | 0 | 0.0430 | 0.1907 | 0.4800 | 0.5823 | 0.5890 | 0.6033 | 0.6190 |
| 7 | 0 | 0.0457 | 0.2313 | 0.5060 | 0.6020 | 0.6280 | 0.6327 | 0.6353 |
| 8 | 0 | 0.0440 | 0.2277 | 0.5127 | 0.6200 | 0.6517 | 0.6510 | 0.6457 |
| 9 | 0 | 0.0370 | 0.1703 | 0.3993 | 0.5303 | 0.5688 | 0.5703 | 0.5817 |
表5正交试验结果及直观分析
表6方差分析
由表6可知环糊精是最显著因子，低聚半乳糖次之，索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清最差，且由表5中的K值可知，A因素第二个水平下的值最高，为0.6345；B因素第一个水平下的值最高，为0.6504；C因素第一个水平下的值最高，为0.6455。故理论上最佳的组合应为A2B1C1，但是由于索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清是影响最小的因素，故为了节约成本，索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清的水平可选1水平，即10g/L，故最后定为三种生长刺激因子正交试验的最佳水平为A1B1C1，即索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清为10g/L、环糊精为5g/L，低聚半乳糖为5g/L时，对细菌的生长促进效果最好。
2、以环糊精和低聚半乳糖组合进行正交试验。
环糊精和低聚半乳糖组合的正交设计，见表7；正交试验结果，见表8。
表7环糊精和低聚半乳糖组合的正交设计
| A环糊精 | B低聚半乳糖 | |
| 1 | 1 | 1 |
| 2 | 1 | 2 |
| 3 | 1 | 3 |
| 4 | 2 | 1 |
| 5 | 2 | 2 |
| 6 | 2 | 3 |
| 7 | 3 | 1 |
| 8 | 3 | 2 |
| 9 | 3 | 3 |
表8环糊精和低聚半乳糖组合结果
由表8可知，环糊精和低聚半乳糖组合下，最好的组合是第一组，此时环糊精为5g/L、低聚半乳糖为5g/L。
3、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合进行正交试验。
索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合的正交设计，见表9；正交试验结果，见表10。
表9索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合的正交设计
表10索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合结果
由表10可知，索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合下，最好的组合是第七组，此时环糊精为5g/L、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清为30g/L。
4、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合进行正交试验。
索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合的正交设计，见表11；正交试验结果，见表12。
表11索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合的正交设计
| A索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清 | B低聚半乳糖 | |
| 1 | 1 | 1 |
| 2 | 1 | 2 |
| 3 | 1 | 3 |
| 4 | 2 | 1 |
| 5 | 2 | 2 |
| 6 | 2 | 3 |
| 7 | 3 | 1 |
| 8 | 3 | 2 |
| 9 | 3 | 3 |
表12索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合结果
由表12可知，索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合下，最好的组合是第四组，此时低聚半乳糖为5g/L、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清为20g/L。
5、确定最优组合。
上述各组合的最优组合的比较结果，见表13。
表13各组合的最优组合比较结果
| 0 | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 | 84 | |
| 正交1 | 0.0000 | 0.0417 | 0.2373 | 0.5467 | 0.6307 | 0.6500 | 0.6657 | 0.6540 |
| H+半1 | 0.0000 | 0.0387 | 0.2090 | 0.5170 | 0.6260 | 0.6580 | 0.6523 | 0.6537 |
| S+H 7 | 0.0000 | 0.0457 | 0.2667 | 0.6477 | 0.6740 | 0.7100 | 0.7197 | 0.7027 |
| S+半4 | 0.0000 | 0.0497 | 0.2477 | 0.5840 | 0.6590 | 0.6940 | 0.6870 | 0.6630 |
| 1.5g/L | 0.0000 | 0.0500 | 0.1297 | 0.2500 | 0.3683 | 0.4400 | 0.4067 | 0.3800 |
| 2.5g/L | 0.0000 | 0.0500 | 0.1297 | 0.3140 | 0.4680 | 0.5400 | 0.5060 | 0.4700 |
其中，
正交1：指索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清、环糊精和低聚半乳糖组合的第一组；
H+半1：指环糊精和低聚半乳糖组合的第一组；
S+H 7：指索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合的第七组；
S+半：指索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和低聚半乳糖组合的第四组；
1.5g/L：指基础培养基中仅添加1.5g/L的低聚木糖的对照组；
2.5g/L：指基础培养基中仅添加2.5g/L的低聚木糖的对照组；
表13中通过比较每种组合下的最佳组合，可知最优组合是索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清和环糊精组合下的第七组，此时环糊精5g/L、索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清30g/L，因此将此组合作为最终筛选的生长刺激因子组合。
二、优化前后培养基的培养效果比较
一)细菌生长速度和菌液密度的比较
将实施例1制备的培养基(简称实验组培养基)和基础培养基(简称对照组培养基)分别进行阿克曼氏粘细菌的培养，培养前上述两种培养基用1mol/L的盐酸调节pH值至6.5，具体方法如下：
1、将对数期阿克曼氏粘细菌分别以4％的接菌量，即1mL菌液接入到25mL实验组培养基和对照组培养基中，37℃厌氧培养。
2、在培养过程中，每隔12h取样，检测菌液密度，菌液密度的测定采用多功能酶标仪测定600nm波长的吸光度值，检测后继续37℃厌氧培养，共测84h，所测OD600nm值见表14。
3、根据所测OD值绘制生长曲线，见图3。
表14优化前后培养基对应的OD600nm值
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 实验组培养基 | 0.0000 | 0.0457 | 0.2667 | 0.6477 | 0.6740 | 0.7100 | 0.7197 | 0.7027 |
| 对照组培养基 | 0.0000 | 0.0122 | 0.029 | 0.0402 | 0.0453 | 0.0512 | 0.0553 | 0.0582 |
由表14和图3可知，采用实验组培养基培养阿克曼氏粘细菌与对照组培养基培养阿克曼氏粘细菌相比，对照组培养基培养的细菌由对数期到平稳期为5-6天，而实验组培养基培养的细菌由对数期到平稳期为24-36h，因此细菌的生长速度由原来的5-6天降为24-36h，极大地缩短了培养时间，且菌液OD600nm值也由0.0697升到了0.7197，极大地促进了阿克曼氏粘细菌的生长。
二)菌落计数的比较
实验组培养基和对照组培养基培养的两种菌液样品分别按照下述菌落计数的测定方法进行实验测定，计算出两种菌液样品的菌落数，再以菌落形成单位的对数值为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长图。
菌落计数的测定方法参考GB 4789.2—2016，具体方法如下：
1、样品稀释
取1mL培养的菌液原液加入到无菌的9mL生理盐水中，制成1:10的样品匀液；再将1:10的样品匀液依次制备10倍系列稀释样品匀液，稀释倍数从101-107。
吸取100μL的样品匀液涂布于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，同时，分别吸取100μL的无菌生理盐水加入到两个无菌平皿中作空白对照。
2、培养
将涂布好的平皿翻转，放到37℃的培养箱中厌氧培养48h。
3、菌落计数
记录稀释倍数和相应的菌落数目。菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
4、计算
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：
式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；
d——稀释因子(第一稀释度)。
备注：因为每个平皿涂布的样品匀液是100μL，故最后计算的时候要乘以10才能表示每毫升样品中的菌落形成单位。
绘制出的生长图，如图4所示，图4表示随着培养时间的变化，两种培养基中细菌的生长情况。
通过比较实验组和对照组培养基菌落数的对数值，说明实验组培养基细菌的菌落数较对照组培养基细菌的菌落数提高10倍多，生长状况得到了明显的改善。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (2)
1.一种阿克曼氏粘细菌培养基，其特征在于，包括基础培养基和生长刺激因子，基础培养基为：
其中，
酸痕量溶液包括：
碱痕量溶液包括：
维生素溶液包括：
生长刺激因子为：
环糊精 5g/L
索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清 30g/L。
2.一种如权利要求1所述的阿克曼氏粘细菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向混合器中加入一定量的蒸馏水；
步骤二、将基础培养基的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤三、将生长刺激因子的各组分常温下添加到蒸馏水中进行混合；
步骤四、向混合器中添加蒸馏水至各组分达到设定的浓度。
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