IT202000003233A1 - Ceppo batterico e suoi usi medici - Google Patents
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Description
TITOLO:
CEPPO BATTERICO E SUOI USI MEDICI
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un ceppo batterico selezionato appartenente al genere Cutibacterium, specie acnes e suo uso medico e composizioni farmaceutiche e nutrizionali contenenti lo stesso ceppo.
La presente invenzione trae origine nel campo microbiologico e trova applicazioni nei campi farmaceutico, cosmetico e nutrizionale.
Specificamente, l?invenzione riguarda un ceppo selezionato di Cutibacterium acnes e postbiotici del ceppo che promuovono la crescita di cellule fibroblastiche attraverso componenti microbiche strutturali e/o producendo sostanze. Il ceppo dell?invenzione e i postbiotici hanno pertanto attivit? antiinfiammatorie e antibatteriche.
STATO DELL?ARTE
L?infiammazione ? essenzialmente una risposta biologica a uno stimolo dannoso o a una lesione di un tessuto dell?organismo che pu? essere causata da cause esterne, quali il contatto con agenti irritanti o microorganismi. L?infiammazione ? considerata una risposta protettiva del corpo finalizzata ad eliminare la causa di una lesione tissutale, a ripulire i tessuti necrotici danneggiati dall?insulto originario e dal processo infiammatorio e ad avviare la riparazione tissutale. Questa risposta dell?organismo coinvolge le cellule immunitarie e i mediatori molecolari.
Attualmente, l?infiammazione ? trattata con la somministrazione sistemica o topica di farmaci antiinfiammatori non steroidei o steroidei. Malgrado la diffusione degli agenti antiinfiammatori, permangono alcuni rischi residui che l?infiammazione possa persistere dopo trattamento con farmaci antiinfiammatori. In pi?, il trattamento antiinfiammatorio non ? privo di effetti collaterali nel caso sia di applicazione topica che di somministrazione sistemica.
Negli ultimi anni, il verificarsi di effetti collaterali nel caso della somministrazione topica ? aumentato per via di un abuso o errato uso di creme steroidee finalizzate a trattare l?infiammazione della cute.
Pertanto, al momento sussiste la necessit? di disporre di nuovi prodotti forniti di attivit? anti-infiammatoria, il cui uso non sia interessato da gravi effetti collaterali anche per un tempo prolungato.
Problemi analoghi originano in campo dermatologico e ginecologico, nel caso di infezioni della cute o della mucosa.
L?abuso di prodotti antibiotici per uso topico nel trattamento di infezioni della cute ha indotto un aumento del numero di casi di resistenza a terapia antibiotica locale, inducendo il medico a prescrivere antibiotici di seconda generazione.
Pertanto, al momento sussiste la necessit? di disporre di nuovi prodotti forniti di attivit? antiinfiammatoria e/o talvolta anche antimicrobica, che costituiscono un?alternativa alle medicine disponibili in commercio.
Uno delle finalit? della presente invenzione sta nel fornire un prodotto dotato di attivit? antiinfiammatoria e talvolta antimicrobica o antifungina, il cui uso sia sostanzialmente privo di effetti collaterali. ? altres? desiderabile fornire un prodotto che sia attivo nel controllo del microbiota umano.
Un?altra finalit? dell?invenzione sta nella fornitura di un prodotto non steroideo dotato di attivit? antiinfiammatoria, che sia specificamente finalizzato all?applicazione topica sulla cute o sulle mucose, quale la mucosa vaginale.
Quest?ultimo, in generale, ? indirizzato contro batteri e/o funghi patogeni, operando, a seconda del target, come agente battericida o batteriostatico o come agente fungicida o micostatico.
D?altro canto, contrastando i patogeni, si ottiene un ripristino pi? rapido delle condizioni di omeostasi attraverso la normalizzazione del microbioma residente.
RIASSUNTO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione origina dal riscontro che un ceppo batterico selezionato del genere Cutibacterium, specie acnes promuove la proliferazione di fibroblasti e ha la capacit? di interferire con la crescita della maggior parte dei comuni batteri e funghi, specialmente quelli che interessano la cute umana.
Inoltre, gli inventori hanno trovato che ceppi batterici vivi o uccisi o loro parti, quali frammenti della loro parete, dellinvenzione producono sostanze o sottoprodotti che promuovono la crescita e migrazione di cellule fibroblastiche. Questa propriet? supporta l?uso del ceppo selezionato o di sostanze prodotte in tal modo come agenti immunomodulanti e lo rende un candidato adatto, in special modo per applicazioni nel campo dermatologico o ginecologico.
Di conseguenza, la presente invenzione fornisce in un primo aspetto un ceppo batterico del genere Cutibacterium specie acnes depositato con numero di accesso (o numero di deposito) DSM 28251 presso International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o una variante che ? essenzialmente derivata da detto ceppo. In un aspetto, l?invenzione fornisce usi medici del summenzionato ceppo batterico Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251. Secondo questo aspetto, il ceppo dell?invenzione ? per somministrazione topica o sistemica. Somministrazione sistemica significa una via di somministrazione di un medicinale, prodotto nutrizionale che include il ceppo dell?invenzione nel sistema circolatorio tale da interessare l?intero corpo. La somministrazione pu? avere luogo tramite somministrazione enterale o somministrazione parenterale, ad esempio mediante iniezione, infusione o impianto.
Secondo un altro aspetto, l?invenzione fornisce ceppi o varianti del ceppo batterico DSM 28251 come sopra identificato, che sono derivati essenzialmente mediante mutazione spontanea, mutazione indotta, coniugazione e selezione, ibridazione e selezione o altri metodi di manipolazione genetica e possono essere ad esso ricondotti. In un altro aspetto, l?invenzione riguarda postbiotici del ceppo di cui sopra e suoi usi medici o nutrizionali.
Il ceppo batterico secondo la presente invenzione pu? essere isolato e selezionato da cute sana fra la moltitudine di ceppi che compone il microbioma cutaneo.
Secondo un altro aspetto ancora, l?invenzione riguarda il ceppo batterico Cutibacterium acnes, depositato con numero di accesso DSM 28251 presso International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o una variante essenzialmente derivata da detto ceppo per uso nella prevenzione o nel trattamento di una malattia infiammatoria o infezione.
Preferibilmente, il ceppo batterico dell?invenzione trova applicazioni nel campo dermatologico e ginecologico, ad esempio nel trattamento di un?infiammazione cutanea o mucosale o infezioni da batteri, funghi o protozoi. In particolare, il ceppo di cui sopra ? efficace nella prevenzione e/o nel trattamento di infezioni fungine. Il ceppo selezionato dell?invenzione ? efficace nel trattamento di funghi, in special modo lieviti del genere Candida spp o dermatofiti, quali Malassezia spp, entrambi fra gli agenti eziologici pi? comuni delle infezioni opportunistiche del corpo umano. In pi?, il ceppo selezionato dell?invenzione ? utilizzato nel trattamento di infezioni fungine che sono resistenti ai prodotti antifungini disponibili sul mercato.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione concerne l?uso cosmetico del ceppo batterico sopra identificato per migliorare un aspetto estetico della cute, quale rossore o couperose.
Secondo un altro aspetto, l?invenzione concerne gli usi nutrizionali del ceppo sopra identificato e di un postbiotico ottenuto in tal modo.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L?invenzione sar? ora descritta in dettaglio in riferimento alle Figure allegate, in cui:
Figura 1 mostra grafici a barre che riportano i valori di setto di Esempio 1, calcolati con il software image J;
Figura 2 mostra grafici a barre con l?area del setto di Esempio 1, calcolata con il software image j;
Figura 3 mostra grafici a barre che illustrano gli effetti in vitro sulla curva di crescita di S. aureus, E. coli e C. albicans, aggiungendo nei terreni di coltura concentrazioni differenti di C. acnes DSM 28251 ucciso dal calore .
Figura 4 illustra la preparazione del surnatante e dello Staphylococcus aureus utilizzata nell?esame dell?Esempio 3.
Figure 5A e 5B mostrano grafici che illustrano il tasso di sopravvivenza di larve di Galleria mellonella dopo iniezione con surnatanti da colture di S. aureus ATCC BAA1680 (At) e S.aureus ATCC 29213 (B) pre-incubate con formulazioni esaminate per 1 h secondo l?Esempio 4. Surnatante formul. A? sta per surnatante incubato con LimpiAD A, ?Surnatante formul. D? per surnatante incubato con la formulazione LimpiAD D, ?Surnatante coniugato? surnatante incubato con le componenti attive di LimpiAD, AHc40, ?Surnatante? controllo positivo, ?Terreno? terreno di coltura da solo (senza coltura batterica), ?Soluzione salina? per trattamento in modalit? fasulla.
Figure 6A e 6B mostrano grafici che illustrano il tasso di sopravvivenza di larve di Galleria mellonella dopo iniezioni con surnatanti da colture di S. aureus ATCC BAA1680 (A) e S.aureus ATCC 29213 (B) pre-incubate con formulazioni esaminate per 4 ore secondo l?Esempio 4. ?Surnatante formul. A? sta per surnatante incubato con formulazione LimpiAD A (come definito nell?Esempio 4), ?Surnatante formul. D? per surnatante incubato con LimpiAD D, ?Surnatante Coniugato? surnatante incubato con le componenti attive di LimpiAD, AHc40, ?Surnatante? controllo positivo, ?Terreno? per terreno di coltura da solo (senza coltura batterica), ?Soluzione salina? per trattamento in modalit? fasulla.
Figura 7 mostra l?espressione di geni target "normalizzati" a controllo, espressi come incrementi o decrementi multipli cattivi, come riportato nell?Esempio 4.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
In un primo aspetto, l?invenzione concerne un ceppo appartenente al genere Cutibacterium specie acnes, depositato con numero di accesso DSM 28251 (ID 19-401) presso International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o una variante essenzialmente derivata da detto ceppo.
L?invenzione concerne anche un postbiotico, come definito in rivendicazione 2 e una parete cellulare, come definito in rivendicazione 3.
Il ceppo batterico di cui sopra ? dotato sia di attivit? anti-infiammatoria in vivo che di almeno una attivit? antimicrobica in vitro. ? altres? dotata/o di questa attivit? una parete cellulare o un postbiotico dal ceppo di cui sopra.
Le attivit? di cui sopra sono comprovate dagli esempi sperimentali portati a termine dagli inventori e riportati negli Esempi seguenti. Questi esami forniscono una base scientifica per l?uso del ceppo batterico sopra identificato come agente antiinfiammatorio, immunomodulante e antimicrobico, in special modo per applicazioni topiche.
In taluni aspetti dell?invenzione, qui fornita una composizione, in special modo una composizione farmaceutica o nutrizionale, contenente un ceppo/una parete o postbiotico, come qui definito.
Secondo un altro aspetto, l?invenzione concerne l?uso del/della ceppo/parete/postiobitco sopra identificati come medicinale o loro usi medici, in special modo come definito nelle rivendicazioni 7-9.
Le propriet? intrinseche del ceppo batterico selezionato forniscono un?azione antiinfiammatoria che d? la possibilit? a un medico di trattare un?ampia gamma di malattie, in special modo quelle localizzate sulla cute sulla mucosa del corpo umano.
Inoltre, le propriet? antibatteriche e/o batteriostatiche del ceppo selezionato lo rendono utile nel trattamento di infezioni, in special modo di infezioni della cute o mucosali.
Il ceppo selezionato si ? dimostrato efficace contro batteri comuni, in special modo batteri gram positivi, in special modo batteri cocchi, quali Staphylococcus aureus o contro Escherichia coli e funghi, ad esempio del genere Candida.
Il ceppo secondo la presente invenzione ? caratterizzato dal punto di vista genotipico ed ? identificabile in maniera chiara e definita mediante tratti specifici identificati all?interno del genoma. Questo ceppo si ? evoluto spontaneamente senza alcun intervento diretto o manipolazione genetica e ha le caratteristiche pertinenti a un?applicazione industriale.
Al fine di verificare e accertare le caratteristiche del ceppo DSM 28251 e di escludere la possibile sovrapposizione di questo ceppo con i ceppi descritti nell?arte antecedente, ? stata realizzata una caratterizzazione genotipica mediante DSMZ.
Definizioni nella presente invenzione:
- "Ceppo DSM 28251? intende includere un ceppo batterico del genere Cutibacterium, specie acnes, depositato il 18 dicembre 2013 (riferimento di identificazione ULTIMO) e convertito in un deposito sotto il trattato di Budapest il 22 dicembre 2019 con numero di accesso DSM 28251 presso International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;
- ?manipolazione genetica" intende includere qualsiasi intervento tecnico finalizzato a dirigere il processo di acquisizione di specifiche caratteristiche genetiche che sono espresse come corrispondenti tratti fenotipici, dove gli interventi tecnici comprendono (Sturley & Young, 1986): (i) incrocio di ceppi naturali, seguito da selezione; (ii) produzione di ibridi, seguita da selezione; (iii) trasformazione, ossia inserzione di DNA esogeno in cromosomi o nel genoma mitocondriale o in altri elementi genetici, quali plasmidi. (iv) Mutagenesi casuale indotta, usualmente seguita da selezione e/o produzione di ibridi (Nevoigt 2008) pu? essere aggiunta come ulteriore modalit? di manipolazione;
- ?variante essenzialmente derivata" intende includere una variante del ceppo Cutibacterium acnes, depositata presso DSMZ con numero di accesso DSM 28251, che pu? essere ad esso ricondotta, tracciando un profilo del DNA microsatellite o per via di un tratto genetico distintivo, rilevabile mediante sequenziamento genomico e analisi comparativa.
- ?terreno di crescita? (sinonimi: terreno di crescita/brodo di coltura/ brodo di crescita) si riferisce a un substrato contenente tutti i composti (fattori) richiesti da un microorganismo per la replicazione cellulare, da cui risulta un incremento del numero delle singole cellule e una crescita della popolazione. I fattori necessari ai microorganismi per la loro crescita nel terreno appartengono principalmente alle categorie: fonte di carbonio, analoga fonte di azoto (costituite entrambe da ammoniaca e amminoacidi liberi, gli ultimi anche noti come FAN), vitamine e sali (oligoelementi). Tipiche fonti di carbonio sono melassa, melassa di barbabietola, estratto di malto d?orzo ed estratto di malto di grano.
La composizione di cellule non vitali/cellule non attuabili, estratti cellulari, lisato cellulare ? strettamente collegata alle propriet? metaboliche e fisiologiche precipue del ceppo DSM 28251.
- ?Postbiotici? significa prodotti batterici non vitali o sottoprodotti metabolici da un microorganismo, quale il ceppo depositato presso DSMZ su 28251 con numero di accesso DSM 28251, che hanno attivit? biologica nell?ospite o quando sono applicati su un tessuto del corpo umano, quale la cute.
- "veicolo" si riferisce a un eccipiente, veicolo, diluente o adiuvante che pu? o pu? non essere presente nella composizione dell?invenzione.
- ?prodotto nutrizionale? significa un prodotto che migliora lo stato nutrizionale e pu? essere utilizzato per supportare o migliorare l?attivit? funzionale di uno o pi? organi o la funzionalit? del corpo umano all?interno dei limiti fisiologici.
- ?ceppo batterico selezionato? significa il ceppo dell?invenzione depositato presso DSMZ con numero di accesso DSM 28251.
- ?parete cellulare? o ?parete del ceppo batterico dell?invenzione? significa un frammento di parete cellulare di ceppo batterico Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251. La parete cellulare pu? essere ottenuta secondo il metodo descritto nella pubblicazione di B. Bizzini, B. Maro e P. Lallouette, Isolement et caract?risation d'une fraction, dite fraction P40 ? partir de Corynebacterium granulosum, Med. et Mal.infect.,1978;408-414. In alcune forme di realizzazione, il frammento della parete cellulare di Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251 ? delipidato, ossia trattato cos? da rimuovere o ridurre considerevolmente la componente lipidica della parete cellulare del batterio per mezzo di tecniche chimiche/biotecnologiche.
Ad esempio, Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251 ? delipidato prima di frantumare per produrre frammenti di parete cellulare. Tipicamente, i frammenti delipidati della parete cellulare del ceppo dell?invenzione comprendono zuccheri e catene peptidiche, tipicamente legate fra loro in glicopeptidi che formano una maglia intessuta stretta. Zuccheri tipici della parete cellulare comprendono acido N-acetilmuramico e N-acetilglucosamina.
COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE
Il ceppo batterico DSM 28251 e suoi ceppi essenzialmente derivati o un frammento o postbiotico in tal modo risultanti si dimostrano estremamente vantaggiosi per un?applicazione industriale nella preparazione di composizioni farmaceutiche, specialmente per l?applicazione per un?applicazione topica.
Di conseguenza, secondo un aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente un ceppo batterico come sopra definito o un frammento o postbiotico in tal modo risultanti e un eccipiente accettabile dal punto di vista farmaceutico o fisiologico.
Il veicolo, diluente o eccipiente adatto dal punto di vista fisiologico o farmaceutico pu? essere selezionato sulla base della via di somministrazione per la quale la composizione farmaceutica risultante ? intesa.
Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione abbracciano qualsiasi composizione realizzata, miscelando un ceppo come qui definito, suo frammento o suo postbiotico secondo la presente invenzione e un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Tali composizioni sono adatte all?uso farmaceutico in un animale o soggetto umano.
Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione comprendono una quantit? efficace dal punto di vista terapeutico di un ceppo come sopra definito o suo frammento/postbiotico e un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Una composizione farmaceutica pu? facoltativamente contenere altri ingredienti attivi. Il termine ?veicolo? si riferisce a un veicolo, eccipiente, diluenti o adiuvante con cui l?ingrediente terapeutico o attivo ? somministrato. Qualsiasi veicolo e/o eccipiente adatto alla forma di preparazione desiderata per la somministrazione ? contemplato per l?uso con i ceppi/parete/postbiotico qui divulgati.
Il veicolo pu? assumere un?ampia variet? di forme a seconda della forma della preparazione desiderata per la somministrazione, ad esempio orale o parenterale, ivi inclusa endovenosa. Nel preparare le composizioni per una forma di dosaggio orale, pu? essere impiegato qualsiasi dei mezzi farmaceutici usuali, quali, ad esempio, acqua, glicoli, oli, alcool, agenti aromatizzanti, conservanti, agenti coloranti e simili nel caso di preparazioni liquide orali quali, ad esempio, sospensioni, elisir e soluzioni; o trasportatori, quali amidi, zuccheri, cellulosa microcristallina, diluenti, agenti di granulazione, lubrificanti, leganti, agenti disintegranti e simili nel caso di preparazioni solide orali, quali, ad esempio, polveri, capsule dure e molli e compresse, laddove le preparazioni solide orali sono preferite rispetto alle preparazioni liquide.
In talune forme di realizzazione, ceppo/parete/postbiotico della presente invenzione possono essere combinati quale ingrediente attivo in intima miscelazione con un veicolo e/o eccipiente farmaceutico adatto secondo tecniche farmaceutiche convenzionali di mescolanza.
Le composizioni includono composizioni adatte alla somministrazione parenterale, ivi inclusa sottocutanea, intramuscolare ed endovenosa, polmonare, nasale, rettale, topica od orale. Una via adatta di somministrazione in ogni dato caso dipender? in parte dalla natura e dalla gravit? delle condizioni che vengono trattate e dalla natura dell?ingrediente attivo. Una via esemplificativa di somministrazione ? la via orale. Le composizioni possono essere convenientemente presentate in una forma unitaria di dosaggio e preparate mediante qualsiasi dei metodi ben noti nell?arte della farmacia. Le composizioni preferite includono composizioni adatte alla somministrazione orale, parenterale, topica, sottocutanea o polmonare nella forma di inalazione nasale o buccale. Le composizioni possono essere preparate mediante qualsiasi dei metodi ben noti nell?arte della farmacia.
Le composizioni farmaceutiche possono essere in forma di compresse, pillole, capsule, soluzioni, sospensioni, emulsione, polvere, supposte e come formulazioni a rilascio prolungato.
Se desiderato, le compresse possono essere rivestite mediante tecniche standard acquose o non acquose. In talune forme di realizzazione, tali composizioni e preparazioni possono contenere almeno lo 0,1% di ceppo. La percentuale di ceppo attivo/parete/postbiotico in queste composizioni pu?, naturalmente, essere variata e pu? convenientemente essere da circa 0,1 percento a circa 60 percento da 0,5 a 20% del peso dell?unit?. La quantit? di ceppo attivo/parete/postbiotico in tali composizioni utili dal punto di vista terapeutico ? tale che sar? ottenuto un dosaggio attivo dal punto di vista terapeutico. Ceppo/parete/postbiotico pu? anche essere somministrato per via intranasale come, ad esempio, gocce liquide o spray. Compresse, pillole, capsule e simili possono anche contenere un legante, quale adragante, acacia, amido di mais o gelatina; eccipienti, quali fosfato dicalcico; un agente disintegrante, quale amido di mais, amido di patate, acido alginico; un lubrificante, quale magnesio stearato; e un agente dolcificante, quale saccarosio, lattosio o saccarina. Quando una forma unitaria di dosaggio ? una capsula, essa pu? contenere, in aggiunta a materiali del tipo sopra riportato, un veicolo liquido, quale una materia grassa oleosa. Vari altri materiali possono essere presenti come rivestimenti o per modificare la forma fisica dell'unit? di dosaggio. Ad esempio, le compresse possono essere rivestite con gomma lacca, zucchero o entrambi. Uno sciroppo o elisir pu? contenere, in aggiunta all?ingrediente attivo, saccarosio come agente dolcificante, metile e propilparabeni come conservanti, un colorante e un agente aromatizzante come aroma di ciliegia o arancia. Per evitare la rottura durante la transizione attraverso la porzione superiore del tratto gastrointestinale, la composizione pu? essere una formulazione a rivestimento enterico.
Nel contesto dell?invenzione, gli usi topici sono preferiti. Di conseguenza, in talune forme di realizzazione, la composizione ? per somministrazione topica. In questa domanda, la composizione contenente ceppo/parete/postbiotico come qui definito pu? essere applicata sulla cute di esseri umani.
Composizioni per somministrazione topica includono, senza limitazione, unguenti, creme, lozioni, soluzioni, paste, gel, stick, liposomi, nanoparticelle, cerotti, bendaggi e fasciature di ferite. In talune forme di realizzazione, la formulazione topica comprende un potenziatore di penetrazione.
Composizioni per somministrazione polmonare includono, senza limitazione, composizioni di polvere secca consistenti della polvere di un ceppo/frammento/postbiotico e la polvere di un veicolo adatto e/o lubrificante. Le composizioni per somministrazione polmonare possono essere inalate da qualsiasi dispositivo inalatore di polveri secche adatto, noto a un esperto del ramo. Tipicamente, la composizione per uso topico pu? contenere una quantit? del ceppo batterico sopra identificato da 0,00001% a 10%, da 0,0001 a 3%, da 0,1 a 2% in peso rispetto al peso totale della composizione.
La composizione per somministrazione topica pu? essere in forma solida, semisolida o fluida. Formulazioni adatte in forma solida includono creme, gel, unguenti, paste, creme, cerotti.
La composizione per applicazione topica in forma fluida pu? essere in forma di lozioni, gel, sospensioni, emulsioni.
Nel caso di una forma di formulazioni fluida o semifluida, il ceppo batterico pu? essere diluito in un veicolo in forma liquida accettabile dal punto di vista fisiologico, quale acqua, alcol, soluzione idroalcolica o glicemica o miscelato con altri liquidi adatti per l?applicazione locale.
A titolo di esempio, le composizioni dell?invenzione in forma liquida possono re preparate, dissolvendo o disperdendo il ceppo batterico o un suo prodotto in acqua e/o alcool. La composizione liquida pu? essere tamponata aggiungere un intervallo di pH convenientemente selezionato da 5 a 7 perch? ompatibile con il pH della cute e poi filtrata e confezionata in contenitori adatti, bottiglie o fiale.
na forma di realizzazione, la formulazione per la somministrazione locale ? in a di crema o emulsione contenente il ceppo batterico trasportato in un piente adatto.
ondo altre forme di realizzazione, la composizione dell?invenzione ? in una a per somministrazione sistemica, in particolare per somministrazione orale. uesti casi, la composizione contiene il ceppo batterico come definito in edenza e uno o pi? veicoli o eccipienti adatti alla somministrazione sistemica. omministrazione delle composizioni ? effettuata in conformit? a un protocollo e dosaggio sufficiente a ridurre la malattia target nel soggetto.
cune forme di realizzazione, nelle composizioni farmaceutiche della presente nzione, il principio attivo o i principi attivi sono generalmente formulati in unit? osaggio L?unit? di dosaggio pu? contenere da 0,00001 a 1000 mg di un o/parete/postbiotico per unit? di dosaggio per somministrazione giornaliera. cune forme di realizzazione, le quantit? efficaci per la formulazione topica nderanno dalla gravit? della malattia, dal disordine o dalla condizione, da una edente terapia, dallo stato di salute dell?individuo e dalla risposta al farmaco. cune forme di realizzazione, la dose ? nell?intervallo da 0,0000% in peso a 60% in peso della formulazione.
ndo utilizzato in combinazione con uno o pi? degli altri ingredienti attivi, o/parete/postbiotico della presente invenzione e l?altro ingrediente attivo ono essere utilizzati in dosi inferiori rispetto a quando ciascuno ? utilizzato olarmente.
etto a formulazioni rispetto a qualsiasi variet? di vie di somministrazione, i di e le formulazioni per la somministrazione di farmaci sono divulgati in Remington?s Pharmaceutical Sciences, 17<th >Edition, Gennaro et al. Eds., Mack Publishing Co., 1985, and Remington?s Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR ed.
20<th >Edition, 2000, Williams & Wilkins PA, USA, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21<st >Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds. , 2005; and in Ansel?s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8<th >Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds., 2005, che sono qui incorporati come riferimento.
In talune forme di realizzazione, la composizione dell?invenzione per somministrazione orale ? un prodotto nutrizionale o dietetico o nutraceutico.
Esempi di forme di realizzazione e procedure preferite della presente invenzione sono descritti sotto per illustrare l?invenzione.
ESEMPIO 1
Migrazione potenziale in vitro di cellule fibroblastiche umane stimolate con surnatante derivato da una coltura di ceppo batterico No. di accesso DSM 28251.
Finalit? dello studio
Uno dei meccanismi d?azione del surnatante di una coltura di ceppo batterico No. di accesso DSM 28251 ? attribuito a un effetto postbiotico. Il termine post-biotico si riferisce a sottoprodotti metabolici di microorganismi, in special modo batteri e/o probiotici. Tipicamente, i postbiotici sono prodotti dall?attivit? metabolica o da processi fermentativi di batteri, quali probiotici (microorganismi vivi che esercitano effetti benefici per l?ospite, quando somministrati in quantit? adatte).
I postbiotici giocano ruoli estremamente importanti nella regolazione della salute e nel mantenimento di un microbiota sano.
Una delle finalit? di questo studio ? valutare l?effetto postbiotico sulla migrazione di cellule fibroblastiche della cute umana immortalizzate, stabilire se con il surnatante derivato da una coltura di ceppo batterico No. di accesso DSM 28251 sia promossa la migrazione di questa linea cellulare.
Campioni esaminati
Surnatante derivato da una coltura di ceppo di batteri con No. di accesso DSM 28251.
Materiali e metodi
Batteri
Il ceppo di batteri con No. di accesso DSM 28251 dell?invenzione ? stato fatto crescere in terreno di brodo di infusione di cervello e cuore (BHI) per una notte a 37?C e poi, per valutare l?effetto postbiotico, il surnatante derivante dalla crescita batterica ? stato centrifugato e successivamente filtrato (0,45 ?m) per rimuovere le cellule batteriche. Prima dell?uso, un?aliquota ? stata piastrata su agar BHI e incubata per 24 ore a 37?C per verificare l?assenza di crescita microbica.
Linea cellulare
Cellule fibroblastiche della cute umana non tumorigeniche sono state mantenute in beute per coltura da 25 cm2 in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 1% di L-glutammina 200 mM, penicillina (100U/ml), streptomicina (100 ?g/ml) e 10% di FBS. Le cellule, dopo lavaggio con DPBS, sono state staccate a temperatura ambiente con soluzione di tripsina-EDTA 0,25% 1 X e le cellule saranno osservate sotto microscopio rovesciato sino a che lo strato cellulare sar? stato disperso (usualmente entro 5 minuti). Le cellule sono state piastrate in un ?-dish (diametro 35 mm) contenente l?inserto di coltura (cod. 81176 Ibidi, Giemme, Italia). L?inserto di coltura consiste di due pozzetti; quando entrambi i pozzetti sono riempiti con cellule aderenti, un interspazio privo di cellule (canale) di approssimativamente 500 ?m si crea dopo aver rimosso l?inserto di coltura. La sospensione cellulare ? stata preparata alla densit? di 3-7 x 105 cellule/ml, applicata in due pozzetti di inserto di coltura (70 ?l/pozzetto) e sar? mantenuta a 37?C in CO2 5% in DMEM integrato con 1% di L-glutammina 200 mM, penicillina (100 U/ml), streptomicina (100 ?g/ml) e FBS 10% . Dopo 24 ore di attacco cellulare appropriato, l?inserto di coltura sar? rimosso, utilizzando pinzette sterili e il ?-dish ? stato riempito con terreno (2 ml).
Esperimento cellulare per l?analisi di migrazione
Le cellule sono state trattate con surnatante, precedentemente filtrato, derivato da una coltura di Aileens bacteria diluita 1:10 e 1:100 con DPBS (soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco). Inoltre, fibroblasti trattati con BHI diluito 1:10 e 1:100 con DPBS sono stati utilizzati quale controllo.
Le cellule saranno mantenute per ulteriori 24 ore. L?entit? di migrazione cellulare sar? fotografata mediante microscopio digitale Eyepiece e misurata, utilizzando un software per l?analisi delle immagini, Image J (V 1.45s, fornito da National Institute of Health, USA). Ciascuna immagine sar? successivamente trasformata in negativo, utilizzando una funzione del software e poi misurata. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e i risultati espressi quale media ? SE. Il test t di Student sar? utilizzato per la significanza statistica. Valori p > 0,05 saranno considerati statisticamente significativi.
Risultati
I risultati ottenuti mostrano che il surnatante da ceppo batterico No. di accesso DSM 28251, diluito 1:10 e 1:100 con DPBS promuove la migrazione cellulare (Figure 1 e 2). Inoltre, BHI diluito 1:10 e 1:100 con DPBS non interferisce con la migrazione di fibroblasti.
ESEMPIO 2
Attivit? di un frammento di parete batterica del ceppo depositato con No. di accesso DSM 28251 con DSMZ sulla crescita di microorganismi patogeni per l?uomo.
Materiale e metodi
Il ceppo batterico ? stato fatto crescere in terreno di infusione di cervello e cuore (BHI) per una notte a 37?C e poi ucciso al calore a 60?C per 1 ora.
La coltura ? stata diluita a 10<7>, 10<6 >e 10<5 >CFU/ml di entrambi i terreni Muller Hinton (MH) o Sabouraud. Inoculi di 10<5 >cellule/ml di S. aureus ATCC 29213 ed E. coli ATCC 11775 sono stati fatti crescere in triplicati nel volume finale di 150 ul di ciascuna diluizione di Muller Hinton della coltura uccisa al calore in una piastra da 96 pozzetti. Analogamente, inoculi di 10<5 >cellule/ml di C. albicans sono stati posti in coltura in triplicati in diluizioni 10<7>, 10<6 >e 10<5 >di Sabouraud della coltura batterica uccisa. Quali controlli, sono stati prodotti triplicati di tutte le diluizioni in entrambi i terreni nonch? controlli per la crescita dei ceppi sono stati prodotti con 10<5 >cellule/ml di inoculi di ceppi di S. aureus ed E.coli e C. albicans nel volume finale di 150 ul di terreno di Muller Hinton e Sabouraud, rispettivamente. La densit? ottica (O.D.) a lunghezza d?onda di 600 nm ? stata misurata per ciascun pozzetto prima (T0) e dopo 3, 6, 20 e 24 ore (T3, T6, T20, T24) di incubazione a 37?C. La crescita come tendenza dei valori di O.D. osservata per ciascun ceppo nel terreno al quale era stato aggiunto ceppo ucciso al calore ? stata confrontata con una in solo terreno di Muller Hinton o Sabouroaud.
La capacit? del ceppo batterico No. di accesso DSM 28251 di interferire o inibire la crescita di batteri e funghi comunemente riscontrati nella cute umana (si vedano i ceppi batterici esaminati) ? stata esaminata con un metodo spettrofotometrico descritto da Hall et. al.
L?inibizione di crescita microbica ? stata valutata in piastre di polistirene da 96 pozzetti. Le diluizioni seriali della miscela tindalizzata (da 10<7 >a 10<5 >CFU/ml) sono state inoculate con i microorganismi esaminati, insieme a microorganismi da soli (controllo) e terreno (bianco). tutti i ceppi microbici sono stati esaminati secondo CLSI (Clinical Standard Laboratory Institute), linee guida [3,4].
A intervalli definiti (3 , 6 , 20 e 24 ore) ? stata effettuata una lettura spettrofotometrica a 600 nm. I risultati sono stati forniti come curve di crescita (microorganismo da solo) e curve di inibizione (microorganismo e concentrazioni tindalizzate). Ciascun esperimento ? stato condotto in ottuplo e ripetuto tre volte, i risultati sono stati espressi come media ? SD.
Ceppi batterici esaminati:
-Staphylococcus aureus
-Candida albicans
-Escherichia coli
I risultati sono riportati in Figura 3 allegata.
Come evidenziato in Figura 3, l?aggiunta del ceppo batterico No. di accesso DSM 28251 dell?invenzione a colture di S aureus rallenta in maniera dose dipendente la fase logaritmica di crescita.
Risultati analoghi sono stati riscontrati con C. albicans
Questi dati sperimentali supportano l?effetto postbiotico del ceppo batterico No. di accesso DSM 28251 secondo l?invenzione.
Esempio 3
Esami con formulazioni contenenti il ceppo DSM 28251 dell?invenzione sulla crescita di C. albicans
Materiale e metodi
Formulazioni esaminate
A) formula di base (priva di ceppo DSM 28251 )
B) formula con ceppo DSM 28251 1%
C) formula con ceppo DSM 28251 2,5%
D) formula con ceppo DSM 28251 2,5% (2 x C40)
La formula di base della formulazione contiene acqua, trigliceride caprilico/caprico, glicerina, burro di Butyrospermum parkii.
Procedura
Ciascuna formulazione ? stata inclusa in terreno di agar (20%) in piastre dotate di 4 settori. I 4 settori sono stati utilizzati per piastrare in maniera differente le diluizioni fungine (10-5 10-8 CFU/ml), le stesse diluizioni sono state piastrate su terreni senza formulazioni come controllo. Dopo inoculazione, le piastre con la formulazione sono state incubate a 37? per 48 ore. La crescita fungina nei terreni con formulazioni ? stata controllata rispetto al controllo. Inoltre, ? stato registrato il pH del solo terreno e di terreno/formule al fine di verificare una possibile interferenza con lo stato di virulenza rispetto a quella di una transizione non virulenta di C. albicans.
Risultati
Sul controllo, ? stata osservata un?evidente formazione di numerose colonie con la tipica morfologia bianca e nuvolosa (2 x 109 CFU / ml).
Dai riscontri al microscopio, osserviamo le caratteristiche morfologie cellulari del microorganismo patogeno con la produzione di ife fungine.
Per tutte Le formulazioni esaminate, osserviamo la formazione di una patina opaca con la formazione mancata di ife, due caratteri che si associano alla transizione del patogeno dallo stato di virulenza a quello di non virulenza.
Inoltre, il pH del solo terreno di coltura (S) ? simile al pH di terreno e formule; pertanto, la variazione di pH non sembra essere coinvolta nello spostamento fenotipico.
Conclusioni
In C. albicans, ? stata osservata una variazione di morfologia delle colonie: in assenza delle formulazioni, sono state osservate le tipiche colonie con un aspetto lattiginoso, mentre in presenza delle formulazioni, ? stata ottenuta una patina omogenea e traslucida. Questa variazione ? stata confermata anche a livello microscopico, senza le formulazioni il microorganismo ? stato osservato sia come lievito che come stampo (presenza di ife), mentre in presenza delle formule soltanto come lievito.
Questa osservazione ? un?evidenza dell?attivit? inibitoria sulla crescita di Candida albicans delle formulazioni contenenti il ceppo selezionato dell?invenzione.
Esempio 4
Azione inibitoria di una formulazione contenente il ceppo DSM 28251 (LimpiAD) contro tossine/cataboliti prodotti da S. aureus: Esame in vivo di Galleria mellonella e saggio di espressione genica
Introduzione
? stata esaminata l?azione potenziale della formula e del principio attivo come agenti in grado di ridurre gli effetti delle tossine di S. aureus su uno specifico target biologico.
S. aureus ? uno dei microorganismi pi? noti nell?eziologia e nello sviluppo della dermatite atopica. Uno dei suoi meccanismi principali di patogenesi ? la produzione di un?ampia gamma di tossine.
La formula LimpiAD esaminata contiene acqua, trigliceride caprilico/caprico, glicerina, burro di Butyrospermum parkii.
A questo fine, ? stato effettuato un saggio in vivo, utilizzando larve di Galleria mellonella.
La tarma della cera pi? grande Galleria mellonella (G. mellonella) ? un organismo modello gi? convalidato per esperimenti di infezione batterica e per esami di tossicit? farmacologica. Essa rappresenta uno strumento essenziale per lo screening preliminare di nuovi composti e una rapida e affidabile valutazione della potenziale attivit? inibitoria e cos? dovrebbe ridurre il numero di esperimenti necessari che utilizzano modelli di mammifero [6].
Le larve di G. mellonella offrono molteplici opzioni per un facile rilascio del patogeno, quale applicazione topica, rilascio orale e iniezione. Il microorganismo pu? essere iniettato direttamente nell?emocele larvale e, pertanto, le larve ricevono una quantit? nota di patogeni.
Un altro vantaggio del modello di G. mellonella ? la possibilit? di valutare l?espressione di geni correlati a immunit? e stress. In tal modo, per investigare l?azione del dispositivo su larve di G. mellonella inoculate con il surnatante di S aureus, abbiamo condotto un saggio qPCR per valutare l?effetto di LimpiAD sui geni dell?immunit? e dello stress di G. mellonella. Abbiamo selezionato geni che giocano un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie dell?insetto all?infezione: fagocitosi, regolazione delle citochine, adesione cellulare e inibitori delle metalloproteinasi.
Materiale e metodi
Ceppi microbici esaminati e condizioni di coltura
Staphylococcus aureus ATCC BAA1680 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 sono stati fatti crescere in brodo di infusione di cervello e cuore, incubando in condizioni termiche a 37?C per l?intera notte.
Preparazione dei surnatanti: le colture dell?intera notte di entrambi i ceppi di Staphylococcus sono state centrifugate a 5000 rpm per 5 minuti. Le cellule batteriche residue sono state rimosse mediante sterilizzazione con filtro (0,22 ?m) e diluite in soluzione salina in un rapporto (1:2). I surnatanti diluiti sono stati miscelati (1:5 p/v) con tre differenti formulazioni (Tabella 1):
- LimpiAD A (formula base senza componente attiva);
- LimpiAD D (con componente attiva 2,5%);
- componente attiva da sola (HAc40)
Dopo incubazione delle formulazioni per 1 h e 4 h, i surnatanti sono stati recuperati mediante centrifugazione e utilizzati per inoculare le larve di Galleria mellonella. Larve trattate, sottoposte a iniezione dei surnatanti (senza formulazione) e solo terreno di coltura (brodo di infusione di cuore e cervello) in un rapporto 1:2 sono state utilizzate come controlli (Figura 25).
Per valutare un?infezione delle larve di G. mellonella con larve sopravvissute: le larve sono state selezionate sulla base di peso e dimensioni e suddivise nei gruppi sperimentali elencati in Tabella 1. Le larve sono state sottoposte a inoculo mediante iniezione, utilizzando un erogatore a ripetizione, adattato con una siringa per insulina (BD, Wellington) e un ago da 1 ml ultrafine attraverso l?ultima pseudozampa delle larve. Dopo l?inoculazione, le larve per ciascuna condizione sono state incubate in un piatto di Petri a 35?C ed ? stata osservata la sopravvivenza nelle successive 96 ore.
Tabella N. 1 Sostanze esaminate e numero di larve di G. mellonella iniettate per ciascun gruppo.
Saggio di espressione genica: qPCR
Tre larve sopravvissute per ciascun gruppo (controllo, soluzione salina; infettate, surnatante ATCC BAA1680; trattate con surnatante S aureus ATCC BAA1680 ) sono state recuperate 96 h dopo il trattamento. RNA ? stato estratto in reagente TRI (Sigma Aldrich) secondo il protocollo del produttore estratti di RNA sono stati quantificati dal punto di vista spettrofotometrico, poi sottoposti a trascrizione inversa in cDNA, utilizzando una miscela di sintesi di cDNA ReadyScript? (Sigma Aldrich)
Nome, funzioni e sequenze dei primer utilizzati nell?espressione genica sono elencati in Tabella 2. I fattori moltiplicativi dell?espressione genica relativamente a un gene di riferimento EF1 sono stati determinati nei campioni normalizzati mediante Rotor-Gene Q - QIAGEN, con PowerSYBR?(AppliedBiosystems). Le condizioni di ciclo erano 5 min a 95?C poi 42 cicli di: 95?C per 5 sec, annealing per 10 sec, 72?C per 20 sec. Una discesa iniziale di 1?C per ciclo a partire da 65?C per i primi 5 cicli risultava in un?amplificazione ottimale per tutti i loci. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in triplicati per tre differenti misurazioni [7].
Tabella 2. Primer utilizzati per analizzare l?espressione genica in larve di Galleria mellonella
La preparazione del surnatante e S. aureus utilizzati nell?esame sono illustrati in Figura 5
Sopravvivenza delle larve
A confronto con i gruppi di controllo, i surnatanti che erano stati preincubati per un?ora con le formule in esame erano di gran lunga meno letali.
Cos?, l?aumento della sopravvivenza delle larve a di S. aureus ATCC BAA1680 ? stata attribuita all?azione delle componenti attive.
Analogamente, dopo 4 h di incubazione, l?attivit? della formula di base A ? stata confermata a un livello inferiore, mentre la formula D confermava la pi? alta sopravvivenza delle larve.
Relativamente al ceppo di S. aureus ATCC 29213, anche qui l?attivit? inferiore era confermata per la formula di base A rispetto alle altre formule esaminate. In questo caso, le componenti attive producevano il maggior incremento di sopravvivenza delle larve rispetto alla formula D in entrambi i pretrattamenti di 1 h e 4 h .
Nell?insieme, questi risultati suggerivano che le componenti attive potessero interferire con patogeni associati a tossine/cataboliti prodotti da S. aureus ATCC BAA1680. Inoltre, l?azione poteva essere apprezzata gi? dopo 1 h di incubazione per entrambi i ceppi e per il ceppo di S. aureus ATCC 29213 l?intensit? di interferenza risultava maggiore quanto pi? prolungata era l?interazione putativa con tossine/cataboliti nei surnatanti (Fig. 27-28).
Al contrario, il gene wheeler 18 era ipoespresso (99,98%) nel gruppo infettato a confronto con il gruppo trattato. Una preincubazione con LimpiAD aumentava, pertanto, significativamente l?espressione di questo gene coinvolto nell?adesione e nella migrazione cellulare.
Saggio di espressione genica
L?espressione dei due geni correlati allo stress metabolico IMPI e GLUT non era alterata significativamente a confronto con il controllo in entrambi i gruppi, come evidenziato in Fig. 7. Pertanto, LimpiAD non altera l?espressione di questi geni. L?espressione dei due geni correlati all?immunit? innata era differentemente espressa nel gruppo infettato rispetto al gruppo trattato. Le citochine di regolazione del gene CITOK (cascata NF-kappa B) non erano sovraespresse (93,8%) nel gruppo infettato a confronto con il gruppo trattato. LimpiAD, pertanto, riduceva l?espressione di citochine pro-infiammatorie
Tabella 3. Espressione genica di G. mellonalla in seguito a trattamento con LimpiAD/infettato
Conclusione
Le infezioni con ceppi patogeni di Staphylococcus aureus sono considerate un fattore dannoso nella dermatite a topica, poich? questi microorganismi producenti cataboliti stimolano l?interessamento di citochine infiammatorie, contribuendo al danno della barriera epidermica e alla manifestazione dei sintomi caratteristici della malattia.
I risultati ottenuti suggeriscono che le componenti di LimpiAD riducono l?effetto dei cataboliti prodotti da S. aureus sulla sopravvivenza di larve di G. mellonella iniettate.
Inoltre, il trattamento con LimpiAD riduceva l?espressione di citochine proinfiammatorie e aumentava l?espressione del gene 18-wheeler coinvolto nella adesione e migrazione cellulare. I dati ottenuti dall?espressione di geni di stress metabolico e immunit? forniscono un?ulteriore evidenza sul meccanismo di azione del dispositivo LimpiAD.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Ceppo batterico, che ? depositato con No. di accesso al deposito DSM 28251 presso International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o variante essenzialmente derivata da detto ceppo.
- 2. Postbiotico che ? un sottoprodotto della fermentazione del ceppo batterico di rivendicazione 1.
- 3. Frammento o parete cellulare del ceppo batterico di rivendicazione 1.
- 4. Ceppo batterico di rivendicazione 1 o postbiotico di rivendicazione 2 o frammento o parete cellulare di rivendicazione 3 per uso quale medicamento.
- 5. Composizione comprendente una quantit? efficace di ceppo batterico depositato con No. di accesso al deposito DSMZ 28251 o variante essenzialmente derivata da detto ceppo o un postbiotico di detto ceppo batterico o un suo frammento o sua parete e un veicolo accettabile dal punto di vista fisiologico.
- 6. Composizione come rivendicato in rivendicazione 5 per l?uso come medicamento.
- 7. Composizione secondo rivendicazione 5 per l?uso nel trattamento di una malattia infiammatoria o allergica o di un?infezione.
- 8. Composizione per l?uso secondo rivendicazione 7 nella prevenzione o nel trattamento di una malattia cutanea o nella prevenzione o nel trattamento di un?infezione batterica o fungina.
- 9. Composizione per l?uso come rivendicato in rivendicazione 7, in cui la malattia cutanea ? eczema, dermatite atopica, acne, dermatite seborroica, rosacea, psoriasi, eritema, rash cutaneo o cute sensibile.
- 10. Composizione secondo rivendicazione 5 in forma di compressa, capsula, polvere o crema.
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