CN115637235A - 具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用。本发明首先自健康皮肤上分离到表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287和CCSM0285，其保藏编号分别为CCTCC No.M 2022779和CCTCC No.M 2022780。实验发现：表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285的发酵液上清对DPPH自由基具有良好清除活性，能降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量，CCSM0287的发酵液上清对透明质酸酶具有良好抑制作用，且能降低LPS刺激巨噬细胞产生的IL‑6水平，因此在抗氧化、抗衰老、抗炎护肤品开发方面具有良好应用前景。

Description

具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，作为机体的屏障保护机体免受外来微生物、抗原或有毒物质的侵害。在人体皮肤表层或毛囊中栖息着大量的微生物，构成了人体皮肤菌群，其在维持皮肤健康中发挥着重要的作用，被称为皮肤的微生物屏障。皮肤微生物群、宿主皮肤及环境构成皮肤微生态系统，它们之间相互作用、相互制约，保持协调的、生理的、动态的平衡。平衡的皮肤微生态，有利于皮肤健康。在日常生活中，化妆品的频繁使用、过度清洁、过度护理、化学品、药品、过度的紫外线暴露、不良生活方式、环境污染等因素可导致皮肤微生态失调。皮肤微生态失调，皮肤生物屏障就会被削弱或者破坏，影响皮肤正常的生理机能，乃至被感染，促进皮肤的老化。

近年来，由于空气污染、紫外线辐射、化妆品频繁使用、精神压力增大、不良生活习惯、健康护肤意识增强及疫情常戴口罩捂脸等因素影响，皮肤出现敏感、特应性皮炎(AD)和痤疮等的发生率逐年上升。研究已表明，敏感肌肤、特应性皮炎和痤疮等皮肤问题都存在皮肤微生态失调等问题。通过调整皮肤微生态正在成为治疗各种皮肤问题的新途径。

机体自身代谢过程中以及受到外界污染、太阳照射等，会不断在人体内产生自由基，而过量自由基的产生会导致机体出现各种疾病和皮肤的衰老。研究表明在光老化的皮肤中，UV辐照后会使皮肤细胞内的ROS增多，诱发MMPs水平增高，导致皮肤的胶原蛋白和弹性蛋白被降解，皮肤变得粗糙、松弛和起皱。皮肤上的表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等对UV引起的皮肤损伤有保护作用，能显著降低紫外辐射诱导的ROS水平之外，还能通过影响多个信号通路直接调节皮肤细胞MMPs的表达水平，减少UV辐照后胶原蛋白和弹性蛋白的降解，维持皮肤的健康。

目前借助于高通量测序、宏基因组学、代谢组学和生物信息学等分析技术，我们对人体皮肤微生物组成、结构和功能有了更深入的认识。作为皮肤微生态中重要角色的皮肤菌群，在维护皮肤健康中发挥着重要的作用。在健康皮肤上存在大量潜在的有益菌，大量的研究表明：以表皮葡萄球菌为代表的凝固酶阴性葡萄球菌等分泌抗菌肽、分解皮脂生成短链脂肪酸(SCFAs)、核苷等代谢物，具有抗菌、抗炎、免疫调节、增强皮肤屏障功能、抗癌等多种生理功能，是潜在的皮肤有益菌(Stacy A,Belkaid Y.Microbial guardians of skinhealth[J].Science,2019,363(6424):227-228.)。

基于表皮葡萄球菌在维护皮肤健康中重要的作用，将来表皮葡萄球菌以及代谢产物可能用于皮肤健康的护理中，2015年已有研究从自体皮肤中分离出微生物，将其与凝胶混合制成新型化妆品，显著改善了皮肤的保湿性(Yuichi Nodakea,Saki Matsumotoa,b.Pilot study on novel skin care method by augmentation with Staphylococcusepidermidis,an autologous skin microbe-Ablinded randomized clinical trial[J].Journal of Dermatological Science 79,2015,119-126)。基于已经报道过的表皮葡萄球菌的种种益处，将表皮葡萄球菌应用到化妆品中具有广阔的应用前景。但是目前国内缺乏健康人群来源的皮肤菌以及功能菌株的筛选报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用。本发明首先从从健康皮肤上分离菌株，进行功效菌株筛选和验证，发现了表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287和CCSM0285的发酵液上清对DPPH自由基具有良好的清除活性，能降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量，CCSM0287的发酵液上清对透明质酸酶具有良好的抑制作用，且能降低LPS刺激巨噬细胞产生的IL-6水平，因此可以为抗氧化、抗衰老、抗炎的皮肤有益菌的开发和微生态护肤品的开发奠定基础。

本发明首先自健康皮肤上分离到表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287和CCSM0285，上述菌株已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号分别为CCTCC No.M 2022779和CCTCC No.M 2022780。上述菌株均具有如下微生物学特征：在TSA血平板上菌落为白而小，形成圆形凸起，边缘整齐，菌落直径大约为0.5～1mm，表面光滑，湿润，不透明，挑取能拉丝，无溶血圈。革兰氏染色阳性。菌体特征呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢。其最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在30～40℃生长温度最佳；表皮葡萄球菌在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，14h左右进入稳定期。

本发明还提供了上述的表皮葡萄球菌CCSM0287以及TSB发酵上清在皮肤抗氧化、抗炎方面的应用，可以制备对抗自由基和炎症因子对皮肤的损伤，抗氧化、抗衰老和缓解炎症的护肤品。上述抗炎包括抑制透明质酸酶和降低LPS引起的巨噬细胞IL-6的表达。上述抗氧化包括清除DPPH自由基和降低由维生素K3诱导人角质形成细胞产生的ROS。

本发明还提供了上述的表皮葡萄球菌CCSM0285菌株以及TSB发酵上清在皮肤抗氧化方面的应用，可以制备对抗自由基对皮肤的损伤，抗氧化、抗衰老的护肤品。上述抗氧化包括清除DPPH自由基和降低由维生素K3诱导人角质形成细胞产生的ROS。

本发明还提供了上述表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285的TSB发酵上清的制备方法，其特征是，表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285在TSB液体培养基(胰酪大豆胨液体培养基)中30～40℃好养发酵培养，发酵液离心，获得TSB发酵上清。

制备方法具体包括以下步骤：将活化后的CCSM0287、CCSM0285的菌株挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，置于30～40℃摇床中，振荡培养16～20h，测定发酵液的OD₆₀₀值，调整菌体OD600值为0.9～1.1，作为种子液；以体积比1％～3％的接种量将种子液接种TSB液体培养基中，30～40℃摇床中，振荡培养10～15h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将发酵液离心，获得TSB发酵上清。

本发明的技术效果是：

1、与现有技术(未见有关表皮葡萄球菌筛选的报道)相比，本发明提供了健康人源(分离自健康人皮肤上)的表皮葡萄球菌CCSM0287和CCSM0285。

2、经试验证明，该表皮葡萄球菌CCSM0287具有良好的抗氧化效果，所述表皮葡萄球菌具有高DPPH自由基清除率，可以降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量。其中，所述表皮葡萄球菌发酵上清DPPH自由基清除率为96.8％，ROS清除率为19.77％；同时表皮葡萄球菌具有高抑制透明质酸酶和降低LPS引起的巨噬细胞炎症因子IL-6的能力，其中，所述表皮葡萄球菌发酵上清对透明质酸酶抑制率达90.42％，IL-6表达方面与阳性对照LPS相比，可显著降低LPS引起的巨噬细胞IL-6表达(下降26.6％)。该菌株在对抗自由基对皮肤损伤，在对抗炎症因子对皮肤损伤，在抗氧化、抗衰老、抗炎护肤品开发方面具有良好的应用前景，填充了表皮葡萄球菌在抗氧化抗炎功效筛选中的空白。

3、经试验证明，该表皮葡萄球菌CCSM0285具有良好的抗氧化效果，所述表皮葡萄球菌具有高DPPH自由基清除率，可以降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量。其中，所述表皮葡萄球菌发酵上清DPPH自由基清除率为80.47％，ROS清除率为21.36％。该菌株在对抗自由基对皮肤损伤，在抗氧化、抗衰老护肤品开发方面具有良好的应用前景，填充了表皮葡萄球菌在抗氧化功效筛选中的空白。

4、经试验证明，表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，14h左右进入稳定期，便于大规模生产应用。

附图说明

图1为表皮葡萄球菌CCSM0287的菌落形态(左)及显微镜照片(右)；

图2为表皮葡萄球菌CCSM0287的生长曲线；

图3为表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清液对人角质形成细胞的细胞毒性影响；

图4为表皮葡萄球菌CCSM0287对人角质形成细胞活性氧ROS的清除效果；

图5为表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清液对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性影响；

图6为表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清液对LPS引起的巨噬细胞RAW264.7表达IL-6的影响；

图7为表皮葡萄球菌CCSM0285的菌落形态(左)及显微镜照片(右)；

图8为表皮葡萄球菌CCSM0285的生长曲线；

图9为表皮葡萄球菌CCSM0285发酵上清对人皮肤角质形成细胞的细胞毒性；

图10为表皮葡萄球菌CCSM0285对人角质形成细胞活性氧ROS的清除效果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

胰酪大豆胨琼脂血培养基(TSA)：胰蛋白胨15.0g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右时，加入5％无菌脱纤维羊血，混匀，倒平板。

胰酪大豆胨液体培养基(TSB)：胰蛋白胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，121℃高压灭菌15min，备用。

保藏培养基：120g脱脂乳粉，880mL蒸馏水，118℃高压灭菌15min，备用。

实施例1、菌株CCSM0287、CCSM0285的分离、筛选与纯化

(1)招募完美肌肤志愿者

要求皮肤健康，素颜状态下，皮肤细腻、毛孔小，无痤疮、脓疱、无炎症、无脱屑等情况，有斑者可参加，近3个月未擦拭药膏；年龄18～30岁，性别不限。

(2)样品采集

要求志愿者采样前一晚洗脸后可做基础护肤(涂水、乳等)，第二天早上不能洗脸，一般中午或下午取样。在采样皮肤部位处选取一块大约4cm×4cm区域，将聚合纤维材料的无菌棉签在润湿液(0.9％氯化钠和0.1％吐温-20)中润湿，在选取区域内来回涂擦50次(擦拭棉拭子要有一定的力度)，用无菌镊子将无菌棉签放置在取样管中，并用封口膜封口。将收集的样品放入冰盒里冷藏，带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快进行菌株的分离。

(3)样品预处理

在超净工作台中用无菌剪刀将带有样品的无菌棉签头剪下，放置于5mL离心管(EP管)中，吸取5mL无菌水于离心管中，充分混匀。

(4)平板筛选

取上述样品液0.5mL加入4.5mL无菌水进行梯度稀释，选择合适的稀释度，吸取0.1mL稀释液涂布于TSA固体血平板，每个稀释度涂布2个平板，分别置于37℃培养箱中好氧培养24h。

(5)划线分纯和保藏

根据凝固酶阴性葡萄球菌菌株在血平板上的菌落特点，不产溶血圈、菌落大小、颜色、湿润、光泽等差异，挑取单菌落分别划线TSA血平板，置于37℃恒温培养箱里培养16h，待多次划线分纯后，采用保藏培养基(脱脂乳粉作为保护剂)保藏于保存管，冷冻干燥后保藏于-85℃深冷冰箱中。

通过上述筛选方法，筛选获得菌株CCSM0285和CCSM0287。

实施例2菌株的微生物学鉴定

将实施例1获得的菌株CCSM0287、CCSM0285进行微生物学鉴定

(1)菌落特征：

菌株在TSA血琼脂平板上划线，37℃培养16h后，观察菌株在平板上的菌落形态特征。结果如图1左图(CCSM0287)和图7左图(CCSM0285)所示，从图1可以看出，表皮葡萄球菌在TSA血平板上菌落为白而小，形成圆形凸起，边缘整齐，菌落直径大约为0.5～1mm，表面光滑，湿润，不透明，挑取能拉丝，无溶血圈。

(2)菌体特征：

将步骤(1)中得到的表皮葡萄球菌挑取少量菌体于载玻片上进行涂片，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态特征。如图1右图(CCSM0287)和图7右图(CCSM0285)所示，从图中可以看出，革兰氏染色阳性。菌体特征呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢。

(3)培养学特征：

将菌株CCSM0287、CCSM0285分别接种到TSB液体培养基中，置于不同温度下培养，研究表明，CCSM0287、CCSM0285的最低生长温度均为15℃，最高生长温度均为45℃，在30～40℃生长温度最佳；接种到不同pH的TSB液体培养基中，37℃恒温培养，CCSM0287、CCSM0285菌株的最高生长pH均为9.0、最低生长pH均为4.0，最适生长pH为6.0。

(4)遗传学特性：

菌株CCSM0287、CCSM0285基因组DNA提取方法：分别挑取纯化的CCSM0287、CCSM0285单菌落接种到10mL TSB液体培养基中，37℃培养14-16h后将菌液离心(8000r/min，15min)收集菌体。

采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物(16s 27F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16s1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT)，PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收，纯化后送美吉生物工程(上海)股份有限公司测序。所得CCSM0287、CCSM0285的16S rDNA核苷酸序列分别见序列表SEQ NO.1和SEQ NO.2，序列长度均为：1382bp。

送GenBank做Blast分析。菌株CCSM0287、CCSM0285同源性最高菌株的是MT604781.1，同源性分别为99％和100％。

根据Goodfellow和O’Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株CCSM0287、CCSM0285与Staphylococcus epidermidis属于同一个种。因此菌株CCSM0287、CCSM0285鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16srDNA对菌株CCSM0287、CCSM0285鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，该菌株已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号分别为：CCTCC No.M 2022779和CCTCC No.M 2022780。

实施例3：表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285的生长曲线的绘制

分别将活化好的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287、CCSM0285按2％(v/v)接种量接入TSB液体培养基中，37℃恒温振荡培养24h，每隔2h在600nm处测定培养液的OD值，以OD₆₀₀值对时间作图得到表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CCSM0287、CCSM0285在TSB液体培养基中的生长曲线，其结果分别如图2和图8所示，从图2中可以看出，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，14h左右进入稳定期，从图8中可以看出，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0285在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，14h左右进入稳定期。

实施例4：表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285发酵上清的DPPH自由基清除率的测定

(1)表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285发酵上清的培养

将表皮葡萄球菌CCSM00287菌株划线于TSA平板，37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的表皮葡萄球菌CCSM0287接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD₆₀₀在0.9～1.1范围，作为种子液。以2％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，37℃，160r/min恒温培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min的速度离心15min，获得的离心上清液即为发酵上清。

表皮葡萄球菌CCSM0285发酵上清的培养方法同上。

(2)用DPPH清除自由基法测表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285的代谢产物中的DPPH自由基清除率，步骤如下：

①用无水乙醇配制DPPH浓度为0.1mm/L母液，避光低温保存。

取100μL样品溶液(发酵上清)和100μLDPPH溶液加入96孔板中，记为溶液s；

取100μL样品溶液和100μl无水乙醇溶液置于96孔板中，记为溶液b；

取100μL 50％乙醇溶液和100μL DPPH溶液置于96孔板中，记为溶液c；

混匀，恒温37℃黑暗环境下反应30min；

②用酶标仪在517nm处分别测As，Ab，Ac孔中所得的反应液的OD值，As，Ab，Ac孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式：

清除率＝100％×[A_c-(A_s-Ab)]/Ac

计算表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285的代谢产物中的DPPH自由基清除率分别为96.8±1.87％和80.47±2.15％。

实施例5：表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285发酵上清清除人角质形成细胞的ROS测定

(1)表皮葡萄球菌CCSM0287、CCSM0285发酵上清的制备

发酵上清液的制备方法同实施例4步骤(1)，将发酵上清浓缩到原体积的1/4，即为表皮葡萄球菌的浓缩发酵上清。

(2)细胞培养

人原代皮肤角质细胞(NEKs)分离自正常皮肤组织，用Promocell专用完全培养基(Keratinocyte Growth Medium 2,C-20011)在37℃，5％CO₂条件下常规培养，待细胞生长至近融合状态，以胰蛋白酶消化传代，每5d传代1次。

(3)细胞活力检测

取处于最佳生长状态的NEKs细胞，常规处理，细胞悬浮液密度调整到8×10⁴-1×10⁵个/mL，以每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。分别加入0.1％、0.5％、1％、5％和10％CCSM0287(CCSM0285)发酵上清的浓缩液培养24h，设置阴性对照组(10％TSB培养基)和空白对照组(NT)，每个实验组设置3个平行孔。培养24h后，每孔加10μL CCK-8试剂(日本同仁CK-04)，常规孵育2h。使用酶标仪测定450nm处测定吸光值，参比波长为600nm或以上。

(4)ROS检测

取处于最佳生长状态的NEKs细胞，用Promocell专用培养基培养，常细胞悬浮液密度调整到8×10⁴-1×10⁵个/mL，以每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。在各反应孔中加入10μmol/L维生素K3，实验组加入5％CCSM0287发酵上清浓缩液，以200μmol/L维生素E为阳性对照，培养24h后，每孔加1μL ROS荧光显色试剂(CellRox，Thermo)，常规孵育4h。使用酶标仪测定荧光值，激发光波长为485nm，发射光为520nm。

从图3可以看出，与空白对照组(NT)相比，表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的浓缩液的添加量低于5％时，未显示细胞毒性，而且能显著促进人原代皮肤角质细胞的生长。在此选择5％CCSM0287发酵上清的浓缩液进行ROS实验。实验结果表明(图4)，维生素K3处理(诱导组)后角质细胞分泌大量的ROS，加入表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清浓缩液(发酵上清组)，可显著降低ROS的量，ROS清除率为19.77％。可见，表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清可显著降低维生素K3引起的ROS的表达，显示出良好的抗氧化效果。

从图9可以看出，与空白对照组(NT)相比，表皮葡萄球菌CCSM0285发酵上清的浓缩液的添加量低于5％时，未显示细胞毒性，而且能显著促进人原代皮肤角质细胞的生长。在此选择5％CCSM0285发酵上清的浓缩液进行ROS实验。实验结果表明(图10)，维生素K3处理后(诱导组)角质细胞分泌大量的ROS，加入表皮葡萄球菌CCSM0285发酵上清浓缩液(发酵上清组)，可显著降低ROS的量，ROS清除率为21.36％。可见，表皮葡萄球菌CCSM0285发酵上清可显著降低维生素K3引起的ROS的表达，显示出良好的抗氧化效果。

实施例6表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的透明质酸酶抑制率测定

(1)表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的制备方法同实施例4步骤(1)。

(2)用透明质酸酶抑制法测表皮葡萄球菌CCSM0287的代谢产物中的透明质酸酶抑制率，步骤如下：

①用0.1M醋酸缓冲溶液配制12.5mM的氯化钙溶液，4000U/mL的透明质酸酶溶液和2mg/mL的透明质酸钠溶液；

②将1mL乙酰丙酮和10mL 0.5M碳酸钠溶液混合均匀备用，临用现配；

③将对二甲氨基苯甲醛1.5g溶于冰醋酸43.75mL中，混合均匀后加10M盐酸6.25mL，临用现配；

(3)取步骤(1)中的发酵上清液作为样品按照表1添加步骤(2)中的试剂进行反应。

表1实验设计

按照上述公式计算得出抑制率。表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的透明质酸酶抑制率为90.42±5.56％。

实施例7表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清对巨噬细胞IL-6的测试

(1)表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的制备

制备方法同实施例4步骤(1)。

(2)细胞活力测试

巨噬细胞RAW264.7在5％CO₂、37℃的培养条件下，利用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基正常培养。当细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并按照8×10⁵cells/mL的密度接种于96孔板。细胞贴壁24h后，分别加入0.1％、0.5％、1％、5％和10％CCSM0287发酵上清的浓缩液培养24h，设置阴性对照组(10％TSB培养基)和空白对照组(NT)，每个实验组设置3个平行孔。处理完成后，按照说明书加入CCK-8试剂孵育1h，在450nm处测量吸光度，计算相对细胞活性。

相对细胞活性(％)＝(样品组OD值/对照组OD值)×100％

(3)经LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的IL-6测试

巨噬细胞RAW264.7在含5％CO₂、37℃的培养条件下，利用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基正常培养。当细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并按照8×10⁵cells/mL的密度接种于96孔板。细胞贴壁24h后，将LPS、LPS和5％CCSM0244发酵上清的浓缩液加入反应孔中，以地塞米松(DEX)为阳性对照，设置空白对照组(NT)，每组设3个平行孔。培养24h后取上清液，用ELISA试剂盒进行IL-6炎症因子的检测。

从图5可以看出，与空白对照组(NT)相比，表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清的浓缩液的添加量低于5％时，未显示细胞毒性，而且能显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的生长。在此选择5％CCSM0287发酵上清的浓缩液进行炎症因子的实验。实验结果表明(图6)，正常细胞产生少量的IL-6细胞因子，而LPS处理后，细胞分泌大量的炎症因子IL-6，加入表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清浓缩液，可显著降低炎症细胞因子IL-6的量，降低率26.6％。可见，表皮葡萄球菌CCSM0287发酵上清可显著降低LPS引起的炎症细胞因子IL-6的表达，显示出良好的抗炎效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东福瑞达生物股份有限公司

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<213> 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) CCSM0287的16S rDNA 核苷酸序列

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aaggggaaaa ctctatctct agaggggtca gaggatgtca agatttggta aggttcttcg 480

cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggtccccgtc aattcctttg 540

agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 600

aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg tttgatcccc acgctttcgc acatcagcgt cagttacaga ccagaaagtc 720

gccttcgcca ctggtgttcc tccatatctc tgcgcatttc accgctacac atggaattcc 780

acttttcctc ttctgcactc aagttttcca gtttccaatg accctccacg gttgagccgt 840

gggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tacgcgcgct ttacgcccaa taattccgga 900

taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg 960

attaggtacc gtcaagacgt gcatagttac ttacacattt gttcttccct aataacagag 1020

ttttacgatc cgaagacctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcaggc tttcgcccat 1080

tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg accgtgtctc agttccagtg 1140

tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct tggtaagccg ttaccttacc 1200

aactagctaa tgcggcgcgg atccatctat aagtgacagc aaaaccgtct ttcactattg 1260

aaccatgcgg ttcaatatat tatccggtat tagctccggt ttcccgaagt tatcccagtc 1320

ttataggtag gttatccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacgtcag aggagcaagc 1380

tc 1382

<210> 2

<211> 1382

<212> DNA

<213> 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) CCSM0285的16S rDNA 核苷酸序列

<400> 2

tactccaccg gcttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaagac 60

ccgggaacgt attcaccgta gcatgctgat ctacgattac tagcgattcc agcttcatat 120

agtcgagttg cagactacaa tccgaactga gaacaacttt atgggatttg cttgacctcg 180

cggtttcgct gccctttgta ttgtccattg tagcacgtgt gtagcccaaa tcataagggg 240

catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caacttagag 300

tgcccaactt aatgatggca actaagctta agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360

acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgt cccccgaagg 420

ggaaaactct atctctagag gggtcagagg atgtcaagat ttggtaaggt tcttcgcgtt 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggtc cccgtcaatt cctttgagtt 540

tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg 600

ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660

atcctgtttg atccccacgc tttcgcacat cagcgtcagt tacagaccag aaagtcgcct 720

tcgccactgg tgttcctcca tatctctgcg catttcaccg ctacacatgg aattccactt 780

tcctcttctg cactcaagtt ttccagtttc caatgaccct ccacggttga gccgtgggct 840

ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctacgc gcgctttacg cccaataatt ccggataacg 900

cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctgattag 960

gtaccgtcaa gacgtgcata gttacttaca catttgttct tccctaataa cagagtttta 1020

cgatccgaag accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt caggctttcg cccattgcgg 1080

aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtggcc 1140

gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggta agccgttacc ttaccaacta 1200

gctaatgcgg cgcggatcca tctataagtg acagcaaaac cgtctttcac tattgaacca 1260

tgcggttcaa tatattatcc ggtattagct ccggtttccc gaagttatcc cagtcttata 1320

ggtaggttat ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac gtcagaggag caagctcctc 1380

gt 1382

Claims (10)

1.一株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0287，所述菌株的保藏编号为CCTCC No.M 2022779。

2.一种以权利要求1所述的表皮葡萄球菌CCSM0287为有效菌，TSB液体培养基发酵制备的TSB发酵上清。

3.权利要求1所述的表皮葡萄球菌CCSM0287或者权利要求2所述的TSB发酵上清在皮肤抗氧化、抗炎方面的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述抗氧化包括清除DPPH自由基和降低由维生素K3诱导人角质形成细胞产生的ROS；所述抗炎包括抑制透明质酸酶和降低LPS引起的巨噬细胞IL-6的表达。

5.权利要求1所述的表皮葡萄球菌CCSM0287或者权利要求2所述的TSB发酵上清在制备对抗自由基和炎症因子对皮肤的损伤，抗氧化、抗衰老和缓解炎症的护肤品方面的应用。

6.一株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0285，所述菌株的保藏编号为CCTCC No.M 2022780。

7.一种以权利要求6所述的表皮葡萄球菌CCSM0285为有效菌，TSB液体培养基发酵制备的TSB发酵上清。

8.权利要求6所述的表皮葡萄球菌CCSM0285或者权利要求7所述的TSB发酵上清在皮肤抗氧化方面的应用；所述抗氧化包括清除DPPH自由基和降低由维生素K3诱导人角质形成细胞产生的ROS。

9.权利要求6所述的表皮葡萄球菌CCSM0285或者权利要求7所述的TSB发酵上清在制备对抗自由基对皮肤的损伤，抗氧化、抗衰老护肤品方面的应用。

10.权利要求2或6所述的TSB发酵上清的制备方法，其特征是，将活化后的菌株挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，置于30～40℃摇床中，振荡培养16～20h，测定发酵液的OD₆₀₀值，调整菌体OD₆₀₀值为0.9～1.1，作为种子液；以体积比1％～3％的接种量将种子液接种TSB液体培养基中，30～40℃摇床中，振荡培养10～15h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将发酵液离心，获得TSB发酵上清。

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