JP7117049B2

JP7117049B2 - 新規なキューティバクテリウムグラニュローサム菌株、該菌株またはその培養物を含むにきび予防または治療用組成物

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Publication number: JP7117049B2
Application number: JP2021510373A
Authority: JP
Inventors: パク，ハン－ス
Original assignee: ゲノムアンドカンパニー
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-05-24
Also published as: JP2021533809A; WO2020040408A1; US20210315801A1; TWI736911B; CN112771149A; US11406589B2; KR101927988B1; TW202023585A; EP3842515A4; EP3842515A1

Description

KCTC

KCTC13597BP

本発明は、新たに分離、同定及びその効能が評価された新たな菌株及びその培養物に関する。また、本発明は、このような新菌株またはその培養物を含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、新規菌株またはその培養物を含む、にきび改善効果を含む皮膚改善効能など多様な効能を有する化粧料組成物に関する。

本出願は、２０１８年８月２３日出願の韓国特許出願第１０－２０１８－００９８８８０号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に組み込まれる。

皮膚における炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、物理的な刺激や化学物質、細菌などによって皮膚損傷が誘発されるとき、それを防御するための作用として始まり、多様な兔疫細胞と炎症誘導サイトカインが関与する。ＩＬ－６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）、ＩＬ－８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８）、ＩＬ－１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－β）などが代表的な炎症誘導サイトカインである。ＩＬ－１βは活性化した単核食細胞、上皮細胞、血管内皮細胞によって生成されて炎症反応を媒介する典型的なサイトカインであり、ＩＬ－６はＴ細胞及び大食細胞によって分泌されて免疫反応を刺激し、炎症反応を調節するサイトカインである。また、活性化した大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は、炎症誘導サイトカインだけでなく、一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ：ＮＯ）やプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）Ｅ２（ＰＧＥ２）を過剰に生成して炎症過程をさらに活性化させる。例えば、炎症性サイトカインによる刺激に反応した末梢血単核、組織マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞などの様々な細胞でＩＬ－８発現が誘導される。

上昇した（例えば、過剰な）炎症誘導サイトカインに関連する炎症性疾患としては、にきび、炎症性角化症（例えば、乾癬）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患などが挙げられる。

アトピー皮膚炎（ＡＤ、ＡｔｏｐｉｃＤｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、痒みを伴う炎症性皮膚疾患であって、慢性的であり、通常は幼児期に始まる。ＡＤは、継続的な痒みを主な症状とし、特別な理由なく回復と悪化を繰り返す特徴を有する。ＡＤに関する近年の多くの研究にもかかわらず、未だにＡＤの原因については明確に知られていない。

にきび（ａｃｎｅ）は、皮膚の皮脂腺の炎症性疾患を意味する。にきびやそれによるにきび跡は、皮膚に生息する細菌によって誘発され得、腸内細菌と同様にその均衡が崩れれば、皮膚炎を誘発するおそれがある。

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、表皮細胞に作用して皮膚障壁機能を破壊するか、又は、Ｔ細胞にスーパー抗原として働いて炎症反応を誘導すると知られている。

前記黄色ブドウ球菌の集落と感染は、代表的に、アトピー皮膚炎の悪化及び湿疹性皮膚炎を誘発し、長期間慢性炎症に進行すれば、喘息及び食品アレルギーをもたらすとの研究が報告されている。さらに、毛包炎（ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ）、せつ腫（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ）、膿痂疹（ｉｍｐｅｔｉｇｏ）、手足の爪周囲炎（Ｐａｒｏｎｙｃｈｉａ）、壊疽性膿瘡（ｅｃｔｈｙｍａ）などの皮膚疾患を持っている患者を対象にした微生物培養で黄色ブドウ球菌が多量検出されたと報告されている。アトピー疾患の外にも、多様な感染性皮膚疾患において黄色ブドウ球菌が臨床的に関連性を有することが知られている（1. Atopic dermatitis and the atopic march. J. Allergy Clin. Immunol.2003, 2. Antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus strains responsible for community-acquired skin infections. Ann Dermatol Venereol. 2008）。

一方、アトピー皮膚炎の発病及び進行において、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）の欠乏及びフィラグリン遺伝子の変形が密接に関連することが周知されている。

フィラグリンは、皮膚障壁を構成する角質細胞に含まれた保湿成分であって、ケラチン、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、ロリクリン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）などのタンパク質とともに角質層（ｓｔｒａｔｕｍｃｏｒｎｅｕｍ）の形成に重要な役割をするタンパク質である。フィラグリン発現量の減少は、皮膚障壁の機能と保湿に変化をもたらして様々な病変につながる。特に、正常な皮膚障壁の形成は外部の刺激に対する防御において重要な役割を果たすが、この機能が喪失された場合は、アトピーの進行に核心的な役割をするようになる。経皮的な抗原の吸収がアトピー性皮膚炎の増加に重要な原因になるという点で、フィラグリンは効果的なアトピー性皮膚炎改善のターゲットになる。

また、近年の研究において、アトピー皮膚炎患者のフィラグリンタンパク質による影響だけでなく、クローディン１遺伝子（ｃｌａｕｄｉｎ１、ＣＤＮ１）の異常発現がアトピー皮膚炎と密接に関連すると報告されている。

一方、キューティバクテリウムグラニュローサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ：Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）は、皮膚常在由来菌の一つとして知られ、今までは数多くの感染を誘発する原因菌（病源菌）として知られていた。

本発明者は、多様な皮膚疾患のうち、特ににきび緩和のため鋭意研究した結果、本発明の完成に至った。

本発明は、上記のような問題点を解決するため、従来単に病源菌として知られていたキューティバクテリウムグラニュローサムを用いた皮膚状態改善用組成物及びキューティバクテリウムグラニュローサム新菌株を提供する。

本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として用いる、にきびまたは炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用途、若しくはアトピー皮膚炎症状改善の用途を提供する。本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を含む組成物であって、アトピー皮膚炎症状、にきび及び炎症性疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。

本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物、それを含む化粧料組成物を提供し、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物の新規用途を提供する。

本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として用いるアトピー皮膚炎症状、にきびまたは毛包炎など炎症性皮膚疾患の抑制、改善、治療または緩和用途を提供する。本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を含む組成物であって、にきび、毛包炎及び炎症性疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。

本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を含む組成物であって、皮膚障壁強化を通じた皮膚保湿効果を有する組成物を提供する。

本発明の一態様は、キューティバクテリウムグラニュローサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）ＧＥＮＳＣ０２菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）を提供する。

また、本発明の一態様は、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）の培養物を提供する。

今までキューティバクテリウムグラニュローサムは、感染症を起こす病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）として知られていた。しかし本発明者は、本発明のＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物が皮膚毒性がないだけでなく、却って皮膚状態改善に有用であるという驚くべきことを確認し、本発明の完成に至った。

前記菌株は、微生物によって形成されるバイオフィルムの除去または形成抑制効果を奏し、抗菌活性も有する。

特に、前記菌株または前記菌株の培養物は、にきび抑制活性を有し、にきび誘発菌の生長を阻止することができる。

本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株は、皮膚に常在する微生物であって、１６ＳｒＤＮＡ配列分析及びＡＰＩテストを経てキューティバクテリウムグラニュローサムに属する新規な菌株であることが確認された。該菌株は、２０１８年７月２４日付で韓国生命工学研究院微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託されて受託番号ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰが付与された。

本発明の一態様によるキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ：Ｃ．ａｃｎｅｓ）に対して抗菌活性を有し得る。

前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓの集落と感染は、にきび及び多様な皮膚炎症を誘発し得る。前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓの集落と感染はにきび、毛包炎または腋臭や足臭などを誘発又は悪化させ得るが、本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓの生長を抑制し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓに対する抗菌活性を提供することができる。

一態様によれば、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、微生物の生長抑制効果だけでなく、微生物によって形成されたバイオフィルムの除去または形成抑制効果を奏することができる。

一態様によれば、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、アトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療活性を有し得る。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。

一態様によれば、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、皮膚保湿活性を有し得る。一態様によれば、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として含む皮膚保湿用組成物を提供することができる。

他の一態様によれば、本発明は、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として含む抗菌用組成物を提供する。

さらに他の一態様によれば、本発明は、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の治療、予防または改善用組成物を提供する。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。

さらに他の一態様によれば、本発明は、前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を有効成分として含む皮膚保湿用組成物を提供する。

本明細書において、用語「培養物」とは、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株が成長及び生存できるように栄養分を供給する培地に前記菌株を一定期間培養して収得する前記菌株、菌抽出物、その代謝物、余分の栄養分などを含む全体培地を意味するが、菌株培養の後、菌株を除去した培養液も含む意味である。

前記培養液は、一定時間静置して下層に沈んだ部分を除いた上層の液体のみ、若しくは、濾過によって菌体を除去するか又は培養液を遠心分離して下部の沈澱を除去した上部の液体のみを意味することもある。このような培養液は常法で濃縮して濃縮液としても用いられ得る。

前記培養液または培養液の濃縮物は、常法で乾燥して乾燥物としても提供され得る。

本明細書における「培養物」は、特に言及しない限り、上述した菌体の培養液、培養液の濃縮物、前記培養液または濃縮物の乾燥物を含む意味である。前記培養物には、場合によって菌体が含まれてもよく、含まれなくてもよく、菌体の有無は特に問題にならない。

用語「菌体」とは、本発明の菌株そのものを意味し、分離して選別した菌株自体または該菌株を培養して培養液から分離した菌株を含む。前記菌体は、培養液を遠心分離して下層に沈んだ部分を採取して収得してもよく、または、重力によって培養液の下層に沈むため、一定時間静置いてから上部の液体を除去することで収得してもよい。

一態様によれば、本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の培養物は、微生物の培養に使用される培地のうち通常の技術者が目的に応じて容易に選択した培地を使用でき、望ましくはキューティバクテリウム培養に使用される培地、より望ましくはＲＣＭ（ＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌＭｅｄｉｕｍ）培地、ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃｓｏｙｂｒｏｔｈ）またはＢＨＩ（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）培地を使用できるが、これに制限されない。

一態様によれば、本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の培養物は、微生物培養培地に本発明の菌株を接種し、当業界で公知の微生物培養方法（例えば、静置培養など）によって製造することができる。

前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の培養物は、培養液、培養液の濃縮物、若しくは培養液または濃縮物の乾燥物を含むことができ、前記濃縮物または乾燥物は当業界で公知の微生物または培養液の濃縮または乾燥方法によって容易に製造することができる。

本発明の一態様は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物を含む組成物、望ましくは化粧料組成物、食品組成物または薬学組成物を提供する。

前記化粧料組成物または薬学組成物は、皮膚外用剤として使用でき、患部に直接塗布することができる。例えば、軟膏、クリーム、エマルションなどの多様な剤形で製造され得る。

また、前記薬学組成物は、経口または非経口投与されて体内に吸収でき、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤などの非制限的な形態で投与され得る。前記化粧料組成物または薬学組成物の形態は特に制限されない。

前記化粧料組成物は、アトピー皮膚炎または炎症性皮膚疾患を抑制するか又は改善することができ、体臭（例えば、足臭、腋臭）の除去または減少に効果的である。

前記炎症性皮膚疾患の例としては、炎症性角化症（例えば、乾癬）、毛包炎、細菌性皮膚炎、膿痂疹、脱毛性毛包炎などが挙げられる。

本発明の一態様による化粧料組成物は、皮膚障壁を強化し、皮膚保湿を向上させることができる。すなわち、本発明の一態様はキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）または前記菌株の培養物を含む皮膚保湿用組成物を提供する。

前記化粧料組成物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有し得る。したがって、本発明の一態様は、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）または前記菌株の培養物を含む抗菌用組成物を提供する。

本発明は、にきび改善に優れたキューティバクテリウムグラニュローサムの新規菌株を提供する。また、アトピー症状改善効果にも優れる。

本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサムの新規菌株を確認し、該菌株またはその培養物を用いた皮膚症状改善効果を明らかにした。これによって、本発明は、皮膚改善機能を有するキューティバクテリウムグラニュローサム新菌株を提供することができる。また、本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサム新規菌株またはその培養物を含むアトピー皮膚炎、にきび及び炎症性角化症、毛包炎、細菌性皮膚炎、膿痂疹、脱毛性毛包炎などの炎症性皮膚疾患の改善、足臭や腋臭の抑制治療または緩和用組成物を提供する。また、本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサム新規菌株またはその培養物を含む皮膚保湿用化粧料組成物を提供する。本発明は、キューティバクテリウムグラニュローサム新規菌株またはその培養物を含む、細塵による皮膚炎症緩和用化粧料組成物を提供する。

本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）の１６ｓｒＲＮＡ塩基配列である。キューティバクテリウムグラニュローサム菌株毎のグリセロールによる色変化を示した図である（０、３、６日目の色変化）。本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株をヒツジ血液寒天培地（ｓｈｅｅｐｂｌｏｏｄａｇａｒ）に塗抹して培養した結果である。菌体の周囲に透明なリングが見られないことから、溶血性がなくて人体に無害であるということが分かる。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株による黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１６２１に対する生長抑制結果である。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株によるキューティバクテリウムアクネスＡＴＣＣ６９１９に対する生長抑制結果である。菌株毎にＩＬ－６の発現を確認した結果であり、ＧＥＮＳＣ０２のＩＬ－６発現が最も低く観察された。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の濃度毎のＩＬ－６発現抑制活性を示した結果である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の濃度毎のＩＬ－８発現抑制活性を示した結果である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の濃度毎のＴＮＦ－αの発現抑制活性を示した結果である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の細胞毒性テスト結果である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の処理によってフィラグリンの発現が向上した結果を示した図である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の処理によってクローディン１の発現が向上した結果を示した図である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の処理によってＨＡＳ３（ＨｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄＳｙｎｔｈａｓｅ）の発現が向上した結果を示した図である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の処理によってアクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ）の発現が向上した結果を示した図である。ＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物の処理による優れたバイオフィルム形成抑制効果を示した図である。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物によるＴＳＬＰ発現減少を示した結果である。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物によるキューティバクテリウムアクネスＡＴＣＣ６９１９リパーゼ阻害活性を示した図である。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株の発酵濾過物が細塵による炎症減少に効果的であることを確認した結果である。

以下、実施例などを挙げて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形でき、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は本発明の具体的な理解を助けるために例示的に提供されるものである。
［実施例１］キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２の分離及び同定
１－１．菌株の分離
アトピー、乾癬、にきびなどの皮膚疾患を患ったことがないか又は最近６ヶ月以内にこれらに関連する治療を受けた履歴がない成人を対象にして皮膚由来菌の分離を行った。皮膚サンプルを採取するため、滅菌生理水で濡らした滅菌綿棒で洗顔していない両頬と鼻翼を力を加えて擦った。綿棒を直ちにＲＣＭの入っている試験管内に入れて密封し、試験管を窒素で充填して３７℃で４８～７２時間培養した。培養された綿棒が入っている試験管の培地を白金耳で採取してＲＣＭ寒天培地に画線塗抹し、該作業を３～４回繰り返して純粋なコロニーを分離した。
１－２．菌株の同定
１）ＡＰＩキットを用いた生化学的同定
分離した菌株を同定する生化学的同定方法として、嫌気性菌ＡＰＩ２０Ａキット（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社製、フランス）を用いた。１０ｍｌのＲＣＭ液体培地に３７℃で２４時間培養した後、遠心分離してから培地を除去した。ＰＢＳで２～３回洗浄した後、メーカーで提供したプロトコルに従ってキットに含まれた培地でＯＤ_６００＝３再懸濁し、ＡＰＩ２０Ａキットの各ウェルに適量分注して、３７℃で２４時間嫌気的に培養した後判読した。

最終結果は同定用プログラムであるＡＰＩｗｅｂで同定し、その結果を下記の表１に示した。ＡＰＩ２０Ａの同定結果、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（＝キューティバクテリウム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ））グラニュローサム（ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）と同じ生化学的特定を見せた。

ＡＰＩ２０Ａ判読結果を下記の表１に示した。

２）１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を通じて同定分離された菌株の純粋培養液１ｍｌを採取してマクロゼン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）に依頼して１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。ＰＣＲのためのプライマーは、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーである２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）と１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）を使用し、シーケンシングには７８５Ｆ（５’－ＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡ－３’）と９０７Ｒ（５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’）を用いた。分離した菌株の１６ｓｒＲＮＡ塩基配列は図１に示した。以上の結果に基づいて前記菌株を「キューティバクテリウムグラニュローサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）ＧＥＮＳＣ０２」菌株と命名し、２０１８年７月２４日付で韓国特許菌株寄託機関である韓国生命工学研究院微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰの付与を受けた。
１－３．グリセロール利用による菌株の区分
前記寄託菌株と同一種の他の菌株との相違点を確認するため、グリセロール利用如何を確認した。

グリセロール利用如何を確認するため、リッチ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＴＳＢ培地、２．５ｇ／ＬＫ_２ＨＰＯ_４及び１．５ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４）に２％のグリセロールを入れて培地を製造した。また、接種した培地がグリセロールを利用する場合、培地の色が赤色から黄色に変わることで可視的に利用如何を判断可能なフェノールレッドを０．００１％（ｗ／ｖ）添加した。それぞれの菌はＲＣＭ培地で活性状態を経て１０^５ＣＦＵ／ｍｌの状態で接種して３７℃で嫌気的に培養し、色の変化を確実に観察するため、何も接種していない培地も同じ条件で保管した。色の変化様相は６日間同じ時間に観察した。

その結果、培養３日目からＮＳＭ１３－４、ＣＳＭ１－３、ＣＳＭ５－１で色が変わり始め、時間が経つほど赤みが消えて、４～５日目に完璧な黄色を呈した。一方、ＧＥＮＳＣ０２は、培養前に比べて赤みが薄くなったが、対照と比べたとき、色の差が僅かであった。このようにＧＥＮＳＣ０２は、リッチ培地下でグリセロールを利用しないか又は僅かに利用する特徴を有することを確認した。これはグリセロールを利用する能力がリッチ培地、ＡＰＩ２０Ａ培地などの培養培地によって変わることを意味する。

表２に各菌株毎のグリセロール利用結果を示した。濃い黄色への変化を－／＋／＋＋／＋＋＋と示した。また、キューティバクテリウムグラニュローサム（Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）菌株毎のグリセロール利用による色変化を図２に示した（０、３、６日目の色変化）。したがって、ＧＥＮＳＣ０２はグリセロールを利用する能力が他の菌株と相違することを確認した。

［実施例２］キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２の溶血性テスト
相当数のキューティバクテリウムグラニュローサム菌株は溶血性毒性を有し、菌株によって人体に有害である。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２の安全性を確認するため、溶血毒性の有無を確認した。液体培地で純粋培養されたキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２を白金耳で採取してヒツジ血液寒天培地に画線塗抹し、３７℃で４８時間嫌気的に培養した。菌体の周囲に透明なリングが生成されるか否かで溶血性を判断した。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２の場合、図３から確認されるように、ヒツジ血液に対して溶血性がなくて人体に無害であると判断された。
［実施例３］黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＫＣＴＣ１６２１及びキューティバクテリウムアクネス（Ｃ．ａｃｎｅｓ）ＡＴＣＣ６９１９に対する生長抑制（オーバーレイクリアゾーンテスト）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＣ．ａｃｎｅｓの生長抑制に対する効果はクリアゾーンの形成を観察することで確認した。寒天培地にこれら菌を接種すれば、淡色で菌が成長して培地の色が濁り、成長できなければ透明に見える。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２がこれら菌の生長を抑制する効果を有すれば、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２周辺の菌が成長できず透明になるはずと予想して実験を行った。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２培養液を白金耳で採取して薄いＲＣＭ寒天培地に２．５ｃｍ程度になるように線を描き、３７℃で７２時間嫌気的に培養した。キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２が十分に成長したことを確認した後、１０^４ｃｆｕ／ｍｌに調整されたＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓ菌株を４５℃程度のまだ固まっていない１０ｍｌのＲＣＭ寒天に接種し、培地が固まる前によく懸濁してキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２が成長している寒天培地上に平たく注いで固めた。固まった寒天培地は３７℃で嫌気的にＳ．ａｕｒｅｕｓは４０時間ほど、Ｃ．ａｃｎｅｓは７２時間ほどさらに培養して、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２が成長した周辺に生じるクリアゾーンの大きさを観察した。陰性対照群としてリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を使用し、陽性対照群としてトリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）を使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは１０ｍｇ／ｍｌ、Ｃ．ａｃｎｅｓは２００ｍｇ／ｍｌをそれぞれ処理した。その結果、図４のようにキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２が成長した周辺で透明に見える領域が観察され、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２から遠くなるにつれて透明度が低下し、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２がＳ．ａｕｒｅｕｓの生長抑制能を有することが確認できた。陰性対照群であるＰＢＳを処理したときはクリアゾーンが観察されず、陽性対照群として殺菌剤であるトリクロサンを処理したときはクリアゾーンが観察されたものの、ＧＥＮＳＣ０２処理に比べて遥かに少ない面積であることが分かる。結果は図４に示した。

また、図５に示されたように、Ｃ．ａｃｎｅｓを接種した結果においても、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２が成長した周辺で透明に見える領域が観察され、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２から遠くなるにつれて透明度が低下し、キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２がＣ．ａｃｎｅｓの生長抑制能を有することが確認できた。また、陰性対照群であるＰＢＳを処理したときはクリアゾーンが観察されず、陽性対照群として殺菌剤であるトリクロサンを処理したときはクリアゾーンが観察されたものの、ＧＥＮＳＣ０２処理に比べて遥かに少ない面積であることが分かる。

このような結果を通じて、本発明のキューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２がにきび誘発菌であるＣ．ａｃｎｅｓを抑制してにきびの改善、予防または治療効果を提供できることを確認した。
［実施例４］本発明による菌株の発酵濾過物の製造
キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株をＲＣＭ寒天培地で７２時間３７℃で嫌気的に培養した。寒天培地に現われた単一コロニーは１０ｍｌのＲＣＭ液体培地に継代培養して同じ条件で培養した。７２時間後、同じ液体培地に０．１％接種して７２時間同じ条件で培養し、上澄み液を遠心分離してポアサイズ０．２２μｍのフィルターで濾過した。
［実施例５］抗炎症効能の評価（有益菌の選別）
まず、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ菌株毎に、それぞれ６－ウェルプレートに２×１０^５個のＨａＣａＴヒト角質細胞株を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２４時間培養することで付着させた細胞に、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ菌株の発酵濾過物を１時間前処理した。その後、熱処理されたＣ．ａｃｎｅｓを１００ＭＯＩ処理して４時間反応させた。各サンプルに対してＲＮＡを抽出した後、炎症反応サイトカイン因子のうち一つであるＩＬ－６に対してＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。

図６に示されたように、Ｃ．ａｃｎｅｓによるＩＬ－６の発現が増加しており、これを通じて炎症が発生していることが分かる。他の菌株との比較実験において、ＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物によるＩＬ－６の発現減少が見られ、ＧＥＮＳＣ０２が他の菌株に比べてより優れた抗炎症効能を有することを確認した。図６は、菌株毎にＩＬ－６の発現を確認した結果であり、ＧＥＮＳＣ０２のＩＬ－６発現が最も低く観察された。

図６の結果を通じて、ＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物の含量に応じた抗炎症効能を確認するため、上述した実験順序と同様に実験を行い、前処理するＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物の濃度を細胞培養液に対して０．０１、０．１、１％とそれぞれ変えて処理して抗炎症効能を再び再現した。

図７～図９の結果において、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－ａの発現が増加していることから、Ｃ．ａｃｎｅｓによる炎症誘発が生じていることが分かる。ＩＬ－６の発現は、ＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物の含量に応じて漸次減少し、ＩＬ－８及びＴＮＦ－αの発現から、低含量のＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物でも優れた抗炎症効能を有することを確認した。
［実施例６］細胞毒性の確認
実施例４で製造した発酵濾過物の細胞毒性を評価するため、以下の実験を行った。９６－ウェル細胞培養プレートにＨａＣａＴ細胞をそれぞれ５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４時間付着した後、試験群試料を濃度毎に添加して５％ＣＯ_２、３７℃の条件で４８時間培養した。４８時間後、培養された細胞培地を除去し、０．５ｍｇ／ｍｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２－５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）ホルマザン溶液を細胞に処理して４時間反応させた。時間が経過した後、細胞培地をすべて除去し、ホルマザン溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶かしてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。その後、Ｏ．Ｄ_{ｓａｍｐｌｅ}／Ｏ．Ｄ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}×１００の式で換算してＨａＣａＴ細胞株の生存率を計算した。

図１０に発酵濾過物の細胞毒性テスト結果を示した。図１０から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０２処理時にもＨａＣａＴ細胞株の生存率に有意な影響はなかった。したがって、ＧＥＮＳＣ０２は細胞毒性がないことを確認できた。
［実施例７］皮膚障壁機能強化効能の確認
炎症反応の外にも、ＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物によってＨａＣａＴ細胞株に対する皮膚障壁強化機能が奏されるかを確認するため、ＨａＣａＴ細胞株にＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物を細胞培養液に対する％毎に処理した後、２４時間反応させて皮膚障壁機能のマーカーであるフィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）とクローディン（ｃｌａｕｄｉｎ－１）の発現をＲＮＡ上で確認した。

図１１及び図１２に示されたように、陽性対照群であるレチノイン酸（ＲＡ’、１μＭ）によってフィラグリンとクローディンの発現が１．５倍ほどに増加した一方、ＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物の０．１％からクローディンの発現が２倍以上増加し、フィラグリンの発現はＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物の０．０１％から増加することを確認した。このような図１１及び図１２の結果から、ＧＥＮＳＣ０２は優れた皮膚障壁強化効果を有することを確認した。

具体的には、図１１から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０２は、優れたフィラグリン発現効果を有すると知られたレチノイン酸（陽性対照群）に比べてフィラグリン発現効果に優れることが分かる。このことから、ＧＥＮＳＣ０２はフィラグリン発現を増加させてアトピー皮膚炎の改善効果、にきびの改善効果、皮膚障壁の強化効果、及び皮膚水分量の維持または増加効果を提供できることを確認した。

図１２から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０２は、優れたクローディン発現効果を有すると知られたレチノイン酸（陽性対照群）に比べてクローディン発現効果に優れることが分かる。このことから、ＧＥＮＳＣ０２はクローディン発現を増加させてアトピー皮膚炎の改善効果、にきびの改善効果、皮膚障壁の強化効果、及び皮膚水分量の維持または増加効果を提供できることを確認した。
［実施例８］皮膚保湿機能強化効能の確認
ＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物による皮膚保湿機能強化効能を確認するため、ＨａＣａＴ細胞株にＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物を細胞培養液に対する％毎に処理した後、２４時間反応させて皮膚保湿機能のマーカーであるＨＡＳ３（ＨｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄＳｙｎｔｈａｓｅ）とアクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ）の発現をＲＮＡ上で確認した。

図１３及び図１４に示されたように、陽性対照群であるレチノイン酸（ＲＡ’、１μＭ）によってＨＡＳ３とアクアポリンの発現が２～４倍ほどに増加し、ＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物によってＨＡＳ３とアクアポリンの発現が陰性対照群（－群）に比べて２倍以上増加することを確認した。図１３及び図１４の結果から、ＧＥＮＳＣ０２が皮膚保湿機能も強化させていることを確認した。
［実施例９］バイオフィルム形成抑制効果の測定
黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１６２１を適正培地（ＴＳＢ＋０．２％グルコース）で１６～２４時間液体培養した。６－ウェルプレート（ポリスチレン）に０．２％グルコースが含有されたＴＳＢを入れた後、各ウェルに約５～１０ｖｏｌ％で試験群を入れた。その後、前記培養菌液を各ウェルに接種し、最終菌株濃度が２×１０^６ＣＦＵ／ｗｅｌｌになるようにした。次いで、３７℃のインキュベーターで２４時間静置培養した。培養の後、培養液を除去し、各ウェルを１～２ｍｌの滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した。洗浄の後、２ｍｌのＰＢＳを添加してスクレーパーでバイオフィルムを掻き出し、十分に懸濁した後、６００ｎｍで吸光度を測定した。吸光度の測定はバイオフォトメーターＤ３０を用いて行った。処理していないウェルを陰性対照群とし、バイカレン（２５μｍ／ｍｌ）が接種されたウェルを陽性対照群としてバイオフィルム形成抑制能を計算した。

図１５に示されたように、ＧＥＮＳＣ０２菌株は陽性対照群よりも優れたバイオフィルム形成抑制能を有することが分かる。
［実施例１０］痒み緩和効能の確認
ＨａＣａＴ細胞株にＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物を細胞培養液に対する％毎に処理した後、４時間反応させ、アトピー皮膚炎の原因の一つとして作用するサイトカインであるＴＳＬＰの発現をＲＮＡ上で確認した。図１６に示されたように、発酵濾過物のＴＳＬＰ発現程度が減少することを確認した。したがって、本発明のＧＥＮＳＣ０２発酵濾過物は、ＴＳＬＰの発現を抑制し、皮膚の痒みを解消してアトピー皮膚炎の改善に効果があることを確認した。
［実施例１１］キューティバクテリウムアクネスＡＴＣＣ６９１９リパーゼ阻害活性（オレイン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＯ）アッセイ）
リパーゼ阻害活性はオレイン酸４－メチルウンベリフェリルを気質として用いて評価した。すなわち、ＲＣＭブロス（ＯＤ_６００＝１）のＣ．ａｃｎｅｓにそれぞれ陽性対照群としてケトコナゾール（２．５μｇ／ｍｌ）、陰性対照群、発酵濾過物を１：１で処理し、嫌気的に３７℃で培養した。これを遠心分離して収得した上澄み液１００μｌと４－ＭＵＯ（ＤＭＳＯ中０．２ｍｇ／ｍｌ）１００μｌとをブラック９６－ウェルマイクロタイタープレートで混合し、３７℃で２４時間反応させた。リパーゼによって遊離された４－メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）を蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）マイクロプレートリーダーで測定した。

図１７に示されたように、陽性対照群と類似の効果が発酵濾過物を１％で処理したときに得られ、濃度依存的にキューティバクテリウムアクネスＡＴＣＣ６９１９リパーゼ阻害活性を見せることを確認した。
［実施例１２］細塵に対する抗炎症効能の評価
まず、それぞれ６－ウェルプレートに６．５×１０^５個のＨａＣａＴヒト角質細胞株を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２４時間培養することで付着させた細胞に、細塵（Ａｌｄｒｉｃｈ製）５０μｇ／ｍｌを２時間処理して炎症を誘導した後、３回洗浄した。その後、ＧＥＮＳＣ０２の発酵濾過物を１時間及び２時間処理し、各サンプルに対してＲＮＡを抽出した後、炎症反応サイトカイン因子であるＩＬ－６に対してＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。その結果を図１８に示した。ＩＬ－６の発現は、ＧＥＮＳＣ０２の培養濾過物によって有意に減少し、２時間処理する場合、さらに減少することを確認した。

本発明は、化粧料組成物として利用可能な新たなキューティバクテリウムグラニュローサム菌株またはその培養物を提供する。本発明の菌株または培養物は、化粧料組成物として利用可能である。

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ
受託日：２０１８０７２４

Claims

キューティバクテリウムグラニュローサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）ＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）。
前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株またはその培養物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有する、請求項１に記載の菌株。
前記キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株は、にきび、アトピー皮膚炎または炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療活性を有するか、若しくは、皮膚保湿活性を有する、請求項１に記載の菌株。
前記炎症性皮膚疾患は、細塵による炎症性皮膚疾患を含む、請求項３に記載の菌株。
キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）またはその培養物を含む、アトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制または改善用の化粧料組成物。
前記炎症性皮膚疾患は、細塵による炎症性皮膚疾患を含む、請求項５に記載の化粧料組成物。
黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有する、請求項５に記載の化粧料組成物。
キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）またはその培養物を含む皮膚保湿用化粧料組成物。
キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）またはその培養物を含む抗菌用組成物であって、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有する抗菌用組成物。
キューティバクテリウムグラニュローサムＧＥＮＳＣ０２菌株（ＫＣＴＣ１３５９７ＢＰ）またはその培養物を含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療用薬学組成物。