IT202100013292A1 - Parete cellulare batterica legata a mucopolisaccaride suoi utilizzi e processo per la sua produzione - Google Patents

Description

TITOLO:

PARETE CELLULARE BATTERICA LEGATA A MUCOPOLISACCARIDE SUOI UTILIZZI E PROCESSO PER LA SUA PRODUZIONE

DESCRIZIONE

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda una parete cellulare batterica legata a mucopolisaccaride, suoi utilizzi e un processo per la sua produzione.

La presente invenzione ha origine nel campo dei prodotti farmaceutici, cosmetici e nutrizionali.

Specificamente, la presente invenzione riguarda l'associazione di una parete cellulare batterica di un ceppo selezionato di Cutibacterium acnes con un mucopolisaccaride fornita di attivit? immunomodulatrice aspecifica e suoi utilizzi nel campo farmaceutico.

Preferibilmente, la parete cellulare batterica associata a mucopolisaccaride divulgata nella presente ? per applicazione topica ed ? adatta a trattare disturbi dermatologici, infezioni o affezioni della pelle.

STATO DELLA TECNICA

L'immunologia essenzialmente riguarda lo studio della difesa del corpo contro le infezioni. Il sistema immunitario ? tipicamente diviso in due categorie: risposta immunitaria innata e risposta immunitaria adattativa. Qualsiasi perturbazione/difetto del sistema immunitario pu? risultare in malattie immunologiche della pelle.

Risposte immunitarie eccessive e indesiderate possono causare ipersensibilit? o malattie autoimmuni, mentre l'ipoimmunit? pu? portare a malattie infettive e a tumori della pelle

Le risposte immunitarie indesiderate sono strettamente correlate all'infiammazione, una risposta biologica a uno stimolo dannoso o a una lesione di un tessuto dell'organismo.

L'infiammazione ? considerata una risposta protettiva del corpo volta ad eliminare la causa della lesione ai tessuti, a disfarsi dei tessuti necrotici danneggiati dall'insulto originale e dal processo infiammatorio, e ad avviare la riparazione dei tessuti.

Questa risposta dell'organismo coinvolge sia le cellule immunitarie che i mediatori molecolari.

Attualmente la maggior parte delle malattie infiammatorie della pelle pi? comuni ? trattata con la somministrazione sistemica o topica di farmaci antinfiammatori steroidei.

Tuttavia, nonostante l'ampio utilizzo e l'efficacia dei farmaci antinfiammatori steroidei nel trattamento delle malattie dermatologiche, rimangono alcuni rischi legati al fatto che la malattia trattata diventa resistente, e i sintomi possono persistere o ripresentarsi dopo la fine del trattamento.

Inoltre, l'abuso o l'uso improprio di formulazioni steroidee per somministrazione topica volte a trattare un'infiammazione della pelle pu? portare ad effetti collaterali locali o generali. Ad esempio, il trattamento topico della pelle che circonda gli occhi con corticosteroidi pu? portare a gravi effetti collaterali agli occhi come ipertensione oculare e/o glaucoma.

Inoltre, in alcuni casi il trattamento di malattie immunologiche della pelle con corticosteroidi non ? completamente soddisfacente.

Pertanto, attualmente c'? la necessit? di avere nuovi prodotti con attivit? antinfiammatoria e/o eventualmente anche antimicrobica, che siano alternativi ai medicinali disponibili in commercio.

In molti casi, quando le malattie immunologiche della pelle sono accompagnate da un'infezione batterica, il trattamento terapeutico include una combinazione di un farmaco steroideo con un farmaco antibatterico.

Tuttavia studi recenti hanno mostrato che il trattamento antibiotico della pelle uccide la maggior parte del microbiota fisiologico della pelle, interferendo con il complesso ecosistema della pelle in cui esistono relazioni interattive e interdipendenti tra i costituenti microbici e tra i microbi e l'ospite.

Inoltre, l'abuso di prodotti antibiotici per applicazione topica nel trattamento delle infezioni della pelle aumenta la possibilit? di resistenza alla terapia antibiotica locale, costringendo il medico a prescrivere antibiotici di seconda generazione.

Di conseguenza, attualmente esiste ancora la necessit? di avere nuovi agenti immunomodulanti aspecifici per trattare malattie immunologiche della pelle.

C'? anche la necessit? di avere nuovi prodotti, specialmente per applicazione topica, con attivit? antinfiammatoria il cui utilizzo anche per un tempo prolungato non sia gravato da effetti collaterali gravi.

C'? anche una necessit? di avere nuovi prodotti per trattare malattie immunologiche della pelle, specialmente quelle che hanno una componente infiammatoria, la cui applicazione topica non compromette la risposta immunitaria.

Uno degli scopi della presente invenzione risiede nel fornire un prodotto con attivit? immunomodulatrice il cui utilizzo topico non comprometta sostanzialmente il microbiota della pelle.

? anche desiderabile fornire un prodotto avente attivit? antinfiammatoria locale che sia attivo anche nel ridurre la carica batterica di microrganismi patogeni. D'altra parte, contrastando gli agenti patogeni, si ottiene un ripristino pi? rapido delle condizioni di omeostasi attraverso la normalizzazione della flora/del microbiota residente della pelle.

Un altro scopo dell'invenzione risiede nel fornire un prodotto non steroideo con attivit? antinfiammatoria, che sia specificamente destinato all'applicazione topica sulla pelle o sulle mucose come quella vaginale.

SOMMARIO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione ha origine dalla constatazione che una parete cellulare batterica, o un suo frammento, di un selezionato ceppo batterico appartenente al genere Cutibacterium, specie acnes, quando associata a mucopolisaccaridi specifici, esercita un'attivit? immunomodulatrice e promuove la crescita e la migrazione di fibroblasti.

Inoltre, gli inventori hanno osservato che l'associazione del ceppo selezionato di Cutibacterium acnes con mucopolisaccaridi come descritto nella presente fornisce un effetto inibitorio su microrganismi patogeni della pelle e regola il meccanismo biologico della risposta immunitaria locale bloccando o rallentando la cascata infiammatoria.

Queste propriet? rendono l'associazione del ceppo selezionato di Cutibacterium acnes con mucopolisaccaridi, come descritto nella presente, un candidato adatto per applicazioni mediche, preferibilmente nel campo dermatologico e/o ginecologico, ad esempio nel trattamento di malattie della pelle legate al sistema immunitario e in infezioni della pelle, specialmente in presenza di infiammazione.

In un primo aspetto, la presente invenzione fornisce una parete cellulare batterica, o una sua frazione o un suo lisato, associata o combinata a mucopolisaccaride in cui la parete cellulare o la frazione ? del ceppo Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso (o numero di deposito) DSM 28251 presso l'International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

In un aspetto l'invenzione fornisce usi medici della suddetta parete cellulare batterica di ceppo Cutibacterium acnes depositato con il numero di accesso DSM 28251. Secondo questo aspetto, il ceppo dell'invenzione ? per somministrazione topica o sistemica, specialmente per utilizzo topico.

Per somministrazione sistemica si intende una via di somministrazione di un medicinale, di una sostanza nutritiva che include il ceppo dell'invenzione nel sistema circolatorio in modo che tutto il corpo sia interessato. La somministrazione pu? avvenire per via enterale, somministrazione orale o somministrazione parenterale, ad esempio mediante iniezione, infusione o impianto.

Una somministrazione o applicazione topica ? la via preferita di somministrazione della parete cellulare batterica o della sua frazione di Cutibacterium acnes DSM 28251 associata al mucopolisaccaride.

La parete cellulare batterica di Cutibacterium acnes DSM 28251 associata a mucopolisaccaride e le composizioni contenenti la stessa possono essere applicate sulla pelle in qualsiasi forma adatta per applicazione topica.

Il ceppo DSM 28251 di Cutibacterium acnes da cui ha origine la parete cellulare batterica divulgata nella presente, pu? essere derivato da mutazione spontanea, mutazione indotta, coniugazione e selezione, ibridazione e selezione o altri metodi di manipolazione genetica, e pu? essere ricondotto a ci?.

Il ceppo batterico da cui ha origine la parete cellulare batterica pu? essere isolato e selezionato da pelle sana, tra la moltitudine di ceppi che compongono il microbiota della pelle.

Secondo un altro aspetto, l'invenzione riguarda una parete cellulare batterica, o una frazione/un lisato, di Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251 associata o combinata a mucopolisaccaride, per l?uso nella prevenzione o nel trattamento di una malattia immunologica della pelle o delle mucose.

Preferibilmente, la parete cellulare batterica associata a mucopolisaccaride dell'invenzione trova applicazioni nel campo dermatologico e ginecologico, ad esempio nel trattamento di infiammazioni o infezioni della pelle o mucosali da batteri, funghi o protozoi.

Ad esempio, l'associazione divulgata nella presente ? efficace nella prevenzione e/o nel trattamento di infezioni batteriche che sono la causa di alcune reazioni di ipersensibilit? di tipo I, ad esempio l'orticaria, e reazioni di ipersensibilit? di tipo III, ad esempio la vasculite cutanea allergica. L'associazione divulgata nella presente ? adatta anche nel trattamento di una funzione anomala della barriera epidermica e dell'immunit? disregolata che causano la dermatite atopica, una malattia della pelle a base allergica con una maggiore predisposizione ad infezioni della pelle ed alla colonizzazione cutanea da microrganismi patogeni come lo Staphylococcus aureus. In un aspetto viene fornita la parete cellulare batterica, o una frazione/un lisato, di Cutibacterium acnes DSM 28251 associata a mucopolisaccaride per l?uso nel trattamento di una malattia della pelle causata da superantigeni, fattori di virulenza prodotti da batteri come S. aureus che potrebbero indurre resistenza ai corticosteroidi.

Inoltre, l'associazione dell'invenzione ? efficace nel trattamento di infezioni da funghi, specialmente lieviti del genere Candida spp, specialmente Candida albicans, o dermatofiti come Malassezia spp, entrambi tra i pi? comuni agenti causali di infezioni opportunistiche del corpo umano. Inoltre, l'associazione dell'invenzione ? usata nel trattamento di infezioni fungine che sono resistenti ai prodotti antifungini disponibili sul mercato.

? stato anche osservato che l'associazione divulgata nella presente ? fornita di un'azione cicatrizzante sulla pelle.

L'uso cosmetico del ceppo batterico sopra identificato per migliorare un aspetto estetico della pelle come il rossore o la couperose ? anche divulgato nella presente. Di conseguenza, in un aspetto l'invenzione concerne un frammento o un lisato della parete batterica di Cutibacterium acnes DSM 28251 legato/associato a mucopolisaccaride o una composizione farmaceutica contenente detta associazione e un veicolo farmaceuticamente accettabile, per l?uso nel trattamento di ferite, abrasioni, ulcerazioni della pelle, ad esempio piaghe da decubito, e per riparare tessuti danneggiati del corpo, specialmente la pelle.

I gruppi funzionali reattivi nei mucopolisaccaridi come i gruppi carbossilici e idrossilici nella loro struttura li rendono adatti all'abbinamento con la parete batterica di Cutibacterium acnes DSM 28251.

Il frammento o il lisato della parete cellulare batterica del ceppo DSM 28251 di Cutibacterium acnes pu? essere ottenuto mediante delipidazione della parete cellulare batterica e successiva frantumazione del ceppo.

In un ulteriore aspetto la presente invenzione concerne un processo per la produzione di una parete cellulare batterica di Cutibacterium acnes DSM 28251 legata/associata a mucopolisaccaride, comprendente le fasi di

a) ossidazione o acetilazione dell'alcol primario con uno tra: periodato, alogenuri di acile, glutaraldeide, acido iodoacetico, acido cloroacetico. Preferibilmente, l'ossidazione avviene sull'idrossile del carbonio sei della porzione funzionale N-acetilglucosamina del mucopolisaccaride come acido ialuronico per via della migliore accessibilit? dei reagenti agli alcoli primari. Questa fase pu? essere eseguita secondo la divulgazione di Kristiansen, K. A., Potthast, A., & Christensen, B. E., ?Periodate oxidation of polysaccharides for modification of chemical and physical properties.? Carbohydrate Research, 345(10), 1264-1271. (2010).

b) reazione, in un mezzo acquoso o organico, tra il mucopolisaccaride attivato comprendente gruppi aldeidici e carbossilici con gruppi amminici presenti nella parete batterica formando la base di Schiff o gruppi ammidici.

Ad esempio, la reazione della fase b) pu? essere eseguita usando acqua come solvente e un tampone per regolare il pH nell'intervallo di 8,5-9, in alternativa il solvente include vantaggiosamente etanolo e tetraidrofurano (THF) e un tampone fosfato preferibilmente per regolare il pH a 7,4 /- 0,4.

I mucopolisaccaridi possono essere modificati chimicamente in due modi differenti: mediante coniugazione o reticolazione.

Entrambi i metodi si basano sulla stessa reazione chimica, nella coniugazione il composto ? legato su una catena di mucopolisaccaridi come una catena di acido ialuronico mediante un legame singolo.

Nel caso della reticolazione, le catene di mucopolisaccaridi sono legate insieme mediante due o pi? legami.

La reazione di coniugazione pu? avvenire usando la reattivit? dei gruppi presenti nei biopolimeri o creando siti adatti alla coniugazione chimica sul polimero per ottenere un mucopolisaccaride attivato.

Tipicamente, i gruppi di coniugazione del frammento di parete batterica sono preferibilmente gruppi amminici, carbossilici e tiolici.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

L'invenzione sar? ora descritta in dettaglio e con riferimento alle Figure allegate in cui:

la Figura 1A e 1B mostrano due grafici che illustrano il tasso di sopravvivenza di larve di Galleria mellonella inoculate con surnatanti da colture di S. aureus BAA1680 e S. aureus ATCC 29213 secondo l'Esempio 1.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

L'invenzione ha origine dalla constatazione che alcune attivit? del ceppo DSM 28251 di Cutibacterium acnes sono inaspettatamente migliorate quando la parete cellulare batterica di questo ceppo, o un suo frammento, ? associata o legata a mucopolisaccaride.

Secondo un aspetto principale, l'invenzione concerne una parete cellulare batterica, o una sua frazione o un suo lisato, associata a mucopolisaccaride come definito nella rivendicazione 1.

Specificamente, la parete cellulare batterica del ceppo DSM 28251 di Cutibacterium acnes, o un suo frammento/una sua frazione, quando ? collegata o associata a mucopolisaccaride ? dotata di un'azione immunomodulatrice che la rende efficace nel trattamento di malattie immunologiche della pelle.

Le attivit? di cui sopra sono dimostrate mediante i test sperimentali eseguiti dagli inventori e riportati nel seguente esempio. Questi test forniscono una base scientifica per l'utilizzo dell'associazione sopra identificata come agente immunomodulatore, specialmente per applicazioni topiche.

Mucopolisaccaridi adatti collegati o associati alla parete cellulare batterica del ceppo descritto sono mucopolisaccaridi fisiologicamente accettabili appartenenti ai seguenti gruppi basati su strutture disaccaridiche centrali:

gruppo 1: eparina/eparan solfato (HSGAG); gruppo 2: condroitin solfato /dermatan solfato (CSGAG), gruppo 3: cheratan solfato, chitosano; gruppo 4: acido ialuronico o loro sali fisiologicamente accettabili.

In alcune forme di realizzazione preferite i mucopolisaccaridi sono selezionati tra acido ialuronico (HA) e suoi sali, condroitin-4-solfato (C4SA), condroitin-6-solfato (C6SC), chitosano, dermatan solfato (DS-condroitin-solfato B), eparin solfato (HS), eparina (HP) e cheratan solfato (KS) e sali fisiologicamente accettabili dei suddetti mucopolisaccaridi.

Tra i mucopolisaccaridi fisiologicamente accettabili, l'acido ialuronico o un suo sale sono preferiti. Sali adatti di acido ialuronico includono i sali di sodio, potassio, calcio. In alcune forme di realizzazione, il peso molecolare di HA ? da 3x10<4 >e 8x10<6 >MW (T.C. Laurent et al., Fractionation of hyaluronic acid. The polydispersity of hyaluronic acid from the bovine vitreous body, Biochim. Biophys Acta, 1960, 42, 476).

Tipicamente, il peso molecolare dei mucopolisaccaridi, come l'acido ialuronico, ? il peso molecolare (MW) medio che pu? essere determinato mediante tecniche convenzionali come SEC-MALLS o diffusione della luce laser multi-angolocromatografia di esclusione dimensionale, o con un metodo come descritto in Ueno et al., 1988, Chem Pharm Bull. 36, 4971-4975; Wyatt 1993, Anal Chim Acta 272: 1-40; Watt Technologies 1999 ?Light scattering University Dawn Course Manual e ?Dawn Eos Manual? Wyatt Technology Corp. Santa Barbara CA (USA).

In alcuni aspetti dell'invenzione, viene qui fornita una composizione, specialmente una composizione farmaceutica o nutrizionale, contenente l'associazione come definita nella rivendicazione 1.

Secondo un aspetto, l'invenzione concerne la parete cellulare batterica divulgata nella presente, o un suo frammento, associata a mucopolisaccaride per l?uso come medicinale.

In particolare, la parete cellulare batterica, o un suo frammento, associata a mucopolisaccaride secondo una delle forme di realizzazione descritte ? per l?uso nel trattamento di malattie immunologiche della pelle.

Malattie immunologiche della pelle che possono essere trattate secondo l'invenzione includono tipi infettivi, allergici, autoimmuni e di altra natura in base all'eziologia, alla patogenesi e alle risposte immunitarie.

Le caratteristiche della parete cellulare batterica della rivendicazione 1 forniscono sia azioni immunomodulatrici che antinfiammatorie, che consentono al medico di trattare una vasta gamma di malattie, specialmente malattie della pelle o delle mucose allergiche, autoimmuni, infettive di un mammifero come gli esseri umani. Inoltre, la componente batterica della parete cellulare batterica associata al mucopolisaccaride, quando viene somministrata per via orale o applicata sulla pelle di un individuo, scatena una risposta immunitaria contro microrganismi patogeni. Questo/a effetto/attivit? rende l'associazione utile nel trattamento di infezioni, specialmente infezioni della pelle e delle mucose.

In particolare, l'associazione descritta nella presente ? efficace nel trattamento della maggior parte dei batteri comuni, principalmente batteri gram-positivi, specialmente batteri cocchi come Staphylococcus aureus o Escherichia coli e lieviti patogeni come quelli del genere Candida, ad esempio Candida albicans.

Il ceppo DSM 28251 da cui si ottiene la parete cellulare batterica divulgata nella presente ? caratterizzato genotipicamente ed ? identificabile in modo chiaro e definito mediante tratti specifici identificati all'interno del genoma. Questo ceppo si ? evoluto spontaneamente, senza alcun intervento o manipolazione genetica diretti, e ha le caratteristiche rilevanti per un'applicazione industriale.

Al fine di verificare e accertare le caratteristiche del ceppo DSM 28251, e per escludere la possibile sovrapposizione di questo ceppo con i ceppi descritti nella tecnica nota, una caratterizzazione del genotipo ? stata fatta da DSMZ.

In alcuni aspetti, l'invenzione concerne anche una parete cellulare batterica di Cutibacterium acnes DSM 28251 associata a mucopolisaccaride e composizioni contenenti la stessa per usi medici nel trattamento di:

- una malattia ginecologica come una vaginite, un'infezione o un'infiammazione vaginale o

- un disturbo proctologico, ad esempio emorroidi, ragadi anali o cicatrici della pelle o della zona perianale o

- ferite, lesioni, abrasioni, ulcerazioni della pelle, ad esempio piaghe da decubito o per guarire ferite.

Processo per ottenere la frazione o il lisato di parete cellulare batterica Una parete cellulare batterica adatta, una sua frazione o un suo lisato, del ceppo DSM 28251 di Cutibacterium acnes che ? associata al mucopolisaccaride, pu? essere ottenuta mediante metodi convenzionali o generali di distruzione cellulare. Un'adeguata demolizione/distruzione/frantumazione della parete cellulare del ceppo pu? essere ottenuta sottoponendo il suddetto ceppo a metodi meccanici/trattamenti di lisi o a metodi non meccanici/trattamenti non di lisi.

In alcune forme di realizzazione, prima di una distruzione o di una frantumazione della parete cellulare batterica, il ceppo di partenza pu? essere inattivato usando metodi convenzionali, ad esempio riscaldando e/o trattando il ceppo con formaldeide.

Distruzione della parete cellulare batterica con metodi/apparati meccanici Metodi meccanici adatti per distruggere (lisi) la parete cellulare batterica del presente ceppo e ottenere frammenti di parete includono metodi di taglio in solidi o di taglio in fluidi.

Un taglio in solidi include l'utilizzo di una macina a biglie, X-press/pressa Hughes. Un taglio in liquidi/fluidi include sonicazione e i metodi ad alta pressione tra cui la pressa Hughes o la pressa French e/o l'omogeneizzazione con un omogeneizzatore o l'utilizzo di un omogeneizzatore microfluidico.

La tecnica con macina a biglie (o abrasione) include tipicamente l'agitazione di una sospensione del ceppo con biglie di vetro.

Tipicamente, la distruzione della parete cellulare batterica con un metodo con macina a biglie viene eseguita in una macina a biglie che include una camera di macinazione incamiciata con un albero rotante che attraversa il suo centro. L'albero ? dotato di agitatore/i che impartisce/impartiscono l'energia cinetica alle biglie nella camera, costringendole a scontrarsi tra loro (Chisti & Moo-Young, 1986; Middelberg, 1995). Biglie adatte possono avere un diametro di 0,10-0,15 mm per un'efficace distruzione dei batteri. I grandi apparati industriali possono usare biglie con un diametro di 0,4-0,6 mm per via del meccanismo di separazione delle biglie dalla sospensione (Kula & Shutte, 1987). Una velocit? periferica adatta ? di almeno 10m<-1 >per la distruzione dei batteri (Kula & Shutte, 1987). Le concentrazioni di cellule possono variare dal 40-50% di peso umido nel brodo introdotto nella camera.

Tagli adatti comprendono anche sonicazione e metodi ad alta pressione tra cui la pressa Hughes o la pressa French, in cui una sospensione congelata di cellule viene spinta attraverso una piccola apertura mediante alte pressioni (Engler, 1985).

La sonicazione include l'utilizzo di ultrasuoni, onde sonore tipicamente con frequenza superiore a 15-20 kHz che possono distruggere una parete cellulare in sospensione. Una potenza acustica adatta, ad esempio, quando si effettua una sonicazione di 5-30 mL di una sospensione batterica al 20% in un mezzo liquido convenzionale usando 35-95W di potenza acustica.

In alternativa, una distruzione meccanica pu? essere ottenuta in un omogeneizzatore a valvola ad alta pressione facendo passare una sospensione cellulare del ceppo sotto alta pressione attraverso una valvola di scarico regolabile a orifizio limitato, come riportato da Engler, 1985. Tipicamente, il design di un omogeneizzatore di base comprende una pompa a spostamento positivo che spinge una sospensione cellulare attraverso il centro di una sede di valvola e lungo la faccia di sede. Regolando la forza sulla valvola si controlla la pressione. Il fluido scorre radialmente lungo la valvola e colpisce un anello di impatto (Middelberg, 1995). La distruzione risulta da una lacerazione aspecifica della parete cellulare. Un tipo di omogeneizzatore esemplificativo ? il design Manton-Gaulin APV (Middelberg, 1995). Ad esempio, la temperatura viene innalzata di circa 21 C per 10 MPa in un omogeneizzatore. C'? una forte influenza della pressione di esercizio sul processo di distruzione nell'omogeneizzatore. Facendo funzionare l'omogeneizzatore a pressioni pi? alte, ? possibile diminuire il numero di passaggi dello slurry cellulare attraverso l'omogeneizzatore per un dato grado di distruzione (Chisti & Moo-Young, 1986; Bury et al., 2001).

Un omogeneizzatore microfluidico pu? anche essere usato come attrezzatura per ottenere una parete cellulare frammentata. In questo apparato due correnti di una sospensione cellulare vengono fatte collidere ad alta velocit? contro una superficie stazionaria e l'energia immessa viene dissipata quasi istantaneamente presso il punto di impatto portando a distruzione delle cellule (Middelberg, 1995; Agerkvist & Enfors, 1990). Il tempo di permanenza della sospensione di ceppo nella camera di distruzione di dispositivi di microfluidizzazione, che ? la parte pi? calda del dispositivo, ? di 25-40 ms. Un raffreddamento sul posto pu? essere ottenuto mediante immersione della camera di distruzione in un bagno di ghiaccio (Sauer et al., 1989; Geciova, esperienza personale). La frazione di cellule distrutte aumenta all'aumentare della pressione e del numero di passaggi.

Distruzione della parete cellulare batterica con metodi non meccanici

Un metodo di distruzione non meccanico si basa sulla decompressione ottenuta introducendo un gas subcritico o supercritico pressurizzato nelle cellule che causa distruzione dopo il rilascio della pressione applicata mediante espansione.

Un'altra distruzione non meccanica della parete cellulare pu? essere ottenuta mediante shock osmotico in cui una sospensione di ceppo cellulare viene diluita in un mezzo liquido/brodo dopo equilibrazione in alta pressione osmotica in condizioni convenzionali.

Un metodo alternativo per la lisi cellulare ? la termolisi che comporta un trattamento termico delle cellule in condizioni convenzionali. Un'altra lisi cellulare non meccanica pu? essere ottenuta mediante permeabilizzazione chimica, specialmente con una sostanza selezionata tra antibiotici come un antibiotico betalattamico, ad esempio penicillina, agenti chelanti, ad esempio EDTA, agenti caotropici, ad esempio urea, guanidina, etanolo, detergenti, ad esempio Triton serie X, sodio dodecil solfato, sodio lauril sarcosinato, solventi come toluene, acetone, cloroformio, idrossidi come idrossido di sodio, ipocloriti come ipoclorito di sodio e loro miscele.

La lisi cellulare del ceppo pu? anche essere ottenuta tramite lisi enzimatica, ad esempio usando una proteasi e una glucanasi per attaccare, prima, il complesso mannoproteico della parete cellulare e poi la catena dorsale del glucano (Kitamura, 1982). Un prodotto adatto per la lisi della parete del ceppo ? il prodotto commerciale Zymolase-20T (Seikagaku America, Inc., Rockville, MD). Anche lisozima pu? essere usato per la lisi di strati di peptidoglicano, poich? catalizza l'idrolisi dei legami b-1,4-glicosidici.

Secondo una forma di realizzazione preferita, un frammento di parete di ceppo DSM 28251 di C. acnes pu? essere ottenuto trattando il ceppo batterico con solfato di ammonio, preferibilmente a una temperatura inferiore alla temperatura ambiente, ad esempio nell'intervallo da 10 a 2?C, e vantaggiosamente, dopo il trattamento, la sospensione viene centrifugata e il frammento precipitato viene raccolto.

Vantaggiosamente, prima del trattamento con solfato di ammonio, il ceppo DSM 28251 di C. acnes viene essiccato e centrifugato, opzionalmente con acqua. Opzionalmente, dopo la centrifugazione, il surnatante risultante dalla centrifugazione viene riscaldato, ad esempio, ad una temperatura da 40 a 95?C, preferibilmente a 75-85?C e poi raffreddato, ad esempio, con acqua fredda, preferibilmente a 3-15?C. Successivamente, la fase di precipitazione viene effettuata incubando con una soluzione di solfato di ammonio ad una concentrazione dal 20 al 60% v/v, ad esempio da 2 a 10?C. Vantaggiosamente, dopo l'incubazione, la sospensione ottenuta viene centrifugata e il frammento precipitato pu? essere raccolto.

Ad esempio, il sedimento batterico viene delipidato mediante trattamento Soxhlet usando solventi organici selezionati tra etere-etanolo, cloroformio, metanolocloroformio e una loro miscela, quindi viene essiccato ad esempio sotto la cappa a flusso laminare. Dopo l'essiccazione, il sedimento viene omogeneizzato con 2 fasi di trattamento Ultraturrax, preferibilmente 1 minuto ciascuna, aggiungendo acqua distillata, preferibilmente nella proporzione di 1:2 p/V. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene scaldato a 80?C e poi raffreddato sotto acqua fredda, preferibilmente da 3 a 15?C, e infine su ghiaccio. Successivamente, la fase di precipitazione di frammento viene effettuata incubando con solfato di ammonio fresco al 40% v/v per 24 ore a 4?C. Dopo l'incubazione, la sospensione viene centrifugata, e il frammento precipitato viene raccolto e liofilizzato.

Delipidazione

In alcune forme di realizzazione, il frammento della parete cellulare di Cutibacterium acnes depositato con il numero di accesso DSM 28251 viene delipidato, ovvero trattato in modo da rimuovere o ridurre notevolmente la componente lipidica della parete cellulare del batterio mediante mezzi di tecniche chimiche/biotecnologiche. Vantaggiosamente, la fase di delipidazione viene eseguita prima della distruzione della parete cellulare batterica.

Ad esempio, il Cutibacterium acnes depositato con il numero di adesione DSM 28251 viene delipidato prima della frantumazione per produrre i frammenti di parete cellulare.

Tipicamente, i frammenti di parete cellulare delipidati del ceppo dell'invenzione comprendono zuccheri e catene peptidiche, tipicamente legati tra loro in glicopeptidi che formano una maglia a rete stretta. Gli zuccheri tipici della parete cellulare comprendono acido N-acetilmuramico e N-acetilglucosammina.

Ad esempio, un processo per ottenere un frammento di parete cellulare del ceppo DSM 28251 di C. acnes include la fase di fornire un ceppo di Cutibacterium acnes DSM 28251 incluso in un brodo o mezzo di coltura, una fase di lavare e delipidare mediante un estrattore Soxhlet.

I batteri delipidati vengono poi sospesi in acqua e quindi sottoposti a lisi meccanica ad esempio con un agitatore meccanico come un omogeneizzatore Ultraturrax e il contenuto viene trattato con solfato di ammonio per far precipitare i frammenti della parete batterica.

I frammenti possono poi essere puliti ad esempio lavando con acqua per ottenere i frammenti di parete cellulare batterica desiderati.

Associazione/collegamento di parete cellulare batterica con mucopolisaccaride L'associazione della parete cellulare batterica con il mucopolisaccaride pu? essere ottenuta facendo reagire un frammento di parete cellulare di ceppo DSM 28251 di C. acnes con una soluzione di un mucopolisaccaride in un solvente adatto.

Una forma di realizzazione del metodo per associare/collegare la parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 con il mucopolisaccaride comprende le seguenti fasi: un sale di un mucopolisaccaride adatto, ad esempio un sale di sodio, potassio o calcio di acido ialuronico (HA), viene sciolto in acqua con un tampone comprendente acetato di sodio per raggiungere un pH nell'intervallo da 5 a 6, preferibilmente da 5,3 a 5,7, ad esempio pH 5,5. Successivamente, iodoacetato o cloroacetato viene aggiunto ad esempio in una quantit? da 1 a 10% in peso, preferibilmente da 3 a 6%, ad esempio 4% in peso rispetto alla quantit? di sale di acido ialuronico di partenza, preferibilmente agitando e poi aggiungendo un agente alcalinizzante preferibilmente carbonato di calcio per raggiungere un pH basico preferibilmente nell'intervallo da 8 a 10, preferibilmente da 8,5 a 9,5, pi? preferibilmente 8,8-9.

A questa soluzione viene aggiunto un frammento di parete di C. acnes DSM 28251 secondo una forma di realizzazione divulgata nella presente per associare/collegare HA alla parete di C. acnes DSM 28251. Preferibilmente, la parete cellulare batterica legata/associata a mucopolisaccaride ottenuta viene lasciata nella soluzione per una notte. Vantaggiosamente, almeno un amminoacido ramificato selezionato preferibilmente tra leucina, valina, iso-leucina o arginina, o glicerolo o glicina viene aggiunto/a alla soluzione della parete cellulare associata a HA per migliorare il collegamento tra HA e la parete di C. acnes DSM 28251.

Come esempio, un coniugato di un frammento di parete cellulare di ceppo DSM 28251 e HA pu? essere preparato e ottenuto come segue: 5 g di ialuronato di sodio vengono sciolti in 100 ml di tampone acetato 0,05 M, pH 5,5 con agitazione per ottenere una soluzione non eccessivamente viscosa, 856 mg di monoiodoacetato o monocloroacetato di sodio vengono quindi aggiunti alla soluzione e la reazione di ossidazione viene consentita a temperatura ambiente lontano dalla luce per 30 minuti. La reazione viene quindi bloccata aggiungendo 1 ml di glicerolo 5 M. Dopo 15 minuti di reazione, il pH viene regolato a circa 9 aggiungendo carbonato di sodio in forma di polvere, dopodich? 5 g di frammento di parete di ceppo DSM 28251 di C. acnes vengono aggiunti alla soluzione (100 unit? stimolanti) e si lascia avvenire l'associazione/il collegamento a temperatura ambiente per svariate ore con agitazione e durante la notte a 4 ?C senza agitazione. I gruppi aldeidici ancora liberi possono essere bloccati aggiungendo 5 ml di una soluzione di 1M di un amminoacido, come arginina, leucina, valina o iso-leucina. La soluzione viene dializzata in acqua e liofilizzata dopo 30 minuti.

Definizioni nella presente invenzione:

- Con "ceppo DSM 28251" si intende includere un ceppo batterico del genere Cutibacterium, specie acnes, depositato il 18 dicembre 2013 (identificazione di riferimento ULTIMO) e convertito in un deposito ai sensi del trattato di Budapest il 22 dicembre 2019 con il numero di acceso DSM 28251 presso l'International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; tipicamente, Cutibacterium acnes ? un batterio gram-positivo.

- con "parete cellulare batterica associata a mucopolisaccaride" si intende che la parete cellulare o una sua frazione, una sua porzione ? collegata a un mucopolisaccaride. Il collegamento o ponte si forma nel processo di produzione della parete cellulare batterica associata a mucopolisaccaride come descritto nella presente. Si ipotizza che il peptidoglicano (mureina) che forma la parete cellulare batterica, interagisca o si colleghi con i mucopolisaccaridi.

Vantaggiosamente, il collegamento o ponte tra peptidoglicani e mucopolisaccaridi si forma nelle condizioni del processo divulgato nella presente.

- con il termine "associazione", secondo l?utilizzo fattone nella presente, si intende la parete cellulare batterica, o frazione/lisato, di Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251 collegata o associata a mucopolisaccaride.

- i termini "associato/a" e "collegato/a" o "legato/a", secondo l?utilizzo fattone nella presente, sono intercambiabili e considerati sinonimi e indicano la formazione di un collegamento, preferibilmente con formazioni di legami, tra la parete batterica e il mucopolisaccaride, specialmente acido ialuronico. In alcuni passaggi i termini di cui sopra intendono designare una parete cellulare associata al mucopolisaccaride secondo l'invenzione.

- i termini "frammento" e "frazione", secondo l?utilizzo fattone nella presente, sono sinonimi quando si riferiscono alla parete cellulare batterica.

- con il termine "lisato" riferito alla parete cellulare batterica si intendono frammenti della parete cellulare ottenuti mediante distruzione secondo una qualsiasi delle tecniche di distruzione divulgate nella presente.

- "mezzo di crescita" (sinonimi: mezzo, mezzo di crescita/brodo di coltivazione/brodo di crescita) si riferisce a un substrato contenente tutti i composti (fattori) richiesti da un microrganismo, specialmente un batterio come un batterio gram+ per la replicazione cellulare risultante nell'aumento del numero delle singole cellule e in crescita della popolazione. I fattori richiesti dai microrganismi per la loro crescita nel mezzo appartengono principalmente alle categorie: fonte di carbonio, fonte di azoto simile (costituita sia da ammoniaca che da aminoacidi liberi, gli ultimi conosciuti anche come FAN), vitamine e sali (oligoelementi). Fonti di carbonio tipiche sono melassa di canna da zucchero, melassa di barbabietola, estratto di malto d'orzo ed estratto di malto di frumento.

- "veicolo" si riferisce a un eccipiente, veicolo, diluente o adiuvante, che pu? o pu? essere presente nella composizione dell'invenzione.

- per "prodotto nutrizionale" si intende un prodotto che migliora lo stato nutrizionale e pu? essere usato per sostenere o migliorare l'attivit? funzionale di uno o pi? organi o la funzionalit? del corpo umano entro i limiti fisiologici.

- per "ceppo batterico selezionato" o "ceppo", come menzionato nella presente, si intende il ceppo dell'invenzione depositato presso il DSMZ con il numero di accesso DSM 28251.

- per "parete cellulare batterica" o "parete del ceppo batterico (dell'invenzione)" si intende la parete cellulare, o un suo frammento o una sua porzione o un suo lisato, del ceppo batterico di Cutibacterium acnes depositato con il numero di accesso DSM 28251.

Ai fini della presente invenzione, la parete cellulare batterica divulgata nella presente pu? essere intera o distrutta in parti o frammenti o porzioni.

Con il termine "frammento" o "lisato" si intende una porzione della parete cellulare batterica del ceppo DSM 28251.

COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE

La parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride divulgata nella presente ? vantaggiosa per un'applicazione industriale nella preparazione di composizioni farmaceutiche, specialmente per applicazione topica. Secondo un aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente una parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride come definito nella presente e un eccipiente farmaceuticamente o fisiologicamente accettabile.

Il veicolo, il diluente o l'eccipiente fisiologicamente o farmaceuticamente adatto pu? essere selezionato in base alla via di somministrazione a cui ? destinata la composizione farmaceutica risultante.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione racchiudono qualsiasi composizione realizzata miscelando un ceppo come definito nella presente, un suo frammento o un suo postbiotico secondo la presente invenzione e un veicolo farmaceuticamente accettabile. Tali composizioni sono adatte ad un utilizzo farmaceutico in un animale o in un essere umano.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione comprendono una quantit? terapeuticamente efficace della parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride e un veicolo farmaceuticamente accettabile. Una composizione farmaceutica pu? opzionalmente contenere altri ingredienti attivi. Il termine "veicolo" si riferisce a un veicolo, eccipiente, diluente, o coadiuvante con cui viene somministrato l'ingrediente terapeutico o attivo. Qualsiasi veicolo e/o eccipiente adatto alla forma di preparazione desiderata per la somministrazione ? contemplato per l?uso con i ceppi/la parete/i postbiotici divulgati nella presente. Il veicolo pu? assumere un'ampia variet? di forme a seconda della forma di preparazione desiderata per la somministrazione, ad esempio orale o parenterale, inclusa quella endovenosa. Nel preparare le composizioni per una forma farmaceutica orale, pu? essere impiegato qualsiasi dei mezzi farmaceutici usuali, come, ad esempio, acqua, glicoli, oli, alcoli, agenti aromatizzanti, conservanti, coloranti e simili nel caso di preparazioni liquide orali, come, ad esempio, sospensioni, elisir e soluzioni; o veicoli come amidi, zuccheri, cellulosa microcristallina, diluenti, agenti granulanti, lubrificanti, leganti, agenti disintegranti e simili nel caso di preparazioni solide orali come, ad esempio, polveri, capsule dure e morbide e compresse; le preparazioni solide orali essendo preferite rispetto alle preparazioni liquide.

In alcune forme di realizzazione, la parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride della presente invenzione pu? essere combinata come ingrediente attivo in intima miscela con un veicolo e/o eccipiente farmaceutico adatto secondo le tecniche convenzionali di compounding farmaceutica.

Le composizioni includono composizioni adatte per somministrazione parenterale, incluse sottocutanea, intramuscolare, ed endovenosa, polmonare, nasale, rettale, topica o orale. Una via di somministrazione adatta in ogni caso dipender? in parte dalla natura e dalla gravit? delle condizioni che vengono trattate e dalla natura dell'ingrediente attivo. Una via di somministrazione esemplificativa ? la via orale. Le composizioni possono essere opportunamente presentate in forma farmaceutica unitaria e preparate mediante qualsiasi dei metodi ben noti nell'arte farmaceutica. Le composizioni preferite includono composizioni adatte per somministrazione orale, parenterale, topica, sottocutanea, o polmonare, nella forma di inalazione nasale o buccale. Le composizioni possono essere preparate mediante qualsiasi dei metodi ben noti nell'arte farmaceutica.

Le composizioni farmaceutiche possono essere nella forma di compresse, pillole, capsule, soluzioni, sospensioni, emulsioni, polveri, supposte, e come formulazioni a rilascio prolungato.

Se lo si desidera, le compresse possono essere rivestite con tecniche acquose o non acquose standard. In alcune forme di realizzazione, tali composizioni e preparazioni possono contenere almeno lo 0,1% di ceppo. La percentuale di parete cellulare batterica attiva di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride in queste composizioni pu?, naturalmente, essere variata e pu? essere opportunamente da circa 0,1 per cento a circa 60 per cento, da 0,5 a 20% del peso dell'unit?. La quantit? di parete cellulare batterica attiva di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride in tali composizioni terapeuticamente utili ? tale da ottenere un dosaggio terapeuticamente attivo. La parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride pu? anche essere somministrata per via intranasale come, ad esempio, gocce liquide o spray.

Le compresse, le pillole, le capsule e simili possono anche contenere un legante come gomma adragante, acacia, amido di mais o gelatina; eccipienti come fosfato dicalcico; un agente disintegrante come amido di mais, amido di patata, acido alginico; un lubrificante come stearato di magnesio; e un agente dolcificante come saccarosio, lattosio o saccarina. Quando una forma farmaceutica unitaria ? una capsula, essa pu? contenere, in aggiunta ai materiali del tipo sopra descritto, un veicolo liquido come un olio grasso. Vari altri materiali possono essere presenti come rivestimenti o per modificare la forma fisica dell'unit? farmaceutica. Ad esempio, le compresse possono essere rivestite con gomma lacca, zucchero e entrambi. Uno sciroppo o un elisir pu? contenere, in aggiunta all'ingrediente attivo, saccarosio come agente dolcificante, metil e propil parabeni come conservanti, un colorante e un agente aromatizzante come aroma alla ciliegia o all'arancia. Per prevenire una degradazione durante il transito attraverso la porzione superiore del tratto gastrointestinale, la composizione ? una formulazione con rivestimento enterico.

Nel quadro dell'invenzione, gli utilizzi topici sono preferiti. Di conseguenza, in alcune forme di realizzazione preferite, la composizione ? per l'applicazione topica. In questa applicazione, la composizione contenente ceppo/parete/postbiotico, come definito nella presente, pu? essere applicata sulla pelle di esseri umani.

Le composizioni per somministrazione topica includono, ma senza limitarvisi, unguenti, creme, lozioni, soluzioni, paste, gel, bastoncini, liposomi, nanoparticelle, cerotti, bende e medicazioni per ferite. In alcune forme di realizzazione, la formulazione topica comprende un potenziatore di penetrazione.

Le composizioni per somministrazione polmonare includono, ma senza limitarvisi, composizioni in polvere secca consistenti nella polvere di un ceppo/frammento/postbiotico, e nella polvere di un veicolo e/o lubrificante adatto. Le composizioni per somministrazione polmonare possono essere inalate da qualsiasi adatto dispositivo inalatore per polvere secca noto a un tecnico del ramo. La composizione per applicazione topica pu? essere in forma solida, semisolida o fluida. Formulazioni adatte in forma solida includono creme, gel, unguenti, paste, preparazioni grasse, creme, cerotti.

La composizione per applicazione locale in forma fluida, pu? essere nella forma di lozioni, gel, sospensioni, emulsioni.

Tipicamente, la composizione per utilizzo topico pu? contenere una quantit? del ceppo batterico sopra identificato da 0,00001% a 10%, da 0,0001 a 3%, da 0,1 a 2% in peso rispetto al peso totale della composizione.

In caso di formulazioni fluide o semifluide, il ceppo batterico pu? essere diluito in un veicolo in forma liquida fisiologicamente accettabile come acqua, alcol, soluzione idroalcolica o glicerilica o miscelato con altri liquidi adatti per applicazione locale. A titolo di esempio, le composizioni dell'invenzione in forma liquida possono essere preparate sciogliendo o disperdendo il ceppo batterico o un suo sottoprodotto in acqua e/o alcol. La composizione liquida pu? essere tamponata per raggiungere un intervallo di pH convenientemente selezionato da 5 a 7 per essere compatibile con il pH della pelle e poi filtrata e confezionata in contenitori adatti come flaconi o fiale. In una forma di realizzazione, la formulazione per l'applicazione locale ? nella forma di una crema o di un'emulsione contenente il ceppo batterico trasportato in un eccipiente adatto.

Secondo altre forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione ? in forma per somministrazione sistemica, in particolare per somministrazione orale. In questi casi, la composizione contiene il ceppo batterico come precedentemente definito e uno o pi? veicoli o eccipienti adatti per somministrazione sistemica.

La somministrazione delle composizioni viene effettuata secondo un protocollo e a un dosaggio sufficiente a ridurre la malattia bersaglio nel soggetto.

In alcune forme di realizzazione, nelle composizioni farmaceutiche della presente invenzione il principio attivo o i principi attivi sono generalmente formulati in unit? farmaceutiche. L'unit? farmaceutica pu? contenere da 0,00001 a 1000 mg di parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride per unit? farmaceutica per somministrazione quotidiana.

In alcune forme di realizzazione, le quantit? efficaci per formulazione topica dipenderanno dalla gravit? della malattia, del disturbo o della condizione, dalla terapia precedente, dallo stato di salute dell'individuo e dalla risposta al farmaco. In alcune forme di realizzazione la dose ? nell'intervallo da 0,001% in peso a circa 60% in peso della formulazione.

Quando usata in combinazione con uno o pi? altri ingredienti attivi, la parete cellulare batterica di ceppo DSM 28251 associata a mucopolisaccaride della presente invenzione e l'altro ingrediente attivo possono essere usati in dosi inferiori rispetto a quando ciascuno viene usato singolarmente.

Per quanto riguarda le formulazioni, in relazione a qualsiasi variet? di vie di somministrazione, i metodi e le formulazioni per la somministrazione di farmaci sono divulgati in Remington?s Pharmaceutical Sciences, 17<a >edizione,

, 1985, e Remington?s Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR ed. 20<a >edizione, 2000, USA, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21<a >edizione, ed. , 2005; e in Ansel?s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8<a >edizione, ed., 2005, che sono incorporati nella presente come riferimento.

In alcune forme di realizzazione, la composizione dell'invenzione per somministrazione orale ? un prodotto nutrizionale o dietetico o nutraceutico.

Esempi di forme di realizzazione e procedure preferite della presente invenzione sono descritti di seguito per illustrare l'invenzione.

ESEMPIO 1

Tasso di sopravvivenza di larve di Galleria mellonella inoculate con surnatanti da colture di S. aureus BAA1680 e S. aureus ATCC 29213

Premesse

La patogenicit? di Staphylococcus aureus nella dermatite atopica (AD) e in altre malattie infiammatorie della pelle ? legata alla sua capacit? di produrre molti fattori di virulenza, tra cui tossine secrete, enzimi, ed antigeni associati alla superficie cellulare. Questi fattori consentono a questo batterio di eludere le difese naturali dell'ospite.

La risposta cutanea a questo insulto coinvolge una complessa cascata biologica e molecolare di eventi, tra cui infiammazione, formazione di tessuto di granulazione, riepitelizzazione, ed angiogenesi.

Questo studio mira a verificare che un acido ialuronico modificato (legato alla parete batterica del ceppo di C. acnes) ? in grado di inattivare tossine/cataboliti prodotti da S. aureus.

A questo scopo, larve di Galleria mellonella sono state usate come un modello validato per lo studio di tossine batteriche.

(Cutuli, M. A., Petronio Petronio, G., Vergalito, F., Magnifico, I., Pietrangelo, L., Venditti, N., & Di Marco, R. (2019). Galleria mellonella as a consolidated in vivo model hosts: new developments in antibacterial strategies and novel drug testing. Virulence, 10(1), 527-541.

Champion, O. L., Wagley, S., & Titball, R. W. (2016). Galleria mellonella as a model host for microbiological and toxin research. Virulence, 7(7), 840-845.) Materiali e metodi

I ceppi di S. aureus BAA1680 e S. aureus ATCC 29213 sono stati riattivati in brodo di soia triptico (TBS) e fatti crescere per una notte a 37 ?C fino a raggiungere una densit? batterica di 109 CFU/ml determinata usando la spettrofotometria (OD 600). La coltura in brodo ? stata centrifugata a 4 ?C per 20 minuti a 16000 rpm. Successivamente, il surnatante ? stato filtrato (0,22 ?m) per assicurare la completa eliminazione delle cellule batteriche.

La presenza della tossina ? stata valutata mediante un saggio di proteina Bradford, usando TSB privo di batteri come controllo negativo.

Il surnatante ? stato prima diluito in soluzione salina in un rapporto di 1:2 e successivamente miscelato con la parete cellulare batterica di C. acnes DSM 28251 associata ad acido ialuronico (1:5 v/v). Tutte le sospensioni ottenute sono state incubate a 37 ?C per 1 ora e 4 ore. Dopo l'incubazione, tutte le sospensioni sono state centrifugate a 4 ?C per 20 minuti a 16000 rpm per recuperare solo i surnatanti usati nei successivi test in vitro e in vivo.

Le larve sono state selezionate in base al peso e alle dimensioni e suddivise in 5 gruppi sperimentali (consistenti in 20 provini), ciascuno trattato con le sospensioni precedentemente ottenute. L'inoculazione ? stata effettuata attraverso un'iniezione, usando un erogatore a ripetizione dotato di siringhe da insulina (BD, Wellington) e un ago ultrafine da 1 ml, attraverso la falsa zampa posteriore delle larve. Dopo l'iniezione, le larve per ciascuna condizione sono state incubate in una capsula di Petri a 35 ?C, e la sopravvivenza ? stata osservata nelle successive 96 ore.

Risultati

I risultati ottenuti dal monitorare la sopravvivenza di larve inoculate con il surnatante a contatto con surnatante di parete cellulare batterica di C. acnes DSM 28251 associata ad acido ialuronico a contatto con parete cellulare batterica di C. acnes DSM 28251 associata ad acido ialuronico hanno mostrato un tasso di sopravvivenza superiore rispetto a larve inoculate con il mezzo non trattato contenente cataboliti.

Questi risultati dimostrano che la parete cellulare batterica di C. acnes DSM 28251 associata ad acido ialuronico potrebbe interferire con i meccanismi patologici associati alle tossine prodotte da S. aureus.

Claims (10)

RIVENDICAZIONI

1. Una parete cellulare batterica o sua frazione o suo lisato associata a mucopolisaccaride in cui il ceppo batterico ? Cutibacterium acnes depositato con numero di accesso DSM 28251 presso l'International Deposit Authority Leibniz-Institut DSMZ.

2. La parete cellulare batterica secondo la rivendicazione 1 in cui il mucopolisaccaride ? selezionato da eparina/eparan solfato; condroitin solfato/dermatan solfato; cheratan solfato; acido ialuronico e chitosano.

3. La parete cellulare batterica secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il mucopolisaccaride ? selezionato da acido ialuronico, condroitin-4-solfato, condroitin-6-solfato, dermatan solfato, chitosano, eparina solfato, eparina, cheratan solfato e loro sali fisiologicamente accettabili e preferibilmente ? acido ialuronico o un suo sale.

4. La parete cellulare batterica o sua frazione o suo lisato associata a mucopolisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 per uso come medicinale.

5. Una composizione comprendente una quantit? efficace di una parete cellulare batterica o sua frazione o suo lisato associata a mucopolisaccaride secondo la rivendicazione 1 e un veicolo fisiologicamente accettabile.

6. La composizione secondo la rivendicazione 5 per uso topico in cui la composizione ? nella forma di una crema, una schiuma, un unguento, una pasta, una polvere, un gel, una soluzione, un ovulo, una lavanda o un?emulsione.

7. La parete cellulare batterica o sua frazione o suo lisato associata a mucopolisaccaride secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 o la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-6 per uso nella prevenzione o nel trattamento di una malattia immunologica della pelle o delle mucose.

8. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 7 in cui la malattia immunologica della pelle o delle mucose ? una malattia allergica, una malattia autoimmune, una malattia infiammatoria o una malattia infettiva della pelle.

9. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 8 in cui la malattia della pelle ? eczema, dermatite atopica, acne, dermatite seborroica, rosacea, psoriasi, eritema o eruzione cutanea.

10. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 8 in cui la malattia infettiva ? un'infezione batterica o fungina della pelle o delle mucose, specialmente infezione da Candida o una malattia ginecologica preferibilmente selezionata da vaginite, infezione e/o infiammazione vaginale.