CN114369553A - 一株抗炎的表皮葡萄球菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株抗炎的表皮葡萄球菌。本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌，该表皮葡萄球菌具有抗炎、抑菌的作用，并且，该菌株具有抗氧化、保湿和/或修复皮肤屏障的功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。

Description

一株抗炎的表皮葡萄球菌

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株抗炎的表皮葡萄球菌。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官对机体存在重要的保护作用，不仅能够阻挡异物和病原的如前，也可防止体内组织液的丢失。皮肤是炎症疾病频发的位点，引起皮肤炎症的原因很多，任何能够引起组织损伤的因素都可以作为炎症的原因，例如，过敏原引起的变态反应，病原微生物引发的皮肤炎症，高温、低温、外伤等其他物理因素导致皮肤损伤引起的炎症。此外，内源性毒性物质、腐蚀性化学物质等也可能造成皮肤的炎症。以青春痘为例，青春期毛囊皮脂腺排出大量皮脂，如果遇到毛孔堵塞的现象，皮脂形成的厌氧环境使得痤疮丙酸杆菌大量生长，激活皮肤的免疫反应，导致痤疮。

在皮肤收到刺激时，角质细胞和成纤维细胞会产生多种参与炎症反应、调节免疫功能的细胞因子。通常情况下，机体修复过程中，炎症反应是必不可少且有所裨益的，但过分的炎症反应会对机体造成严重影响，甚至加深损害。因此需要给予抗炎药物，以避免过分炎症反应对机体造成的损伤。

现有技术中，对于过敏原引起的皮肤炎症主要给予糖皮质激素类药物或抗组胺药物，对于病原微生物造成的皮肤炎症，主要给予抗毒防腐药物、抗病原菌或抗病毒的药物，例如，给与抗生素类的药物。但这些药物大多对皮肤存在一定的刺激作用，在修复炎症部位的损伤的同时，也对其他健康组织起到不利的影响。而如何在抗炎的同时，保护其他皮肤组织仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株抗炎的表皮葡萄球菌。

本发明提供了一株表皮葡萄球菌，其保藏编号为CCTCC NO:M20211392。

本发明还提供了所述表皮葡萄球菌在制备抗炎的产品中的应用。

本发明中，所述抗炎包括降低炎性因子水平。一些实施例中，所述炎性因子包括IL-8、L-2和/或NO。一些具体实施例中，所述抗炎是抗由LPS诱导的炎症。具体的，是抗由LPS诱导的表皮细胞的炎症。所述表皮细胞为角质形成细胞。

本发明还提供了所述的表皮葡萄球菌在制备抑菌的产品中的应用。

本发明中，所述抑菌包括抑制金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和/或铜绿假单胞菌中至少一种。

本发明还提供了所述的表皮葡萄球菌在制备抗氧化、保湿和/或修复皮肤屏障产品中的应用。

本发明中，所述抗氧化包括清除羟自由基和/或ABTS自由基。

本发明中，所述保湿包括上调保湿相关基因水平。一些实施例中，所述保湿相关基因包括AQP3。具体的，所述保湿基因为表皮细胞的保湿相关基因。所述表皮细胞为角质形成细胞。

本发明中，所述修复皮肤屏障包括修复皮肤细胞和/或上调屏障修复相关基因水平。

本发明中，所述修复皮肤细胞包括在SDS诱导条件下保护皮肤细胞的存活率。一些实施例中，所述皮肤细胞为角质形成细胞。

本发明中，所述屏障修复相关基因为表皮细胞的屏障修复相关基因。一些具体实施例中，所述屏障修复相关基因包括FLG、IVL、LOR和/或OVOL1中至少一种。

本发明还提供了一种药物和/或化妆品，其原料包括本发明所述的表皮葡萄球菌。

一些实施例中，本发明所述药物和/或化妆品中包括如下i)～iv)中至少一种：

i)、保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌的活菌；

ii)、灭活的保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌；

iii)、保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌的培养物；

iv)、保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌的提取物。

本发明中，所述培养物包括培养获得的培养液，或者所述培养液经分离获得的上清液或菌体，或培养液经细胞破碎后获得的悬浮液。

本发明中，所述的提取物包括对培养物提取获得的多糖、蛋白或其他次生代谢产物。

本发明还提供了一种护肤的方法，其为给予本发明所述的护肤的产品。

本发明中，所述护肤方法中，所述给予的方式包括喷雾、涂抹、贴敷和/或导入。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌，该表皮葡萄球菌具有抗炎、抑菌的作用，并且，该菌株具有抗氧化、保湿和/或修复皮肤屏障的功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。

生物保藏证明

表皮葡萄球菌GforU-2Staphylococcus epidermidis GforU-2，于2021年11月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20211392。

附图说明

图1示GforU-2抑制病原菌菌液浓度变化图；

图2示GforU-2降低Raw264.7细胞NO释放量；

图3示GforU-2下调炎症因子基因表达量；

图4示GforU-2促进HaCaT细胞损伤修复；

图5示GforU-2上清液上调屏障修护相关基因表达；

图6示GforU-2灭活菌体上调屏障修护相关基因表达；

图7示GforU-2上调保湿相关基因AQP3的表达；

图8示GforU-2清除自由基能力。

具体实施方式

本发明提供了一株抗炎的表皮葡萄球菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

表皮葡萄球菌存在于几乎所有健康人的体表，是正常皮肤表面绝对优势常驻菌，从脸部、手脚到躯干，甚至鼻道，都能发现它们的踪迹。它们帮助宿主的免疫系统发育成熟，是健康皮肤菌群的重要成员。本发明提供的表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcusepidermidis)GforU-2，来源于健康幼儿面部皮肤，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211392。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈球状，无芽孢，无鞭毛；在BHI平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在肉汤液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

研究表明，本发明提供的表皮葡萄球菌具有抗炎、抑菌的作用，此外还具有具有修复、保湿、抗氧化等功能，在医药品、化妆品等领域拥有极大应用潜力。

进一步的，本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌在应用中的存在形式为存活的或灭活的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式。所述衍生物形式包括但不限于：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁或其相关成分、胞外多糖、或含有免疫原性成分的化合物。本发明实施例中，以保藏编号为CCTCC NO:M20211392的表皮葡萄球菌的培养上清液、菌体或灭活菌体为受试物进行实验验证。

体外抑菌试验表明,本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有抑制金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌等病原菌生长的作用，抑菌率11％-32％

本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有清除羟自由基、ABTS自由基的作用，清除率15％-23％；总抗氧化能力与对照比相比提高了5％-24％。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有抗炎作用，能够降低金葡诱导的HaCaT炎性因子IL-1α表达量，与对照相比可降低39％-58％；IL-8表达量，与对照相比可降低12％-24.5％；能够降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO释放量，与对照组比可降低10％-32.5％。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有促进表皮细胞修复的作用，GforU-2提升SDS损伤的HaCaT细胞存活率10％～28％，增加了2％-25％。GforU-2具有上调丝聚合蛋白FLG(filaggrin)、兜甲蛋白LOR(loricrin)、Ovo样转录因子1,OVOL1(OvoLike Transcriptional Repressor 1)表达的作用，上调基因表达量1.1-3.8倍。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有上调保湿因子水通道蛋白3,AQP3(Aquaporin 3)表达的作用，上调基因表达量1.3-1.8倍。

本发明中，所述药物为外用制剂，其剂型包括溶液剂、洗剂、乳剂、粉剂、软膏、糊剂。其中，所述洗剂包括水粉剂或混悬剂。

本发明中，所述化妆品可分为：清洁类化妆品、护理类化妆品及美容/修饰类化妆品。所述清洁类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到清洁卫生作用或消除不良气味的化妆品。所述护理类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到保养作用的化妆品。所述美容/修饰类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法，施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等)，起到美容、修饰、增加人体魅力作用的化妆品。

皮肤适用的清洁类化妆品包括：洗面奶、卸妆水(乳)、清洁霜(蜜)、面膜、花露水、痒子粉、爽身粉或浴液；皮肤适用的护理类化妆品包括护肤膏霜、乳液或化妆水；皮肤适用的美容/修饰类化妆品包括：粉饼、胭脂、眼影、眼线笔(液)、眉笔、香水或古龙水；毛发适用清洁类化妆品包括洗发液、洗发膏或剃须膏；毛发适用的护理类化妆品包括护发素、发乳、发油/发蜡或焗油膏；毛发适用的美容/修饰类化妆品包括：定型摩丝/发胶、染发剂、烫发剂、睫毛液(膏)、生发剂或脱毛剂；指甲适用的清洁类化妆品包括洗甲液；指甲适用的护理类化妆品包括护甲水(霜)、指甲硬化剂；指甲适用的美容/修饰类化妆品包括指甲油；口唇适用的清洁类化妆品包括唇部卸妆液；口唇适用的护理类化妆品包括润唇膏；口唇适用的及美容/修饰类化妆品包括：唇膏、唇彩或唇线笔。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：GforU-2菌株的分离

将无菌棉签蘸取生理盐水于6月龄健康男婴皮肤面部皮肤采样。剪取棉签头于10ml生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI平板，37℃恒温培养24～48h后，挑取白色反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为GforU-2。

革兰氏染色镜检：菌株GforU-2为G+，显微镜下呈球状，无芽孢，无鞭毛；在BHI平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在肉汤液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2：GforU-2的核酸鉴定

1、16s rRNA基因序列分析：

挑取单菌落置BHI离心管中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15sec，57℃15sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较后得出GforU-2菌株为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

实施例3：GforU-2菌株致病菌抑菌实验-菌液浓度变化

1.表皮葡萄球菌GforU-2菌液制备：

将活化的表皮葡萄球菌GforU-2菌液以BHI液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测并调整OD₆₀₀＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得待测样品。

2、病原菌菌液制备：

将病原菌以BHI培养基37℃培养18h，检测OD₆₀₀测定菌数，调整病原菌菌液浓度为1×10⁸cells/ml。

3、抑制病原菌实验

将待测样品以10％体积分数加入病原菌中，37℃培养2h，以菌液浓度(OD₆₀₀)降低百分比评价对病原菌生长影响。

4、结果如表1：

表1 GforU-2病原菌抑菌率

结果显示GforU-2对金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌均具有抑制作用。GforU-2病原菌抑菌率结果见图1。

实施例4GforU-2降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO释放量

1、表皮葡萄球菌样品制备

将表皮葡萄球菌GforU-2用BHI培养基培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至1×10⁸cells/ml，离心后，菌体用1×PBS重悬后121℃高压灭菌30min得灭活菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得上清液。

2、细胞制备

将Raw264.7细胞消化后，以每孔2×10⁵cells/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、GforU-2添加及LPS刺激

实验分为三组，

LPS对照组：受试细胞中不添加GforU-2成分，

受试组1：受试细胞中添加GforU-2上清液5％(体积分数)；

受试组2：受试细胞中添加GforU-2灭活菌体10％(质量分数)。各组细胞于5％二氧化碳培养箱37℃孵育2h，然后每孔加入100ngLPS诱导Raw264.7发炎，20h后取细胞培养上清，用NO含量检测试剂盒检测NO含量，共进行三批实验，每次3个复孔。结果如表2：

表2 GforU-2降低Raw264.7细胞NO释放量

组别	平行1	平行2	平行3	NO抑制率(％)
					GforU-2上清液	26.48	24.50	23.34	24.77
GforU-2灭活菌体	13.67	10.57	11.39	11.88

与LPS对照组相比，GforU-2上清液NO抑制率24.77％；灭活菌体NO抑制率11.88％。GforU-2降低Raw264.7细胞NO释放量结果见图2。

实施例5：GforU-2降低金葡诱导的HaCaT炎性因子IL-1α、IL-8表达量

1、表皮葡萄球菌样品制备

将表皮葡萄球菌用BHI培养过夜，检测OD₆₀₀，调整菌液浓度至1×10⁸cells/ml，离心后，菌体121℃高压灭菌30min得菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得发酵上清。

2、细胞制备

将HaCaT细胞消化后以2×10⁵cells/ml接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、金黄色葡萄球菌制备及添加

金黄色葡萄球菌接入肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用MEM无血清培养基调整菌液浓度至3×10⁹cells/ml，每孔100μl添加入培养过夜的HaCaT细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，PBS清洗5次，每孔重新加入1ml MEM无血清培养基。

4、表皮葡萄球菌添加

将上清液5％加入金黄色葡萄球菌刺激过的HaCaT细胞中，每组3个复孔，培养过夜。

5、检测炎性因子IL-1α、IL-8表达量

将上述HaCaT细胞弃去培养基后，用RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1000ng进行反转录及qPCR。结果如表3：

表3 GforU-2下调炎症因子的表达

表皮葡萄球菌能够降低金葡诱导的HaCaT炎性因子IL-1α、IL-8表达量下调，本发明的表皮葡萄球菌GforU-2具有抗炎作用。GforU-2下调炎症因子的表达见图3。

实施例6：GforU-2促进SDS损伤修复实验

接种HaCaT细胞(5×10⁵cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，孵育8h。

实验分为三组，对照组不添加含有GforU-2的成分，受试组1加入5vol％GforU-2的灭活上清液，受试组2加入10wt％GforU-2的灭活菌体。

然后各组继续孵育24h。加入10μl CCK-8溶液，孵育4h，检测450nm处吸光值。

细胞存活率＝(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)。

结果如表4：

表4 GforU-2促进HaCaT细胞修复

GforU-2上清液及灭活菌体对SDS诱导的HaCaT细胞损伤均具有修复作用。GforU-2促进HaCaT细胞修复见图4。

实施例7：GforU-2促进HaCaT屏障修复相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT细胞(5×10⁵cells/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验分为三组，control的孔中不加入受试物，受试组1的细胞中加入GforU-2菌株发酵上清5vol％，受试组2加入灭活菌体10wt％。各组分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，并反转为cDNA，进行qPCR检测修复相关基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。

公式：F＝2^^(-ΔΔCT)

结果如表5～6：

表5 GforU-2上清液上调修复基因的表达

表6 GforU-2灭活菌体上调修复基因的表达

结果显示加入GforU-2上清液、灭活菌体均具有促进皮肤屏障修护的作用。GforU-2上调修复基因的表达的结果见图5、图6。

实施例8：GforU-2促进HaCaT保湿相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT细胞5×10⁵cells/ml至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验分为二组，control的孔中不加入受试物受试组加入灭活菌体10wt％。各组分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，并反转为cDNA，进行qPCR检测AQP3的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。

公式：F＝2^^(-ΔΔCT)

结果如表7：

表7 GforU-2上调保湿基因AQP3的表达

结果显示加入GforU-2上清液、灭活菌体孵育后，保湿相关AQP3基因表达上调，因此GforU-2具有保湿的作用。GforU-2上调保湿基因AQP3的表达的结果见图7。

实施例9：GforU-2自由基清除能力检测

1.表皮葡萄球菌GforU-2菌液制备：

将活化的表皮葡萄球菌GforU-2菌液以BHI液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测并调整OD₆₀₀＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤获得待测样品。

2.羟自由基清除能力检测

试剂配制和检测方法按照索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸光度，求平均值并计算各样品清除率，公式如下：

羟自由基清除率 D％＝[(A测定-A对照)÷(A空白-A对照)]×100％

3.ABTS自由基清除能力检测

试剂配制和检测方法按照索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品405nm吸光度，求平均值并计算各样品清除率，公式如下：

ABTS自由基清除率 D％＝[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白×100％

结果如表8：

表8 GforU-2自由基清除率(％)

组别	平行1	平行2	平行3	平均值
					羟自由基	18.12	21.41	20.00	19.84
ABTS自由基	19.56	18.20	19.68	19.15

结果显示，GforU-2对羟自由基、ABTS自由基均具有清除作用，因此GforU-2具有抗氧化的功效。GforU-2清除自由基结果见图8。

实施例10：GforU-2菌株的总抗氧化能力检测

1、GforU-2灭活上清液的制备：

将活化的GforU-2菌液以本发明中所述培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18小时，使用分光光度计OD600nm测定菌数，调整液浓度度为1×10⁹cells/ml，离心取上清，高压灭活并过0.22μm的滤膜得到灭活上清液。

2、总抗氧化能力检测

将GforU-2灭活上清液用总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒进行检测，反应10min后用酶标仪在593nm下测定吸光值。根据吸光值带入标椎曲线计算得到X值，总抗氧化能力计算公式：

总抗氧化能力(mol/ml)＝X×V反总÷V样

结果如表9：

表9 GforU-2总抗氧化能力(μmol/ml)

组别	平行1	平行2	平行3	平均值	对照组	提高率(％)
							总抗氧化能力	1.840	1.784	1.911	1.845	1.700	8.5

按照总抗氧化能力检测试剂盒测定的GforU-2的总抗氧化能力为1.845μmol/ml，与对照比提高8.5％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.表皮葡萄球菌，其保藏编号为CCTCC NO:M20211392。

2.权利要求1所述表皮葡萄球菌在制备抗炎的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括降低炎性因子水平，所述炎性因子包括IL-8、L-2和/或NO。

4.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在制备抑菌的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑菌包括抑制金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和/或铜绿假单胞菌中至少一种。

6.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在制备抗氧化、保湿和/或修复皮肤屏障产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗氧化包括清除羟自由基和/或ABTS自由基。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述保湿包括上调保湿相关基因水平，所述保湿相关基因包括AQP3。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，

所述修复皮肤屏障包括修复皮肤细胞和/或上调屏障修复相关基因水平；

所述皮肤细胞为角质形成细胞；

所述屏障修复相关基因包括FLG、LOR和/或OVOL1中至少一种。

10.一种化妆品和/或药物，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的表皮葡萄球菌。

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