CN115919734B - 一种共培养表皮葡萄球菌发酵液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共培养表皮葡萄球菌发酵液及其应用。本发明在添加了益生元成分的培养基中，接种表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285共同好氧培养，经过离心分离得到共培养发酵液；该发酵液能够促进角质形成细胞的增殖与迁移，在3D皮肤模型上能够促进β防御素的表达，具有改善皮肤生物屏障与生理屏障的作用，从而修复皮肤、增强皮肤防御力。

Description

一种共培养表皮葡萄球菌发酵液及其应用

技术领域

本发明涉及一种共培养表皮葡萄球菌发酵液及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

皮肤微生态是皮肤最外层的生物屏障，平衡的皮肤微生态对保护皮肤发挥着非常重要的作用。皮肤表面的菌群对维持皮肤微生态平衡和皮肤屏障功能至关重要。根据不同微生物在皮肤表面定植的时间长短，可将其分为常驻菌群与暂驻菌群。皮肤常驻菌群能够通过占位作用形成生物屏障，使致病菌及外籍菌无法立足于皮肤表面并产生抑制病原菌的化合物；还能分解皮脂甘油三酯为脂肪酸，形成乳化皮脂膜，既对自身及表皮角质形成细胞具有营养作用，又可防止皮表水分蒸发，促进免疫器官发育，增强机体免疫。

皮肤菌群的标志性细菌成员主要来自棒状杆菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属；标志性真菌成员主要是马拉色菌属。皮肤表面的不同菌属均发挥着不同的作用，特别是葡萄球菌属中的表皮葡萄球菌属，多项研究表明，该菌属对皮肤具有一定的有益作用。比如皮肤角质形成细胞可以感受到表皮葡萄球菌释放短链脂肪酸，调节自身生长速率和炎性反应，作用于伤口愈合；表皮葡萄菌属也参与适应性免疫的发展过程，帮助建立皮肤对包括表皮葡萄球菌在内的体表微生物耐受性。表皮葡萄球菌还可以产生丝氨酸蛋白酶ESP，抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。

皮肤表面的菌群之间相互影响，这些影响包含不同菌属之间的生长代谢以及不同代谢情况下对皮肤的作用等，因此，具有一定的群体效应。将分离出来的皮肤菌，进行单一培养，可发现该皮肤菌的生长代谢情况，同时可以在体外评价单一皮肤菌代谢物质对皮肤的功效作用。申请人之前申报的发明专利2022107046246中，自健康皮肤上分离到表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287和CCSM0285，其保藏编号分别为CCTCCNo.M2022779和CCTCC No.M 2022780。将上述两种表皮葡萄球菌分离鉴定后，进行单一培养并进行了其代谢产物对皮肤作用的评价，实验发现：表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285的发酵液上清对DPPH自由基具有良好清除活性，能降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量，CCSM0287的发酵液上清对透明质酸酶具有良好抑制作用，且能降低LPS刺激巨噬细胞产生的IL-6水平。但在体外将两株表皮葡萄球菌进行共同培养，并进行代谢产物的研究还未有报道。

益生元，包括多元醇类、多糖类以及富含多糖类的植物提取物成分，对人类健康具有积极的作用，能够促进微生物的生长。不同种类的微生物对益生元的利用不同，针对性的选择益生元可以用来研究其对皮肤微生物的作用影响。

因此，申请人在单一表皮葡萄球菌培养基基础上，添加一定量的益生元成分，将两株表皮葡萄球菌进行共培养，获得表皮葡萄球菌共培养发酵液，经过评价该共培养发酵液，其能够促进角质形成细胞的增殖与迁移、同时促进β防御素的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种共培养表皮葡萄球菌发酵液及其应用。本发明在NB液体培养基中添加一定的益生元成分，接入两株表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285进行共培养，经过离心分离得到共培养发酵液；该发酵液能够促进角质形成细胞的增殖与迁移，在3D皮肤模型上能够促进β防御素的表达，具有改善皮肤生物屏障与生理屏障的作用，从而修复皮肤、增强皮肤防御力。

本发明的技术方案是：一种共培养表皮葡萄球菌发酵液，其特征是，在添加了益生元成分的NB培养基中，接种表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285共同好氧培养12-20h后，将发酵液离心，滤膜过滤，得到表皮葡萄球菌共培养的发酵液。

上述益生元成分为多元醇、多糖类以及富含多糖的植物提取物成分。优选的，益生元成分为甘油、丁二醇、低聚果糖、燕麦β-葡聚糖、鼠李糖、果寡糖、海藻糖、松茸多糖等中的一种或几种，更优选为甘油和燕麦β-葡聚糖。

优选的，在NB培养基中添加的益生元成分的用量为0.2-5.0％。

其制备方法具体包括以下步骤：

1)将活化后的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287、CCSM0285菌株挑取单菌落分别接种于TSB液体培养基中，置于30～40℃摇床中，振荡培养12～20h，测定发酵液的OD₆₀₀值，调整菌体OD₆₀₀值为0.9～1.1，作为种子液；

2)分别以体积比0.3％～2.5％的接种量将两株菌的种子液共同接种于含有益生元的NB液体培养基中，30～40℃摇床中，振荡培养12～20h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将发酵液离心，滤膜过滤，得到表皮葡萄球菌共培养的发酵液。

上述表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287和CCSM0285，已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号分别为CCTCCNo.M2022779和CCTCC No.M 2022780(见发明专利2022107046246)。

本发明还提供了上述的共培养表皮葡萄球菌发酵液在促进角质形成细胞的增殖与迁移，在3D皮肤模型上促进β防御素的表达，进而改善皮肤生物屏障与生理屏障，修复皮肤、增强皮肤防御力、抗衰老方面的应用。

本发明的技术效果是：

1.与现有的单一表皮葡萄球菌培养相比，本发明提供了一种两株表皮葡萄球菌共培养发酵液，且特别筛选了益生元成分添加到培养基中进行两株表皮葡萄球菌的培养。

2.本发明制备的共培养表皮葡萄球菌发酵液，具有较好的修复效果，能够促进角质形成细胞的增殖，在添加量1.0％的条件下，细胞增殖率达到118.43％，且共培养发酵液的细胞增殖率显著优于0287发酵液和0285发酵液；相比较于BC组，在作用24h、48h后1.0％的共培养发酵液显著促进角质形成细胞的迁移，且优于PC组；在3D皮肤模型上能够β防御素(HBD1、HBD2)的表达，与BC组相比，2％的发酵液使β防御素HBD1、HBD2蛋白含量显著上升，提升率分别为42％、38％。

3.制备该发酵液的两株菌株来源于健康皮肤，经过发酵富集能够获取表皮葡萄球菌的有益代谢产物，这些代谢产物对皮肤微生物屏障、生理屏障具有较好的修复作用。

与此同时，两株表皮葡萄球菌的共培养初步模拟了在皮肤上多种菌群存在的情况，以及在共培养情况下菌体代谢产物对皮肤的影响，为后续研究多种皮肤菌群共培养奠定了基础，也为深入研究皮肤菌群对皮肤的影响提供研究方法。

附图说明

图1为不同样品在不同浓度下对角质形成细胞增殖率的影响；

图2为不同样品在不同浓度下对角质形成细胞迁移的影响；

图3为不同样品对3D皮肤模型角质层的影响；

图4为不同样品对HBD1蛋白染色结果；

图5为不同样品对HBD2蛋白染色结果；

图6为不同样品对HBD1蛋白含量的影响；

图7为不同样品对HBD2蛋白含量的影响。

具体实施方式

下面通过实施例和附图来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和实验条件，或按照商品说明书进行选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

胰酪大豆胨液体培养基(TSB)：胰蛋白胨17.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，121℃高压灭菌15min，备用。

基础培养基(NB培养基)：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，121℃高压灭菌15min，备用。

本发明中共培养的两株表皮葡萄球菌为CCSM0287和CCSM0285，已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号分别为CCTCC No.M 2022779和CCTCC No.M 2022780(见发明专利2022107046246)。

实施例1：共培养培养基及种子液的制备

共培养培养基：在1000ml的NB培养基基础上，依次添加25ml甘油、10g燕麦β-葡聚糖，震荡混匀，形成菌株共培养的培养基。

种子液：将表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285分别接种到TSB培养基中，37℃摇床振荡培养16-20h，测定种子液的OD₆₀₀，调整到OD₆₀₀＝1.0，分别作为两株菌的种子液。

实施例2：表皮葡萄球菌CCSM0287、0285单一发酵液以及共培养发酵液的制备

表皮葡萄球菌CCSM0287、0285单一发酵液的制备：在两个50mL离心管中分别添加30mL制备的共培养培养基，将两株菌的种子液各200μL，接种于两个培养基中，离心管摇床160r/min培养20h后取出，并测定培养液OD₆₀₀；分别将发酵液8000r/min离心，0.22μm滤膜过滤，得到表皮葡萄球菌CCSM0287、0285单一发酵液。

共培养发酵液的制备：在50mL离心管中添加30mL制备的共培养培养基，接种表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285各100μL，离心管摇床160r/min培养20h后取出，并测定培养液OD₆₀₀；将发酵液8000r/min离心，0.22μm滤膜过滤，得到表皮葡萄球菌共培养的发酵液。20h后不同菌株培养液的OD₆₀₀如表1所示。

表1 20h后不同菌株培养液的OD₆₀₀

实施例3：共培养发酵液对角质形成细胞的促增殖作用

将处于对数生长期的HaCaT细胞以3×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，于37℃，CO₂培养箱培养24h，加入不同测试样品(用10％FBS的DMEM培养液配成0.5％、1.0％浓度(质量浓度)的NB培养基样品、NB+益生元样品(2.5％甘油、1％燕麦β-葡聚糖)、0287发酵液、0285发酵液和共培养发酵液样品)来处理细胞24h，采用CCK-8方法检测修复乳液对细胞增殖的影响(图1)，同时采用DMSO配制的3.0％样品溶液作为对照，图1中CT为不加任何样品的对照组。从图1结果可以看出，0.5％、1.0％的共培养发酵液能够显著促进角质形成细胞的增殖(p<0.01)，在添加量1.0％的条件下，细胞增殖率达到118.43％，且共培养发酵液的细胞增殖率显著优于0287发酵液和0285发酵液。

实施例4：共培养发酵液促进角质形成细胞迁移

按每孔3×10⁵/ml的细胞密度将HaCaT细胞接种于6孔板，24h后更换含0.1％血清的培养基(DMEM高糖培养基)，板中的细胞贴壁约90％以上，使用细胞划痕器进行细胞划痕，用0.1％FBS的DMEM高糖培养基(阴性对照)、PC组(0.1％FBS的DMEM高糖培养基配制成1μg/mLEGF)、1.0％的共培养发酵液组(0.1％FBS的DMEM高糖培养基配制成1.0wt％共培养发酵液组)处理划痕，并继续培养，分别在24h、48h培养时间后，显微镜下观察、测量并照相比较(图2)。从图2中可以看出，与阴性对照(BC组)相比较，1.0％的共培养发酵液组在24h、48h均能够显著促进角质形成细胞的迁移，且要优于PC组。

实施例5：共培养发酵液促进β防御素的表达

将3D表皮皮肤模型(

)培养于6孔板中，提前添加0.9mL相应分组的EpiGrowth培养液，备用。设置两个组，一组用于HBD1、HBD2的免疫组化检测，一组用于组织形态检测。

组织形态检测组在表面添加阳性对照组(PC组选用WY14643(PPAR激活剂)50μM)、共培养发酵液(2wt％，用PBS缓冲液配制成2％的浓度)各25μL于6孔板中，置于CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育24h，BC组不给药。孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。取用于组织形态检测的模型一组，用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，将模型环切取下，进行H&E染色检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。组织形态检测结果图3显示，与BC组相比，PC组模型组织形态没有明显变化；共培养发酵液给药组模型角质层有增厚现象。

免疫组检测组，在表面添加阳性对照组(PC组选用1,25-二羟基维生素D3浓度为0.5μg/mL)、共培养发酵液(2wt％，用PBS缓冲液配制成2％的浓度)各25μL于6孔板中，置于CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育24h，BC组不给药。孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。进行免疫荧光染色，采集图片(图4、图5)，并收集HBD1、HBD2积分光密度(IOD)值分析(图6、图7)。从图4和图5可以看出：相对于BC组，共培养发酵液作用于表皮模型上，经染色结果显示，HBD1、HBD2蛋白含量较高(染色为棕色部分，在黑白图中为深灰色)。从图6和图7可以看出：与BC组相比，共培养发酵液作用于模型上的HBD1、HBD2蛋白含量显著上升，提升率分别为42％、38％。

Claims (3)

1.一种共培养表皮葡萄球菌发酵液，其特征是，

1)将活化后的表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285菌株挑取单菌落分别接种于TSB液体培养基中，置于30～40℃摇床中，振荡培养12～20h，测定发酵液的OD₆₀₀值，调整菌体OD₆₀₀值为0.9～1.1，作为种子液；

2)分别以体积比0.3％～2.5％的接种量将两株菌的种子液共同接种于含有益生元的NB液体培养基中，30～40℃摇床中，振荡好氧培养12-20h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将发酵液离心，滤膜过滤，得到表皮葡萄球菌共培养的发酵液；

所述益生元成分为甘油、丁二醇、低聚果糖、燕麦β-葡聚糖、鼠李糖、果寡糖、海藻糖和松茸多糖中的一种或几种；

所述在NB培养基中添加的益生元成分的用量为0.2-5.0％。

2.权利要求1所述的共培养表皮葡萄球菌发酵液在制备修复皮肤、增强皮肤防御力、抗衰老的护肤品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述修复皮肤、增强皮肤防御力和抗衰老是通过促进角质形成细胞的增殖与迁移，促进β防御素的表达来实现的。

Images