CN114350563A - 一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌 - Google Patents

一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌。本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌，该表皮葡萄球菌能够恢复皮肤屏障，并且，该菌株具有抗菌、保湿、抗炎、抗氧化等功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。

Description

一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌。
背景技术
广义的皮肤屏障包括物理屏障、色素屏障、神经屏障、免疫屏障。狭义的皮肤屏障主要指物理性屏障，通常所述的皮肤屏障是指物理屏障。皮肤的物理性屏障由皮脂膜和角质层组成。皮脂膜主要由皮脂腺分泌的油脂，角质层细胞产生的脂质和小汗腺分泌的汗液乳化组成，角质层是表皮最外层的部分，主要由10～20层扁平、没有细胞核的死亡细胞组成。皮肤屏障能够抵御外界有害、刺激物、日光进入，同时具有保湿及调节抗炎作用。皮肤物理屏障受损将引起皮肤干燥、皮肤老化、色素沉着、异位性皮炎、湿疹、银屑病、鱼鳞病、日光性皮炎等皮疾病。
研究发现，中间丝相关蛋白(filaggrin，FLG)、紧密连接蛋白I(claudin-1,CLDN1)、角质层糜蛋白酶(human tissue kalikreins7，KLK7)、肥大细胞糜蛋白酶(mastcell chymase，CMA1/MCC)。SPINK5和胱胺蛋白(cystatin A，CSTA)等皮肤屏障相关基因的突变，均可导致皮肤屏障功能缺陷、从而导致特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)、哮喘等特应性疾病时发生。而抑制这些皮肤屏障功能相关基因的表达，则能够恢复皮肤屏障，改善皮肤状态。目前，尚未见到与修复这些皮肤屏障相关基因的菌株的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌。
本发明提供的表皮葡萄球菌的保藏编号为CCTCC NO:M20211390。
本发明还提供了所述表皮葡萄球菌在制备恢复皮肤屏障的产品中的应用。
本发明中，所述恢复皮肤屏障包括修复皮肤细胞和/或上调屏障修复相关基因水平。
本发明中，所述修复皮肤细胞包括在SDS诱导条件下保护皮肤细胞的存活率。一些实施例中，所述皮肤细胞为角质形成细胞。
本发明中，所述屏障修复相关基因为表皮细胞的屏障修复相关基因。一些具体实施例中，所述屏障修复相关基因包括FLG、IVL、LOR和/或OVOL1中至少一种。
本发明还提供了所述的表皮葡萄球菌在制备抑制有害菌生长和/或促进有益菌增殖的产品中的应用。
一些实施例中，所述有害菌包括金黄色葡萄球菌、变异链球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和/或铜绿假单胞菌中至少一种。
一些实施例中，所述有益菌包括表皮葡萄球菌。
本发明中，所述的表皮葡萄球菌在制备抗炎和/或抗氧化产品中的应用。
本发明中，所述抗炎包括下调炎症因子IL-8和/或NO的水平。
一些实施例中，所述抗炎是抗由LPS诱导的炎症。具体的，是抗由LPS诱导的表皮细胞的炎症。所述表皮细胞为角质形成细胞。
本发明中，所述抗氧化包括清除羟自由基和/或ABTS自由基。
本发明中，所述保湿包括上调保湿相关基因水平。
本发明还提供了所述的表皮葡萄球菌在保湿的产品中的应用。
本发明中，所述产品为药物和/或化妆品，其为外用制剂。
本发明中，所述保湿包括上调保湿相关基因水平。一些实施例中，所述保湿相关基因包括AQP3。具体的，所述保湿基因为表皮细胞的保湿相关基因。所述表皮细胞为角质形成细胞。
本发明还提供了一种药物和/或化妆品，其原料包括本发明所述的表皮葡萄球菌。
一些实施例中，本发明所述药物和/或化妆品中包括如下i)～iv)中至少一种：
i)、保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌的活菌；
ii)、灭活的保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌；
iii)、保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌的培养物；
iv)、保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌的提取物。
本发明中，所述培养物包括培养获得的培养液，或者所述培养液经分离获得的上清液或菌体，或培养液经细胞破碎后获得的悬浮液。
本发明中，所述的提取物包括对培养物提取获得的多糖、蛋白或其他次生代谢产物。
本发明还提供了一种护肤的方法，其为给予本发明所述的护肤的产品。
本发明中，所述护肤方法中，所述给予的方式包括喷雾、涂抹、贴敷和/或导入。
本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌，该表皮葡萄球菌能够恢复皮肤屏障，并且，该菌株具有抗菌、保湿、抗炎、抗氧化等功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。
生物保藏证明
表皮葡萄球菌ProfMIC-202Staphylococcus epidermidis ProfMIC-202，于2021年11月08日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20211390。
附图说明
图1示ProfMIC-202病原菌抑菌率图；
图2示ProfMIC-202降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO释放；
图3示ProfMIC-202下调炎症因子IL-8表达量；
图4示ProfMIC-202促进HaCaT细胞损伤修复；
图5示ProfMIC-202上清液上调屏障修护相关基因表达；
图6示ProfMIC-202灭活菌体上调屏障修护相关基因表达；
图7示ProfMIC-202上调保湿相关基因的表达；
图8示ProfMIC-202清除自由基能力。
具体实施方式
本发明提供了一株修复皮肤屏障的表皮葡萄球菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
表皮葡萄球菌存在于几乎所有健康人的体表，是正常皮肤表面绝对优势常驻菌，从脸部、手脚到躯干，甚至鼻道，都能发现它们的踪迹。它们帮助宿主的免疫系统发育成熟，是健康皮肤菌群的重要成员。本发明从健康成人面部皮肤中分离鉴定的新表皮葡萄球菌ProfMIC-202，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC NO:M20211390。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈球状；在BHI平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在肉汤液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
研究表明，本发明提供的表皮葡萄球菌具有修复皮肤屏障的功能，同时具有抑菌、保湿、抗炎、抗氧化等功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。
进一步的，本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M 20211348的表皮葡萄球菌在应用中的存在形式为存活的或灭活的，为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，本发明实施例中，以保藏编号为CCTCC NO:M20211390的表皮葡萄球菌的培养上清液、菌体或灭活菌体为受试物进行实验验证。
本发明的ProfMIC-202经16S rRNA鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
ProfMIC-202具有促进细胞修复因子外皮蛋白IVL(involucrin)、丝聚合蛋白FLG(Filaggrin)、兜甲蛋白LOR(loricrin)、Ovo样转录因子1,OVOL1(ovoliketranscriptional repressor 1)等基因表达的作用，促进基因表达量1.1～3.8倍。
体外抑菌试验表明,本发明的表皮葡萄球菌ProfMIC-202具有抑制金黄色葡萄球菌、变异链球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌等病原菌生长的作用，抑菌率10％～52％。
体外抑菌试验表明,本发明的表皮葡萄球菌ProfMIC-202具有促进表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260增殖的作用，促进率10％～26％。
体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌ProfMIC-202具有抗炎作用，能够降低金葡诱导的HaCaT炎性因子IL-8表达量，与对照相比可降低15％～32％；能够降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO释放量，与对照组比可降低12％～33％；
体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌ProfMIC-202具有促进表皮细胞修复的作用，ProfMIC-202提升SDS损伤的HaCaT细胞存活率5％～22％。
ProfMIC-202具有促进保湿因子水通道蛋白3,AQP3(aquaporin 3)基因表达量的作用，上调AQP3表达1.8-3.5倍。
本发明中，所述药物为外用制剂，其剂型包括溶液剂、洗剂、乳剂、粉剂、软膏、糊剂。其中，所述洗剂包括水粉剂或混悬剂。
本发明中，所述化妆品可分为：清洁类化妆品、护理类化妆品及美容/修饰类化妆品。所述清洁类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到清洁卫生作用或消除不良气味的化妆品。所述护理类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到保养作用的化妆品。所述美容/修饰类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到美容、修饰、增加人体魅力作用的化妆品。
皮肤适用的清洁类化妆品包括：洗面奶、卸妆水(乳)、清洁霜(蜜)、面膜、花露水、痒子粉、爽身粉或浴液；皮肤适用的护理类化妆品包括护肤膏霜、乳液或化妆水；皮肤适用的美容/修饰类化妆品包括：粉饼、胭脂、眼影、眼线笔(液)、眉笔、香水或古龙水；毛发适用清洁类化妆品包括洗发液、洗发膏或剃须膏；毛发适用的护理类化妆品包括护发素、发乳、发油/发蜡或焗油膏；毛发适用的美容/修饰类化妆品包括：定型摩丝/发胶、染发剂、烫发剂、睫毛液(膏)、生发剂或脱毛剂；指甲适用的清洁类化妆品包括洗甲液；指甲适用的护理类化妆品包括护甲水(霜)、指甲硬化剂；指甲适用的美容/修饰类化妆品包括指甲油；口唇适用的清洁类化妆品包括唇部卸妆液；口唇适用的护理类化妆品包括润唇膏；口唇适用的及美容/修饰类化妆品包括：唇膏、唇彩或唇线笔。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：ProfMIC-202菌株的分离
将无菌棉签蘸取生理盐水于健康成年人面部皮肤采样。剪取棉签头于10ml生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI平板，37℃恒温培养24～48h后，挑取白色反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-202。
革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-202为G+，显微镜下呈球状，无芽孢，无鞭毛；在BHI平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在肉汤液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2：ProfMIC-202菌株的核酸鉴定
1、16s rRNA基因序列分析：
挑取单菌落置BHI离心管中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15sec，57℃15sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min。
3、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较后得出ProfMIC-202菌株为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
实施例3：ProfMIC-202菌株致病菌抑菌实验-菌液浓度变化
1.表皮葡萄球菌ProfMIC-202菌液制备：
将活化的表皮葡萄球菌ProfMIC-202菌液以BHI液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测并调整OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得待测样品。
2、病原菌菌液制备：
将病原菌以BHI培养基37℃培养18h，检测OD600测定菌数，调整病原菌菌液浓度为1×108cells/mL。
3、抑制病原菌实验
将待测样品以10％体积分数加入病原菌中，37℃培养2h，以菌液浓度(OD600)降低百分比评价对病原菌生长影响。
4、结果如表1
表1 ProfMIC-202病原菌抑菌率
致病菌名称 平行1 平行2 平行3 抑菌率(％)
金黄色葡萄球菌 15.4 11.2 13.7 13.4
变异链球菌 16.7 15.1 12.9 14.9
人葡萄球菌 14.3 11.2 12.9 12.8
溶血葡萄球菌 13.3 10.9 12.1 12.1
痤疮丙酸杆菌 20.1 18.2 18.4 18.9
铜绿假单孢菌 52.5 45.6 43.5 47.2
结果显示ProfMIC-202对金黄色葡萄球菌、变异链球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞杆菌均具有抑制作用。ProfMIC-202病原菌抑菌率结果见图1。
实施例4：ProfMIC-202促进表皮葡萄球菌生长实验
将活化的表皮葡萄球菌ProfMIC-202菌液以BHI液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测OD600测定菌数，调整OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清，0.22μm滤膜过滤得灭活上清液。
灭活上清液以10％体积分数加入初始OD600＝0.2的表皮葡萄球菌(模式菌株CGMCC1.4260)菌液中，37℃静置2h，以相对菌液浓度(样品OD600与对照比值)评价ProfMIC-202对表皮葡萄球菌生长的影响。结果如表2：
表2 ProfMIC-202促进表皮葡萄球菌增殖(％)
Figure BDA0003474164930000071
结果显示，ProfMIC-202灭活上清液对表皮葡萄球菌CGMCC 1.4260生长具有促进作用。
实施例5：ProfMIC-202降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO释放实验
1、表皮葡萄球菌样品制备
将表皮葡萄球菌ProfMIC-202用BHI培养基培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至1×108cells/mL，离心后，菌体用1×PBS重悬后121℃高压灭菌30min得灭活菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得上清液。
2、细胞制备
将Raw264.7细胞消化后，以每孔2×105cells/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、ProfMIC-202添加及LPS刺激
实验分为三组，
LPS对照组：受试细胞中不添加ProfMIC-202成分，
受试组1：受试细胞中添加ProfMIC-202上清液5％(体积分数)；
受试组2：受试细胞中添加ProfMIC-202灭活菌体10％(质量分数)。
将各组细胞于55％二氧化碳培养箱37℃孵育2h，然后每孔加入100ngLPS诱导Raw264.7发炎，20h后取细胞培养上清，用NO含量检测试剂盒检测NO含量，共进行三批实验，每次3个复孔。
表3 ProfMIC-202降低Raw264.7细胞NO释放量
组别 平行1 平行2 平行3 NO抑制率(％)
ProfMIC-202上清液 27.74 23.83 17.28 22.95
ProfMIC-202灭活菌体 14.54 14.22 13.23 14.00
结果：与LPS对照组相比，ProfMIC-202发酵清液NO抑制率22.95％；灭活菌体NO抑制率14.0％。ProfMIC-202降低Raw264.7细胞NO释放量结果见图2。
实施例6：ProfMIC-202降低金黄色葡萄球菌诱导的HaCaT炎症因子IL-8表达量
1、表皮葡萄球菌ProfMIC-202样品制备
将表皮葡萄球菌ProfMIC-202用BHI培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至1×108cells/mL，离心后，菌体121℃高压灭菌30min得菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得上清液。
2、细胞制备
将HaCat细胞消化后以4×105cells/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、金黄色葡萄球菌制备及添加
金黄色葡萄球菌接入肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用MEM无血清培养基调整菌液浓度至3×109cells/mL，每孔100μl添加入培养过夜的HaCat细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，PBS清洗5次，每孔重新加入1mlMEM无血清培养基。
4、ProfMIC-202样品添加
将上清液液5％加入金黄色葡萄球菌刺激过的HaCaT细胞中，每组3个复孔，培养过夜，实验另设不添加ProfMIC-202成分的对照组。
5、检测炎症因子IL-8表达量
将上述HaCaT细胞弃去培养基后，用RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1000ng进行反转录及qPCR。结果如表4：
表4 ProfMIC-202下调炎症因子IL-8的表达
Figure BDA0003474164930000091
表葡萄球菌能够降低金葡诱导的HaCaT炎性因子IL-8表达量下调，本发明的表葡萄球菌ProfMIC-202具有抗炎作用。ProfMIC-202下调炎症因子IL-8的表达见图3。
实施例7：ProfMIC-202促进HaCaT细胞损伤修复实验
接种HaCaT细胞(5×105cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，孵育8h。
实验分为三组，对照组不添加含有ProfMIC-202的成分，受试组1加入5vol％ProfMIC-202的灭活上清液，受试组2加入10wt％ProfMIC-202的灭活菌体。
然后各组继续孵育24h。加入10μlCCK-8溶液，孵育4h，检测450nm处吸光值。
细胞存活率＝(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)。
结果如表5：
表5 ProfMIC-202促进HaCaT细胞修复
Figure BDA0003474164930000101
结果表明，ProfMIC-202对HaCaT细胞SDS损伤具有修复作用。ProfMIC-202促进HaCaT细胞修复结果见图4。
实施例8：ProfMIC-202促进HaCaT屏障修复相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT细胞(5×105cells/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验分为三组，control的孔中不加入受试物，受试组1的细胞中加入ProfMIC-202菌株上清液5vol％，受试组2加入灭活菌体10wt％。各组分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，并反转录为cDNA，进行qPCR检测修复相关基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
公式：F＝2-ΔΔCT
结果如表6～7：
表6 ProfMIC-202上清液上调修复基因的表达
Figure BDA0003474164930000102
表7 ProfMIC-202灭活菌体上调修复基因的表达
Figure BDA0003474164930000103
结果显示加入表皮葡萄球菌ProfMIC-202后，可上调修护相关基因的表达，具有促进皮肤屏障修护的作用。ProfMIC-202上调修复基因的表达结果见图5、图6。
实施例9：ProfMIC-202促进HaCaT保湿基因AQP3表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT细胞cells/mL至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验分为二组，control的孔中不加入受试物受试组加入灭活菌体10wt％。各组分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，并反转为cDNA，进行qPCR检测水通道蛋白AQP3的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
公式：F＝2^(-ΔΔCT)
结果如表8：
表8 ProfMIC-202上调保湿基因AQP3的表达
Figure BDA0003474164930000111
结果显示加入ProfMIC-202灭活菌体孵育后，保湿相关基因水通道蛋白AQP3基因表达上调，因此ProfMIC-202具有保湿的作用。ProfMIC-202上调保湿基因AQP3的表达结果见图7。
实施例10 ProfMIC-202自由基清除能力检测
1.表皮葡萄球菌ProfMIC-202菌液制备：
将活化的表皮葡萄球菌ProfMIC-202菌液以BHI液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测并调整OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤获得待测样品。
2.羟自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸光度，求平均值并计算各样品清除率，公式如下：
羟自由基清除率 D％＝[(A测定-A对照)÷(A空白-A对照)]×100％
3.ABTS自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品405nm吸光度，求平均值并计算各样品清除率，公式如下：
ABTS自由基清除率D％＝[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白×100％
结果如表9：
表9 ProfMIC-202自由基清除率(％)
组别 平行1 平行2 平行3 平均值
羟自由基 16.00 18.35 16.24 16.86
ABTS自由基 21.77 23.37 22.39 22.51
结果显示，ProfMIC-202对羟自由基、ABTS自由基均具有清除作用，因此ProfMIC-202具有抗氧化的功效。ProfMIC-202清除自由基结果见图8。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株表皮葡萄球菌，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M20211390。
2.权利要求1所述表皮葡萄球菌在制备恢复皮肤屏障的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述恢复皮肤屏障包括修复皮肤细胞和/或上调屏障修复相关基因水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述皮肤细胞为角质形成细胞；所述屏障修复相关基因包括FLG、IVL、LOR和/或OVOL1中至少一种。
5.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在制备抑制有害菌生长和/或促进有益菌增殖的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有害菌包括金黄色葡萄球菌、变异链球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和/或铜绿假单胞菌中至少一种；所述有益菌包括表皮葡萄球菌。
7.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在制备抗炎和/或抗氧化产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括下调炎症因子IL-8和/或NO的水平；所述抗氧化包括清除羟自由基和/或ABTS自由基。
9.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在保湿的产品中的应用。
10.一种药物和/或化妆品，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的表皮葡萄球菌。
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