KR101728895B1 - 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주, 이를 이용한 발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-epi70 군주, 이를 이용한 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 기탁번호 KCCM11698P로 수탁된, 비피도박테리움 속 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70) 균주를 제공한다.
Description
본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주, 이를 이용한 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 사람은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다(Peterson, 2009). 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있고, 각질세포(keratinocyte)와는 분화하여 떨어져 있다. 상기 표피는, 일명 “벽돌과 몰탈 구조”라고 불리는 형태를 띄고 있다(Elias 2007). 피부 조직은 계속적인 자가회복과정을 거치는데, 분화과정의 마지막을 거친 인설(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로, 신체에 유익(benefit)을 주는 균(Micro-organism)을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만(Rijkers et al., 2011), 피부 상재균과 피부의 상호관계에 대한 프로바이오틱스 연구는 미비한 실정이다. 한 연구결과에 따르면 프로바이오틱스 미생물의 군집 조절이 가능한 기능을 가지고 있으며, 대부분 유해한 균총을 억제하며 유익한 균총을 활성화 시키는 것으로 보고되었다(Million et al.,2013).
피부생태환경을 다시 살펴보면, 물리적인 요소들과 생물학적인 요소들이 잘 어우러져 다양한 서식처를 제공하며, 더 나아가 사람과 미생물 사이의 미묘한 균형에 대해 생각해 볼 수 있을 것이다. 공생관계의 균형이 무너지게 되면 그와 동시에 피부의 붕괴와 감염이 발생하게 된다(Grice and Segre 2011).
이번 연구에서는 인체 표피에 프로바이오틱스를 적용하여, 피부 상재균이 어떤 변화를 나타내는지 관찰하고, 더 나아가 상기 피부상재균의 변화를 유도하여, 잠재적 피부환경의 개선효과를 나타낼 수 있는지 연구하였다.
본 발명의 목적은 인체 자극이 없으며, 피부환경 개선효과가 우수한 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 이용한 발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 주름개선 및 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화 유도효과가 우수한 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 이용한 발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주 또는 상기 균주로부터 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 이용한 발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비피도박테리움 GFC-epi70 속 균주를 이용한 발효물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 기탁번호 KCCM11698P로 수탁된, 비피도박테리움 속 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70) 균주에 관한 것이다.
한 구체예에서 상기 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70) 균주는 서열번호 4의 16s rRNA로부터 동정될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 동정하기 위한 PCR 프라이머세트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주 또는 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주로부터 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도 및 피부주름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 이용한 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 제조방법은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균주를 여과하는 단계; 및 상기 여과된 균주를 숙성하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 신생아(생후 1년 미만)의 분변에서 Real-Time PCR 법을 활용하고, 자체 제작한 비피도박테리움 타겟 프라이머를 이용하여 균주를 분리하였다.
본 발명의 균주 GFC-epi70 발효물을 시험자의 얼굴에 처리 후 Pyrosequencing 기술을 이용하여 skin-microbiome의 변화를 확인하였으며, 균주GFC-epi70 발효물의 임상시험을 통하여 진피치밀도의 증가를 통해 피부주름개선능을 확인하였다.
본 발명에 따른 균주를 이용하여 생산된 발효물은 skin-microbiome 변화유도에 효과적이며, 피부의 진피치밀도 개선과 주름개선이 효과적인 장점이 있으며, 상기 균주를 이용한 발효물은 인체에 자극적이지 않고, 독성이 없기에 인체 친화적인 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 처리하였을 시 피부미생물 군집의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 적용하기 전/후의 피부상재 미생물 군집의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 진피 치밀도의 변화를 시간 경과에 따라 비교한 사진이다.
도 4는 피로시퀀싱(Pyrosequencing) 분석결과 피부에 분포하는 미생물의 분포도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 적용하기 전/후의 피부상재 미생물 군집의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 진피 치밀도의 변화를 시간 경과에 따라 비교한 사진이다.
도 4는 피로시퀀싱(Pyrosequencing) 분석결과 피부에 분포하는 미생물의 분포도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70)를 제공한다. 구체예에서 상기 비피도박테리움속 GFC-epi70 균주는 생후 1년 미만의 신생아의 분변을 혐기성 조건에서 배양하고, 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time polymerase chain reaction, RT-PCR)법을 활용하여, 비피도박테리움 타겟 프라이머를 이용하여 균주를 분리한다.
한 구체예에서 상기 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70) 균주는 서열번호 4의 16s rRNA로부터 동정될 수 있다.
본 발명은 상기 균주를 동정하기 위한 PCR 프라이머 세트를 제공한다. 상기 PCR 프라이머 세트는 비피도 박테리움 속에만 반응하여 증폭되도록 고안되었으며, 염기서열번호는 다음과 같다. Forward: GCGTGCTTAACACATGCAAGTC(서열번호 1), Reverse: CACCCGTTTCCAGGAGCTATT(서열번호 2), Probe: TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC(서열번호 3)
본 발명은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주 또는 상기 균주로부터 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도 및 피부주름 개선 효과가 우수한 프로바이오틱스 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 이용한 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 제조방법은 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균주를 여과하는 단계; 및 상기 여과된 균주를 숙성하는 단계;를 포함한다.
한 구체예에서 상기 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주를 멸균된 배지에 1.0x107 내지 1.0x109의 세균수가 되도록 하여 1%~3% 수준으로 접종하고, 혐기성 조건에서 정치 배양을 90~130 시간 동안 배양하고, 상기 배양된 균주를 pH 3.8~4.2 조건에서 여과한 다음, 상기 여과된 균주를 20℃~30℃에서 10~16일 동안 숙성하여 발효물을 제조할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 통상적인 것을 사용할 수 있다. 예를 들면 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)를 사용할 수 있다.
상기 여과는 통상적인 필터를 사용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예
Bifidobacterium
animalis
subsp
.
lactis
GFC
-
epi70의
분리
생후 10 개월된 신생아의 분변 1g을 채집하여 생리식염수와 혼합한 후 3시간 내에 실험실에 이송한 뒤 멸균 증류수에서 진탕하여 시료의 상등액을 취하였다. 이를 10-4배(부피)로 희석한 샘플 0.1mL을 가 MRS 한천배지(Peptospecial 10 g, beef extract 10g, yeast extract 5g, Glucose 20g, Triammonium Citrate 2g, sodium acetate 5g, maganessium sulfate 0.2g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, Agar 15g, Tween80 1g/L, pH 6.2±0.2, MBcell(Cat.No. MB-M1025))에 도말하여 혐기성 인큐베이터에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 형성된 집락 80개를 순수 분리 배양하여, 24 시간 동안 혐기인큐베이터에서 재배양하였다. 배양이 완료된 이후 동정을 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time polymerase chain reaction, RT-PCR) 전용 프라이머(Primer)를 사용하여 집락 동정하였다. 이때 사용된 프라이머는 비피도 박테리움 속에만 반응하여 증폭되도록 고안되었으며, 염기서열번호는 다음과 같다. (Forward: GCGTGCTTAACACATGCAAGTC, Reverse: CACCCGTTTCCAGGAGCTATT, Probe: TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC)
또한, PCR 증폭에 사용된 조건은 다음과 같다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분(42 사이클). 최종 PCR 반응이 끝난 뒤 Real-time pcr 곡선 그래프가 형성된 colony를 16s DNA 염기서열 분석을 통하여 비피도박테리움(Bifidobacterium)으로 확인하였으며, 분리명 GFC-epi70을 붙여 명명하고, 2015년 5월 22일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 수탁하여 기탁번호 KCCM11698P를 부여받았다.
Bifidobacterium sp. GFC-epi70의 MRS 배지 발효물 제조
분리된 Bifidobacterium sp. GFC-epi70의 MRS 배지 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지를 121℃에서 15분 동안 고압멸균을 실시한 뒤 37℃ 냉각이 완료되면, 1.0x109 의 세균수가 되도록 하여 1% 접종한다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 120 시간 동안 실시한다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤 육안상으로 배양액의 색상이 짙은 갈색임이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛ 필터(밀리포어) 제균을 실시한다. 필터가 완료되면 상온에서 2주간 숙성기간을 거쳐 MRS 배지 발효물을 제조한다.
피험자와 Skin-
Microbiome
샘플채집
본 실험에 사용된 샘플은 대한피부과학연구소(KDRI)에서 실시하였으며, 사전동의를 얻은 피험자를 대상으로 실험을 실시하였다. 시험에 사용된 프로바이오틱스(Probiotics)로는 상기 제조된 비피도박테리움 속 GFC-epi70(Bifidobacterium GFC-epi70)의 발효물을 사용하였으며, 배양 후 균체를 제거한 배양액을 피험자의 피부에 적용시켜 총 72 시간 동안 피부샘플을 채집하여 분석에 사용하였으며 채집방법은 참고문헌을 참고하였다(Zhang etal., 2012). 외부요인으로부터 변화가 상대적으로 적은 피부를 선정하기 위해 발의 피부(발등, 발바닥, 발가락)를 대상으로 실험을 실시하였다. 피부상재 미생물을 채취하기 위해 72 시간 동안 상기 프로바이오틱스를 6시간 간격으로 적용하였고, 프로바이오틱스 처리전(Epidermis A)과 처리 후 72 시간(Epidermis B) 샘플을 채집하였다. 피부 샘플 채집은 참고문헌을 바탕으로 멸균수와 스크래퍼를 이용하여 채집하였으며, 모든 작업은 clean bench 내에서 실시되었다. 본 연구는 IRB 심의기준에서 면제사유에 해당되는 것으로 확인하였다.
피부
상재미생물의
genomic
DNA 추출 및 DNA 증폭
피부로부터 채집된 샘플을 0.85% NaCl에 현탁한 상등액을 원심분리(17,000 rpm/m)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 1회 세척한 후, FastDNA SPIN KIT(MP Biomedical, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA gene 증폭을 위하여 GC clamp(5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG- 3’)가 부착된 341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG- 3’)와 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)를 이용하였다[18,25]. PCR 반응은 0.4 mM dNTP, 0.5 units Taq polymerase, 4 mM Mg2 +이 함유된 Takara Perfect Premix (Takara, Japan) 10 ㎕에 DNA template(20 μg/mL) 1㎕, 1.0 μM forward primer와 1.0 μM reverse primer를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20 ㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응은 C1000-Dual (Bio-Rad, USA)를 이용하여 64℃에서 50℃까지 온도를 낮추면서 2 cycle씩 증폭을 실시하는 touch down PCR 방법을 사용하였으며, 최종적으로 72℃에서 8분 처리 후, 4℃에서 보관하였다. 얻어진 PCR 산물을 이용하여 DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석에 사용하였다.
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (
DGGE
)
DGGE 분석에는 D-code system (Bio-rad, USA)을 사용하였다. 사용한 polyacrylamide gel 농도는 8% 였고, 40% polyacrylamide bis-solution 29:1 (3.3% C) (Bio-Rad, USA)이 40%~60% 사이의 농도 구배가 수직으로 형성되도록 제작하였다. 이때 사용된 변성제는 7 M urea와 40% (w/v) formamide (Sigma, USA)였다. D-code system에 약 7ℓ의 TAE buffer (20 mM Tris, 10 mM acetic acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)를 채우고, 2 X loading dye (0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol, 70% glycerol)와 PCR 산물을 동량 혼합해 50V에서 800 분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 마친 polyacrylamide gel은 Redsafe(Intron, Korea) 용액에서 15 분간 염색 후 나타난 특정 밴드를 분석하였다.
Pyrosequencing
분석
사람의 피부에서 채집된 샘플의 DNA를 추출하고 주형으로 사용하여 16S rRNA 유전자 증폭은 V1에서 V3까지의 지점(region)을 목표로, primer 27f (5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 518r (5’-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’)를 기반으로 한 fusion primer를 사용하였고, 각 primer 20pmol과 추출된 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. PCR mixture는 template 1 ㎕, 10xbuffer (w/o MgCl2) 5㎕, dNPTsmixture(100mM) 1㎕, primers(forward/reverse)20pmol 2㎕, Taqpolymerase(Roche, Basel, Switzerland)(5U/㎕) 0.25㎕로 구성하였다. DNA 증폭을 위해 2720 thermal cycler 모델(Applied biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 emPCR 증폭(amplification)을 수행하였다. 절차는 initial denaturation (94℃, 4분)을 한 후, denaturation (94℃, 30초), annealing(58℃, 4분 30초), extension (68℃, 30초)한 것을 50 cycle 반복 수행한 후 마지막으로 10℃에서 정지(Hold)하였다. 증폭된 PCR 산물은 각각 bead에 부착하여 PCR을 하고 GS FLX titanium system (Roche, USA) 염기서열 분석기를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 진행하였다.
자료분석 및 통계처리
DGGE 결과의 band intensity는 GelCompar2 (Bionumeric, Belgium)를 이용하여 이미지를 히스토그램 하고 수치화하여 분석하였고, 생물다양성 자료분석 및 ACE, Chao1, ICE 등과 같은 지수는 EstimatesS 프로그램을 이용하여 작성하였다(Colwell etal.,2005). Rarefaction curve는 PAST 프로그램을 이용하여 작성하였다(Hammer etal.,2001).
임상 시험방법
시험물질 적용 방법
실제 사용법과 동일하게 하기 위해 시험의뢰자가 제공한 사용방법을 피험자에게 교육하였다.
의뢰자가 제공한 사용방법은 다음과 같다: 아침, 저녁 적당량을 취하여 얼굴 전체에 부드럽게 발라준다.
시험 순서
(1) 첫 번째 방문일
- 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다.
- 피험자는 시험 방법과 일정 및 위험성과 가능한 이상반응 등에 대해 설명을 듣고 기초정보를 작성하고 동의서에 서명하였다.
- 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후 30분간 항온항습 조건(20℃~24℃, 40~60%RH)에서 안정을 취하였다.
- 평가 시마다 동일한 부위에서 측정이 이루어질 수 있도록 다음과 같이 측정부위를 구획하였다.
(a) Cutometer? 측정 시험부위: 양측 입꼬리(lip commissure)와 동측 이주(tragus)를 연결한 가상선의 1/2 지점
Cutometer Parameter setting: On-time 2 sec / Off-time 2 sec / Pressure 450 mbar / Repetition 3 times
(b) Ultrascan UC-22? 측정 시험부위: 양측 눈꼬리(Lateral canthus)로부터 수평 외측으로 1cm 떨어진 지점.
- 안면의 우측과 좌측을 무작위로 시험부(시험제품 도포 부위) 및 대조부(대조제품 도포 부위)로 분류하였다.
- 양측 측정지점에서 Cutometer?를 이용하여 탄력도를, Ultrascan UC-22?를 이용하여 진피 치밀도(Dermal density)를 측정하였다.
- 피험자 주의사항과 제품 사용법을 교육한 후 제품을 배포하였다.
- 시험기간 동안 매일 전화 등의 방법으로 제품사용의 순응도를 체크하였다.
(2) 두 번째 방문일 (2주차)
- 첫 방문일과 동일한 방법으로 동일한 부위에서 기기평가를 시행하였다.
- 피부과 전문의가 이상반응 유무를 평가하였다.
(3) 세 번째 방문일 (4주차)
- 첫 방문일과 동일한 방법으로 동일한 부위에서 기기평가를 시행하였다.
- 피부과 전문의가 이상반응 유무를 평가하였다.
평가 및 분석 방법
(1) Cutometer?를 이용한 탄력 개선 효과 평가: 시험군의 사용 전,후 탄력 측정치 간의 통계학적 유의성을 하기 표 1과 같이 SPSS(Version 19.0.0)프로그램의 Wilcoxon 부호 순위 검정을 이용해 분석 및 검증하였다.
탄력효과 개선 정도는 하기 식 1과 같이 % 값으로 도출하였다.
[식 1]
탄력효과 개선율(%)=[(제품사용측정치-제품사용전 측정치)/제품사용전 측정치]*100
시험군과 대조군의 2주차, 4주차에 측정된 피부 탄력 측정치 변화량 간의 통계학적 유의성을 하기 표 2와 같이 SPSS(Version 19.0.0)프로그램의 Mann-Whitney 비모수 검정을 이용해 분석 및 검증하였다.
(2) Ultrascan UC-22를 이용한 진피 치밀도 개선 효과 평가: 시험군의 사용 전 후 진피치밀도 측정치 간의 통계학적 유의성을 SPSS(Version 19.0.0) 프로그램의 Wilcoxon 부호 순위 검정을 이용해 분석 및 검증하였다.
시험군과 대조군의 시험전 대비 2주차 및 4주차에 측정된 진피 치밀도 수치 변화량 간의 통계학적 유의성을 SPSS(Version 19.0.0)프로그램의 Mann-Whitney 비모수 검정을 이용해 분석 및 검증하였다.
(3) 피부과 전문의에 의한 안전성 평가: 시험기간 중 피험자 방문일마다 제품사용에 의한 부작용(홍반, 부종, 인설, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림 및 기타 이상증) 발생 여부를 평가하였다.
피시험자
선정기준
(1) 만 30세 이상 50세 미만의 성인 여성으로 피부과 전문의의 검사를 통해 시험에 적합한 피부상태를 가지고 있다고 판단된 사람
(2) 시험에 대한 충분한 설명(시험과정, 발생 가능한 부작용 등)을 받아 이를 이해하고 자유의지로 시험에 참여하기로 한 사람
(3) 시험기간 동안 원활한 추적관찰이 가능한 사람
제외기준
피험자와의 면담을 통해 다음 사항에 해당되는 사람은 피험자에서 제외하였다.
(1) 피부질환 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 사람
(2) 동일한 실험에 참가한 뒤 6개월이 경과되지 않은 사람
(3) 민감성, 과민성 피부를 가진 사람
(4) 시험부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 사람
(5) 연구 시작 전 3개월 내에 시험부위에 동일 또는 유사한 효능의 화장품 및 의약품 등을 사용한 사람
(6) 연구 시작 전 6개월 내에 시험부위에 시술을 받은 사람
(7) 그 외 시험자의 판단으로 시험이 어렵다고 생각되는 경우
중도탈락기준
(1) 시험부위에 소양감이나 홍반 등의 유해사례가 발생한 경우
(2) 피시험자가 실험진행과정 중 시험 부위에 과도한 자외선 노출을 하거나 지나친 음주, 흡연 등으로 결과의 평가에 장애가 발생한 경우
(3) 피시험자가 실험 진행 과정 중 개인사정에 의해 추적관찰이 어려운 경우
(4) 기타 시험자가 시험지속이 어렵다고 판단하는 경우
피시험자의
숫자와 이에 대한 근거
본 시험은 본 발명에 따른 프로바이오틱스(비피도박테리움 속 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70)의 발효물)의 피부 탄력 및 진피 치밀도 개선 효과와 관련된 제품 고유 특성과 그 사용 안전성을 평가하기 위한 임상시험으로서 대한피부과학연구소 자체 규정 및 의뢰자의 요구에 따라서 10명 이상의 피험자를 확보하고자 하였으며 최종 피험자의 숫자는 11명이었다. 피험자 기본 정보는 하기 표 4와 같다.
| No. | ID | Gender | Age |
| 1 | 966 | Female | 32 |
| 2 | 812 | Female | 35 |
| 3 | 734 | Female | 35 |
| 4 | 763 | Female | 38 |
| 5 | 764 | Female | 38 |
| 6 | 672 | Female | 38 |
| 7 | 661 | Female | 42 |
| 8 | 144 | Female | 45 |
| 9 | 807 | Female | 46 |
| 10 | 699 | Female | 46 |
| 11 | 974 | Female | 49 |
탄력개선시험
피부는 탄력성을 지닌 고체(solid)의 성질뿐만 아니라 점성을 갖는 유체(fluid)의 성질을 동시에 지니며, 이와 같은 피부의 기계적 특성을 점탄성(viscoelasticity)이라고 한다. 피부 탄성(elasticity)의 경우 콜라겐(collagen)과 탄력소(elastin)간의 연결체 구조들에 의해 발생되며, 점성(viscosity)의 경우 하이알루론산 등을 포함하는 세포 외 기질들에 의해 구성되는 유체성분에 의해 발생된다. 피부의 점탄성은 탄력에 의한 피부 변형에 부가적인 움직임을 제공함으로써 외력에 대해 좀 더 효과적으로 피부를 보호할 수 있게 한다.
피부의 점탄성을 측정하는 방법에는 단축으로 신장시키는 방법(uniaxial stretching), 탄도를 이용한 방법(ballistometry), 비틀림을 이용한 방법(torsion), 톱니형을 이용한 방법(indentation), 흡입강을 이용한 방법(suction) 등이 있으며 이중 흡입강을 이용한 방법이 최근 가장 많이 연구되고 있는 재현성 높은 방법이다. Cutometer?는 흡입강을 이용한 대표적인 피부 점탄성 측정장비로서 R0~R9, F1~4등 다양한 수치들을 제공하며 피부 탄력성과 관련된 여러 연구들에서 이용되고 있다. 초기 외력에 의해 발생하는 전체 변형 정도에 대비한 즉각적인 복원 정도가 가장 중요한 지표일 수 있다는 점에서 이를 대변하는 R7 수치가 최근 주목 받고 있으며 실제로 많은 연구들에서 특히 노화의 진행과 관련해서 가장 상호연관성이 높은 지표로 R7을 언급하고 있다.
본 시험에서는 4 주간의 기간 동안 피험자들을 대상으로 Cutometer?를 이용한 탄력개선 효능을 R7 수치의 변화를 통해 평가하였으며, 평과 결과를 하기 표 5 내지 표 8에 나타내었다.
* 피부탄력 측정값(R7) - 시험 부위(시험제품 도포 부위)
| ID | 제품 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 |
| 966 | 0.3574 | 0.4000 | 0.4308 |
| 812 | 0.3658 | 0.3646 | 0.3894 |
| 734 | 0.2378 | 0.3995 | 0.4268 |
| 763 | 0.2804 | 0.3788 | 0.3422 |
| 764 | 0.2995 | 0.3372 | 0.3393 |
| 672 | 0.3436 | 0.4329 | 0.4496 |
| 661 | 0.2651 | 0.3245 | 0.3639 |
| 144 | 0.2373 | 0.2740 | 0.3134 |
| 807 | 0.3013 | 0.3587 | 0.3638 |
| 699 | 0.2367 | 0.2839 | 0.3558 |
| 974 | 0.2392 | 0.2770 | 0.3333 |
* 피부탄력 측정값(R7) - 대조 부위(대조제품 도포 부위)
| ID | 제품 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 |
| 966 | 0.3759 | 0.3803 | 0.3911 |
| 812 | 0.3144 | 0.3174 | 0.3615 |
| 734 | 0.3743 | 0.4684 | 0.4458 |
| 763 | 0.3029 | 0.3721 | 0.2845 |
| 764 | 0.3364 | 0.3234 | 0.3201 |
| 672 | 0.3396 | 0.3891 | 0.3898 |
| 661 | 0.2339 | 0.2920 | 0.3135 |
| 144 | 0.2513 | 0.2608 | 0.3018 |
| 807 | 0.3095 | 0.3509 | 0.3341 |
| 699 | 0.2510 | 0.2926 | 0.2715 |
| 974 | 0.2505 | 0.2702 | 0.3204 |
* 시험 제품 사용부위의 탄력도 변화
| 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 | |
| 탄력수치 (R7) | 0.2876 | 0.3483 | 0.3735 |
| 탄력 개선율( % ) | - | 21.11 | 29.87 |
| P-value(VS 사용 전) | - | 0.004* | 0.003* |
* 피부탄력 측정값(R7) 증가량
| 사용 2주 후 | 사용 4주 후 | |
| 시험제품 도포 부위 | 0.0606 | 0.0858 |
| 대조제품 도포 부위 | 0.0343 | 0.0359 |
| P-value | 0.243 | < 0.008* |
상기 표 5 내지 표 8을 참조하면, 본 발명의 균주 발효물을 피부에 적용시 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.
진피치밀도
개선 시험
피부 노화는 내적(intrinsic) 노화 및 외적(extrinsic) 노화의 두 가지 과정에 의해 유발된다. 내적 노화는 시간의 흐름에 따라 유전적 요소에 의해 결정된 과정에 의해 유발되며 미세한 피부 주름 형성을 특징으로 하며 자외선 등의 외적 노화 인자들은 거칠고 깊은 주름을 유발하는 것을 특징으로 한다. 내적 노화 및 외적 노화에 의해 발생한 주름은 조직학적으로 살펴보면 먼저 내적 노화의 경우 세포 외 기질(extracellular matrix)의 위축과 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastic fiber)의 감소를 특징으로 하며 광노화 등의 외적 노화의 경우 엘라스틴의 변성 및 축적, 제1,3,7형 콜라겐의 감소가 특징적이다. 이와 같은 진피 내 조직학적 변화는 내적 및 외적 노화 모두 공통적으로 기질 분해 효소(matrix metalloproteinase)의 증가로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다.
초음파측정기를 이용한 진피 치밀도(dermal density) 측정은 항노화 화장품의 효능평가에 이용되고 있는데, 실제로 피부 노화의 주 증상인 주름의 정도와 진피 치밀도 측정수치 간에는 음의 상관관계가 있음이 보고된 바 있으며 앞서 기술한 바와 같이 노화에 의한 진피층 변화가 주로 콜라겐 생성양의 저하의 양상으로 나타난다는 점에서 노화된 진피층의 개선효과를 진피 치밀도 측정으로 간접적으로 평가할 수 있다.
본 시험에서는 4주간의 시험기간 동안 피험자들을 대상으로 시험물질 사용으로 인해 유발될 수 있는 진피층의 변화를 초음파 측정기를 통해 평가하여 하기 표 9 내지 표 11, 및 도 3에 그 결과를 나타내었다.
* 진피 치밀도(Dermal density) 측정값 (%): 시험 부위(시험제품 도포 부위)
| ID | 제품 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 |
| 966 | 15 | 23 | 22 |
| 812 | 19 | 20 | 26 |
| 734 | 18 | 26 | 28 |
| 763 | 12 | 16 | 13 |
| 764 | 16 | 16 | 15 |
| 672 | 15 | 23 | 24 |
| 661 | 11 | 13 | 15 |
| 144 | 15 | 22 | 23 |
| 807 | 17 | 20 | 21 |
| 699 | 16 | 15 | 19 |
| 974 | 13 | 16 | 19 |
* 진피 치밀도(Dermal density) 측정값 (%): 대조 부위(대조제품 도포 부위)
| ID | 제품 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 |
| 966 | 15 | 21 | 19 |
| 812 | 20 | 19 | 24 |
| 734 | 18 | 23 | 23 |
| 763 | 12 | 15 | 11 |
| 764 | 16 | 19 | 16 |
| 672 | 15 | 22 | 21 |
| 661 | 10 | 10 | 13 |
| 144 | 16 | 20 | 21 |
| 807 | 17 | 19 | 20 |
| 699 | 15 | 13 | 17 |
| 974 | 13 | 13 | 17 |
* 시험 제품 사용부위의 진피 치밀도 변화
| 사용 전 | 사용 2주 후 | 사용 4주 후 | |
| 진피치밀도 ( % ) | 15.18 | 19.09 | 20.45 |
| P-value(VS 사용전 ) | - | 0.008* | 0.005* |
도 3은 Dermal density improving d in vivo test의 결과 사진으로, 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주 발효물을 5% 포함하는 크림을 피부에 도포하여 진행하였다. 상기 도 3을 참조하면 본 발명의 발효물을 피부에 도포하고 2주 및 4주 경과 후에 진피치밀도를 측정시, 균주 발효물 사용 전보다 진피치밀도가 증가한 것을 알 수 있었으며. 이를 통해 본 발명의 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주발효물을 적용시 피부탄력이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 상기 표 9 내지 표 11을 참조하면, 본 발명의 비피도박테리움 속 GFC-epi70 발효물을 피부에 적용시 진피 치밀도의 증가 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험결과
DGGE
방법을 이용한
피부상재
미생물의 변화 분포 및 구조
사람의 피부로부터 채집된 샘플 Epidermis A 와 Epidermis B 에서 미생물을 분리 배양하지 않고 직접 DNA를 추출하여 DGGE 전기영동을 실시한 결과, Epidermis A 에서는 28개의 band가 분리되었고, 11종이 Uncultured bacterium, 13종이 Staphylococcus 속(genus) 이었고, Bacilluslicheniformis, Micrococcussp., Rhodococcussp., Brevibacteriumsp.으로 확인되었다. Epidermis B 는 16개의 band가 분리되었고, 2종의 Uncultured bacterium DGGE band, 7종의 Uncultured bacterium clone, 5종의 Staphylococcus 속(genus), Cellulomonassp.Amycolatopsissp.으로 확인되었으며, 각 band의 확인결과는 하기 표 12와 같다.
상기 표 12를 참조하면, 본 발명의 발효물을 적용한 Epidermis B의 피부 상재미생물 변화는 아무것도 처리하지 않은 대조군 Epidermis A와 발효물을 적용한 Epidermis B의 band 패턴을 비교하였을 때 종 다양성의 큰 변화를 확인하였고, Staphylococcus 속(genus)에 속하는 것으로 확인된 band들이 우점종임을 확인하였으며, 본 발명의 프로바이오틱스를 적용한 Epidermis B에서 Staphylococcus 속(genus) 밴드(band)의 강도(intensity)가 더욱 활성화되는 것으로 확인되었다. 이와 반대로 Uncultured Sphingomonas, Uncultured alpha Proteobacterium, Sphingominas sp., 및 Micrococcus sp.에 속하는 개체들의 band intensity는 감소하는 것을 확인하였다(도 1 참조). DGGE band intensity는 개체군의 수가 많거나 적은 정도를 의미하는데, 이번 연구결과에서 Staphylococcus 속(genus)이 발의 피부에서 중요한 우점종 임을 확인하였다. DGGE gel의 이미지 사진은 Gelcompar2(Bionumeric Belgium) 프로그램을 사용하여 band의 intensity를 histogram 데이터로 변환하여 수치화하였고, 이 데이터를 기반으로 band Profile을 작성하여 하기 표 13에 나타내었다. 하기 표 13을 참조하면, Epidermis A의 Richness와 Shannon diversity 는 8.22, 3.18인 것으로 분석되었고, Epidermis B는 4.71, 2.51 로 분석되었다. Epidermis A의 Richness는 Epidermis B와 비교하였을 때 약 2배 높은 것으로 확인되며, Shannon 지수도 약 1.5배 높은 것으로 확인되었다. Epidermis A 의 evenness는 0.96, Epidermis B는 0.91로 확인되었고, Simson’s 지수는 Epidermis A 0.05, Epidermis B 0.09로 확인되었다. Shannon (H) 지수는 포괄적 다양성을 의미하는 것으로서 개개의 생물 종의 중요 값과 총 개체수를 가지고 계산되는 지수이며, 이 지수가 증가하면 미생물 군집의 다양성이 증가한다는 의미이고(Kern et al.,2003),(Nahar et al.,2006), evenness(e) 지수는 Shannon(H) 지수를 종(species)수의 로그값으로 나눈 값으로 생물종들 사이의 분포 비율을 판별하는 지수로 1에 가까울수록 미생물 군집이 균등하게 분포하고 있음을 의미한다.
DGGE 방법을 이용한 피부미생물의 변화 분포 및 구조를 분석한 결과Probiotics를 피부에 적용함에 따라 피부 상재미생물의 변화하는 것으로 사료되며(Farnleitner et al.,2004)의 결과에서 DGGE 방법은 적은 양의 DNA를 PCR로 증폭하고 증폭된 DNA를 이용함으로써 종 다양성을 더 정밀하게 확인할 수 있는 방법이라고 보고하였고, (Kim et al.,2006)은 더 다양한 미생물뿐만 아니라 배양을 통해서는 표현 되지 않는 미생물까지도 확인할 수 있다고 보고하였다. (Grice and Segre 2011)의 결과에서 Staphylococcus sp. 그리고 Corynebacterium sp. 등이 피부의 우점종으로 확인된다고 보고하였으며, 피부의 부위별 차지하는 비율이 다른 것으로 보고되었고, 본 연구에서도 Staphylococcus 속(genus)에 포함되는 종들이 우점종임을 DGGE 분석결과 확인할 수 있었다.
Pyrosequencing
방법을 이용한 피부 미생물의 변화 분포 및 구조
분석을 실시하기 위해 각 샘플의 전처리를 거친 후 Pyrosequencing 방법을 이용하여 총 21,327개의 염기서열(평균길이 345 bp)을 확보하였다. 하기 표 13을 참조하면, Pyrosequencing 결과 Epidermis A 샘플은 3,987개의 염기서열이 확인되었고, Epidermis B는 6,513개의 16S rRNA gene sequence를 획득할 수 있었다.
도 4는 피로시퀀싱(Pyrosequencing) 분석결과 피부에 분포하는 미생물의 분포도를 나타낸 그래프이다. 상기 도 4를 참조하면, 미생물의 문(phylum) 분류결과, Epidermis A의 경우 Firmicutes(52.4%)>Actinobacteria(27.3%)>Proteobacteria(20.2%)>Deinococcus-Thermus(0.1%)순으로 4개의 문으로 동정되었고, Epidermis B의 경우 Firmicutes(51.7%)>Actinobacteria(47.6%)>Proteobacteria(0.7%)순으로 3개의 문이 분포하였다.
속(genus)별로 구분해보면, Epidermis A 에서는 Staphylococcus (50.3%)>Corynebacterium(25.6%)>Enhydrobacter(17.5%)비율로 나타났고, 1%미만으로 확인된 속(genus)들은 25그룹이었다. Epidermis B에서는 Staphylococcus(49.2%)>Corynebacterium(47.4%)>Eremococcus(1.2%)>Clostridium(1.1%)비율로 확인되었고, 1% 미만으로 확인된 속(genus)들은 9그룹이었다. 본 발명의 프로바이오틱스를 epidermis에 적용후 미생물 군집의 변화량은 Staphylococcus 속(genus)은 1% 미만으로 비율의 변화가 거의 없었고, Corynebacterium 속(genus)이 21.9% 증가하였으며, Enhydrobacterium 속(genus)은 16.9% 감소하는 변화를 나타냈다.
사람의 epidermis 에서는 Staphylococcus sp.가 일반적으로 발견되는 기생 또는 공생 미생물로 알려져 있으며, Corynebacterium sp.의 경우 신체부위별 epidermis마다 차이가 있지만 많은 수의 개체수가 확인되는 것으로 알려져 있다(Callewaert etal.,2013). Staphylococcus 속(genus)은 상기 프로바이오틱스의 사용으로 분포비율의 영향을 받지 않는 것으로 확인되었으며, Corynebacterium 속(genus)은 사용전(Epidermis A)보다 분포비율이 증가하고 Enhydrobacter 속(genus)은 감소되는 것으로 확인되었다. 이는 상기 프로바이오틱스의 사용으로 Corynebacterium 속(genus)의 군집 증가에 영향을 미쳤으며, 반대로 Enhydrobacter 속(genus) 은 군집 감소에 영향을 미치는 것으로 사료된다. Operational taxonomic unit(OTU)은 분류의 대상이 되는 생물체의 개체 또는 군을 나타내고 일반적으로 종을 말하는데, 하기 표 13의 epidermis에 본 발명의 발효물을 적용하기 전, 후의 피부상재 미생물 군집의 분석 결과를 보면, Epidermis A가 Epidermis B Sequencing read 에 비해 OTU 값이 약 2배 높게 확인되어 Richness가 높은 것으로 확인되었다. 도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-epi70 균주의 발효물을 피부에 적용하기 전/후의 피부상재 미생물 군집의 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 2를 참조하면, Epidermis A 와 Epidermis B의 희박화곡선(Rarefaction curve)의 기울기는 큰 차이를 나타냄을 알 수 있다. 하기 표 14를 참조하면, Shannon 지수에 근거하여 분석한 결과, Epidermis A가 1.84, Epidermis B는 1.24로 확인되었으며, 본 발명의 프로바이오틱스의 사용으로 epidermis의 종다양성도 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 최소 종 추정치는 ACE, ICE, Chao 1, Chao 2 방법으로 분석하였고, Epidermis A 에서는 각각 71종, 75종, 71종, 73종 Epidermis B 는 72종, 73종, 72종, 73종이 존재하는 것으로 추정되었다.
Epidermis에서 흔하게 발견되는 미생물은 주로 Staphylococcus 속, Corynebacterium속에 포함된 종들이 있다. 신체부위에 따라 피지선이 많이 발달된 부위에서는 Propionibacterium 속 또한 흔하게 발견된다. 이런 피부 상재미생물들은 일반적으로 대부분 인체에 무해하지만 때에 따라 감염을 일으키는 원인이 되기도 한다(Grice and Segre 2011). 미생물들의 인체의 피부에서 공생관계 또는 기생관계에 대한 의문점은 오랜시간 동안 제시되어 왔지만 최근에 발표된 연구결과에 따르면, Staphylococcusepidermids는 피부에서 biofilm을 형성하여 외부로부터 다른 미생물의 감염 또는 번식을 억제 하는 것으로 보고되었다. 또한 S.epidermidis 는 glutamyl endopeptidase protein(encoded by the esp gene)을 생성하고, 인체의 AMP β-defensin 2 (also known as β-defensin 4A)를 발현유도하여 S.aureus 의 정착을 방해하는 것으로 확인되었다. (Iwase etal.,2010) 게다가 공생미생물들은 인체의 많은 틈새에 자리를 잡고서 외부의 병원균으로부터의 감염을 막고 있다. 이런 공생미생물들은 피부아래의 T-cell 들을 학습시키며, 병원균들과 같은 미생물로부터 방어할 수 있도록 인지를 시키는 것으로 보고되었다 (Fredricks 2001). 또한 (Braff etal.,2005) 의 연구결과에서도 피부의 미생물들은 keratinocyte 와 상호작용을 거쳐 다양한, cytokines, chemokine 및 microbial pepetides 를 유도한다고 보고되었다. 또한 본 발명의 발효물을 처리후 피부의 미생물 군집의 변화를 Pyrosequencing 분석결과, Proteobacteria에 속하는 종들의 대부분은 epidermis에서 억제되는것으로 확인되었는데, 피부상재 미생물의 군집 중에서 Proteobacteria 는 다양한 외부 환경을 접촉함으로 인하여 전달되는 것으로 사료된다. 많은 연구결과에서 Proteobacteria가 차지하는 비율이 세균의 주요한 문중에서 가장 큰 그룹이고, 여러 속(genus)를 포함하며, 대부분의 Proteobacteria들은 자연환경에서 흔하게 발견되는 그룹으로 알려져 있다(Woese 1987).
결론적으로 이번 연구결과 피부에 Staphylococcus 속(genus)와 Corynebacterium 속(genus)들의 분포율이 각각, 45% 이상으로 우점하고 있기 때문에 다른 미생물들이 피부에 정착하기 어렵고 경쟁적인 관계에서 밀려난 것으로 사료된다. (Grice and Segre 2011) 등의 연구결과에서도 피부의 Staphylococcus 속(genus)과 Corynebacterium 속(genus)에 속하는 미생물들이 신체부위별 차이는 있지만 주된 피부 상재 미생물 임을 보고하였고, 여러 외부요인으로 인한 변화가 생겨도 Staphylococcus 속(denus)과 Corynebacterium 속(genus)의 군집은 일정한 수준으로 유지되는 것으로 보고되었다. 이는 우점도가 높아 다른 외부요인에 의한 영향을 받아도 일정한 수준으로 빠르게 우점되는 것으로 사료된다. 결론적으로 본 발명의 발효물은 피부상재균의 변화를 유도하고 Staphylococcus 속(genus) 및 Corynebacterium 속(genus)과 같은 피부상재균의 우점도를 증가시켜 잠재적으로 피부환경개선에 효과가 나타나는 것으로 사료되며, 추가적으로 이를 뒷받침하기 위해 많은 시험대상으로부터 이번 연구에서 실시된 방법을 적용하여 분석하고 통계처리가 병행되어야 할 것이다.
* 발효물 처리 전 후 Pyrosequencing 다양성 지수 통계 결과
| Parameter |
Epidermis A
( 처리전 ) |
Epidermis B
( 처리후 ) |
| Total height of intensity | 1930 | 1539 |
| No. of Major Band | 28 | 16 |
| Richness a | 8.22 | 4.71 |
| Shannon(H) b | 3.18 | 2.51 |
| Evenness(e) c | 0.96 | 0.91 |
| Simpson's(D) d | 0.05 | 0.09 |
* 발효물 처리 전 후 미생물 군집의 다양성 지수(OTUs)
| Total Read a | OTUs b | ACE | ICE | Chao1 | Chao2 | Shannon c | ESC d | |
| Epidermis A | 3984 | 53 | 71 | 75 | 71 | 73 | 1.84 | 0.99 |
| Epidermis B | 6513 | 29 | 72 | 74 | 72 | 73 | 1.24 | 0.99 |
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> GFC Company Limited
<120> Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70, fermented
material using the same and manufacturing method thereof
<130> AJP15276
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
gcgtgcttaa cacatgcaag tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
cacccgtttc caggagctat t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 3
tcacgcatta ctcacccgtt cgcc 24
<210> 4
<211> 1345
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16s rRNA sequence for isolation of Bifidobacterium animalis
subsp. lactis GFC-epi70
<400> 4
cgggatccct ggcagcttgc tgtcggggtg agagtggcga acgggcctac ttgcgtgacc 60
aacctgccct gtgcaccgga atagctcctg gatacgggtg gtaataccgg atgctccgct 120
ccatcgcatg gtggggtggg aaatgctttt gcggcatggg atggggtcgc gtcctatcag 180
cttgttggcg gggtgatggc ccaccaaggc gttgacgggt agccggcctg agagggtgac 240
cggccacatt gggactgaga tacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 300
tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga cgccgcgtgc gggatggagg ccttcgggtt 360
gtaaaccgct tttgttcaag ggcaaggcac ggtttcggcc gtgttgagtg gattgttcga 420
ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttatc 480
cggatttatt gggcgtaaag ggctcgtagg cggttcgtcg cgtccggtgt gaaagtccat 540
cgcctaacgg tggatctgcg ccgggtacgg gcgggctgga gtgcggtagg ggagactgga 600
attcccggtg taacggtgga atgtgtagat atcgggaaga acaccaatgg cgaaggcagg 660
tctctgggcc gtcactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 720
cctggtagtc cacgccgtaa acggtggatg ctggatgtgg ggccctttcc acgggtcccg 780
tgtcggagcc aacgcgttaa gcatcccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca 840
aagaaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg 900
aagaacctta cctgggcttg acatgtgccg gatcgccgtg gagacacggt ttcccttcgg 960
ggccggttca caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1020
tcccgcaacg agcgcaaccc tcgccgcatg ttgccagcgg gtgatgccgg gaactcatgt 1080
gggaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcagatcatc atgcccctta 1140
cgtccagggc ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaacg cggtgcgaca cggtgacgtg 1200
gggcggatcg ctgaaaaccg gtctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1260
ggcggagtcg ctagtaatcg cggatcagca acgccgcggt gaatgcgttc ccgggccttg 1320
tacacaccgc ccgtcaagtc atgaa 1345
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- 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지고, 기탁번호 KCCM11698P로 수탁된 비피도박테리움 애니멀리스 락티스 GFC-epi70(Bifidobacterium animalis subsp. lactis GFC-epi70) 균주를 동정하기 위한 PCR 프라이머세트.
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