KR20230061273A

KR20230061273A - 큐티박테리움 속 균주를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230061273A
Application number: KR1020220139722A
Authority: KR
Inventors: 신창식; 이지영; 권보은; 김현정; 김한설; 박현경; 최종은
Original assignee: 씨제이바이오사이언스 주식회사
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-05-08
Also published as: CN118434427A; WO2023075430A1; EP4424318A1

Abstract

본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도에 관한 것으로, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 세포 독성을 보이지 않고, 피부염증을 유발하는 면역세포의 증식을 억제하고, 면역반응을 억제하며, 여드름 유발균에 대한 항균 효과가 있고, 피부세포의 재생을 촉진시켜 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.

Description

큐티박테리움 속 균주를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물{Composition for the prevention, improvement, or treatment of inflammatory skin diseases comprising a strain of the genus Cutibacterium}

본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료 용도에 관한 것이다.

피부는 각종 산화 물질, 대기오염, 중금속, 자외선 (ultraviolet radiation, UV) 등으로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 피부의 구조는 표피, 진피, 피하지방의 3개 층으로 크게 분류되며, 이 중 90% 차지하는 진피층은 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당 단백질로 구성되어 있다. 주요 구성물질 콜라겐은 인체의 단백질 총 질량 중 약 25%를 차지하는 중요한 섬유성 단백질로, 결체조직의 대부분을 차지하며, 세포간 매트릭스 역할, 구조적 지지체 기능, 세포의 분할과 분화 유도, 피부의 인장강도 제공 등의 중요한 기능을 한다.

뿐만 아니라, 체내로부터 배출된 피지성분, 땀 성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 등이 피부상에 존재하는 피부 상재균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 이들에 의해 피부염증이 유발될 수도 있으며, 태양의 자외선에 의한 피부장벽 손상으로 인한 병원성 미생물에 의한 2차 감염 노출로 여드름, 가려움, 피부염, 알레르기 발생 등 각종 피부질환을 유발한다는 것은 잘 알려진 사실이다.

이와 같은 각종 유해 환경으로부터 피부를 보호하기 위하여, 피부 유해균의 성장을 효과적으로 저해하면서 부작용이 없는 물질의 발굴 및 이를 적용한 의약품 및/또는 화장품의 개발이 요구된다.

KR

10-2032546

B1

본 출원의 목적은 (a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및

(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 큐티박테리움 속 (Cutibacterium) 균주를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원인은 여드름(acne), 로사세아(rosacea) 등의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 효과가 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물이 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 효과가 있음을 확인하고 본 출원을 완성하였다.

이에, 본 출원은 신규한 큐티박테리움 속 균주를 제공한다.

본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 출원의 일 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 일 예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 또는 사료 조성물일 수 있다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품 첨가제 또는 건강기능식품일 수 있다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 조성물은 사료 첨가제일 수 있다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용, 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물 (예컨대, 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 또는 사료 조성물)의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균을 억제하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환 원인균에 대한 억제 방법을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

다른 예는 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 소독제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 상기 소독제를 소독이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 세척제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 상기 세척제를 세척이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다.

이하, 본 출원을 보다 자세히 설명한다.

큐티박테리움 속 균주 및 이의 배양물

일 양상은 큐티박테리움 속 균주를 제공한다.

본 명세서에서, 큐티박테리움 속 균주는 모든 큐티박테리움 속 균주를 포함할 수 있다. 상기 큐티박테리움 속 균주는 예를 들면, 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 및 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 또는 3종)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 C. acnes 아종 acnes (Type I), C. acnes 아종 defendens (Type II), 또는 C. acnes 아종 elongatum (Type III)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 C. acnes 아종 defendens (Type II)일 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 리보타입(Ribotype)이 RT1, RT2, RT3, RT4, RT5, RT6, RT7, RT8, RT9, 또는 RT10일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 RT2일 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는, 시퀀스 타입(Sequence type)이 69 또는 153인 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는, CC (clonal complex)가 CC72 (Type II)인 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,

(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자, 및

(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하거나, 및/또는

하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)의 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있다:

(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,

(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,

(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,

(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,

(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및

(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,

(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하고,

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,

(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및

(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하고,

하기 (1) 내지 (6)의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다:

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 16S rRNA로 서열번호 8로 이루어지는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다:

CJRS-10651,

CJRS-10652,

CJRS-10653,

CJRS-10654,

CJRS-10655, 및

CJRS-10656.

상기 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주로 이루어지는 군에서 선택된 균주는, 공통적으로 서열번호 8의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다.

상기 CJRS-10651 균주는 기탁번호 KCCM13032P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10651"로 명명)인 것일 수 있다.

상기 CJRS-10652 균주는 기탁번호 KCCM13033P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10652"로 명명)인 것일 수 있다.

상기 CJRS-10653 균주는 기탁번호 KCCM13034P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10653"으로 명명)인 것일 수 있다.

상기 CJRS-10654 균주는 기탁번호 KCCM13035P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10654"로 명명)인 것일 수 있다.

상기 CJRS-10655 균주는 기탁번호 KCCM13036P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10655"로 명명)인 것일 수 있다.

상기 CJRS-10656 균주는 기탁번호 KCCM13037P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10656"으로 명명)인 것일 수 있다.

본 명세서에서, 큐티박테리움 속 균주의 "배양물"은 큐티박테리움 속 균주를 배양하여 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 큐티박테리움 속 균주의 배양물은 균주(균체)가 제거된 형태이거나, 균주가 제거되지 않은 형태일 수 있다. 상기 균주가 제거되지 않은 형태의 큐티박테리움 속 균주의 배양물은, 배양물 내 큐티박테리움 속 균주를 포함하는 것일 수 있다.

상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주의 전체 배양물, 이의 희석액, 농축물, 건조물 (예, 동결건조물 등), 파쇄물, 및/또는 분획물 등이 될 수 있으며, 상기 농축물은 상기 배양물을 원심분리 또는 증발시켜 수득할 수 있으며, 상기 건조물을 상기 배양물을 건조기 등을 이용하여 건조하여 수득할 수 있으며, 상기 동결건조물은 상기 배양물을 동결건조기 등을 이용하여 동결건조하여 수득할 수 있으며, 파쇄물은 상기 균주 또는 배양물을 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.

상기 배양물은 고상(고체, 예를 들면 건조물), 액상(액체), 또는 유동상일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.

일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 일정기간 배양하여 얻은 배양된 균주, 이의 대사물, 및/또는 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.

일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 후 균체(균주)를 제거한 무세포 (cell-free) 배양물일 수 있다. 상기 균체 제거는 분리(예컨대, 원심분리), 여과 등의 통상적인 방법에 의한 것일 수 있으며, 예컨대, 원심분리에 의한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 무세포 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 배양물을 원심분리하여 얻어진 상등액 (supernatant)일 수 있다.

또한, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양하여 얻어진 배양물 또는 균주를 제거한 무세포 배양물을 여과한 뒤에 남은 액체(또는 배양여액)일 수 있다.

일 예에서, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분의 분자량이 특정 수치범위를 만족하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 균주가 제거된 형태이거나, 균주가 제거되지 않은 형태일 수 있다.

예컨대, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 kDa는 kilodalton을 의미하며, dalton은 원자 질량 단위(g/mol)를 의미한다. 또한 본 명세서에서, "이하"는 0을 초과하는 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예컨대, 3kDa 이하는 0 초과 3kDa 이하의 수치범위를 의미할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하, 또는

0.5 내지 4kDa, 0.5 내지 3.75kDa, 0.5 내지 3.5kDa, 0.5 내지 3.25kDa, 0.5 내지 3kDa, 0.5 내지 2.75kDa, 0.5 내지 2.5kDa, 0.5 내지 2.25kDa, 0.5 내지 2kDa, 0.5 내지 1.75kDa, 0.5 내지 1.5kDa, 0.5 내지 1.25kDa, 0.5 내지 1kDa, 0.5 내지 0.75kDa, 0.75 내지 4kDa, 0.75 내지 3.75kDa, 0.75 내지 3.5kDa, 0.75 내지 3.25kDa, 0.75 내지 3kDa, 0.75 내지 2.75kDa, 0.75 내지 2.5kDa, 0.75 내지 2.25kDa, 0.75 내지 2kDa, 0.75 내지 1.75kDa, 0.75 내지 1.5kDa, 0.75 내지 1.25kDa, 0.75 내지 1kDa, 1 내지 4kDa, 1 내지 3.75kDa, 1 내지 3.5kDa, 1 내지 3.25kDa, 1 내지 3kDa, 1 내지 2.75kDa, 1 내지 2.5kDa, 1 내지 2.25kDa, 1 내지 2kDa, 1 내지 1.75kDa, 1 내지 1.5kDa, 1 내지 1.25kDa, 1.25 내지 4kDa, 1.25 내지 3.75kDa, 1.25 내지 3.5kDa, 1.25 내지 3.25kDa, 1.25 내지 3kDa, 1.25 내지 2.75kDa, 1.25 내지 2.5kDa, 1.25 내지 2.25kDa, 1.25 내지 2kDa, 1.25 내지 1.75kDa, 1.25 내지 1.5kDa, 1.5 내지 4kDa, 1.5 내지 3.75kDa, 1.5 내지 3.5kDa, 1.5 내지 3.25kDa, 1.5 내지 3kDa, 1.5 내지 2.75kDa, 1.5 내지 2.5kDa, 1.5 내지 2.25kDa, 1.5 내지 2kDa, 1.5 내지 1.75kDa, 1.75 내지 4kDa, 1.75 내지 3.75kDa, 1.75 내지 3.5kDa, 1.75 내지 3.25kDa, 1.75 내지 3kDa, 1.75 내지 2.75kDa, 1.75 내지 2.5kDa, 1.75 내지 2.25kDa, 1.75 내지 2kDa, 2 내지 4kDa, 2 내지 3.75kDa, 2 내지 3.5kDa, 2 내지 3.25kDa, 2 내지 3kDa, 2 내지 2.75kDa, 2 내지 2.5kDa, 2 내지 2.25kDa, 2.25 내지 4kDa, 2.25 내지 3.75kDa, 2.25 내지 3.5kDa, 2.25 내지 3.25kDa, 2.25 내지 3kDa, 2.25 내지 2.75kDa, 2.25 내지 2.5kDa, 2.5 내지 4kDa, 2.5 내지 3.75kDa, 2.5 내지 3.5kDa, 2.5 내지 3.25kDa, 2.5 내지 3kDa, 2.5 내지 2.75kDa, 2.75 내지 4kDa, 2.75 내지 3.75kDa, 2.75 내지 3.5kDa, 2.75 내지 3.25kDa, 2.75 내지 3kDa, 3 내지 4kDa, 3 내지 3.75kDa, 3 내지 3.5kDa, 3 내지 3.25kDa, 3.25 내지 4kDa, 3.25 내지 3.75kDa, 3.25 내지 3.5kDa, 3.5 내지 4kDa, 3.5 내지 3.75kDa, 또는 3.75 내지 4kDa 범위를 만족하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 상기 수치범위를 만족하도록 하기 위하여 적절한 수단, 절차, 공정 등을 수행할 수 있으며, 예컨대 여과, 분리 과정 등을 수행할 수 있다. 본 명세서에서, "여과"는 "분리"와 상호 호환되어 혼용될 수 있으며, 배양물 내 포함되는 성분을 특정 수치범위의 크기 또는 분자량으로 획득하기 위하여 수행되는 모든 종류의 공정을 의미할 수 있다.

일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 0.3μm 이하, 0.29μm 이하, 0.28μm 이하, 0.27μm 이하, 0.26μm 이하, 0.25μm 이하, 0.24μm 이하, 0.23μm 이하, 0.22μm 이하, 0.21μm 이하, 또는 0.2μm 이하로 여과하여 수득한 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 0.22μm로 여과하여 수득한 배양물일 수 있다. 본 명세서에서 "이하"는 0을 초과하는 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다 (예컨대, "0.3μm 이하"는 0 초과 0.3μm 이하의 수치범위를 의미함). 상기 필터는 상기 배양물을 여과하는데 통상적으로 사용되는 것이라면 어느 것이든 제한없이 사용할 수 있다. 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주가 제거된 형태이거나, 제거되지 않은 형태일 수 있다.

일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하로 여과하여 수득한 여과물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 3kDa 이하로 여과한 배양물일 수 있다. 상기 필터는 상기 배양물을 여과하는데 통상적으로 사용되는 것이라면 어느 것이든 제한없이 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 특정 수치의 kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물은 특정 수치의 kDa 이하로 분리하여 수득한 분리물로 혼용하여 사용될 수 있다. 즉, 특정 수치의 kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물(또는 분리하여 수득한 분리물)은, 상기 배양물 내 포함되는 물질이 특정 수치의 kDa 이하의 분자량을 가진 것임을 의미하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 3kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물은, 상기 배양물 내 포함되는 물질이 3kDa 이하의 분자량을 가진 것임을 의미하는 것일 수 있다. 즉, 본 명세서에서 특정 수치범위(kDa)로 여과하여 수득한 배양물이라 함은, 상기 배양물 내 포함되는 물질의 분자량이 모두 상기 특정 수치범위(kDa)를 만족하는 것을 의미할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하, 또는

0.5 내지 4kDa, 0.5 내지 3.75kDa, 0.5 내지 3.5kDa, 0.5 내지 3.25kDa, 0.5 내지 3kDa, 0.5 내지 2.75kDa, 0.5 내지 2.5kDa, 0.5 내지 2.25kDa, 0.5 내지 2kDa, 0.5 내지 1.75kDa, 0.5 내지 1.5kDa, 0.5 내지 1.25kDa, 0.5 내지 1kDa, 0.5 내지 0.75kDa, 0.75 내지 4kDa, 0.75 내지 3.75kDa, 0.75 내지 3.5kDa, 0.75 내지 3.25kDa, 0.75 내지 3kDa, 0.75 내지 2.75kDa, 0.75 내지 2.5kDa, 0.75 내지 2.25kDa, 0.75 내지 2kDa, 0.75 내지 1.75kDa, 0.75 내지 1.5kDa, 0.75 내지 1.25kDa, 0.75 내지 1kDa, 1 내지 4kDa, 1 내지 3.75kDa, 1 내지 3.5kDa, 1 내지 3.25kDa, 1 내지 3kDa, 1 내지 2.75kDa, 1 내지 2.5kDa, 1 내지 2.25kDa, 1 내지 2kDa, 1 내지 1.75kDa, 1 내지 1.5kDa, 1 내지 1.25kDa, 1.25 내지 4kDa, 1.25 내지 3.75kDa, 1.25 내지 3.5kDa, 1.25 내지 3.25kDa, 1.25 내지 3kDa, 1.25 내지 2.75kDa, 1.25 내지 2.5kDa, 1.25 내지 2.25kDa, 1.25 내지 2kDa, 1.25 내지 1.75kDa, 1.25 내지 1.5kDa, 1.5 내지 4kDa, 1.5 내지 3.75kDa, 1.5 내지 3.5kDa, 1.5 내지 3.25kDa, 1.5 내지 3kDa, 1.5 내지 2.75kDa, 1.5 내지 2.5kDa, 1.5 내지 2.25kDa, 1.5 내지 2kDa, 1.5 내지 1.75kDa, 1.75 내지 4kDa, 1.75 내지 3.75kDa, 1.75 내지 3.5kDa, 1.75 내지 3.25kDa, 1.75 내지 3kDa, 1.75 내지 2.75kDa, 1.75 내지 2.5kDa, 1.75 내지 2.25kDa, 1.75 내지 2kDa, 2 내지 4kDa, 2 내지 3.75kDa, 2 내지 3.5kDa, 2 내지 3.25kDa, 2 내지 3kDa, 2 내지 2.75kDa, 2 내지 2.5kDa, 2 내지 2.25kDa, 2.25 내지 4kDa, 2.25 내지 3.75kDa, 2.25 내지 3.5kDa, 2.25 내지 3.25kDa, 2.25 내지 3kDa, 2.25 내지 2.75kDa, 2.25 내지 2.5kDa, 2.5 내지 4kDa, 2.5 내지 3.75kDa, 2.5 내지 3.5kDa, 2.5 내지 3.25kDa, 2.5 내지 3kDa, 2.5 내지 2.75kDa, 2.75 내지 4kDa, 2.75 내지 3.75kDa, 2.75 내지 3.5kDa, 2.75 내지 3.25kDa, 2.75 내지 3kDa, 3 내지 4kDa, 3 내지 3.75kDa, 3 내지 3.5kDa, 3 내지 3.25kDa, 3.25 내지 4kDa, 3.25 내지 3.75kDa, 3.25 내지 3.5kDa, 3.5 내지 4kDa, 3.5 내지 3.75kDa, 또는 3.75 내지 4kDa로 여과하여 수득한 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 범위로 여과하여 수득한 배양물은 (1) 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과, 및/또는 (2) 여드름 유발균에 대한 항균 효과가 우수한 것일 수 있다.

일 예에서, 큐티박테리움 속 균주의 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 일정기간 배양하여 얻은 배양물이거나, 상기 배양물을 열처리(또는 멸균(예를 들면, 오토클레이브 또는 열풍건조))하여 수득된 큐티박테리움 속 균주의 사균체가 포함된 배양물일 수 있다.

본 명세서에서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 상기 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양은 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, pH 6 내지 8, 또는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 일 예에서, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고/있거나, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다

일 예에서, 배양 온도는 20 내지 45℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 30 내지 35℃, 또는 35 내지 40℃일 수 있고, 배양 조건은 100 내지 500 rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 250rpm, 또는 200rpm일 수 있으며, 배양 시간(기간)은 1 내지 160 시간, 10 내지 100시간, 12 내지 72 시간, 24 내지 72시간, 30 내지 60시간, 40 내지 50시간, 45 내지 50시간, 또는 48시간일 수 있다. 일 예에서 배양은 상기 범위의 배양 온도에서 상기 범위의 배양 시간 동안 수행될 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며 당업자는 공지된 내용에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

상기 큐티박테리움 속 균주를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시킬 수 있다. 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예를 들면, 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예를 들면, 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예를 들면, 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 기타 금속염(예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있고/있거나 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물의 효과

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주 및/또는 상기 균주의 배양물은 항염증 활성, 항균 활성, 피부 재생 활성, 피부 보습 활성, 및 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 또는 5종 모두)의 활성을 가지는 것이거나, 상기 활성이 강화된 것일 수 있다. 상기 활성 강화는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "항염증 활성"은 염증 발생을 억제하거나, 염증의 정도를 경감하는 등 염증을 감소시키는 모든 활성을 의미할 수 있다. 일 예에서 상기 항염증 활성은 염증을 유발하는 염증 세포(예컨대, 대식 세포 등)의 증식을 억제하거나 염증 세포가 생성하는 염증 물질(예컨대, 염증성 사이토카인, 히스타민 등)의 유전자 전사 억제 또는 단백질 번역 억제 등의 활성을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 항염증 활성은 면역 반응으로 생성된 염증 물질(예컨대, 염증성 사이토카인(인터류킨-6 등), 케모카인 리간드(CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2, 케모카인 리간드 2) 등), 종양괴사인자(TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 등) 등)을 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 상기 염증은 염증성 피부질환으로 인한 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항균 활성"은 염증을 유발하는 세균의 성장을 저해하거나, 및/또는 사멸시키는 등의 활성을 의미할 수 있다. 상기 염증을 유발하는 세균은 염증성 피부질환 유발균일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "피부"는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "피부 개선 활성"은 피부 재생, 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 수분 공급, 피부 영양 공급, 피부 톤 개선, 모공 축소, 피부결 개선, 각질 제거, 피부 볼륨 개선, 두피 보호, 두피 또는 피부의 피지 방지, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 모발 영양 공급, 모발 볼륨 개선, 피부 보호 (예컨대, 피부 염증 완화 또는 개선용, 피부 가려움증 개선용, 또는 아토피 개선용), 또는 피부 상태 개선 등을 모두 포함하는 개념일 수 있다.

상기 피부 개선은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 노화 방지, 피부 보습 개선, 피부 수분 공급, 및 피부 영양 공급으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 피부 개선은 두피 보호, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 및 모발 영양 공급으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 피부 개선은 민감성 피부 개선을 의미할 수 있다. 상기 민감성 피부 개선은, 온도 (예컨대, 고온 또는 저온), 바람, 유해물질 (예컨대, 미세먼지, 피지, 기름, 세균 등), 화학물질 (예컨대, 호르몬 등)에 의하여 일어나는 피부 반응 (예컨대 피부 트러블, 면역 반응, 염증 반응 등)을 개선하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 피부 상태를 건강한 상태로 유지하거나 질환으로 인해 악화된 피부 상태를 개선하거나 증진하는 모든 활성을 의미할 수 있다. 상기 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 피부의 표피, 진피, 및/또는 피하 조직에 존재하는 세포들의 증식을 촉진하거나 생장을 유도하는 것일 수 있다. 상기 피부 상태를 악화시키는 질환은 염증성 피부질환일 수 있다. 일 예에서, 상기 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 각각 피부 재생 관련 마커(예컨대 Src 또는 MMP2 (metalloproteinase-2) 등의 단백질 또는 유전자)의 발현량을 증가시키는 것이거나, 피부 보습 관련 마커(예컨대 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3) 또는 AQP3 (Aquaporin 3) 등의 단백질 또는 유전자)의 발현량을 증가시키는 것 등을 의미할 수 있다.

일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주 및/또는 상기 균주의 배양물은

(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하지 않거나, 및/또는

하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 균주(예컨대, 큐티박테리움 속 균주) 및/또는 이의 배양물과 비교하여, 상기 활성이 우수할 수 있다:

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 약학 조성물

다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 약학(적) 조성물을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 출원에서, "예방"이란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환(질병)의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란, 일 예에 따른 조성물의 투여로 질환이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 상기 질환은 염증성 피부질환을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, "염증성 피부질환"은 탈모, 로사세아(Rosacea), 피부 붉어짐, 돌기, 물집, 두드러기, 가려움, 피부 벗겨짐, 발진, 알러지성 약물 발진, 비알러지성 약물 발진 (예컨대, 항정신병약, 테트라사이클린, 술파제 항생제, 히드로클로로티아지드, 또는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)에 의한 약물 발진), 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 세균성 피부염(예컨대, 큐티박테리움 속 세균(예컨대, 큐티박테리움 아크네, 큐티박테리움 아비덤, 및/또는 큐티박테리움 그래눌로섬)에 의한 피부염), 바이러스성 피부염, 아토피 피부염, 주사피부염, 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

일 예에 따른 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여 방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 복강 투여, 복강 주사, 관절강 내 주사, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 투여(예컨대, 두피 또는 피부에 도포), 경피 주사, 국소 도포, 근육 투여, 복막내 투여와 같은 비경구 투여이거나, 경구 투여일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

일 예에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제(분말제), 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고상 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

일 예에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있고, 본 출원에서, "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 출원 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 출원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

일 예에 따른 약학 조성물의 투여량 (큐티박테리움 속 균주의 배양물의 건조물 중량 기준)은 예를 들면, 포유동물에 하루 동안 약 0.0001 내지 10000mg/kg, 0.0001 내지 5000mg/kg, 0.0001 내지 1000mg/kg, 0.0001 내지 900mg/kg, 0.0001 내지 800mg/kg, 0.0001 내지 700mg/kg, 0.0001 내지 600mg/kg, 0.0001 내지 500mg/kg, 0.0001 내지 400mg/kg, 0.0001 내지 300mg/kg, 0.0001 내지 200mg/kg, 1 내지 1000mg/kg, 1 내지 900mg/kg, 1 내지 800mg/kg, 1 내지 700mg/kg, 1 내지 600mg/kg, 1 내지 500mg/kg, 1 내지 450mg/kg, 1 내지 400mg/kg, 1 내지 350mg/kg, 1 내지 300mg/kg, 1 내지 250mg/kg, 10 내지 1000mg/kg, 10 내지 900mg/kg, 10 내지 800mg/kg, 10 내지 700mg/kg, 10 내지 600mg/kg, 10 내지 500mg/kg, 10 내지 450mg/kg, 10 내지 400mg/kg, 10 내지 350mg/kg, 10 내지 300mg/kg, 10 내지 250mg/kg, 100 내지 1000mg/kg, 100 내지 900mg/kg, 100 내지 800mg/kg, 100 내지 700mg/kg, 100 내지 600mg/kg, 100 내지 500mg/kg, 100 내지 450mg/kg, 100 내지 400mg/kg, 100 내지 350mg/kg, 100 내지 300mg/kg, 100 내지 250mg/kg, 200 내지 1000mg/kg, 200 내지 900mg/kg, 200 내지 800mg/kg, 200 내지 700mg/kg, 200 내지 600mg/kg, 200 내지 500mg/kg, 200 내지 450mg/kg, 200 내지 400mg/kg, 200 내지 350mg/kg, 200 내지 300mg/kg, 또는 200 내지 250mg/kg으로 투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 약학 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 출원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있으며, 일 예에서 상기 대상은 앞서 설명한 바와 같은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하거나, 염증성 피부질환을 가지는 개체 (인간 등의 포유동물) 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있다.

일 예에 따른 약학 조성물은 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 1 내지 80중량%, 5 내지 80중량%, 5 내지 75중량%, 5 내지 70중량%, 5 내지 65중량%, 50 내지 70중량%, 55내지 65중량%, 60 내지 65중량%, 10 내지 60중량%, 15 내지 60 중량%, 20 내지 60 중량%, 1 내지 50중량%, 5 내지 50중량%, 10 내지 50중량%, 15 내지 50 중량%, 20 내지 50 중량%, 1 내지 40중량%, 5 내지 40중량%, 10 내지 40중량%, 15 내지 40 중량%, 20 내지 40 중량%, 1 내지 30중량%, 5 내지 30중량%, 10 내지 30중량%, 15 내지 30 중량%, 20 내지 30 중량%, 1 내지 25중량%, 5 내지 25중량%, 10 내지 25중량%, 15 내지 25중량%, 20 내지 25중량%, 또는 23 내지 25중량%로 포함할 수 있다.

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물

또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품 자체이거나, 식품에 첨가되는 식품 첨가제 형태이거나, 또는 건강 기능 식품일 수 있다.

일 예에 따른 식품 조성물은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등을 의미할 수 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 출원의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 출원의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 출원의 식품은 염증성 피부질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반 식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 알 예에 따른 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

일 예에 따른 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 염증성 피부질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

일 예에 따른 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 출원의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물의 일 예로 건강 음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강 음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

일 예에 따른 식품 조성물은 염증성 피부질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 예를 들면, 일 예에 따른 조성물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물

또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물은 사료 자체로 사용되거나, 사료에 첨가되는 사료 첨가제 형태로 사용될 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 사료 조성물은 부형제, 희석제, 및/또는 첨가제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 상기 구성 성분 외에도 동물의 성장 촉진에 유효한 성분, 영양 성분, 영양 보조 성분, 보존 안정성을 높이는 성분, 피복제 성분, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 생균제; 아밀라아제, 리파아제 등의 효소; L-아스코르브산, 염화콜린, 이노시톨 등의 비타민; 염화칼륨, 시트르산철, 산화마그네슘, 인산염류 등의 미네랄; 리신, 알라닌, 메티오닌 등의 아미노산; 푸마르산, 부티르산, 락트산 등의 유기산 또는 이의 염; 비타민 C, 비타민 E 등의 항산화제, 프로피온산칼슘 등의 곰팡이 방지제; 레시틴, 글리세린 지방산 에스테르 등의 유화제; 및/또는 색소 등을 포함할 수 있다. 상기에 기술되지 않았더라도 일 예에 사료 조성물은 통상의 기술자가 예상할 수 있는 범위 내의 다른 기타 영양성분을 추가로 포함할 수 있다.

일 예에 따른 조성물을 포함하는 사료를 급여할 수 있는 개체(동물)는 특별히 제한은 없으나 포유류, 어류, 갑각류 및/또는 패각류일 수 있고, 예를 들면, 돼지, 소, 말, 염소, 사슴, 양, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 개, 고양이, 토끼, 물고기일 수 있다.

상기 사료 조성물이 사료 첨가제 형태로 사용되는 경우, 시판되는 사료에 일 예에 따른 사료 첨가제를 첨가한 형태로서 제조될 수 있다. 일 예에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 사료는 분말 또는 펠렛 제형, 또는 액상 제형인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것을 아니다. 또한, 사료에 첨가되는 본 출원의 사료 첨가제의 첨가량은 특별한 한정을 요하는 것은 아니다.

상기 사료는 본 출원의 조성물을 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합하거나, 사료 제조 시 직접 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 사료 내 포함되는 본 출원의 사료 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예컨대, 건조된 분말형태일 수 있다. 상기 사료 첨가제는 전체 사료 중량의 0.005 내지 10 중량%, 0.05 내지 10 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.005 내지 5 중량%, 0.05 내지 5 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.005 내지 2 중량%, 0.05 내지 2 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료는 상기 사료 첨가제 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제가 첨가될 수 있는 사료는 시판되는 사료, 또는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물

또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환 원인균에 대한 억제 방법을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 명세서에서 "항균용 조성물"은 항균 활성을 가지는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 항균 활성은 앞에서 설명한 바와 같으며, 염증성 피부질환 유발균의 성장을 저해하거나, 및/또는 사멸시키는 것 등을 의미할 수 있다. 상기 항균 활성은 항생 활성과 혼용되어 사용될 수 있으며, 상기 항균용 조성물은 염증성 피부질환의 유발균에 대하여 성장 저해능 및/또는 사멸능을 갖는 모든 형태의 제제를 포괄하는 것으로, 특별한 언급이 없는 한 항생용 조성물, 항균제, 항생제, 방부제, 살균제 등과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

상기 염증성 피부질환의 유발균은 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum), 스타필로코쿠스 오레우스(S. aureus), 박테로이드 후라길리스 (B. fragilis), 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스(S. epidermidis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종 모두)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 염증성 피부질환은 앞에서 설명한 바와 같으며, 예컨대 여드름 또는 로사세아 등의 질환일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 다른 예는 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 소독제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 소독제를 소독이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 세척제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 세척제를 세척이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다.

상기 소독제는 병원균 감염을 막기 위한 제제를 총칭하는 것으로, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

상기 항균용 조성물이 염증성 피부질환의 유발균에 대하여 항균 효과를 가지므로, 염증성 피부질환의 유발균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척(세정)하는 용도로 적용될 수 있다.

큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 화장료 조성물

또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용, 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

일 예에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 이러한 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 항염증, 또는 피부 개선 활성 예컨대, 피부 재생 활성 촉진, 및/또는 피부 보습 활성(기능) 강화 효과)를 가질 수 있다. 상기 피부 개선 활성은 앞에서 설명한 바와 같다.

본 명세서에서 제공되는 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물의 제형에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 용액, 현탄액(무수 및 수계), 유탁액(에멀젼), 페이스트, 겔, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상 등), 파우더, 연고, 패치, 화장수, 에센스, 젤, 로션, 용액, 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 또는 분무제 등으로 제형화 될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탄액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 연고, 패치, 화장수, 에센스, 젤, 로션, 마스크, 팩, 분말, 캅셀, 및 분무제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 출원에 있어서의 피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

일 예에서, 상기 조성물은 통상적인 계면활성제(유화제)를 포함하고, O/W (oil in water; 수중유), W/O (water in oil; 유중수), W/O/W, 또는 O/W/O 제형의 유화 또는 가용화 형태의 성상을 갖는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 피부외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 모든 계면활성제들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예컨대, 비이온 계면활성제 및 음이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비이온 계면활성제는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제, 폴리글리세린계 계면활성제, 슈가 에스테르계 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 폴리글리세릴-메칠글루코오스디스테아레이트, 폴리글리세릴-메칠글루코오스스테아레이트, 폴리글리세릴-디스테아레이트 (예컨대, 폴리글리세릴-10 디스테아레이트 등), 폴리글리세릴-스테아레이트, 하이드로제네이티드레시틴, 세테아릴올리베이트, 소르비탄올리베이트,　PEG(poly(ethylene glycol))-스테아레이트류 (예컨대, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트 등), 글리세릴스테아레이트, 글리세릴스테아레이트에스이, 데실글루코사이드, 코코-글루코사이드, 라우릴글루코사이드, 카프릴릴/카프릴글루코사이드, 아라키딜글루코사이드, C12-20 (직쇄 또는 분지형) 알킬 글루코사이드, 세테아릴글루코사이드, 세테아레스류 (예컨대, 세테아레스-20 등),　스테아레스류 (예컨대, 스테아레스-2, 스테아레스-21, 등), 올레일 알코올의 폴리에틸렌글리콜에테르 (예컨대, 올레스-20, 등), 메칠글루코스세스퀴스테아레이트, 소르비탄스테아레이트, 슈크로스코코에이트, 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트60 등), 소르비탄세스퀴올리에이트, 소르비탄올리베이트, 기름야자오일, 기름야자커넬오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온 계면 활성제는 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산암모늄, 라우릴 황산마그네슘, 라우릴 황산트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산암모늄, 소듐코코암포아세테이트, 암모늄라우레스설페이트, 암모늄라우릴설페이트, 코카마이드엠이에이, 디소듐라우레스설포석시네이트, 티이에이-코코일글루타메이트, 소듐코코일애플아미노산, 코카마이드디이에이, 소듐라우레스설페이트, 소듐라우릴설페이트, 포타슘코코일글리시네이트, 소듐스테아로일글루타메이트, 포타슘세틸포스페이트 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물은, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합 이외에, 피부에 적용하기 위하여 통상적으로 함유되는 성분들, 오일, 폴리머, 점증제, 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적으로 함유되는 성분들 및 이들의 함량은 목적하는 조성물의 기능, 성상 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다.

예컨대, 상기 오일은 실리콘 오일, 예컨대, 사이클로펜타실록산, 디메치콘, 디메치콘올, 사이클로메치콘, 트리실록산, 아모디메치콘, 페닐트리메치콘, 디실록산, 사이클로헥사실록산, PEG-디메치콘류 (예컨대, PEG-12 디메치콘, PEG-10 디메치콘, PEG-7 디메치콘 등), 폴리실리콘류 (예컨대, 폴리실리콘-11 등), 시메치콘, 디페닐디메치콘, PEG-9폴리디메칠실록시에칠디메치콘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 비실리콘 오일, 예컨대, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 부틸렌글라이콜디카프릴레이트/디카프레이트, 하이드로제네이티드폴리이소부텐, 이소프로필미리스테이트, 세틸에틸헥사노에이트, 하이드로제네이티드폴리데센, 디에톡시에틸석시네이트, 헥실라우레이트, 트리에틸헥사노인, 이소노닐이소노나노에이트, 폴리이소부텐 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 트리글리세라이드; 왁스 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 폴리올은 부틸렌글라이콜, 글리세린, 글리세레스 (예컨대, 글리세레스-26 등), 메틸프로판디올, PEG(poly(ethylene glycol))/PPG(poly(propylene glycol)) 코폴리머류 (예컨대, PEG/PPG-17/6코폴리머 등), 메틸글루세스류 (예컨대, 메틸글루세스-20 등), 디프로필렌글라이콜, 프로필렌글라이콜, 프로판디올, 카프릴릴글라이콜, 펜틸렌글라이콜 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 점증제는 카보머, 암모늄아크릴로일디메틸타우레이트/브이피코폴리머, 잔탄검, 소듐폴리아크릴레이트, 하이드록시에틸셀룰로오스, 아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머, 소듐폴리아크릴레이트, 소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메틸타우레이트코폴리머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 소듐카보머 등으로 이루어진 고분자 화합물들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 첨가제는 피부 외용제 및/또는 화장료의 제조에 통상적으로 사용되는, 이온 봉쇄제, 유화 안정제, pH 조절제, 피부컨디셔닝제, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트 (emollient), 비타민, 곤충 기피제, 보존제, 소염제, 염기성화 또는 산성화제, 착색제 (안료), 용해제, 담체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 피부 외용제 및/또는 화장료 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 용제를 포함할 수 있으며, 사용 가능한 용제는 정제수, 암반수, 온천수, 빙하수, 해수, 심층 해양수, 식물 추출수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 앞서 설명한 성분 이외에 스킨(피부) 케어 및/또는 모발/두피 케어에 유리한 효과를 발휘하는 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 유리한 효과는 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 수분 공급, 피부 보습, 피부 영양 공급, 모공 축소, 피부결 개선, 각질 제거, 피부 볼륨 개선, 두피 보호, 두피 또는 피부의 피지 방지, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 모발 영양 공급, 모발 볼륨 개선 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 적용 대상의 피부/모발/두피에서 소망하는 모든 효과일 수 있다. 예컨대, 상기 활성 성분은 각종 식물 추출물 (예컨대, 지모 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 연꽃 추출물, 토마토 추출물, 금은화 추출물, 동백꽃 추출물, 해조류 추출물 등), 식물 캘러스 배양물 또는 배양 추출물, 효모 추출물, 세포 함유 또는 무세포 효모 배양물 또는 배양 추출물, 비타민, 각종 펩타이드, 지질, 또는 지방산 (예컨대, 각종 어패류 유래의 지질, 지방산, 펩타이드 등) 히알루론산, 글리코시드 (예컨대, 알부틴 등), 이외의 각종 피부용 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 소망하는 효과에 따라서 적절한 활성 성분을 선택하여 사용할 수 있다. 일 예에서, 상기 활성 성분은 수소첨가 폴리이소부텐 (hydrogenated polyisobutene)과 지모추출물의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 예는 상기 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 피부, 모발, 및/또는 두피 케어용 제품일 수 있고, 예를 들어 얼굴, 손, 발, 온몸 등의 피부, 두피, 모발 등에 적용하기 위한 모든 형태의 화장품 및/또는 세정용 (클렌징) 제품일 수 있다. 일 예에서, 상기 제품은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림(자외선차단제), 비비크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품; 및 샴푸, 비누, 클렌징폼, 바디클렌저 등의 세정용 제품 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물(약학 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물, 및/또는 항균용 조성물) 및 방법의 투여 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있으며, 일 예에서 상기 대상은 앞서 설명한 바와 같은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하거나, 염증성 피부질환을 가지는 개체 (인간 등의 포유동물) 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있다.

본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도에 관한 것으로, 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.

도 1은 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651, CJRS-10652, CJRS-10653, CJRS-10654, CJRS-10655, 및 CJRS-10656 균주; 이하 같다.)의 용혈 활성으로 인한 독성 유무를 확인하기 위하여 용혈성 시험을 수행한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 본 출원에서 선별한 리보타입(Ribotype)이 RT2인 6개 균주가 가지는 공통적인 유전적인 특징을 확인하기 위하여 phylogenetic tree 형태로 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 처리하였을 때 대조군(Cell only w/ stimuli; 염증반응만 유도한 군), 양성대조군(염증반응 유도 후 Dex 처리군), 음성대조군(염증반응 후 식물성 공배지(Broth) 처리군) 및 비교군(염증반응 유도 후 Type I(ATCC 6919), Type II(ATCC 11828), Type I(CJIN1-1), Type I(CJIN1-2), Type II(CJIN2-1), Type II(CJIN2-2), Type III(CJIN3-1), B. fragilis 및 S. epidermidis의 배양물 처리군)과 비교하여, 면역세포에서 면역반응(면역세포의 증식(proliferation) 및 IL-6, CCL2, 및 TNF-a의 발현량)을 확인한 그래프이다.
도 5는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각의 여드름 유발 균주인 C. acnes(ATCC 6919)에 대한 항균 활성(antimicrobial activity)을 확인한 그래프이다. (NC: 아무 것도 처리하지 않음, Doxy: 양성대조군으로 독시사이클린(doxycycline)을 처리한 군)
도 6은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각의 세균(S. epidermidis)의 바이오필름(biofilm) 형성 억제 효과를 확인한 그래프이다. (NC: 아무 것도 처리하지 않음, Doxy: 양성대조군으로 독시사이클린(doxycycline)을 처리한 군)
도 7은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각을 농도별(5%(v/v), 10%(v/v), 20%(v/v))로 처리하였을 때 세포 독성 효과를 확인한 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리하였을 때 피부 효능(피부 세포 재생 효능)을 확인한 그림 및 그래프이다 (상처 후 0시간, 4시간 후 및 8시간 후).
도 9, 및 도 10은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리하였을 때 피부 재생 관련 마커인 Src, MMP2 (metalloproteinase-2)의 발현량과, 피부 보습 관련 마커인 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3)와 AQP3 (Aquaporin 3)의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 출원에서 선별한 6개 균주 (생균)를 Raw264.7 대식세포를 함께 배양하여 Raw264.7 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 (IL-6)과 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 IL-10/IL-6의 비율로 계산하여 그래프로 나타낸 것이다. (대조군으로 B. fragilis 균주를 사용하였다.)
도 12 및 도 13은 본 출원에서 선별한 2개 균주(CJRS-10652 균주 및 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였을 때 면역세포의 증식과 염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-8)의 발현량을 확인한 그래프이다. (양성대조군: 덱사메타손(Dex)을 사용한 군)
도 14a, 도 14b, 및 도 15는 본 출원에서 선별한 2개 균주(CJRS-10652 균주 및 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 로사세아가 유도된 마우스에 복강 투여하였을 때 피부 홍반, 상피조직과형성 및 피부 염증의 정도를 확인한 그래프 및 사진이다. (Vehicle: 아무 것도 처리하지 않은 대조군, LL37: LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아 병변을 유도한 군, Doxy: 양성대조군으로, 병변을 유도한 마우스에 독시사이클린(doxycycline)을 복강 투여한 군)
도 16 및 도 17은 피부 모델 T&R HuSkin에 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 처리하고 장벽개선 지표인 Filaggrin 및 보습개선 지표인 Aquaporin-3의 발현양을 확인한 결과이다.
도 18 및 도 19는 인간섬유아세포에 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 처리하고 세포독성 유무 및 콜라겐 생성 기능을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실험예 1. 균주 확보

1) 피시험자 선정

만 18세 이상 39세 이하의 건강한 성인 남녀 73명을 대상으로 (씨알에이코리아社를 인체 피지 채취 위탁 기관으로 선정, IRB 승인(승인번호: CRAIRB20-030502)) 본 시험을 진행하였다.

2) 피부 피지 채취

물로 가볍게 세안 후 멸균수를 거즈에 적셔 코를 가볍게 닦아내었다. 따뜻한 물에 적신 멸균 거즈를 약 5분간 코에 올려 놓고 기다렸다. 순간접착제 (Cyanoacrylate) 1방울을 테이프에 묻힌 후 약 10초간 기다렸다. 테이프를 코에 적용 후 1분간 기다린 후에 피지를 추출하였다 (SSB, Skin Surface Biopsy). 피지가 묻은 테이프를 1.5ml e-tube (glycerol 50% + RCM (Reinforced Clostridial Medium, BD Difco) 50%)에 넣어서, 피부 피지 샘플을 채취하였다.

3) 피부 균주 배양 및 확보

상기 피지 샘플을 PBS에 희석한(10⁰~10³) 후 RCM agar plate에 streaking 후 anaerobic gas pack jar에 넣어 37℃에서 96시간 동안 배양하였다. 개별 plate당 10~20개의 single colony를 RCM broth에 넣고 24시간 동안 anaerobic gas pack jar (37℃)에서 활성화시켰다. 24시간 후 fresh RCM broth에 샘플의 1%를 접종한 후 anaerobic gas pack jar에 넣고 37℃ 에서 48시간 동안 배양하여 총 1735개의 사람 피부유래 균주를 확보하였다. 확보된 균주들을 아래 표 1에 기재된 primer를 이용하여 16S rRNA와 RecA sequencing을 진행하였고, sequencing 기반으로 166개의 특이적인 C. acnes 균주를 선별하였다. 대식세포 기반의 증식및 염증지표(IL-6, CCL2, TNF-α)억제 시험을 통하여 6개의 특이적인 C. acnes 균주를 선별하였다.

본 출원에서 선별한 6개 균주인 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주는 공통적으로 서열번호 8의 16S rRNA를 포함하는 것으로 확인되었다. 확보된 균주들의 시퀀스 타입(Sequence type), 리보타입(Ribotype), 및 면역학적 표현형(Immunological phenotype)을 확인하고 이를 아래 표 2에 나타내었다.

16S 및 RecA PCR sequencing primer와 16S rRNA gene sequence

16S PCR
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (서열번호 1)
1482R	TACGGYTACCTTGTTACGACTT (서열번호 2)
16S sequencing
515F	GTGCCAGCMGCCGCGGTAA (서열번호 3)
518F	CCAGCAGCCGCGGTAATACG (서열번호 4)
RecA PCR
recA_F	AGCTCGGTGGGGTTCTCTCATC (서열번호 5)
recA_R	GCTTCCTCATACCACTGGTCATC (서열번호 6)
RecA sequencing
recA_F	GGTACCACTGCCATCTTCATTA (서열번호 7)
16S rRNA gene sequence	TCATTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTTTGTGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTTTGGGATAACTTCAGGAAACTGGGGCTAATACCGGATAGGAGCTCCTGCTGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTCGGCGGTTGGGGATGGACTCGCGGCTTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCTTACCAAGGCTTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCGCCTGTGACGAAGCGTGAGTGACGGTAATGGGTAAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGTGGTTGATCGCGTCGGAAGTGTAATCTTGGGGCTTAACCCTGAGCGTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATTCCTGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTTCCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGGTCCATTCCACGGGTTCCGCGCCGTAGCTAACGCTTTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGTAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGGATCGGGAGTGCTCAGAGATGGGTGTGCCTCTTTTGGGGTCGGTTCACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCACTGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCAGTGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGTGGCGAGCCTGTGAGGGTGAGCGAATCTCGGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGGCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCGTTGTGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACTGGTGATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT (서열번호 8)

확보된 C. acnes 균주 분류 및 면역 특성

Strains	Sequence type	Ribotype	Immunological phenotype
ATCC 6919	Type I	RT1	비유효
CJIN-1-1
CJIN-1-2
CJRS-10651	Type II	RT2	유효
CJRS-10652
CJRS-10653
CJRS-10654
CJRS-10655
CJRS-10656
ATCC 11828	Type II	RT2	비유효
CJIN-2-1
CJIN-2-2
CJIN-3-1	Type III	RT9	비유효

확보된 C. acnes 균주의 시퀀스 타입(Sequence type) 및 리보타입(Ribotype)은 아래 실시예 2-2의 eMLST 분석 결과에 따라 분류하였고, Immunological phenotype은 아래 실시예 3-3의 면역지표 분석 결과에 따라 분류하였다.상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주인 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주는 Sequence type이 Type II, 리보타입(Ribotype)이 RT2, Immunological phenotype이 유효인 특징을 공통적으로 갖는 것으로 확인되었다.

실험예 2. 배양물 확보

상기 표 2에 나타난 균주, 및 비교군으로 사용되는 B. fragilis(Bacteroides fragilis, 박테로이드 후라길리스, KCTC5013) 균주, 및 S. epidermidis(Staphylococcus epidermidis, 스타필로코커스 에피더미디스, 표피포도구균, KCTC3958) 균주를 각각 48시간 동안 RCM 배지(BD Difco) 또는 식물성 배지(아래 표 3에 식물성 배지의 조성을 나타내었음)에서 배양한 후, 원심분리기(4000g, 20분, 상온)를 사용하여 원심분리하여 균주를 제외한 배양물(Cell free supernatant)을 확보하였다.

식물성 배지 조성

성분	회사	%(w/v)	Volume (g/L)
Glucose	Sigma aldrich	0.5	5
Peptone from vegetable	Sigma aldrich	2.5	25
Sodium chloride	Oxoid	0.5	5
Sodium acetate	Sigma aldrich	0.3	3
Cysteine HCl	Sigma aldrich	0.05	0.5

상기 확보된 배양물의 pH를 NaOH를 이용하여 pH 7로 조정한 후, 배양물을 0.22μm 포어 사이즈 필터로 여과하고, 3kDa amicon filter를 통해 3kDa 이하로 여과된 배양물을 수득하여 이를 최종 시험 물질로 준비하였다.이하의 실시예에서, 염증반응을 유도하기 위한 물질로 상기 표 2의 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 pH 7로 조정한 후 0.22μm 포어 사이즈 필터로 여과된 배양물을 준비하여 사용하였다.

실시예 1. 피부유래 균주의 용혈활성 시험

본 출원에서 선별한 6개의 피부 유래 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)의 용혈 활성으로 인한 독성 유무를 확인하기 위하여 용혈성 시험을 수행하였다.

RCM broth에서 활성화시킨 상기 피부 유래 균주들을 각각 sheep blood agar에 도말하여 anaerobic chamber에서 37℃ 에서 48시간 배양하였다. 콜로니 집락 주위에 적혈구가 용해되어 clear zone이 생성되는지 확인하고 이를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 시험 결과 본 출원에서 선별한 모든 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)에 대해서 용혈성을 보이지 않아 본 출원에서 선별한 균주는 안전한 것으로 판단되었다.

실시예 2. 선별된 균주 유전자 분석

실시예 2-1. 균주의 phylogenetic feature 확인.

C. acnes는 종 내 균주간 (intraspecies level) 유전체의 차이가 큰 것으로 알려져 있다. 실제로 종 내 균주간의 유전체의 차이가 크기에, 현재는 같은 C. acnes 종으로 분류되고 있지만 type I은 C. acnes 아종 acnes로 type II는 C. acnes 아종 defendens로 type III는 C. acnes 아종 elongatum로 재분류(reclassification)되어야 한다고 제안된다. 이들 type들도 16S rDNA sequence가 다르며 여러 다양한 사람들의 피부 메타지놈(metagenome)의 relative abundance에 의해서 여러 리보타입(ribotype; RT)들로 나누어지는 것으로 알려져 있다.

실험예 1에서 제조된 균주들의 리보타입(ribotype; RT)을 각 균주들의 전장유전체 분석(Whole Genome Sequencing; WGS)을 통해서 확인하였다 (이러한 결과를 상기 표 2에 나타내었음). 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)와, NCBI genome site로부터 확보한 리보타입이 RT2인 37개 균주 (reference 균주)들의 전장유전체 데이터를 이용하여, roary tool 기반으로 core gene과 accessory gene을 구하였다. 전장유전체의 sequence를 이용하여 phylogenetic feature를 확인한 후, MUSCLE algorithm을 이용해서 alignment를 진행하고 maximum likelihood 방법으로 tree 모양을 표현하여 이를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 즉, Core gene set을 이용해서 phylogenetic tree를 그리고 core gene과 accessory gene set들을 포함하여 matrix 형태의 그림으로 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. Edge에 있는 score는 bootstrap을 10,000번 반복 시 나온 신뢰값이다. 본 출원에서 선별한 6개 균주는 도 2a에 빨간색 박스 내에 빨간색 글씨로 기재하고 왼쪽 화살표로 표시하였으며, reference 균주는 검정색으로 기재하였다.

도 2b에서, 균주가 가지고 있는 유전자 클러스터(gene clusters)를 파란색으로 표시하였다.

도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리보타입이 RT2인 reference 균주(도 2a에서, 빨간색 박스로 포함되지 않은 나머지 균주)들은 특정 유전자 클러스터(gene clusters)를 가지고 있지만, 본 출원에서 분리한 6개 균주는 상기와 같은 특정 유전자 클러스터가 없는 것을 확인하였다 (이러한 부분을 도 2b에서 위쪽 화살표로 표시하였음).

도 2a에서 빨간색 박스로 포함된 균주 중 검정색으로 표시된 JCM 18920 균주는, 도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 분리한 6개 균주와 비교하여 추가적인 accessory gene을 가지고 있었다. 이러한 점은 JCM 18920 균주가 본 출원에서 분리한 6개 균주와 다른 모습을 가지고 있는 것임을 나타내는 것으로, 본 출원에서 분리한 6개 균주와 상이한 것임을 확인하였다 (이러한 부분을 도 2b에서 아래쪽 화살표로 표시하였음).

실시예 2-2. 균주의 eMLST(Expanded Multi-locus Sequence Typing) 분석

추가적으로, 상기 NCBI genome site로부터 확보한 리보타입이 RT2인 37개 균주 (reference 균주)와 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)를 비교하기 위하여 eBURSTv3 program (http://eburst.mlst.net/default.asp)을 이용해서 eMLST 분석을 수행하였다 (Dreno et al. 2018). eMLST 분석은 C. acnes 균주들에 보존되어(conserved) 있으면서 16S rRNA sequence보다 phylogenetic resolution을 향상시켜주었던 유전자들의 sequence들을 이용해서 분리하는 것이다. 유전자들의 sequence variation에 따라서 특정한 sequence type (ST)로 나뉘고 나뉜 ST들은 frequency에 따라서 아래 표 4와 같이 특정한 clonal complex (CC)로 그룹핑되었다. ST는 서열의 다양성을 기반으로 나누는 방법이며, CC는 나누어진 ST를 서열의 차이를 이용하여 하나의 클러스터로 분류하는 방법이다. 아래의 표 4는 선별된 RT2 C. acnes들의 eMLST 분석을 통한 sequence type (ST) 및 clonal complex를 보여준다:

Strains	aroE	atpD	gmk	guaA	lepA	sodA	tly	camp2	ST	Clonal complex (CC)
C. acnes strain KCOM 1861 (= ChDC B594)	17	4	2	4	2	12	10	28	6	CC6 (type II)
C. acnes HL082PA2	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes HL060PA1	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes strain T20574	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes strain T20670	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes strain T20736	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes strain T20758	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes strain T20816	17	4	2	4	2	3	10	10	6	CC6 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 09-109	17	9	2	4	2	3	10	10	25	CC6 (type II)
C. acnes HL103PA1	17	9	2	4	2	3	10	10	25	CC6 (type II)
C. acnes HL050PA2	17	4	2	17	2	3	11	11	26	CC6 (type II)
C. acnes subsp. defendens ATCC 11828	17	4	2	4	2	12	10	13	27	Singleton (type II)
C. acnes J139	17	4	2	16	2	12	10	12	27	Singleton (type II)
KCTC 3320	17	4	2	4	2	12	10	13	27	Singleton (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 09-323	17	4	2	16	2	12	10	12	28	CC30 (previously CC72) (type II)
C. acnes HL001PA1	17	4	2	4	2	6	10	12	30	CC30 (previously CC72) (type II)
C. acnes strain 09-9	17	4	2	4	2	3	10	19	65	CC6 (type II)
C. acnes strain T29350	17	4	2	4	2	3	10	19	65	CC6 (type II)
C. acnes strain T29362	17	4	2	4	2	3	10	19	65	CC6 (type II)
C. acnes strain T29420	17	4	2	4	2	3	10	19	65	CC6 (type II)
CJRS-10651	17	4	2	4	4	6	10	12	69	CC72 (type II)
CJRS-10652	17	4	2	4	4	6	10	12	69	CC72 (type II)
CJRS-10654	17	4	2	4	4	6	10	12	69	CC72 (type II)
CJRS-10655	17	4	2	4	4	6	10	12	69	CC72 (type II)
CJRS-10656	17	4	2	4	4	6	10	12	69	CC72 (type II)
C. acnes isolate MGYG-HGUT-00111	17	4	2	4	2	12	10	12	72	CC72 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 11-49	17	4	2	4	2	12	10	12	72	CC72 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 10-482	17	4	14	16	2	12	10	39	130	Singleton (type II)
C. acnes strain MIT 1857-A1	20	4	2	4	2	6	10	42	137	CC72 (type II)
C. acnes strain P15-071	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T45496	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T45374	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T28840	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T28811	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T45321	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T45-496	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T45-374	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T28-811	17	4	2	16	2	20	10	12	139	CC72 (type II)
C. acnes strain T55820	17	4	2	4	2	3	36	10	150	CC6 (type II)
C. acnes strain P15-087	17	4	2	4	2	3	36	10	150	CC6 (type II)
C. acnes strain CA17	17	4	2	4	4	6	10	46	153	NA
CJRS-10653	17	4	2	4	4	6	10	46	153	NA
C. acnes strain 09-23	17	9	2	4	2	3	32	10	25 or 128	CC6 (type II)
C. acnes JCM 18920	17	-	2	4	-	6	10	-	NA	NA

상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주는 eMLST 분석 결과 ST (sequence type)가 69 또는 153인 것으로 확인되었다 (CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주의 경우 ST가 69, CC (clonal complex)가 CC72 (Type II), CJRS-10653 균주의 경우 ST 153, CC는 NA(확인되지 않음)).

ST 69와 ST 153의 차이는 hemolytic factor 관련 유전자인 camp2의 single nucleotide sequence 차이로 확인되어 그 차이가 미약하므로, ST 153으로 확인된 CJRS-10653 균주의 CC는 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주의 CC인 CC72 (Type II)와 가까울 것으로 판단할 수 있다.

eMLST 분석 결과, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)와 유사한 eMLST 분포를 가지고 있는 균주로 C. acnes JCM 18920 및 C. acnes CA17 균주로 확인되었으나, 아래와 같은 이유로 본 출원에서 선별한 6개 균주는 C. acnes JCM 18920 균주 및 C. acnes CA17 균주와 상이한 것으로 확인되었다.

C. acnes JCM 18920 균주는 상기 실시예 2-1에서도 확인한 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주와 달리 추가적인 accessory gene을 가지고 있는 것으로 보여 본 출원에서 선별한 6개 균주와 상이함을 확인하였다.

본 출원에서 선별한 6개 균주가 C. acnes CA17 균주와 상이한 점을 확인하기 위하여 C. acnes CA17 균주의 유전체 비교를 실시하였다. 본 출원에서 선별한 6개 균주와 C. acnes CA17 균주의 WGS과 genome sequence alignment 결과를 통해서 확인한 결과, 4번 scaffold에 1-3467 영역의 plasmid가 C. acnes CA17 균주에만 특이적으로 존재함을 확인하였다. 상기 영역을 BLAST를 통해서 nucleotide sequence database (GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, 그리고 RefSeq)와 매칭한 결과, 상기 영역은 Salmonella enterica 균주에서 유래한 plasmid sequence로 확인되었다. 즉, C. acnes CA17 균주는 Salmonella enterica 균주에서 유래 plasmid가 있으므로, 본 출원에서 선별한 6개 균주와 상이한 것을 확인하였다.

실시예 2-3. 균주의 Orthologous Gene 분석

본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)의 orthologous gene을 Orthofinder를 통해서 분석하였다.

BLASTP을 이용해서 특정 thresholds (identity > 40 % 그리고 coverage > 80 %)를 통한 균주 특이적으로 존재하는 유전자들을 선별하였으며, Hypothetical protein이나 특정 family protein으로써 annotation이 잘되지 않은 유전자들은 제외하였다. 또한, 균주 특이적인 문헌조사를 실시하였고 C. acnes와 면역표현형과 관련된 문헌들에서 언급된 유전자들을 위주로 category들을 나눠서 정리하였다. 이러한 결과 중 일부를 아래 표 5에 나타내었다.

선별된 균주들의 특이적인 유전적 구성

Gene product	Function	Accession No.	Selected^‡	ATCC 11828
Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator)	Branched amino acid metabolic pathway regulator	WP_002531510.1	+	-
락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin)	Bacteriocin	WP_070651130.1	+	-
베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase)	Bacterial oncogene	WP_002518535.1	-	+
2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase)	L-Leucine metabolic pathway	WP_142263178.1	-	+
3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase)	L-Leucine metabolic pathway	WP_002513330.1	-	+
타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA)	CRISPR adaptive immune system	WP_002514606.1	-	+
타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC)		WP_002514608.1
CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3)		WP_002514605.1

(Selected ^‡ : 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주); ATCC 11828: 기존의 리보타입이 RT2인 균주 (reference))상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)는 기존에 밝혀졌던 리보타입이 RT2인 균주(대조군, ATCC 11828 균주)와 상이한 것을 확인하였다.

즉, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다.

또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것으로 확인되었다. 상기 베타-글루큐로니다제는 쓸개에서 나오는 담즙을 응집(aggregation)시켜서 결석을 만드는 것임이 잘 알려져 있으며 대장암(colon cancer)를 유발하는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것(L-Leucine pathway가 결실(deletion)되었음)으로 확인되었다.

또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 3. 면역지표 분석

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물에 대한 면역세포(Raw264.7 대식세포)의 면역지표를 확인하였다.

실시예 3-1. 면역세포 배양

본 실험에 사용한 면역세포는 Raw264.7(KCLB 40071) 대식세포를 사용하였다. 본 실험에 들어가기 일주일 전에 Raw264.7 대식세포를 FBS 10%(v/v) DMEM에 배양 및 유지하였다. 실험 18시간 전에 Raw264.7 대식세포를 5 x 10⁴/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.

실시예 3-2. 균주 배양물과 면역세포 co-culture:

Raw264.7 대식세포에 염증반응을 유도하기 위해 Raw264.7 대식세포에 실험예 2에서 제조된 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하고 RPMI Media(gibco) 95ul를 넣어 총 100μl를 37℃ incubator에서 1시간 동안 처리하였다. 염증 반응 유도 시, 정상세포(도 3의 제일 왼쪽, Cell only) 그룹을 제외한 모든 그룹에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하여 염증자극을 주었다.

1시간 후, 실험예 2에서 제조된 균주의 배양물(20μl)과 fresh RPMI Media(80μl)를 더하여 총 100μl를 염증 유도 물질인 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 처리된 plate에 추가하여 (총 200μl/well) 총 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

즉, Raw264.7 대식세포에 면역반응을 유도하기 위하여 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하였고, 그 후 다양한 균주의 배양물을 처리하고 면역지표를 확인하여 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

양성 대조군(Positive control)으로는 덱사메타손(dexamethasone, sigma)(100nM) (도 3의 Dex)을 사용하였다. 음성 대조군(negative control)으로는 식물성 공배지 (도 3의 Broth) 또는 fresh RPMI Media(gibco)를 넣은 정상세포(Cell only)를 사용하였다.

실시예 3-3. 면역지표 분석

24시간 후 상층액(cultured supernatant)을 모두 확보하고 남은 Raw264.7 대식세포의 viability 및 증식(proliferation) 정도를 확인하기 위해 cell counting kit 8 (Enzo, 5μl/well) + fresh RPMI media (95μl)를 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하였다.

확보된 상층액(supernatant)을 이용하여 Raw264.7 대식세포에서 분비된 염증성 사이토카인(IL-6(interleukin 6, 인터루킨 6), CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2, 케모카인 리간드 2), TNF-α(tumor necrosis factor alpha))의 양을 ELISA를 통해 측정하였다. Raw264.7 대식세포를 사용하여 균주의 타입별로 상기 염증성 사이토카인 수준의 감소 및 Raw264.7 대식세포의 증식(proliferation) 억제 정도를 확인하여 이를 도 3, 및 도 4에 나타내었고, 염증억제 기능의 정도에 따라 유효 또는 비유효 균주로 표기하였다 (유효/비유효 결과는 상기 표 2에 나타내었음).

도 3의 위쪽 그래프 및 도 4에 나타난 바와 같이, 정상 세포(Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않음; Cell only)는 염증성 사이토카인이 분비되지 않았으나, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증반응을 유도한 경우(Cell only w/ stimuli) 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)이 크게 증가하였다. 양성 대조군으로서, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응을 유도하고 덱사메타손(Dex)를 처리한 경우, 염증성 사이토카인의 양이 감소한 것을 확인하였다. 음성 대조군으로서 Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응을 유도하고 식물성 공배지(Broth)를 처리한 경우 염증 반응이 감소되지 않았다.

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에는 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응이 유도되어 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)의 분비량을 현저히 감소시켰으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상으로 염증성 사이토카인의 분비량을 감소시키는 것임을 확인하였다.

다른 종류의 큐티박테리움 속 균주(ATCC6919, ATCC11828, CJIN1-1, CJIN1-2, CJIN2-1, CJIN2-2, CJIN3-1) 또는 다른 세균(B. fragilis 또는 S. epidermidis)의 배양물을 처리한 경우에는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리한 경우와 상반되게, pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응이 유도되어 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)의 분비량에 변화가 없거나, 오히려 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다.

도 3의 아래쪽 그래프는 정상 세포(Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않음; Cell only)를 기준으로, 염증반응을 유발하는 Raw264.7 대식세포의 증식 정도를 %로 나타낸 것이다. 도 3의 아래쪽 그래프에 나타난 바와 같이, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증반응을 유도한 경우(Cell only w/ stimuli) 염증반응을 유발하는 Raw264.7 대식세포의 증식이 증가하였다.

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에는 Raw264.7 대식세포의 증식이 Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우와 동등하거나 그 이하로 감소한 것을 확인하였다.

실시예 4. 여드름 유발 균주 C. acnes (ATCC 6919) 성장 저해 효과

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 여드름 유발균으로 알려진 C. acnes(ATCC 6919)에 대한 항균 활성을 확인하였다. 양성 대조군으로 독시사이클린(doxycycline)(0.025μg/ml)을 사용하였다.

상기 균주의 배양물 농축액을 RCM broth에 희석하여 96-well plate에 첨가한 후 C. acnes ATCC 6919 균주를 RCM broth를 이용하여 10^6 CFU/mL까지 희석하여 96-well plate에 10%(v/v) 접종하였다. 균주 접종 후 anaerobic camber에서 48시간동안 37℃ 환경에서 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 ATCC 6919 균주에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Negative Control; NC)를 기준으로 성장 저해 효과를 %로(Antimicrobial activity (% of inhibition))로 나타낸 그래프이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 독시사이클린(Doxy)를 처리한 경우 C. acnes ATCC 6919 균주의 성장이 저하된 것을 확인하였다. 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리한 경우에도 C. acnes ATCC 6919 균주의 성장이 저하되었으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린(Doxy)을 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상이었음을 확인하였다.

실시예 5. 바이오필름(Biofilm) 형성 억제

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 S. epidermidis 세균의 바이오필름(biofilm) 형성을 억제하는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 독시사이클린(doxycycline; Doxy)(4μg/ml)을 사용하였다.

96-well 세포배양 플레이트에 S. epidermidis 세균을 1X10⁷CFU/mL로 24시간 동안 배양하여 부착시켜준 다음, 아무 것도 처리하지 않거나 (Negative Control; NC), 양성 대조군으로 독시사이클린(Doxy)을 처리하거나, 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 처리하고, TSB(Tryptic Soy Broth, BD difco) 배지, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 바이오필름 형성 정도를 측정하기 위해 Crystal violet(0.1% v/v)으로 처리하여 바이오필름을 염색하고 Tecan으로 570nm에서 측정하였다. 이후, O.D. sample/O.D. control X 100의 공식으로 환산하여 바이오필름(biofilm) 형성 억제율(inhibition rate)를 계산하였다.

구체적으로, Deep freezer에 보관되어 있던 S. epidermidis 세균을 꺼내어 TSB(Tryptic Soy Broth, BD difco)에 3%(v/v)으로 접종하고, 37℃ 에서 16시간동안 배양하였다. 키워진 배양액을 fresh TSB 배지에 1x10⁷CFU/mL이 되도록 희석하였다. 실험군인 동결건조 된 배양액은 농도에 맞게 증류수로 희석하여 샘플을 준비하였다.

96-well microtiter polystyrene plate 각 well에 100μl의 바이오필름(biofilm)을 형성시킬 S. epidermidis 세균와 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물 5%(v/v) 10μl, TSB 배지 90ul을 함께 처리하여 총 200μl로 각 well을 구성하였다. 24시간동안 37℃ 인큐베이터에서 plate 상태로 배양하였다. 24시간 배양한 미생물 균주는 crystal violet 용액 염색을 위해 전처리 과정을 하였다. 균주 plate 밑면의 생물막을 제외한 상등액은 suction하여 제거하였다. 각 well에 100μl의 1XPBS 용액을 이용하여 1번 wash 하였다. Wash된 생물막은 0.1% crystal violet 용액을 이용하여 20분간 빛이 없는 상온 조건에서 염색하였다. 염색이 끝난 후, 1XPBS용액 100ul을 이용하여 wash하였다. 33%의 Acetic acid 용액을 이용하여 염색된 생물막을 plate에서 떼어내었다. 용해된 생물막은 optical density plate reader기를 이용하여 OD_570nm 파장에서의 값을 통해 형성/억제를 평가하고 이러한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, S. epidermidis 세균에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Negative Control; NC), 바이오필름(Biofilm) 형성 억제 효과가 나타나지 않았다. 양성 대조군으로 S. epidermidis 세균에 독시사이클린(Doxy)을 처리한 경우, Biofilm 형성 억제 효과가 나타났다.

S. epidermidis 세균에 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에도 Biofilm 형성 억제 효과가 나타났으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린(Doxy)을 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상으로 Biofilm 형성을 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 6. 독성 시험

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 세포 독성이 없음을 확인하였다.

96-well 세포배양 플레이트에 HaCaT 세포를 각각 2x10^4/well로 24시간 동안 부착한 다음, Broth(식물성 공배지)를 농축하여 첨가하거나(0%(v/v), 5%(v/v), 10%(v/v), 또는 20%(v/v)) (Negative Control; Broth), 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 농축 후 첨가하여(5%(v/v), 10%(v/v), 20%(v/v)) 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 배양한다. 24시간 후에 배양된 세포배지를 제거하고 cell counting kit-8 용액을 세포에 처리하여 2시간동안 반응시킨 후 Tecan으로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후, O.D sample /O.D control Х 100의 공식으로 환산하여 HaCaT 세포주의 survival rate(Cell viability)을 계산하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에도 HaCaT 세포의 생존율에 영향을 끼치지 않았고, 오히려 세포 생존율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물은 세포 독성이 없으며, 오히려 세포 독성 감소 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. 피부 효능 시험

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물의 피부 재생 효능을 확인하였다.

Cell culture insert(Ibidi)에 HaCaT 세포를 각각 1x10^6/ml의 양으로 70μl씩 seeding 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 멸균된 포셉을 이용해 insert를 제거하여 wound healing assay에 필요한 wound 조건을 만들어 준 후, PBS로 2번 washing한다. FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양한다. 배양물 처리 후 0시간, 4시간, 8시간에 현미경을 이용하여 세포사진을 촬영하고 cell profiler 프로그램을 이용해 wound 면적을 계산, (0시간 면적-n시간 면적)/0시간 면적x100의 공식으로 환산하여 HaCaT 세포주의 wound closure를 확인하고 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.

도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 wound closure가 증가하여 피부 세포 재생 효능이 우수한 것을 확인하였다.

또한, HaCaT 세포주에 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 첨가하여 피부 재생 관련 마커인 Src, MMP2 (metalloproteinase-2) 발현을 확인하였다. Src의 활성 증가는 표피 상피세포, 진피층 및 혈관내피의 재생이 촉진되는 것을 의미하며, MMP2는 조직재생에 중요한 세포외 기질의 재생을 도와주고 각질세포, 섬유아세포와 같이 재상피화에 중요한 세포의 이동을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

HaCaT 세포를 24 well 세포배양 플레이트에 1x10^5의 양으로 seeding 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24h동안 반응시켜 Src와 MMP2의 발현을 RNA상에서 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 Src, MMP2의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물의 피부 재생 효능을 나타낸다.

또한, 피부 보습 효과를 확인하기 위해 HaCaT 세포를 24 well 세포배양 플레이트에 1x10^5의 양으로 seeding 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24h동안 반응시켜 피부 보습 기능의 마커인 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3)와 AQP3 (Aquaporin 3)의 발현을 RNA상에서 확인하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 HAS3, AQP3의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물의 피부 보습 기능 강화 효능이 우수함을 나타낸다.

실시예 8. 생균의 염증조절 유효성 평가 시험

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)를 식물성 배지(표 3)에서 배양한 후 원심분리하여 (4000g, 20분, 상온), 균주 배양물을 제외한 생균을 확보하였다. 확보된 생균과 면역세포(Raw264.7 대식세포)를 각각 5x10^4 / well의 동일한 비율(1:1)로 96 well plate에서 24시간 co-culture한후 균주의 염증조절 효능을 확인하였다. 대조군으로는 염증완화 균주로 알려져 있는 B. fragilis 균주를 사용하였다. Raw264.7 대식세포에서 분비된 염증성 사이토카인 (IL-6)과 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 ELISA로 측정한 후 그 값을 IL-10/IL-6의 비율로 계산하고 이를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)는 B. fragilis 균주와 비교하여 염증성 사이토카인 (IL-6)의 분비량을 감소시키고 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 촉진시켜 전체적으로 항염증 활성이 우수하였다.

실시예 9. Primary 면역세포 배양 및 면역지표 분석

본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물 처리 시 면역세포의 면역지표를 확인하였다.

본 실험에 사용한 면역세포는 마우스 유래의 marrow derived macrophages(mouse BMDM, ㈜한림)와 human monocyte derived macrophage(HMDM, ATCC)이다. 실험에 들어가기 일주일 전에 다음의 조건하에 세포를 배양하였다. BMDM with 10ng/ml of mouse M-CSF 또는 HMDM with 50ng/ml of human M-CSF in 10% RPMI Media의 조건에서 세포를 배양하고, M-CSF를 넣은 fresh RPMI Media 를 3일 간격으로 바꾸어 주었다. 실험 18시간 전에 시험하고자 하는 면역세포를 5 x 10⁴/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.

96 well 세포배양 플레이트에 mouse BMDM (도 12) 또는 HMDM (도 13)을 M-CSF가 포함된 배지를 이용하여 5x10^4/well seeding 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 본 실험시 염증반응을 유도하기 위해 면역세포에 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하고 RPMI Media 95μl를 넣어 total 100μl를 37℃ incubator에서 1시간 동안 처리하였다. 염증반응 유도시 정상세포(Cell only) 그룹을 제외한 모든 그룹에는 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증자극을 주었다. 1시간 후 본 출원에서 선별한 CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주 각각의 배양물(20μl)와 fresh Media(80μl)를 더하여 총 100μl를 염증 유도 물질이 처리된 plate에 추가하여 (total 200μl/well) 총 24시간 동안 37℃ incubator에서 배양하였다. 양성 대조군(Positive control)로는 덱사메타손(dexamethasone; Dex)(100nM)을 사용하였다. 음성 대조군(negative control)로는 fresh Media가 처리된 정상세포(Cell only)를 사용하였다. 24시간 배양 후 cultured supernatant를 모두 확보하고 남은 면역세포의 증식 정도를 확인하기 위해 cell counting kit-8 (5μl well) + fresh media (95μl)를 처리하여 37℃ incubator에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하고, Cell only 기준으로 세포 증식 정도를 %로 표기하였다. 확보된 세포 상등액을 이용하여 면역세포에서 분비된 cytokines (IL-6, IL-8)의 양을 ELISA를 통해 측정하였다.

도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, mouse BMDM 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only) 염증성 사이토카인(IL-6)이 분비되지 않았다. Cell w/ stimuli 경우 염증성 사이토카인(IL-6)의 분비가 크게 증가하였고, 면역세포인 mouse BMDM 세포의 증식이 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only)와 비교하여 크게 증가하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우에는 mouse BMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6의 양과 증가한 mouse BMDM 세포의 증식이 크게 낮아지는 것을 확인하였다.

본 출원에서 선별한 CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주의 배양물을 각각 처리한 경우에는 mouse BMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6의 양과 증가한 mouse BMDM 세포의 증식이 크게 낮아지는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 덱사메타손을 사용한 경우와 동등하거나 그보다 우수한 효과를 나타내는 것임을 확인하였다.

도 13은 mouse BMDM 세포 대신 HMDM 세포를 사용하여 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)의 분비량을 확인한 결과로, HMDM 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only) 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)이 거의 분비되지 않았다. Cell w/ stimuli의 경우 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)의 분비가 크게 증가하였으나, 양성대조군으로 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우에는 HMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6, IL-8의 양이 크게 감소하였다.

본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우도 HMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6, IL-8의 분비량이 크게 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 10. 로사세아 동물 모델 유효성 평가

본 동물 유효성 시험을 위하여 32마리의 5주령 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오사에서 구입하였으며, 12시간 인공 광주기를 주는 사육실에 반입하고 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다.

로사세아 동물 모델을 만들기 위하여 마우스의 등쪽 부위의 털을 제모기와 제모 크림을 이용하여 제거한다. 제모 24시간 후에 로사세아 병변을 유도하기 위해 320μM의 LL37 펩타이드(㈜펩트론)를 50μl씩 인슐린 주사기를 이용하여 피내주사 (intradermal injection) 하였다. LL37 주사는 1일 2회, 2일간 (총 4회) 실시하였으며, 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물은 두번째 LL37 주사와 동시에 150μl씩 1일 1회, 3일간 (총 3회) 복강으로 투여한다. 기존 로사세아 치료용법의 하나인 독시사이클린 (doxycycline)은 1mg/kg 1일 1회, 3일간 (총 3회) 복강으로 투여하였다.

마지막 균주 배양물 투여 24시간 후 캘리퍼를 이용하여 홍반의 크기 (넓이)를 측정하였으며 CO₂가스를 사용하여 동물을 안락사 시킨 후, 병변 부위를 사진으로 찍어 홍반의 정도를 육안 관찰하고 조직 사진과 염증 부위의 넓이를 그래프로 도 14a 및 도 14b에 나타내었다.

도 14a 및 도 14b에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우 피부에 홍반이 크게 나타나는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 피부에 홍반이 다소 감소하는 것을 확인하였다.

마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리(복강 투여)하였더니 피부에 홍반이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린을 처리한 경우와 비교하여도 월등하게 우수한 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

또한, 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물 투여에 따른 주사 동물 모델의 병리학적 검사 결과를 알아보기 위하여, LL37 펩타이드 투여 부위의 피부를 적출하여 조직 염색용으로 4% 포름알데하이드(formaldehyde) 용액에 고정하여 파라핀 포매하였다. 파라핀 포매한 조직으로 절편을 만든 후 조직학적 변화 관찰을 위해 헤마톡실린-에오신(hematoxyline-eosin; H&E)염색을 실시하여 현미경으로 관찰하고, 조직사진을 도 15에 나타내고, 조직병리학적 평가 점수를 아래 표 6에 나타내었다.

	Epithelial hyperplasia	Dermal inflammation	Total
Vehicle	0	0	0
LL37	2.75	2.5	5.25
CJRS-10653	1.6	1.8	3.4
CJRS-10652	1.8	1.4	3.2
Doxy	1.2	2.4	3.6

도 15에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우(LL37) 염증 부위의 넓이가 크게 증가하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 염증 부위의 넓이가 다소 감소한 것을 확인하였다. 마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였더니 염증 부위의 넓이가 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린을 처리한 경우와 비교하여도 월등하게 우수한 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

또한 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우(LL37) 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)과 피부염증 (Dermal inflammation)이 크게 증가하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)은 감소하였지만, 피부염증 (Dermal inflammation)은 감소시키지 못하는 것을 확인하였다.

그러나 마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였더니 증가된 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)과 피부염증 (Dermal inflammation)이 크게 감소한 것을 확인하였다.

이러한 결과로부터, 본 출원에서 선별한 균주의 배양물을 마우스에 복강 처리하였을 때, 홍반, 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia) 및 피부염증 (Dermal inflammation)이 모두 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 11. 피부 장벽 개선 및 보습효과 확인

피부 주름 및 노화의 주 원인으로는 피부 진피층의 무너진 장벽, 수분 손실 및 콜라겐 생성 감소 등이 있다. 특히, 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐의 결핍은 피부 주름의 발생 원인 중 하나이며, 노화가 진행됨에 따라 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 더하여, 수분 손실은 피부 재생을 더디게 만들어 탄력이 줄어들어 잔주름의 원인이 되고 피부 노화를 촉진시킨다. 따라서 피부 장벽(Filaggrin) 개선, 콜라겐(Procollagen type I)의 생성정도 및 보습(Aquaporin-3)개선의 중요 지표들을 확인하여 피부 주름개선 및 항노화 효과를 확인할 수 있다.

㈜티앤알바이오팹에서 제작한 피부 3D 미니티슈 (organoid)인 T&R HuSkin에 poly I:C를 이용하여 염증을 유도하였다. 그 후 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 적용하여, 피부 개선 지표(장벽 개선 및 보습)의 변화를 확인하였다.

시험방법

1) T&R HuSkin은 진피층과 표피층으로 구성된 전층 (full thickness) 피부 모델이며 ㈜티앤알바이오팹의 3DXPrinter바이오프린터를 이용하여 제작되었다.

2) 진피층의 제작을 위하여 돼지 피부유래 세포외기질 기반 하이드로젤과 인간 유래 섬유아세포 (fibroblast; Lonza, Basel, Switzerland) 를 100×10^4 cells/ml의 농도로 혼합한 바이오잉크를 프린팅하였으며 37 ℃ 인큐베이터에서 40분간 노출시켜 겔화 하였다.

3) 이후 겔화된 진피층 위에 인간 유래 각질형성세포 (keratinocyte; Lonza)를 55×10^4 cells/insert로 분주하고 1일동안 각질형성세포 배양액(Keratinocytes growth media, KGM; Lonza)에 완전히 잠긴 상태로 배양하였다.

4) 1일 이후 피부와 같은 배양조건을 부여해주기 위하여 각질형성세포가 분주된 진피층 표면만을 공기중에 노출시키는 Air-liquid interface(ALI) 조건을 구현하여 7일간 조직화하였다.

5) 7일간 ALI조건에서 배양하여 확보한 T&R HuSkin에 염증유도 물질(poly I:C, 20μg/mL) 및 시험물질(본 출원에서 선별한 균주 배양물, 0.5x 농도, 5%(v/v))을 동시에 처리하여 2일간 HuSkin 추가 배양 후 피부개선 관련 지표들의 변화를 확인하였다. (각 조건당 N=2).

6) IF 형광 사진 확보 후 Image J의 mean gray value를 통해 각 사진(area of interest: 사진 전체 면적)의 형광Intensity값을 수치화 하였다.

시험결과

1) 장벽 개선

T&R HuSkin에서 장벽개선 지표인 Filaggrin의 발현양을 IF염색을 통하여 비교분석 하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 처리한 군 모두에서 Filaggrin의 발현양이 음성대조군(Poly I:C 단독 처리) 대비 동등 이상으로 증가하였다. 그 중에서 CJRS-10651, CJRS-10653, CJRS-10654, 또는 CJRS-10655 균주 배양물 처리군은 Filaggrin의 발현양이 정상대조군(non-treated) 동등 수준까지 회복된 것을 확인할 수 있었고, CJRS-10656 균주 배양물 처리군의 경우는 Filaggrin의 발현양이 정상대조군(non-treated) 대비 더 증가한 것을 확인하였다.

2) 보습 개선

T&R HuSkin에서 보습개선 지표인 Aquaporin-3의 발현양을 IF를 통하여 비교분석 하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 처리한 군 모두에서 Aquaporin-3의 발현양이 음성대조군(Poly I:C 단독 처리) 대비 동등 이상으로 증가하였다. 그 중에서 CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주 배양물 처리군은 정상대조군(non-treated) 대비 Aquaporin-3의 발현양이 동등 수준까지 회복된 것을 확인하였다.

실시예 12. 콜라겐 지표 확인.

본 출원에서 선별한 균주 배양물을 인간섬유아세포에 처리 시 배양물의 독성 및 배양물에 의한 콜라겐 생성 및 분비 정도를 확인하였다.

실험방법

1) 인간섬유아세포 배양

본 실험에서는 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk cell)를 사용하였다. 본 실험에 들어가기 일주일 전에 인간섬유아세포를 FBS 10%(v/v) DMEM에 배양 및 유지하였다. 실험 18시간 전에 인간섬유아세포를 1x10⁴/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.

2) 균주 배양물과 인간섬유아세포 co-culture

균주 배양물 원액((실험예 2에서, 균주 배양물을 원심분리하여 균주를 제외한 배양물(cell free supernatant)) 및 실험예 2에서 제조된 3kDa 이하로 여과된 균주 배양물의 농도가 10, 20, 30, 40 %(v/v)가 되도록 FBS 10%(v/v) DMEM을 이용해 제조한 뒤, 인간섬유아세포 100 μL가 있는 plate에 100 μL씩 추가하여 최종 농도 5, 10, 15, 20 %(v/v)로 처리하고 (총 200 μL/well) 총 24시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

배양액이 인간섬유아세포의 viability에 미치는 영향 및 콜라겐 생성 정도를 확인하여 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. 음성 대조군 (negative control)으로는 FBS 10%(v/v) DMEM을 넣은 정상세포 (Cell only)를 사용하였다.

3) 인간섬유아 세포 독성 테스트

24시간 후 상층액(cultured supernatant)을 모두 확보하고 남은 인간섬유아세포의 viability 정도를 확인하기 위해 cell counting kit 8 (Enzo, 5μL/well) 및 fresh RPMI media (95μL)를 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 균주 배양물 원액 및 3kDa 이하로 여과한 배양물을 처리하였을 때, 모든 농도에서 인간섬유아세포에서의 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.

4) 인간섬유아세포 콜라겐 생성 기능 측정

상기 3)에서 확보된 상층액(supernatant)을 이용하여 인간섬유아세포에서 분비된 프로콜라겐 타입 I C-펩티드(Procollagen type I C-peptide; PIP)를 ELISA 키트를 사용하여 콜라겐 생성 기능을 확인하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 균주 배양물 원액 및 3kDa 이하로 여과한 배양물을 처리하였을 때, 모든 농도에서 PIP 분비가 대조군(cell only)과 비교하여 동등 이상 증가되었음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

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Claims

큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
상기 큐티박테리움 속 균주는,
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
제1항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
상기 큐티박테리움 속 균주는,
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
를 포함하는 것인, 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
제4항에 있어서, 상기 염증성 피부질환 유발균은 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum), 스타필로코쿠스 오레우스(S. aureus), 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스(S. epidermidis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 항균용 조성물.
큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
상기 큐티박테리움 속 균주는,
(1) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(2) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
제7항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 식품 조성물.
큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
상기 큐티박테리움 속 균주는,
(1) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(2) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제10항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
제10항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 사료 조성물.
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주.
제13항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것인, 큐티박테리움 속 균주:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
제13항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 서열번호 8의 16S rRNA 유전자를 포함하는 것인, 큐티박테리움 속 균주.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 항염증 활성, 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균 활성, 피부 재생 활성, 피부 보습 활성, 및 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 활성을 가지는 것인, 큐티박테리움 속 균주.