KR102544440B1 - 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 j2k-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법 - Google Patents

피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 j2k-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항주름평가 방법을 UV 조사를 이용하여 주름 유발하는 방법이 아닌, 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 배양물을 이용하여 주름을 유발시켜 소재를 평가하는 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법에 관한 것이다.

Description

피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법{A novel anti-wrinkle evaluation method that treats Enterobacter aerogenes J2K-739 strain derived from skin flora and Enterobacter genus derived from skin flora as an irritant}
본 발명은 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항주름평가 방법을 UV 조사를 이용하여 주름 유발하는 방법이 아닌, 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 배양물을 이용하여 주름을 유발시켜 소재를 평가하는 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법에 관한 것이다.
인간의 피부는 크게 피부의 겉 표면을 둘러싸고 있는 '표피', 표피 아래에서 혈관, 신경 등의 구조물들을 지지하는 기질을 공급하는 '진피', 그리고 진피와 근육 사이에서 지방을 다량 함유하고 있는 '피하 조직'으로 구성되어 있다.
그 중에서도 진피에는 약 70% 내외의 수분을 함유하고 있으며, 표피에는 약 30% 정도의 수분을 함유하고 있다고 알려져 있다.
하지만, 이는 건강한 사람의 피부 기준에 불과하며 표피의 수분율이 10% 이하로 떨어질 경우, 피부가 거칠어지고 피부 노화가 촉진되는 등 부정적인 영향을 띄게 된다.
또한, 건조한 피부가 유지됨에 따라 피부에 대한 트러블과 건선 및 아토피 등 다양한 염증이 유발될 수 있다.
마지막으로 미세먼지, 건조한 환경, 자외선 등의 외인성 환경 요인에 노출되는 빈도수가 증가됨에 따라 피부 장벽 및 보습에 대한 효과가 뛰어난 제품에 대한 수요가 증가하고 있다.
한편, 한국인과 일본인과 같은 동양인들은 맑고 깨끗한 피부에 대한 관심이 높으며, 이런 분위기를 반영하듯이 국내 화장품업계뿐만 아니라 다국적 기업도 미백 원료 물질이나 효과에 연구가 증가하고 있다.
특히, 나이가 듦에 따라 피부 노화의 한 현상으로서 주름이 증가하는데, 미용 등의 관점에서 특히 여성에게 있어서 주름의 방지 및 개선에 대한 관심이 매우 높아지고 있다.
주름은, 크게 나누어, 각질층을 포함하는 표피의 기능저하에 의해 발생하는 잔주름과, 표피보다 깊은 진피의 기능 저하에 의해 발생하는 큰주름(또는 표정 주름)으로 나누어진다.
각질층을 포함하는 표피의 기능 저하에 의해 생기는 주름은, 주로 나이듦, 자외선, 낮은 온도, 낮은 습도 등의 영향으로 표피의 수분 유지 기능이 저하됨으로써 생긴다.
한편, 진피의 기능 저하에 의해 생기는 주름은, 노화나 자외선, 그리고 기계적 스트레스의 영향으로, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)가 증감함으로써, 콜라겐이나 엘라스틴으로 이루어지는 피부의 탄력 구조 상태가 무너짐으로써 생긴다고 되어 있다.
피부에 생긴 잔주름의 홈이 깊게 파임으로써 큰주름으로 이행하는 것이 알려져 있어 잔주름과 큰주름은 각각 밀접하게 관련되어 있다.
건조가 심한 겨울철에 잔주름이 발생하기 쉬운 것은 공통된 인식이며, 잔주름의 예방 및 개선을 위해서는 화장료, 특히 화장수, 유액, 크림, 미용액 등으로 보습을 행하는 것, 그리고 가습기를 이용하여 가습하는 것이 중요한 것으로 생각되고 있다.
보습을 목적으로 한 화장료로는 특히, 글리세린이나 히알루론산 등의 보습제를 포함하는 화장료가 사용되고 있다.
지금까지, 건조 표피를 이용한 거친 피부 모델을 이용하여, 각질층 투명도를 높이는 후보 물질을 평가하는 방법이나, 각질층 세포간 지질의 구조 변화를 지표로 하여 피부 배리어 기능 개선 또는 향상되는 후보 물질을 평가하는 방법이 알려져 있었다.
이들 방법은, 각질층 투명도나 피부 배리어 기능을 개선하는 후보 물질을 평가하고 있지만, 주름을 개선하는 후보 물질의 평가에 관한 기재는 없었다.
또한, 일반적인 평가 방법은 피험자의 비교적 긴 기간 동안의 자율적인 화장품 도포를 전제로 하고 있으므로, 화장품의 도포가 평가자의 기준에 따라 적합하게 이루어지고 있는지 확인하기 힘들다.
이에, 시험의 부작용에 대한 피험자의 부담이 적으며, 화장품의 도포가 평가자에 의해 일관되게 이루어지고, 평가 기간이 짧으면서도 객관적인 결과를 도출해낼 수 있는 주름 개선 화장료 조성물에 대한 임상 평가 방법의 요구가 존재한다.
한국등록특허 제10-2134930호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 개발된 것으로서, 본 발명의 목적은 항주름평가 방법을 UV 조사를 이용하여 주름 유발하는 방법이 아닌, 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 배양물을 이용하여 주름을 유발시켜 소재를 평가하는 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법을 제공하고자 한다.
본 발명인 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법은,
HDF(Human deraml fibroblast) cell 을 배양하는 HDF세포배양단계(S100);와
상기 HDF(Human deraml fibroblast) cells 를 분주하고, 습윤 배양기를 통해 안정화시키는 계대배양단계(S200);와
Serum free 배지에 시료를 처리하고, 피부 상재균으로부터 유래된 균주 또는 배양물을 처리하고 일정 시간 반응시키는 피부상재균반응단계(S300);와
상기 반응 후 세포를 하베스트한 후, RNA isolation을 진행하기 위한 RNA추출단계(S400);와
상기 분리된 RNA를 정량한 뒤, cDNA를 합성하기 위한 cDNA합성단계(S500);와
상기 합성된 cDNA에 대하여 real- time PCR 수행 후 증폭 산물을 정량 분석하기 위한 증폭산물정량분석단계(S600);를 포함함으로써, 본 발명의 과제를 해결하게 된다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 것과 같이, 항주름평가 방법을 UV 조사를 이용하여 주름 유발하는 방법이 아닌, 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 배양물을 이용하여 주름을 유발시켜 소재를 평가함으로써, 종래 평가 방식의 문제점인 자외선 조사에 의한 과도한 홍반 반응 발생, 광알레르기, 광감작 등을 방지할 수 있게 된다.
도 1은 본 발명인 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주의 동정 결과 16S rRNA 서열도이다.
도 2는 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법을 나타낸 실험 진행 모식도이다.
도 3은 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법의 실험 데이터 결과값이다.
도 4는 본 발명인 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주의 기탁을 입증하는 기탁증이다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명에서의 용어, '조성물'이란, 바람직하게는 피부외용제 조성물을 의미하고, 피부외용제 조성물이란, 일반적으로 피부에 적용되는 조성물 전부를 의미하고, 의약품,의약부외품, 화장료 등을 포함하는 것이다.
한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 조성물로부터 피부 상태의 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 조성물에 배양물 여과액이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화하는 것을 포함하는 의미이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
상기 과제를 해결하기 위해 피부에서 피부상재균을 분리 동정하여 피부에 유해한 상재균을 찾아내고자 하였다.
구체적으로, 세명대학교 임상 센터로부터 건강한 여성의 안면 피부 시료를 채취하여 균주 분리하여 시료로 사용하였다.
상기 피부 시료들은 각각 멸균 생리 식염수에 현탁 및 희석하고, 이를 0.1 mL씩 취해 Difco Tryptic Soy Agar 배지에 도말하였다.
이후, 플레이트를 35℃의 항온 배양기에서 2일 동안 배양하였다.
이후, 생성된 각각의 콜로니를 TSA 플레이트에 획선 접종하였고, 35℃에서 2일 동안 배양하여 미색의 집락을 보이는 콜로니를 취했다.
위와 같은 방법으로 다양한 종류의 피부 상재균을 분리 동정하였다.
예를 들어, 상기한 피부 상재균은,
엔테로박터속 세균, 클렙시엘라 속 세균, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) , 모락셀라 오슬로엔시스(Moraxella osloensis), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 세균 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
이때, 본 발명의 예시에서는 엔테로박터속 세균을 적용하였으며, 상기한 다양한 세균 중 어느 하나로 적용할 수 있음은 자명한 것이다.
본 발명에서는 상재균 발효 여과물을 처리함으로 인해 주름을 유발할 수 있음을 in vitro 실험을 통해 확인하고, 이를 통해 신규한 항주름 평가 방법을 개발하였다.
이에 대하여 하기에서 구체적으로 설명하도록 하겠다.
본 발명에서는, 상기 피부 상재균으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14920BP의 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주를 수득하였다.
이때, 상기 피부 상재균으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14920BP 의 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 이의 배양물을 이용하여, 주름을 유발시켜 소재를 평가하는 것을 특징으로 한다.
이때, 바람직하게 상기 소재는 화장료 조성물에 해당하게 된다.
또한, 도 1에 도시한 바와 같이, 상기 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법은,
HDF(Human deraml fibroblast) cell 을 배양하는 HDF세포배양단계(S100);와
상기 HDF(Human deraml fibroblast) cells 를 분주하고, 습윤 배양기를 통해 안정화시키는 계대배양단계(S200);와
Serum free 배지에 시료를 처리하고, 피부 상재균으로부터 유래된 균주 또는 배양물을 처리하고 일정 시간 반응시키는 피부상재균반응단계(S300);와
상기 반응 후 세포를 하베스트한 후, RNA isolation을 진행하기 위한 RNA추출단계(S400);와
상기 분리된 RNA를 정량한 뒤, cDNA를 합성하기 위한 cDNA합성단계(S500);와
상기 합성된 cDNA에 대하여 real- time PCR 수행 후 증폭 산물을 정량 분석하기 위한 증폭산물정량분석단계(S600);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기한 과정을 실시예를 통해 구체적으로 설명하도록 한다.
일반적으로, UV 조사를 이용하여 주름을 유발하는 실험 방법으로서, MMP-1 qPCR 실험 방법을 이용하고 있었다.
구체적으로, HDF(Human deraml fibroblast)cells를 3 × 105 / 60 mm culture dish에 분주하고, 37%, 5% CO2 습윤 배양기에서 18 시간 동안 안정화시킨 후 serum free 배지로 교체하였다.
Serum free 배지에 시료를 처리하고, 2시간 뒤에 UV-B를 25 mJ/cm2로 조사하여 20 시간 동안 반응하였다.
반응 후 세포를 NucleoZOL lysis buffer(NM, 740404)를 이용하여 harvest한 뒤, MN사에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA isolation을 진행하였으며, 분리된 RNA를 microplate reader를 이용하여 정량한 뒤 HiSenScript™ RH(-) RT PreMix Kit(intron, 25087)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA와 2X Real-Time PCR Master Mix & Premix(BioFACT)를 이용하여 real- time PCR 수행 후 증폭 산물을 정량 분석하였다.
상기한 주름 유발 방법은 자외선 조사에 의한 과도한 홍반 반응 발생, 광알레르기, 광감작 등을 발생시킬 수 있어 임상 대상자를 선정함에 있어 상당한 애로 사항이 발생하였다.
실시예 1 : 엔토로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-739) 배양물 제조
순수 분리한 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-739) 균주의 종균 배양(seed culture)은 TSB 배지에 단일 콜로니를 접종하여 35℃ 항온배양기에 24시간 동안 배양하여 사용하였다.
엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-739) 균주의 성장이 최적화된 배지 조성은 글루코스 2.5%, 효모추출물 2.0%, 염화나트륨 0.5%, 제2인산칼륨 0.25%를 함유한 최적화된 배지로 하며, pH 7.5로 조정한 배지에 상기 종균배양액을 5%(V/V)되게 접종한 후, 온도 35℃, 회전수 150rpm 조건으로 48시간 배양하였다.
배양 후 원심 분리하여 배양액으로부터 균체를 제거하고 상등액을 여과하여 균체를 완전히 제거한 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-739) 배양물을 수득하였다.
비교예 1 : 엔토로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-727) 배양물 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 2 : 엔토로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-753) 배양물 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 3 : 엔토로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes J2K-743) 배양물 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 4 : 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae J2K-755)배양물 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
균주번호 균주명 연령 성별
J2K-739 Enterobacter aerogenes 51 여
J2K-727 Enterobacter aerogenes 52 여
J2K-753 Enterobacter aerogenes 48 여
J2K-743 Enterobacter aerogenes 26 여
J2K-755 Klebsiella pneumoniae 52 여
실시예와 비교예 들은 동일한 방법으로 제조하였으며, 표 1 과 같이, 차이점은 건강한 여성들의 안면 피부 시료를 채취하여 균주 분리하여 각각의 시료로 사용한 것이다.
실험예 1 : MMP-1 qPCR 실험방법
HDF(Human deraml fibroblast)cells를 3 × 105 / 60 mm culture dish에 분주하고 37%, 5% CO2 습윤 배양기에서 18 시간 동안 안정화시킨 후, serum free 배지로 교체하였다.
상기 Serum free 배지에 시료를 처리하고, 상기 실시예 1과 비교예 1 내지 4를 처리하고 20 시간 동안 반응하였다.
반응 후, 세포를 NucleoZOL lysis buffer(NM, 740404)를 이용하여 harvest한 뒤, MN사에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA isolation을 진행하였다.
이후, 분리된 RNA를 microplate reader를 이용하여 정량한 뒤 HiSenScript™ RH(-) RT PreMix Kit(intron, 25087)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
이후, 합성된 cDNA와 2X Real-Time PCR Master Mix & Premix(BioFACT)를 이용하여 real- time PCR 수행 후 증폭 산물을 정량 분석하였다.
상기한 실험 결과를 도 3에 도시하였으며, 도 3과 같이, 가로축은 각 실시예 및 농도에 따른 값이며, 세로축은 이에 따른 발현양에 관한 것이다.
단, UV 조사값은 보통 단위면적당 UV 조사량에 관한 것으로 통상적인 값을 적용하였다.
발현양이 증가할수록 보다 정확하고 세밀한 평가가 가능함으로 바람직하다.
실시예 1은 0.3 ~ 3%의 농도에서 농도의존적으로 MMP-1 mRNA 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.
비교예 1 ~ 4와 비교하였을 때도, MMP-1 mRNA 발현이 크게 증가되었음을 알 수 있었으며, 실시예 1의 3% 농도에서 종래 UV-B 조사를 이용한 주름 유발보다 MMP-1 mRNA 발현이 약 1.6배 ~ 1.7배 증가하는 것을 알 수 있었다.
실시예 1은 농도와 관계없이 기존 UV 조사 방법보다 발현양이 많다는 것을 알 수 있다.
따라서, 실시예 1의 3% 농도가 가장 바람직한 평가가 이루어진다고 판단된다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC14920BP 20220322
<110> J2KBIO CO., LTD. <120> A novel anti-wrinkle evaluation method that treats Enterobacter aerogenes J2K-739 strain derived from skin flora and Enterobacter genus derived from skin flora as an irritant <130> J2K-739 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 778 <212> RNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 1 gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg 60 aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat 120 gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga 180 cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 240 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 300 ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcgaggag gaaggcatta 360 aggttaataa ccttggtgat tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 420 agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 480 cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattcg 540 aaactggcag gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 600 gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 660 ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 720 tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcg 778 <210> 2 <211> 673 <212> RNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 2 ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt aagtcgaccg cctggggagt 60 acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 120 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaacttagc 180 agagatgctt tggtgccttc gggaactctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 240 gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag 300 cgatccggtc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga 360 cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa 420 agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga 480 gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg 540 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa 600 gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg cttaccactt tgtgattcat gactggggtg 660 aagtcgtaac agg 673

Claims (7)

  1. 피부 상재균으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14920BP의 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주.
  2. 피부 상재균으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14920BP 의 엔테로박터 에어로게네스 J2K-739 균주 또는 이의 배양물을 이용하여,
    주름을 유발시켜 소재를 평가하는 것을 특징으로 하는 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

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Title
식약처 민원인 안내서 <피부의 주름개선에 도움을 주는 기능성화장품 유효성평가 가이드라인> (2020.09.) *
식품의약품안전청 주관 최종보고서 <3차원 인공피부를 이용한 주름개선 화장품의 효력평가 방법개발> (2003.11.) *

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