JP2024505253A - 遺伝子操作された細菌中でのタンパク質発現を増加させるための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、特に、治療的タンパク質を発現する微生物、1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、1以上の酸化防止剤、1以上の脂肪アルコール、ならびにコロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物を含む組成物および組成物を作製するための方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、2021年2月1日に出願された米国仮特許出願第63/144,076号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。2022年1月31日に作成された、前記ASCIIコピーは、129062-02020_SL.txtと命名され、45,460バイトのサイズである。

技術分野
本開示は、遺伝子操作された細菌中でのタンパク質発現を増加させるための方法、キット、および組成物に関する。

タンパク質またはペプチドの標的化された送達系として遺伝子操作された細菌を使用する適用における最近の向上は、治療剤として魅力的になってきている。この種類の遺伝子操作された細菌は、組換えプロバイオティック細菌と呼ばれることもある(US 2018/0161380 A1、A.M. Munivarら、US 2018/0135062 A1、T. Wirthら、WO 2017/044836 A1、T. Hitchcockら、WO 2017/147507 A1、T. Hitchcockら)。他の例としては、治療的価値を有する天然生成物を産生する細菌株が挙げられる(WO 2019/046801 A1、R.L. Galloら)。

この領域における製剤の現在の状況（技術水準）は、凍結乾燥または凍結-乾燥された細菌を、カプセルまたはクリーム中に入れることを伴う。カプセルは、粘膜または液体中に溶解するが、クリームは、標的領域に直接塗布することができる。

タンパク質発現を増加させ、目的のタンパク質を継続的に発現する遺伝子操作された細菌を含む組成物の改良された製剤を開発することが依然として必要である。

US 2018/0161380 A1 US 2018/0135062 A1 WO 2017/044836 A1 WO 2017/147507 A1 WO 2019/046801 A1

一態様によれば、本開示は、1以上の生きている微生物および第1の混合物を含む組成物であって、1以上の微生物が治療剤を産生し、第1の混合物が1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、および1以上の酸化防止剤を含み、少なくとも1x10¹⁰CFU/gの生存能力を有する、組成物を提供する。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、1以上の脂肪アルコールまたはアルコールをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、ラクトース、トレハロース、スクロース、マルトース、およびセロビオースからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、1以上のオリゴ糖は、フルクト-オリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、マンナンオリゴ糖(MOS)、イソマルト-オリゴ糖、キシロ-オリゴ糖、ガラクト-オリゴ糖、およびラフィノースからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、1以上の酸化防止剤は、アスコルビン酸、ビタミンA、ビタミンE、a-カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、および親油性酸化防止剤の水溶性誘導体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、親油性酸化防止剤の水溶性誘導体は、アルファ-トコフェロールリン酸またはアルファ-トコフェロールポリエチレングリコールエステルである。

いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類はラクトースであり、1以上のオリゴ糖はフルクト-オリゴ糖(FOS）であり、1以上の酸化防止剤はアスコルビン酸である。

いくつかの実施形態によれば、1以上の脂肪アルコールは、飽和脂肪アルコールおよび不飽和脂肪アルコールからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、飽和脂肪またはアルコール酸は、セチルアルコールであり、不飽和脂肪アルコールは、オレイルアルコールである。いくつかの実施形態によれば、オレイルアルコールとセチルアルコールとの混合物は、約25%のオレイルアルコール/75%のセチルアルコールから約50%のオレイルアルコール/50%のセチルアルコール(w/w)の範囲である。

いくつかの実施形態によれば、第2の混合物は、約1:1の比のオレイルアルコールおよびセチルアルコールを含む。

いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、約50%(w/w)～約55%(w/w)であり、1以上のオリゴ糖は、約10%(w/w)～約15%(w/w)であり、1以上の酸化防止剤は、約0.1%(w/w)～約2%(w/w)であり、1以上の微生物は、約30%(w/w)～約35%(w/w)である。

いくつかの実施形態によれば、微生物および第1の混合物の組成物は、約10:1の比であり、第2の混合物は、前記1以上の脂肪アルコールを含む。

いくつかの実施形態によれば、第2の混合物は、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、第2の混合物は、脂肪アルコールと組み合わせた場合、約1%(wt/wt)のコロイド性オートミールおよび約0.5%(wt/wt)のアルカリ性オートミール抽出物を含む。

いくつかの実施形態によれば、微生物は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、オエノコッカス(Oenococcus)、またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)およびその混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、微生物は、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)である。

いくつかの実施形態によれば、治療剤は、微生物によって天然に産生される。いくつかの実施形態によれば、微生物は、治療剤を産生するように遺伝子操作されている。

いくつかの実施形態によれば、治療剤は、ポリペプチド、低分子、および代謝物から選択される。

いくつかの実施形態によれば、治療剤は、1以上のLEKTIタンパク質ドメイン、フィラグリン、インターフェロン、エンケファリン、インターロイキン、および抗微生物剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、1以上のLEKTIタンパク質ドメインは、LEKTI-d6である。

いくつかの実施形態によれば、1以上の抗微生物剤は、キチナーゼ、グルカナーゼ、またはペプチドグリカンヒドロラーゼからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、微生物は、栄養要求性によって弱毒化される。いくつかの実施形態によれば、微生物は、D-アラニン栄養要求株である。いくつかの実施形態によれば、微生物は、alr1、alr2、およびdat遺伝子のうちの1以上の欠失を含む。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、哺乳動物の皮膚に投与される。

いくつかの実施形態によれば、治療剤の発現は、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、増加する。

いくつかの実施形態によれば、治療剤の発現は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、または少なくとも13倍である。いくつかの実施形態によれば、治療剤の発現は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも5倍である。いくつかの実施形態によれば、治療剤の発現は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも10倍である。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、少なくとも2.5x10¹⁰CFU/g、少なくとも5x10¹⁰CFU/g、少なくとも1x10¹¹CFU/g、少なくとも2.5x10¹¹CFU/g、少なくとも5x10¹¹CFU/g、少なくとも1x10¹²CFU/g、または少なくとも2.5x10¹²CFU/gの生存能力を有する。いくつかの実施形態によれば、組成物は、約1x10¹⁰CFU/g～約1x10¹¹CFU/g、約5x10¹⁰CFU/g～約5x10¹¹CFU/g、約1x10¹¹CFU/g～約1x10¹²CFU/g、または約5x10¹¹CFU/g～約5x10¹²CFU/gの生存能力を有する。

いくつかの実施形態によれば、抗微生物活性は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、または少なくとも5倍である。いくつかの実施形態によれば、抗微生物活性は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、または少なくとも12倍である。

いくつかの実施形態によれば、LEKTIタンパク質ドメイン活性は、8時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、または少なくとも5倍である。いくつかの実施形態によれば、LEKTIタンパク質ドメイン活性は、24時間後に、第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、または少なくとも12倍である。

別の態様によれば、本開示は、本明細書に開示される組成物のいずれか1つ、および製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、製薬上許容し得る担体は、水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される。

別の態様によれば、本開示は、本明細書に開示される組成物のいずれか1つまたは本明細書に開示される医薬組成物のいずれか1つを調製するための方法であって、(a)1以上の微生物と、第1の混合物とを組み合わせるステップ、ここで前記第1の混合物は、1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、および1以上の酸化防止剤を含むものである;(b)ステップ(a)の結果、得られる組成物を凍結乾燥するステップ;および(c)1以上の脂肪アルコールを含む第2の混合物と、ステップ(b)の結果、得られる凍結乾燥組成物とを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。

別の態様によれば、本開示は、対象における疾患、障害、または状態を処置する方法であって、対象に、本明細書に開示される組成物のいずれか1つまたは本明細書に開示される医薬組成物のいずれか1つを投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態によれば、疾患、障害、または状態は、皮膚疾患または障害、炎症疾患、およびがんである。

いくつかの実施形態によれば、皮膚疾患または障害は、ネザートン症候群、乾癬、にきび、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥肌、アレルギー、発疹、UV刺激性皮膚、洗剤刺激性皮膚、皮膚菲薄化、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑、脱毛症、および/または多毛症である。

いくつかの実施形態によれば、疾患または障害は、疼痛と関連し、急性疼痛、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、外傷性疼痛、炎症性疼痛、術後切断痛、がんと関連する疼痛、骨折痛、骨粗鬆症性疼痛、骨肉腫疼痛、および痛風関節痛からなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、がんは、悪性黒色腫、結腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、口腔舌扁平上皮癌、扁平上皮がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、脳腫瘍および口腔がんからなる群から選択される。

別の態様によれば、本開示は、微生物による治療剤の発現を増加させる方法であって、(a)1以上の微生物と、1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、および1以上の酸化防止剤を含む第1の混合物とを組み合わせるステップ;(b)ステップ(a)の結果、得られる組成物を凍結乾燥するステップ;および(c)1以上の脂肪アルコールを含む第2の混合物と、ステップ(b)の結果、得られる凍結乾燥組成物とを組み合わせるステップを含む、本明細書に開示される組成物のいずれか1つまたは本明細書に開示される医薬組成物のいずれか1つを調製することを含む、方法を提供する。

図１は、液体培養物中でのSE27a増殖(図1A～1D)およびLEKTI-d6産生(図1E～1H)に対する培地製剤の効果を示すグラフを示す。SE27aの増殖は、(A)ASM培地、(B)TSB培地、(C)ASM+1%コロイド性オートミール(CO)および(D)ASM+0.5%コロイド性オートミール抽出物(COE)上に示されている。活性LEKTI産生は、(E)ASM培地、(F)TSB培地、(G)ASM+1%COおよび(H)ASM+0.5%COE上に示されている。 図１－１の続きである。 図2は、寒天プレート上での細菌増殖に対するコロイド性オートミール(CO)およびコロイド性オートミール抽出物(COE)の添加の効果を示すグラフを示す。 図3は、寒天プレート上での活性LEKTIレベルに対するコロイド性オートミール(CO)およびコロイド性オートミール抽出物(COE)の添加の効果を示すグラフを示す。 図4は、オレイルアルコール:セチルアルコール(OA:CA)、OA:CA+コロイド性オートミール(CO)およびOA:CA+コロイド性オートミール抽出物(COE)中で製剤化されたSE-27のASM寒天プレート上での細菌増殖の増殖を示すグラフを示す。 図5は、8時間にわたるASM寒天プレート上での増殖後の、オレイルアルコール:セチルアルコール(OA:CA)、OA:CA+コロイド性オートミール(CO)およびOA:CA+コロイド性オートミール抽出物(COE)中で製剤化されたSE-27aの活性LEKTI-d6産生を示すグラフを示す。 図6は、ブタ皮膚表面上での24hのインキュベーションにわたる、プラセボまたはオレイルアルコール:セチルアルコール(OA:CA)+コロイド性オートミール(CO)中で製剤化されたSE-27aの細菌含量を示すグラフを示す。 図7は、ブタ皮膚表面上での24hのインキュベーションにわたる、プラセボまたはオレイルアルコール:セチルアルコール(OA:CA)+コロイド性オートミール(CO)中で製剤化されたSE-27aの活性LEKTI-d6レベルを示すグラフを示す。 図8Aは、1%コロイド性オートミールの存在下または非存在下の(ASM)2%D-アラニンを含有する人工汗培地中でのSE484の増殖を示すグラフを示す。図8Bは、枯草菌(Bacillus subtilis)に対するSE484使用済みブロスの抗微生物活性を示すグラフを示す。示される時点は、使用済み培地が収集された増殖の時間に対応し、より高いMIC値は、より強力な抗微生物活性に対応する。 図9A～9Cは、1%コロイド性オートミール(w/w)および2%D-アラニン(w/w)を添加したオレイルアルコール:セチルアルコール1:1(w/w)中で製剤化され、10⁶(図9A)、10⁷(図9B)および10⁸(図9C)CFU/cm²でex vivoでブタ皮膚上に塗布された、SE351による増殖および活性LEKTI産生を示すグラフを示す。示される時間は、30℃での皮膚インキュベーション期間を表す。点線は、プラセボ試料中で見られた平均CFU/cm²(上側)およびLEKTI活性(下側)を表す。

本開示は、投与時に細菌生成物を安定化し、タンパク質発現を増加させるように設計された非水性組成物中で製剤化された微生物生成物に関する。いくつかの実施形態によれば、乾燥態様の組成物は、保存のために組成物を安定化するように作用する。いくつかの実施形態によれば、組成物は、疾患または障害の処置における対象への微生物生成物の投与後にタンパク質発現を増加させる。

本開示の一態様は、疾患または障害、例えば、皮膚疾患または障害、炎症疾患、およびがんを処置または改善するための組換えタンパク質を発現するように遺伝的に変化させた表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)の組換えタンパク質のタンパク質発現を増加させる組成物を提供する。

本明細書で使用される用語「皮膚疾患」およびその文法的変形は、ヒトの皮膚の正常な、またはベースライン状態と比較して一般的に望ましくない、または有害である皮膚状態または状態を意味する。異常な皮膚状態の例としては、限定されるものではないが、ネザートン症候群、乾癬、にきび、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥肌、アレルギー、発疹、UV刺激性皮膚、洗剤刺激性皮膚（酵素および洗浄用洗剤において使用される分子およびラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む）、皮膚菲薄化（例えば、高齢者および小児に由来する皮膚）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑、脱毛症、および多毛症が挙げられる。

本明細書で使用される用語「遺伝的に改変された」およびその文法的変形は、微生物の外部で調製されたDNAの導入によって遺伝的に改変された、または操作された微生物（例えば、細菌）を記述するために使用される。例えば、新しい遺伝子を含有するプラスミドDNAの、細菌への導入により、細菌はこれらの遺伝子を発現することができる。あるいは、新しい遺伝子を含有するDNAを細菌に導入した後、細菌のゲノム中に組み込むことができ、そこで細菌はこれらの遺伝子を発現するであろう。

本明細書で使用される場合、用語「微生物」または「組換え微生物」とは、その天然状態から遺伝的に改変された微生物、例えば、細菌細胞を指す。かくして、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」とは、その天然状態から遺伝的に改変された細菌細胞または細菌を指す。例えば、組換え細菌細胞は、そのDNA中に導入された、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再配置、およびヌクレオチド改変を有してもよい。これらの遺伝子改変は、細菌または細菌細胞の染色体中に存在してもよい。組換え細菌細胞は、その染色体中に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含んでもよい。

本明細書で使用される用語「処置する（治療する）」、「処置すること（治療すること）」、「処置（治療）」およびその文法的変形は、対象、例えば、患者において生理的応答または転帰を得るのに望ましいプロトコール、レジメン、プロセスまたは治療をその対象に提供することを意味する。特に、本発明の方法および組成物を使用して、疾患症状の発達を減速するか、または疾患もしくは状態の開始を遅延させるか、または疾患発達の進行を停止させることができる。しかしながら、全ての処置された対象が特定の処置プロトコール、レジメン、プロセスまたは治療に応答するわけではない可能性があるため、処置は、所望の生理的応答または転帰がありとあらゆる対象または対象集団、例えば、患者集団において達成されることを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば、患者集団は、処置に対して応答しない可能性があるか、または不十分に応答する可能性がある。

本発明においては、対象は哺乳動物であってもよい。本明細書で使用される場合、「哺乳動物」およびその文法的変形は、任意のカテゴリーの哺乳動物を意味する。本発明においては、哺乳動物としては、例えば、ヒト、農業用動物、家畜、実験動物などが挙げられる。農業用動物のいくつかの例としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが挙げられる。家畜のいくつかの例としては、イヌ、ネコなどが挙げられる。実験動物のいくつかの例としては、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される化合物または組成物の「有効量」または「治療上有効量」という用語は、対象に投与した場合に本明細書に記載されるような有益な、または望ましい結果をもたらすのに十分であるそのような化合物または組成物の量である。有効な剤形、投与様式、および投与量は、経験的に決定することができ、そのような決定は、当業者の技術の範囲内にある。当業者であれば、投与量が投与経路、排出速度、処置の持続期間、投与される任意の他の薬物の同一性、哺乳動物、例えば、ヒト患者の年齢、大きさ、および種、ならびに医学および獣医学の分野で周知の同様の因子に応じて変化することを理解できる。一般に、本発明による組成物の好適な用量は、所望の効果をもたらすのに有効な最低用量である、組成物のその量であろう。本発明の組成物の有効用量を、1日を通して適切な間隔で別々に投与される、2、3、4、5、6以上のサブ用量として投与してもよい。

本明細書で使用される場合、用語「約」は一般的に、特定の使用の文脈内で記述される数値より1.5%大きい、または1.5%小さいものであってよい範囲を指す。例えば、「約5」は、3.5～6.5の範囲を含むであろう。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、生きている微生物と、1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、および1以上の酸化防止剤の混合物とを含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、1以上の脂肪アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物をさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明における使用にとって好適な細菌としては、限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、またはオエノコッカス(Oenococcus)およびその混合物が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、微生物組成物は、スタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、コリネバクテリウム種(Corynebacterium spp.)、アシネトバクター・ジョンソニイ(Acinetobacter johnsonii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のうちの1種以上を含む。いくつかの実施形態によれば、皮膚上に見出される他の関連するか、または類似する種が使用される。特定の実施形態は、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)細菌の使用を含む。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、ラクトース、トレハロース、スクロース、マルトース、およびセロビオースからなる群から選択される1以上の二糖類の混合物を含む。いくつかの実施形態によれば、1以上のオリゴ糖は、フルクト-オリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、マンナンオリゴ糖(MOS)、イソマルト-オリゴ糖、キシロ-オリゴ糖、ガラクト-オリゴ糖、およびラフィノースからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、アスコルビン酸、ビタミンA、ビタミンE、a-カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、および親油性酸化防止剤の水溶性誘導体、例えば、アルファ-トコフェロールリン酸、アルファ-トコフェロールポリエチレングリコールエステルからなる群から選択される1以上の酸化防止剤を含む。一実施形態によれば、二糖類はラクトースであり、オリゴ糖はフルクト-オリゴ糖であり、酸化防止剤はアスコルビン酸である。

いくつかの実施形態によれば、微生物は、二糖類、オリゴ糖、および酸化防止剤と混合され、組成物は、飽和脂肪アルコールおよび不飽和脂肪アルコールからなる群から選択される1以上の脂肪アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、飽和脂肪アルコールは、セチルアルコールであり、不飽和脂肪アルコールは、オレイルアルコールである。いくつかの実施形態によれば、セチルアルコールおよびオレイルアルコールは、1:1の比である。

いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、約20%(w/w)、約25%(w/w)、約30%(w/w)、約35%(w/w)、約40%(w/w)、約45%(w/w)、約50%(w/w)、約55%(w/w)、または約60%(w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、約20%(w/w)～約30%(w/w)、約25%(w/w)～約35%(w/w)、約30%(w/w)～約40%(w/w)、約35%(w/w)～約45%(w/w)、約40%(w/w)～約50%(w/w)、約45%(w/w)～約55%(w/w)、または約50%(w/w)～約60%(w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、少なくとも20% (w/w)、少なくとも25% (w/w)、少なくとも30% (w/w)、少なくとも35% (w/w)、少なくとも40% (w/w)、少なくとも45% (w/w)、少なくとも50% (w/w)、少なくとも55% (w/w)、または少なくとも60% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の二糖類は、20% (w/w)以下、25% (w/w)以下、30% (w/w)以下、35% (w/w)以下、40% (w/w)以下、45% (w/w)以下、50% (w/w)以下、55% (w/w)以下、または60% (w/w)以下である。

いくつかの実施形態によれば、1以上のオリゴ糖は、約5% (w/w)、約6% (w/w)、約7% (w/w)、約8% (w/w)、約9% (w/w)、約10% (w/w)、約11% (w/w)、約12% (w/w)、約13% (w/w)、約14% (w/w)、約15% (w/w)、約16% (w/w)、約17% (w/w)、約18% (w/w)、約19% (w/w)、または約20% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上のオリゴ糖は、約5%(w/w)～約20%(w/w)、約5%(w/w)～約15%(w/w)、約5%(w/w)～約10%(w/w)、約10%(w/w)～約20%(w/w)、約10%(w/w)～約15%(w/w)、または約15%(w/w)～約20%(w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上のオリゴ糖は、少なくとも5% (w/w)、少なくとも6% (w/w)、少なくとも7% (w/w)、少なくとも8% (w/w)、少なくとも9% (w/w)、少なくとも10% (w/w)、少なくとも11% (w/w)、少なくとも12% (w/w)、少なくとも13% (w/w)、少なくとも14% (w/w)、少なくとも15% (w/w)、少なくとも16% (w/w)、少なくとも17% (w/w)、少なくとも18% (w/w)、少なくとも19% (w/w)、または少なくとも20% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の食物源オリゴ糖は、5% (w/w)以下、6% (w/w)以下、7% (w/w)以下、8% (w/w)以下、9% (w/w)以下、10% (w/w)以下、11% (w/w)以下、12% (w/w)以下、13% (w/w)以下、14% (w/w)以下、15% (w/w)以下、16% (w/w)以下、17% (w/w)以下、18% (w/w)以下、19% (w/w)以下、または20% (w/w)以下である。

いくつかの実施形態によれば、1以上の酸化防止剤は、約0.1% (w/w)、約0.2% (w/w)、約0.3% (w/w)、約0.4% (w/w)、約0.5% (w/w)、約0.6% (w/w)、約0.7% (w/w)、約0.8% (w/w)、約0.9% (w/w)、約1.0% (w/w)、約1.1% (w/w)、約1.2% (w/w)、約1.3% (w/w)、約1.4% (w/w)、約1.5% (w/w)、約1.6% (w/w)、約1.7% (w/w)、約1.8% (w/w)、約1.9% (w/w)、または約2.0% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の酸化防止剤は、約0.1% (w/w)～約2.0% (w/w)、約0.1% (w/w)～約1.5% (w/w)、約0.1% (w/w)～約1.0% (w/w)、約0.1% (w/w)～約0.5% (w/w)、約0.5% (w/w)～約2.0% (w/w)、約0.5% (w/w)～約1.5% (w/w)、約0.5% (w/w)～約1.0% (w/w)、約1.0% (w/w)～約2.0% (w/w)、または約1.0% (w/w)～約1.5% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の酸化防止剤は、少なくとも0.1% (w/w)、少なくとも0.2% (w/w)、少なくとも0.3% (w/w)、少なくとも0.4% (w/w)、少なくとも0.5% (w/w)、少なくとも0.6% (w/w)、少なくとも0.7% (w/w)、少なくとも0.8% (w/w)、少なくとも0.9% (w/w)、少なくとも1.0% (w/w)、少なくとも1.1% (w/w)、少なくとも1.2% (w/w)、少なくとも1.3% (w/w)、少なくとも1.4% (w/w)、少なくとも1.5% (w/w)、少なくとも1.6% (w/w)、少なくとも1.7% (w/w)、少なくとも1.8% (w/w)、少なくとも1.9% (w/w)、または少なくとも2.0% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の酸化防止剤は、0.1% (w/w)以下、0.2% (w/w)以下、0.3% (w/w)以下、0.4% (w/w)以下、0.5% (w/w)以下、0.6% (w/w)以下、0.7% (w/w)以下、0.8% (w/w)以下、0.9% (w/w)以下、1.0% (w/w)以下、1.1% (w/w)以下、1.2% (w/w)以下、1.3% (w/w)以下、1.4% (w/w)以下、1.5% (w/w)以下、1.6% (w/w)以下、1.7% (w/w)以下、1.8% (w/w)以下、1.9% (w/w)以下、または2.0% (w/w)以下である。

いくつかの実施形態によれば、1以上の微生物は、約20% (w/w)、約25% (w/w)、約30% (w/w)、約35% (w/w)、約40% (w/w)、または約45% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の微生物は、約20% (w/w)～約45% (w/w)、約20% (w/w)～約40% (w/w)、約20% (w/w)～約35% (w/w)、約20% (w/w)～約30% (w/w)、約20% (w/w)～約25% (w/w)、約25% (w/w)～約45% (w/w)、約25% (w/w)～約40% (w/w)、約25% (w/w)～約35% (w/w)、約25% (w/w)～約30% (w/w)、約30% (w/w)～約45% (w/w)、約30% (w/w)～約40% (w/w)、約30% (w/w)～約35% (w/w)、約35% (w/w)～約45% (w/w)、約35% (w/w)～約40% (w/w)、または約40% (w/w)～約45% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の微生物は、少なくとも20% (w/w)、少なくとも25% (w/w)、少なくとも30% (w/w)、少なくとも35% (w/w)、少なくとも40% (w/w)、または少なくとも45% (w/w)である。いくつかの実施形態によれば、1以上の微生物は、20% (w/w)以下、25% (w/w)以下、30% (w/w)以下、35% (w/w)以下、40% (w/w)以下、45% (w/w)以下である。

いくつかの実施形態によれば、組成物の微生物は、少なくとも2.5x10¹⁰CFU/g、少なくとも5x10¹⁰CFU/g、少なくとも1x10¹¹CFU/g、少なくとも2.5x10¹¹CFU/g、少なくとも5x10¹¹CFU/g、少なくとも1x10¹²CFU/g、少なくとも2.5x10¹²CFU/g、または少なくとも5x10¹²CFU/gの生存能力を有する。いくつかの実施形態によれば、組成物の微生物は、約2.5x10¹⁰CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g、約 2.5 x 10¹¹ CFU/g、約5 x 10¹¹ CFU/g、約 1 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹² CFU/g、または約5 x 10¹² CFU/gの生存能力を有する。いくつかの実施形態によれば、組成物の微生物は、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約2.5 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g ～約1 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約5 x 10¹¹ CFU/g、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約2.5 x 10¹¹ CFU/g、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約1 x 10¹¹ CFU/g、2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約5 x 10¹⁰ CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g～約2.5 x 10¹² CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g ～約1 x 10¹² CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g～約5 x 10¹¹ CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g～約2.5 x 10¹¹ CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g～約1 x 10¹¹ CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g～約2.5 x 10¹² CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g ～約1 x 10¹² CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g～約5 x 10¹¹ CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g～約2.5 x 10¹¹ CFU/g、約2.5 x 10¹¹ CFU/g～約2.5 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹¹ CFU/g ～約1 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹¹ CFU/g～約5 x 10¹¹ CFU/g、約5 x 10¹¹ CFU/g～約2.5
x 10¹² CFU/g、約5 x 10¹¹ ～約1 x 10¹² CFU/g、約1 x 10¹² CFU/g～約2.5 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹⁰ CFU/g～約5 x 10¹² CFU/g、約5 x 10¹⁰ CFU/g ～約5 x 10¹² CFU/g、約1 x 10¹¹ CFU/g～約5 x 10¹² CFU/g、約2.5 x 10¹¹ CFU/g～約5 x 10¹² CFU/g、約5 x 10¹¹ CFU/g～約5 x 10¹² CFU/g、または約1 x 10¹² CFU/g～約5 x 10¹² CFU/gの生存能力を有する。

いくつかの実施形態によれば、微生物、二糖類、オリゴ糖、および酸化防止剤の混合物は、脂肪アルコールの混合物と約10:1の比である。いくつかの実施形態によれば、微生物、二糖類、オリゴ糖、および酸化防止剤の混合物と、脂肪アルコール混合物との比は、約8:1、約9:1、約10:1、または約11:1である。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物は、脂肪アルコールと混合される。いくつかの実施形態によれば、コロイド性オートミールは、約0.1% (wt/wt)、約0.5% (wt/wt)、約1.0% (wt/wt)、約1.5% (wt/wt)、または約2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、コロイド性オートミールは、約0.1% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約1.0% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約0.5% (wt/wt)、0.5% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)、約0.5% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、0.5% (wt/wt)～約1.0% (wt/wt)、約1.0%～約2.0% (wt/wt)、約1.0% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、または約1.5% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、コロイド性オートミールは、少なくとも0.1% (wt/wt)、少なくとも0.5% (wt/wt)、少なくとも1.0% (wt/wt)、少なくとも1.5% (wt/wt)、または少なくとも2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、コロイド性オートミールは、0.1% (wt/wt)以下、0.5% (wt/wt)以下、1.0% (wt/wt)以下、1.5% (wt/wt)以下、または2.0% (wt/wt)以下である。

いくつかの実施形態によれば、アルカリ性オートミール抽出物は、約0.1% (wt/wt)、約0.5% (wt/wt)、約1.0% (wt/wt)、約1.5% (wt/wt)、または約2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、アルカリ性オートミール抽出物は、約0.1% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約1.0% (wt/wt)、約0.1% (wt/wt)～約0.5% (wt/wt)、0.5% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)、約0.5% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、0.5% (wt/wt)～約1.0% (wt/wt)、約1.0%～約2.0% (wt/wt)、約1.0% (wt/wt)～約1.5% (wt/wt)、または約1.5% (wt/wt)～約2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、アルカリ性オートミール抽出物は、少なくとも0.1% (wt/wt)、少なくとも0.5% (wt/wt)、少なくとも1.0% (wt/wt)、少なくとも1.5% (wt/wt)、または少なくとも2.0% (wt/wt)である。いくつかの実施形態によれば、アルカリ性オートミール抽出物は、0.1% (wt/wt)以下、0.5% (wt/wt)以下、1.0% (wt/wt)以下、1.5% (wt/wt)以下、または2.0% (wt/wt)以下である。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、二糖類、オリゴ糖、酸化防止剤および生きている微生物を第1の混合物中で組み合わせること、ならびにその混合物を凍結乾燥することによって調製される。いくつかの実施形態によれば、二糖類、オリゴ糖、酸化防止剤および生きている微生物を含む凍結乾燥された第1の混合物は、脂肪アルコール、例えば、オレイルアルコールおよびセチルアルコールと組み合わされる。いくつかの実施形態によれば、脂肪アルコールは、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物をさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、脂肪アルコールおよび/またはコロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物を含まない組成物と比較した場合、増加したタンパク質発現を提供する。いくつかの実施形態によれば、脂肪アルコールおよび/またはコロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物を含まない組成物と比較した場合のタンパク質発現の増加倍率は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、または約15倍である。

いくつかの実施形態によれば、組成物は、脂肪アルコールおよび/またはコロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物を含まない組成物と比較した場合、発現されたタンパク質のタンパク質活性の増加を提供する。いくつかの実施形態によれば、脂肪アルコールおよび/またはコロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物を含まない組成物と比較した場合の発現されたタンパク質のタンパク質活性の増加倍率は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、または約15倍である。

いくつかの実施形態によれば、本発明による使用のための組成物は、治療有効量の所望のポリペプチドまたはその治療上有効なドメインを産生する製薬上有効量の組換え細菌、例えば、少なくとも約0.01重量%、約0.05重量%、約0.1重量%、約0.2重量%、約0.3重量%、約0.4重量%、約0.5重量%、約0.6重量%、約0.7重量%、約0.8重量%、約0.9重量%、約1.0重量%、約1.5重量%、約2.0重量%、約3.0重量%、約4.0重量%、約5.0重量%、約6.0重量%、約7.0重量%、約8.0重量%、約9.0重量%、約10.0重量%、約11.0重量%、約12.0重量%、約13.0重量%、約14.0重量%、約15.0重量%、約16.0重量%、約17.0重量%、約18.0重量%、約19.0重量%、約20.0重量%、約25.0重量%、約30.0重量%、約35.0重量%、約40.0重量%、約45.0重量%、約50.0重量%以上の組換え細菌を含んでもよく、その上限は、約90.0重量%の組換え細菌である。

いくつかの実施形態によれば、本発明による使用のための組成物は、例えば、少なくとも約0.01重量%～約30重量%、約0.01重量%～約20重量%、約0.01重量%～約5重量%、約0.1重量%～約30重量%、約0.1重量%～約20重量%、約0.1重量%～約15重量%、約0.1重量%～約10重量%、約0.1重量%～約5重量%、約0.2重量%～約5重量%、約0.3重量%～約5重量%、約0.4重量%～約5重量%、約0.5重量%～約5重量%、約1重量%～約5重量%以上の組換え細菌を含んでもよい。

微生物および微生物組成物
遺伝的に変化したタンパク質産生微生物は、疾患もしくは障害またはその症状の根本にある原因を処置する治療的タンパク質を発現し、必要に応じて、分泌することによって疾患または障害を処置することができる。いくつかの実施形態によれば、治療的タンパク質は、LEKTIタンパク質ドメイン、フィラグリン、インターフェロン、またはインターロイキンである。

いくつかの実施形態によれば、治療的タンパク質は、哺乳動物の皮膚の中または上でセリンプロテアーゼを阻害するのに有効である1以上のLEKTIドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、組換えLEKTIドメインは、哺乳動物において天然に産生される内因性LEKTIタンパク質の欠陥を補う。いくつかの実施形態によれば、遺伝的に変化した細菌は、組換えタンパク質を産生する能力を保持しながら、自己複製し、それによって、治療剤の連続的供給をもたらすことができる。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、哺乳動物における標的部位で1以上のLEKTIタンパク質ドメインを発現し、もたらすように遺伝的に改変された微生物を含む、疾患または障害の処置のための微生物生成物のための組成物であって、LEKTIタンパク質ドメインが、哺乳動物の皮膚の1以上の層を透過するのに有効であり、哺乳動物の皮膚の中または上で少なくとも1つのセリンプロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害するのに有効である、組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「栄養要求性の」または「栄養要求性」とは、生物がその増殖にとって必要とされる特定の化合物を合成することができないことを指す。栄養要求株は、この特徴を示す生物である。

本明細書で使用される場合、用語「alrA」および「alr」とは、alrA遺伝子の正常なアレルを含む、D-アラニンラセマーゼ遺伝子を指す。いくつかの実施形態においては、S.epidermidisに由来するalr遺伝子(UniProtKB-Q8CNK7 (ALR_STAES)は、D-アラニンラセマーゼタンパク質(EC5.1.1.1)をコードする。いくつかの実施形態においては、遺伝子座識別子SE1674(alrl)およびSE1079(alr2)は、特定のS. epidermidisのD-アラニンラセマーゼ遺伝子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「dat」とは、dat遺伝子の正常なアレルを含む、D-アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子を指す。いくつかの実施形態においては、S.epidermidisに由来するdat遺伝子(UniProtKB-Q8CS41 (DAAA_STAES))は、D-アラニンアミノトランスフェラーゼタンパク質(EC:2.6.1.21)をコードする。いくつかの実施形態においては、遺伝子座識別子SE1423(dat)は、特定のS. epidermidisのD-アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、用語「murI」とは、murI遺伝子の正常なアレルを含む、グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を指す。いくつかの実施形態においては、S. epidermidisに由来するmurI遺伝子(UniProtKB - Q8CPL0 (MURI_STAES))は、グルタミン酸ラセマーゼタンパク質(EC:5.1.1.3)をコードする。いくつかの実施形態においては、遺伝子座識別子SE0843(murI)は、特定のS. epidermidisのグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を指す。

S.aureusのD-アラニン栄養要求株はMRSAワクチンを生産する目的で生産された(Moscoso Mら、27th ECCMID 22-25 April 2017, The Congress of ESCMID (P0473); Moscosoら、Virulence (2018) Vol. 9(1): 604-620、それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする)。この場合、アラニンラセマーゼalr1だけでなく、dat遺伝子もノックアウトすることが必要であることが見出された。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、ヒトSPINK5遺伝子のLEKTIタンパク質(hLEKTI-d6)のドメイン6の分泌形態を発現する、その染色体中にDNAカセットを含有する組換え表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)株を提供する。その染色体中にこの発現カセットを担持する宿主株は、必須アミノ酸、D-アラニン[2つのアラニンラセマーゼ遺伝子(alr1およびalr2)およびD-アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子(dat)]の生合成に関与する3つの遺伝子の欠失を含有する株であるS. epidermidis株SE_ΔΔΔであり、この株をこのアミノ酸に対して栄養要求性にする。

いくつかの実施形態によれば、染色体hLEKTI-d6構築物株は、D-アラニン栄養要求性を補完するalrA遺伝子も含有するプラスミド構築物に由来する分泌型hLEKTI-d6タンパク質を発現するS. epidermidis SE_ΔΔΔである、別の株であるS. epidermidis 27aと比較して7つの異なる特性を有する。これらの特性は、1)D-アラニン添加を使用する増殖制御の尺度を提供する、SE_ΔΔΔのD-アラニン栄養要求性の保持;2)おそらく、染色体の組込み部位での遺伝的環境、hLEKTI-d6遺伝子発現を駆動するプロモーターの組合せの相乗効果に起因し得る分泌型hLEKTI-d6タンパク質の増強されたレベル(1;2)、濃い培養物中の菌体密度感知機構によって誘発される転写の活性化(3;4)、および/またはデルタ毒素遺伝子、hldの調節と関連する独自のDNAもしくはRNA構造(4)によって影響される、分泌型hLEKTI-d6タンパク質の予想外に増強された産生;ならびに3)染色体外遺伝子エレメント(プラスミド)上に担持されることに対する染色体に組み込まれた発現カセットの性質に起因する、発現カセットの安定性の潜在的な増強、および片利共生フローラへの水平伝播の可能性の減少を含む。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、哺乳動物の皮膚上での使用にとって好適な1以上の様々な細菌を含む微生物組成物を提供する。例としては、限定されるものではないが、非病原性細菌および片利共生細菌が挙げられる。本発明における使用にとって好適な細菌としては、限定されるものではないが、Bifidobacterium、Brevibacterium、Propionibacterium、Lactococcus、Streptococcus、Staphylococcus (例えば、S. epidermidisおよび/もしくはS. hominis)、Lactobacillus (例えば、L. acidophilus)、Pediococcus、Leuconostoc、またはOenococcusが挙げられる。いくつかの実施形態によれば、微生物組成物は、スタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、コリネバクテリウム種(Corynebacterium spp.)、アシネトバクター・ジョンソニイ(Acinetobacter johnsonii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のうちの1種以上を含む。いくつかの実施形態によれば、皮膚上に見出される他の関連するか、または類似する種が使用される。

特定の実施形態は、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)細菌の使用を含む。いくつかの実施形態によれば、使用されるS. epidermidisの株は、バイオフィルムを産生することができない。これの例は、S. epidermidis株ATCC 12228またはNRRL B-4268である。

いくつかの実施形態によれば、組換え微生物は、LEKTIタンパク質ドメインの連続的供給をもたらすために哺乳動物の皮膚の表面上で無制限に、または制御された期間にわたって生存するように適合化される。いくつかの実施形態では、組換え微生物は、哺乳動物の皮膚上に天然に存在する片利共生微生物と一緒に生存する。いくつかの実施形態では、組換え微生物は、哺乳動物の皮膚上に天然に存在する片利共生微生物を排除して生存する。いくつかの実施形態によれば、組換え微生物は、哺乳動物の皮膚上で増殖するように適合化される。他の実施形態では、組換え微生物は、最早生存していないが、有効量の治療的ポリペプチド、例えば、LEKTIまたは治療的に有効なそのドメインを含有する。そのような細胞は、治療的ペプチド（またはそのドメイン）を標的部位に送達する詳細に応じて、損傷を受けていないものであってもよく、またはそうでなくともよい。

本明細書で使用される用語「組換え」およびその文法的変形は、異なる供給源に由来する、または同じ供給源の異なる部分に由来するDNA片を含む組換えDNAによって、またはそれを使用して形成された、生物、タンパク質、または遺伝物質に関すること、またはそれを示すことを意味する。例えば、用語「組換えDNA」は、異なる供給源に由来する、または同じ供給源の異なる部分に由来するDNAの断片をスプライスするための組換え方法によって形成されたDNA分子を意味する。いくつかの実施形態では、DNAの2つ以上の異なる供給源を、制限酵素を使用して切断し、リガーゼを使用して一緒に連結する。別の例として、用語「組換えタンパク質」または「組換えドメイン」およびその文法的変形は、異なる供給源に由来する、または同じ供給源の異なる部分に由来するDNAのスプライスされた断片を起源とする組換え方法によって形成されたタンパク質分子を意味する。別の例として、用語「組換え微生物」または「組換え細菌」およびその文法的変形は、1以上の組換えDNA/タンパク質分子を含む微生物/細菌を意味する。

LEKTI遺伝子: いくつかの実施形態によれば、組換え微生物は、LEKTIタンパク質をコードする哺乳動物遺伝子を発現するように操作される。LEKTI遺伝子は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、イヌ、霊長類、またはヒトの遺伝子配列などの任意の哺乳動物から取得することができる。いくつかの実施形態によれば、LEKTI遺伝子配列は、ヒト遺伝子配列である。いくつかの実施形態によれば、組換え微生物は、LEKTI遺伝子の断片を含むように操作される。

いくつかの実施形態によれば、組換え微生物は、本明細書に列挙される配列番号のいずれか1つ以上に対する少なくとも約75%の同一性、または80%の同一性、または85%の同一性、または90%の同一性、または95%の同一性を有する、本明細書に開示される配列を含む。本明細書で使用される用語「同一性」およびその文法的変形は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、アラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度を意味する。同一性パーセント（%）は、配列アラインメントにおける一致数に100を乗じて、内部ギャップを含む、整列した領域の長さで割ることによって算出される。

いくつかの実施形態によれば、操作された微生物によって発現される組換えタンパク質は、LEKTIタンパク質の1以上のプロテアーゼ阻害ドメインを含む。いくつかの非限定例としては、ドメインD1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、およびD15のうちの1つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、操作された微生物によって発現される組換えタンパク質は、 LEKTI阻害ドメイン6またはドメインD8～D11を含む。

いくつかの実施形態によれば、LEKTIタンパク質ドメインは、ネザートン症候群の症状を改善するのに有効である。本明細書で使用される用語「改善する」、「改善すること」およびその文法的変形は、対象における疾患の症状の重症度を低下させることを意味する。いくつかの実施形態では、LEKTIタンパク質ドメインは、哺乳動物の皮膚の中または上に存在する1以上のプロテアーゼの競合的または非競合的インヒビターとして作用する。いくつかの実施形態では、LEKTIタンパク質ドメインは、セリンプロテアーゼインヒビターとして作用する。本明細書で使用される用語「プロテアーゼ」および「プロテイナーゼ」は互換的に使用され、両方の用語は、タンパク質溶解を行う酵素を指す。

いくつかの実施形態によれば、微生物は、LEKTIタンパク質ドメインをコードする組換えDNAプラスミドを用いたトランスフェクション/形質転換によって遺伝的に改変される。DNAを微生物に導入するための他の従来の、または発見すべき方法を、本発明において使用することもできる。いくつかの実施形態によれば、組換えDNAプラスミドは、LEKTIタンパク質ドメインならびに1以上の分泌ペプチドおよび/または細胞透過ペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態によれば、LEKTIドメインは、微生物からの分泌および/または哺乳動物の皮膚の透過を増強するのに有効である1以上の組換えタンパク質ドメインに機能し得る形で連結される。

本開示はまた、LEKTIのアレル変異体、またはその一部(ドメインD1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、およびD15の1つ以上)、ならびに例えば、組換えタンパク質の発現または活性を変化させるように改変されたSPINKの合成遺伝子または突然変異型遺伝子(例えば、SPINK5)にも関する。また、核酸コードの縮重性が、同じアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列における考慮された変化であり得ることも知られている。したがって、本開示は、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸残基を含む。当業者であれば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を構成する塩および温度の有効な組合せを決定することができる。また、LEKTIのオーソログが、他の種、例えば、イヌ、ヒツジ、ラット、ハムスター、ニワトリおよびブタにおいて存在することも想定される。したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号103に記載のLEKTIまたはその一部(ドメインD1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、およびD15の1つ以上)に対する少なくとも約70%～80%の同一性、好ましくは、90%～95%の同一性、より好ましくは、98%～99%の同一性を有するポリペプチドをコードするSPINK(例えば、SPINK5)核酸に関する。

いくつかの実施形態によれば、LEKTIドメインは、以下の表1および表2の非限定例から選択される。

いくつかの実施形態によれば、疾患または障害は、皮膚疾患、疼痛と関連する疾患または障害、がん、およびウイルス感染から選択される。いくつかの実施形態によれば、皮膚疾患は、掻痒症、酒さ、乾癬、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、およびネザートン症候群からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、疼痛と関連する疾患または障害は、急性疼痛、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、外傷性疼痛、炎症性疼痛、術後切断痛、がんと関連する疼痛、骨折痛、骨粗鬆症性疼痛、骨肉腫疼痛、および痛風関節痛からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、がんは、悪性黒色腫、結腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、口腔舌扁平上皮癌、扁平上皮がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、脳腫瘍および口腔がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染は、呼吸器感染、皮膚感染、および対象においてがんを引き起こすウイルス感染からなる群から選択される。

抗微生物剤: 本明細書で使用される用語「抗微生物剤」、「抗微生物タンパク質」または「抗微生物ポリペプチド」は、互換的に使用することができ、抗微生物活性、すなわち、細菌および/または真菌、例えば、グラム陽性およびグラム陰性細菌および真菌の増殖を阻害する、および/またはそれを殺傷する能力を有する任意の実体を指す。抗微生物剤は、抗微生物剤の非存在下と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、または70%より大きく、または30%～70%の任意の整数もしくはそれより大きく、細菌および/または真菌の増殖の阻害または生存能力の減少をもたらす任意の薬剤である。言い換えると、抗微生物剤は、抗微生物剤の非存在下と比較して、少なくとも約30%、少なくとも40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、または70%より大きく、または30%～70%の任意の整数、細菌および/または真菌細胞の集団を減少させる任意の薬剤である。一実施形態では、抗微生物剤は、細菌細胞を特異的に標的化する薬剤である。別の実施形態では、抗微生物剤は、細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変する(すなわち、阻害する、または活性化する、または増加させる)。いくつかの実施形態においては、抗微生物剤は、ポリペプチド、すなわち、工学的微生物によって発現および分泌されるポリペプチドである。

抗微生物剤は、キチナーゼ、グルカナーゼ、またはペプチドグリカンヒドロラーゼを含んでもよい。

本明細書で使用される用語「キチナーゼ」とは、真菌細胞壁の主要成分である、キチン鎖を形成するβ-1,4結合N-アセチルグルコサミンポリマーの加水分解を触媒することができる酵素を指す。キチナーゼは、病原体に応答して植物中で発現される。

本明細書で使用される用語「グルカナーゼ」とは、複合炭水化物の分解または脱重合を触媒することができる酵素を指す。組成物中のグルカナーゼは、セロオリゴ糖、リグノセルロース、セルロース、ヘミセルロース、およびペクチンのうちの1つ以上を分解することができる。そのような酵素活性は、限定されるものではないが、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、またはペクチン酸リアーゼ活性であってもよい。組成物のグルカナーゼは、ベータ-グルカン、セルロース、セロビオース、pNP-D-グルコピラノシドおよびキシランのうちの1つ以上を分解することができる。

本明細書で使用される場合、用語「ペプチドグリカンヒドロラーゼ」とは、外部に露出した場合に細菌細胞壁を分解することができる酵素を指す。細菌細胞壁は、可撓性ペプチド側鎖によって架橋されたグリカン鎖からなり、細菌細胞壁に強度および剛性を提供する。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との両方のペプチドグリカンは、NAM残基に結合したペプチドステム鎖によって架橋されたN-アセチルグルコサミン(NAG)およびβ-(1-4)-N-アセチルムラミン酸(NAM)の反復単位を特徴とする。いわゆるペプチドグリカンヒドロラーゼ(PGH)は、ペプチドグリカン鎖および側鎖分枝内の結合を切断するのを担う酵素である。

本明細書で互換的に用いられる用語「感染」または「微生物感染」とは、その最も広い意味で、微生物によって引き起こされる任意の感染を指し、細菌感染、真菌感染、酵母感染および原虫感染を含む。

製剤（配合物）：いくつかの実施形態によれば、局所製剤は、クリーム、ローション、スプレー、溶液剤、ゲル、軟膏、ペースト、膏薬、塗料、生体接着剤、懸濁液剤、エマルジョンなどの、体表面への適用にとって好適な任意の形態にあってもよく、ならびに/またはリポソーム、ミセル、および/もしくはミクロスフェアを含有するように調製することができる。そのような製剤を、体表面から蒸発する水分が、体表面への適用時およびその後も製剤中で維持されるような、閉鎖した被覆層と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態によれば、製剤は、生きている細胞培養物の組成物を含んでもよく、治療上有効な組換えポリペプチドまたは治療上有効なそのドメインを産生する少なくとも1つの操作された細菌株を含んでもよい。この操作された生きている細胞培養物の組成物は、異常な皮膚状態を処置または防止するために、皮膚に直接的にポリペプチドを送達することができる。

局所製剤は、任意の他の活性成分が当業界で公知の皮膚科学的ビヒクル(例えば、水性または非水性ゲル、軟膏、油中水または水中油エマルジョン)中に溶解または分散されたものを含む。そのようなビヒクルの構成物質は、水、水性バッファー溶液、非水性溶媒(エタノール、イソプロパノール、ベンジルアルコール、2-(2-エトキシエトキシ)エタノール、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノラウレート、グリコフロールまたはグリセロール)、油(例えば、液体パラフィンなどの鉱油、Miglyol(商標)などの天然もしくは合成トリグリセリド、またはジメチコンなどのシリコン油)を含んでもよい。特に、製剤の性質ならびにその意図される使用および適用部位に応じて、用いられる皮膚科学的ビヒクルは、以下の一覧：可溶化剤または溶媒(例えば、ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリンなどのβ-シクロデキストリン、またはエタノール、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのアルコールもしくはポリオール)；増粘剤(例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはカルボマー)；ゲル化剤(例えば、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマー)；保存剤(例えば、ベンジルアルコール、塩化ベンズアルコニウム、クロルヘキシジン、クロルブトール、安息香酸塩、ソルビン酸カリウムまたはEDTAもしくはその塩)；ならびにpH緩衝剤(リン酸二水素とリン酸水素塩との混合物、またはクエン酸とリン酸水素塩との混合物など)から選択される1以上の成分(例えば、製剤が水性ゲルである場合、水に加えた成分)を含有してもよい。

製薬上許容し得る担体を本発明の製剤中に含有させてもよく、それは当業界で従来使用されている任意の担体であってもよい。その例としては、水、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、単糖類、二糖類、多糖類、炭化水素油、脂肪および油、ワックス、脂肪酸、シリコン油、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコン界面活性剤、ならびにそのような担体の水ベースの混合物およびエマルジョンベースの混合物が挙げられる。本明細書で使用される用語「製薬上許容し得る（製薬上許容可能な）」または「製薬上許容し得る担体（製薬上許容可能な担体）」は、望ましくない生物学的効果または製剤の他の成分との望ましくない相互作用を引き起こすことなく、医薬製剤中に含有させることができる化合物または組成物を指し、本明細書で使用される「担体」または「ビヒクル」とは、局所適用される組成物中への組込みにとって好適な担体材料を指す。本明細書において有用な担体およびビヒクルは、非毒性的であり、有害な様式でそれが含有される製剤の他の成分と相互作用しない、当業界で公知の任意のそのような材料を含む。用語「水性」とは、水を含有するか、または皮膚もしくは粘膜組織への適用後に水を含有するようになる製剤を指す。

フィルム形成剤は、それが乾燥するときに、適用部位の上に保護フィルムを形成する。このフィルムは、活性成分の除去を阻害し、それと、処置される部位との接触を維持する。本発明における使用にとって好適であるフィルム形成剤の例は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版 (Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995)、page 1530に記載されたFlexible Collodion, US P.であり、コロジオンは、蒸発してピロキシリンのフィルムを遊離するピロキシリン(ニトロセルロース)を含有するエチルエーテル/エタノール溶液である。フィルム形成剤はさらに、担体として作用することができる。乾燥してフィルムを形成する溶液剤は、塗料と呼ばれることもある。クリームは、医薬製剤の業界で周知の通り、水中油または油中水の粘性の液体または半固体エマルジョンである。

クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤、および水性相を含有する。「内部」相とも呼ばれる油相は、一般的には、ワセリンおよびセチルまたはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールを含む。水性相は通常、必須ではないが、体積において油相が上回り、一般的には、保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、一般的には、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性界面活性剤である。

ローションは、摩擦なしに皮膚表面に適用される調製物であり、典型的には、活性薬剤を含む粒子が水またはアルコール基剤中に存在する液体または半液体の調製物である。ローションは通常、固形物の懸濁液であり、好ましくは、水中油型の液体油性エマルジョンを含む。ローションは、より多くの液体組成物を適用することが容易なため、大きい体面積を処置するための本明細書における好ましい製剤である。ローション中の不溶性物質は、一般に微細に分割されることが必要である。

ローションは、典型的には、より良好な分散をもたらすための懸濁化剤ならびに活性薬剤を皮膚と接触するように局在化させ、保持するのに有用な化合物、例えば、メチルセルロース、エトキシメチル-セルロースナトリウムなどを含有するであろう。

溶液剤は、溶解された物質の分子が溶媒の分子の間に分散されるように、1以上の化学物質(溶質)を液体中に溶解することによって調製される均一な混合物である。溶液剤は、溶質を緩衝化する、安定化する、または保持するための他の製薬上または化粧上許容し得る化学物質を含有してもよい。溶液剤を調製する際に使用される溶媒の一般的な例は、エタノール、水、プロピレングリコールまたは任意の他の許容し得るビヒクルである。勿論周知の通り、ゲルは半固体の懸濁液型系である。単相ゲルは、典型的には、水性であるが、好ましくは、アルコール、および必要に応じて、油も含有する、担体液体を通じて実質的に均一に分布した有機高分子を含有する。好ましい「有機高分子」、すなわち、ゲル化剤は、「カルボマー」ファミリーのポリマー、例えば、Carbopolの商標の下で商業的に入手できるカルボキシポリアルキレンなどの架橋アクリル酸ポリマーである。また、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコールなどの親水性ポリマー；ヒドロキシ-プロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロースフタレート、およびメチルセルロースなどのセルロース系ポリマー；トラガカントおよびキサンタンゴムなどのゴム；アルギン酸ナトリウム；ならびにゼラチンも好ましい。均一なゲルを調製するために、アルコールもしくはグリセリンなどの分散剤を添加するか、またはゲル化剤を、磨砕、機械的混合もしくは撹拌、またはその組合せによって分散させることができる。軟膏は、これも当業界で周知の通り、典型的には、ワセリンまたは他の石油誘導体に基づく半固体調製物である。使用される特定の軟膏基剤は、当業者には理解されるように、いくつかの望ましい特徴、例えば、皮膚軟化性などを提供するものである。他の担体またはビヒクルと同様、軟膏基剤は、不活性であり、安定であり、非刺激性であり、非感作性であるべきである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版 (Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995)、pages 1399-1404に説明されたように、軟膏基剤を、4つのクラス：脂肪性基剤；乳化性基剤；エマルジョン基剤；および水溶性基剤に分類することができる。脂肪性軟膏基剤としては、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および石油から得られる半固体炭化水素が挙げられる。

吸収性軟膏基剤としても知られる、乳化性軟膏基剤は、水をほとんど含有しないか、または全く含有せず、例えば、硫酸ヒドロキシステアリン、無水ラノリン、および親水性ワセリンを含む。

エマルジョン軟膏基剤は、油中水(W/O)エマルジョンまたは水中油(O/W)エマルジョンであり、例えば、アセチルアルコール、モノステアリン酸ステアリル、ラノリン、およびステアリン酸を含む。好ましい水溶性軟膏基剤は、変化する分子量のポリエチレングリコールから調製される；さらなる情報については、Remington: The Science and Practice of Pharmacyを参照されたい。

ペーストは、活性薬剤が好適な基剤中に懸濁された半固体剤形である。基剤の性質に応じて、ペーストは、脂肪ペーストまたは単相水性ゲルから作られたものの間に分割される。脂肪ペースト中の基剤は、一般的には、ワセリンまたは親水性ワセリンなどである。単相水性ゲルから作られたペーストは、一般的には、基剤としてカルボキシメチルセルロースなどを含む。

促進剤（エンハンサー）は、典型的には、「可塑性」促進剤と呼ばれる親油性共促進剤、すなわち、約150～1000の範囲の分子量、約1wt%未満、好ましくは、約0.5wt%未満、最も好ましくは、約0.2wt%未満の水性溶解度を有する促進剤である。可塑性促進剤のヒルデブラント溶解パラメーターδは、約2.5～約10の範囲、好ましくは、約5～約10の範囲にある。好ましい親油性促進剤は、脂肪エステル、脂肪アルコール、および脂肪エーテルである。特定の最も好ましい脂肪酸エステルの例としては、ラウリン酸メチル、オレイン酸エチル、モノラウリン酸プロピレングリコール、ジラウリン酸プロピレングリコール、モノラウリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール、イソプロピルn-デカノエート、およびミリスチン酸オクチルドデシルが挙げられる。脂肪アルコールとしては、例えば、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールが挙げられるが、脂肪エーテルとしては、ジオールまたはトリオール、好ましくは、C₂～C₄アルカンジオールまたはトリオールが1個または2個の脂肪エーテル置換基で置換された化合物が挙げられる。

さらなる浸透促進剤は、局所薬物送達の当業者には公知である、および/または関連のある教科書および文献に記載されている。例えば、Percutaneous Penetration Enhancers、Smithら(編) (CRC Press, 1995)(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。

上記で同定されたものに加えて、様々な他の添加剤を、本発明の組成物中に含有させることができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、酸化防止剤、収斂剤、香料、保存剤、皮膚軟化剤、色素、染料、保湿剤、推進剤、および日焼け防止剤、ならびに存在が製薬上望ましいか、または別途望ましいものであってよい他のクラスの材料が挙げられる。本発明の製剤中への含有のための必要に応じた添加剤の典型例は、以下の通りである：ソルベートなどの保存剤；イソプロパノールおよびプロピレングリコールなどの溶媒；メントールおよびエタノールなどの収斂剤；ポリアルキレンメチルグルコシドなどの皮膚軟化剤；グリセリンなどの保湿剤；ステアリン酸グリセロール、PEG-100ステアリン酸、ポリグリセリル-3-ヒドロキシラウリルエーテル、およびポリソルベート60などの乳化剤；ソルビトールおよびポリエチレングリコールなどの他のポリヒドロキシアルコール；桂皮酸オクチルメトキシル(Parsol MCXとして商業的に入手可能)およびブチルメトキシベンゾイルメタン(Parsol 1789の商標の下で入手可能)などの日焼け防止剤；アスコルビン酸(ビタミンC)、a-トコフェロール(ビタミンE)、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、ε-トコフェロール、ζ_ι-トコフェロール、Ζ^Λ-トコフェロール、η-トコフェロール、およびレチノール(ビタミンA)などの酸化防止剤；エッセンシャルオイル、セラミド、必須脂肪酸、鉱油、植物油(例えば、大豆油、ヤシ油、シアバターの液体画分、ヒマワリ油)、動物油(例えば、ペルヒドロスクアレン)、合成油、シリコン油またはワックス(例えば、シクロメチコンおよびジメチコン)、フッ素化油(一般的には、ペルフルオロポリエーテル)、脂肪アルコール(例えば、セチルアルコール)、およびワックス(例えば、蜜蝋、カルナバ蝋、およびパラフィン蝋)；皮膚感触改変剤；ならびに膨潤粘土およびCarbopolの商標の下で商業的に得ることができる架橋カルボキシポリアルキレンなどの増粘剤および構造化剤(ストラクチュラント)。他の添加剤としては、皮膚(特に、角質層における皮膚の上層)の調子を整え、その水分含量の低下を遅延させることによってそれを柔らかく維持する、および/または皮膚を保護する材料などの有益な薬剤を含む。そのようなコンディショナーおよび保湿剤としては、例えば、ピロリジンカルボン酸およびアミノ酸；2,4,4’-トリクロロ-2-ヒドロキシジフェニルエーテル(トリクロサン)および安息香酸などの有機抗微生物剤；アセチルサリチル酸およびグリシルレチン酸などの抗炎症剤；レチノイン酸などの抗脂漏剤；ニコチン酸などの血管拡張剤；コウジ酸などのメラニン形成のインヒビター；ならびにそれらの混合物が挙げられる。さらなる追加の活性薬剤としては、例えば、アルファヒドロキシ酸、アルファケト酸、ポリマー性ヒドロキシ酸、保湿剤、コラーゲン、海洋抽出物、ならびにアスコルビン酸(ビタミンC)、a-トコフェロール(ビタミンE)、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、ε-トコフェロール、ζ_ι-トコフェロール、ζ₂-トコフェロール、η-トコフェロール、およびレチノール(ビタミンA)などの酸化防止剤、ならびに/または製薬上許容し得るその塩、エステル、アミド、もしくは他の誘導体が挙げられる。好ましいトコフェロール化合物は、a-トコフェロールである。追加の薬剤としては、例えば、両方ともLancaster Group AGに割り当てられた、GrossらのWO94/00098およびGrossらのWO94/00109(参照により本明細書に組み込まれる)に記載された、皮膚組織への酸素供給を改善することができるものが挙げられる。日焼け防止剤およびUV吸収化合物を含有させることもできる。そのような日焼け防止剤およびUV吸収化合物の非限定例としては、アミノ安息香酸(PABA)、アボベンゾン、シノキサート、ジオキシベンゾン、ホモサレート、メンチルアントラニレート、オクトクリレン、メトキシ桂皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、パディメートO、フェニルベンズイミダゾール硫酸、スリソベンゾン、二酸化チタン、サリチル酸トロラミン、酸化亜鉛、エンスリゾール、メラジレート、オクチノキサート、オクチサレート、およびオクトクリレンが挙げられる。その全体が本明細書に組み込まれる、Title 21. Chapter 1. Subchapter D. Part 352. 「Sunscreen drug products for over-the-counter human use」を参照されたい。

他の実施形態は、本発明の製剤を用いた処置を容易にする、様々な非発癌性、非刺激性の治癒材料を含んでもよい。そのような治癒材料は、栄養素、ミネラル、ビタミン、電解質、酵素、ハーブ、植物エキス、腺エキスもしくは動物エキス、または皮膚障害の治癒を容易にするために製剤に添加することができる安全な治療剤を含んでもよい。

これらの様々な添加剤の量は、化粧品の分野で従来使用されているものであり、例えば、局所製剤の総重量の約0.01%～約20%の範囲である。

本発明の製剤はまた、乳白剤、香料、着色料、安定剤、界面活性剤などの従来の添加剤を含んでもよい。特定の実施形態では、保存時の腐敗を防ぐため、すなわち、酵母およびカビなどの微生物の増殖を阻害するために、抗微生物剤などの他の薬剤を添加することもできる。

好適な抗微生物剤は、典型的には、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルおよびプロピルエステル(すなわち、メチルおよびプロピルパラベン)、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、イミド尿素、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、リプレッサーおよびインデューサー、すなわち、目的のポリペプチドの産生を阻害する(すなわち、グリコース)または誘導する(すなわち、キシロース)ための他の薬剤を添加することもできる。そのような添加剤が製剤の機能と適合し、それを阻害しないという条件で、それらを使用することができる。

製剤はまた、投与される化学物質、または組成物の他の成分からもたらされる皮膚刺激または皮膚損傷の可能性を最小化するか、または除去するための刺激緩和性添加剤を含有してもよい。

好適な刺激緩和性添加剤としては、例えば、a-トコフェロール；モノアミンオキシダーゼインヒビター、特に、2-フェニル-1-エタノールなどのフェニルアルコール類；サリチル酸塩；アスコルビン酸塩；モネンシンなどのイオノフォア；両染性アミン；塩化アンモニウム；N-アセチルシステイン；カプサイシン；およびクロロキンが挙げられる。刺激緩和性添加剤は、存在する場合、刺激または皮膚損傷を緩和するのに有効な濃度で組成物中に含有させることができ、典型的には、製剤の約20wt%以下、より典型的には、約5wt%以下を占める。

特定の実施形態において本製剤中に含有させ、かくして、活性薬剤と共に局所的に適用することができるさらなる好適な薬理活性物質としては、限定されるものではないが、以下のもの：有色素性または非有色素性の年齢によるシミ、角質繊維、およびシワを改善または根絶する薬剤；抗微生物剤；抗細菌剤；かゆみ止め剤および乾燥防止剤；抗炎症剤；局部麻酔剤および鎮痛剤；コルチコステロイド；レチノイド；ビタミン；ホルモン；ならびに代謝拮抗剤が挙げられる。

局所薬理活性物質のいくつかの例としては、アシクロビル、アンホテリシン、クロルヘキシジン、クロトリマゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ミコナゾール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ナイスタチン、ネオマイシン、カナマイシン、フェニトイン、パラアミノ安息香酸エステル、メトキシ桂皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、トコフェロール、酢酸トコフェロール、セレンスルフィド、亜鉛ピリチオン、ジフェニルヒドラミン、プラモキシン、リドカイン、プロカイン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、クロタミトン、ヒドロキノンならびにそのモノメチルおよびベンジルエーテル、ナプロキセン、イブプロフェン、クロモリン、レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、コールタール、グリセオフルビン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン21-酢酸、ヒドロコルチゾン17-吉草酸、ヒドロコルチゾン17-酪酸、プロゲステロン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ミノキシジル、ジピリダモール、ジフェニルヒダントイン、過酸化ベンゾイル、および5-フルオロウラシルが挙げられる。

クリーム、ローション、ゲル、軟膏、ペーストなどを、罹患した表面上に広げ、優しく塗り込むことができる。溶液剤を同じように適用することができるが、より典型的には、スポイト、スワブなどを用いて適用し、罹患した領域に注意深く適用する。

適用レジメンは、状態の重症度および初期処置に対するその応答性などの、容易に決定することができるいくつかの因子に依存するが、通常は、継続的に1日あたり1回以上の適用を含むであろう。当業者であれば、投与される製剤の最適量、投与方法および反復速度を容易に決定することができる。一般に、本発明の製剤を、週に1回または2回から最大で1日1回または2回の範囲で適用することが企図される。

本発明の医薬組成物は、1以上の製薬上許容し得る希釈剤または担体と、必要に応じて、1以上の他の化合物、薬物、成分および/または材料との混合物中に、1以上の活性成分、例えば、治療剤を含む。選択される投与経路に関係なく、本発明の薬剤/化合物は、当業者には公知の従来の方法によって製薬上許容し得る剤形に製剤化される。例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy (第21版、Lippincott Williams and Wilkins、Philadelphia、Pa.)を参照されたい。

製薬上許容し得る希釈剤または担体は、当業界で周知であり(例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy (第21版、Lippincott Williams and Wilkins、Philadelphia、Pa.)およびThe National Formulary (American Pharmaceutical Association、Washington、D.C.)を参照されたい)、糖(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール)、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム(例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム)、クエン酸ナトリウム、水、水性溶液(例えば、食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル注射液)、アルコール(例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール)、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール)、有機エステル(例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド)、生分解性ポリマー(例えば、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)、およびポリ(無水物))、エラストマーマトリクス、リポソーム、ミクロスフェア、油(例えば、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、綿実油、および落花生油)、ココアバター、ワックス(例えば、坐剤ワックス)、パラフィン類、シリコン類、タルク、サリチル酸塩などが挙げられる。本発明の医薬組成物中で使用されるそれぞれの製薬上許容し得る希釈剤または担体は、製剤の他の成分と適合し、対象にとって有害ではないという意味で「許容し得る（許容可能な）」ものでなければならない。選択された剤形および意図された投与経路にとって好適な希釈剤または担体は、当業界で周知であり、選択された剤形および投与方法のための許容し得る希釈剤または担体を、当業界における通常の知識を使用して決定することができる。

本発明の医薬組成物は、必要に応じて、医薬組成物において一般的に使用される追加の成分および/または材料を含有してもよい。これらの成分および材料は、当業界で周知であり、(1)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤；(2)カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアカシアなどの結合剤；(3)グリセロールなどの保湿剤；(4)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；(5)パラフィンなどの溶解遅延剤；(6)第4級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；(7)セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；(8)カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；(9)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤；(10)エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントなどの懸濁化剤；(11)緩衝剤；(12)ラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン類、ココアバター、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト類、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム類、およびポリアミド粉末などの賦形剤；(13)；水または他の溶媒などの不活性希釈剤；(14)保存剤；(15)界面活性剤；(16)分散剤；(17)ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、生分解性ポリマー、リポソーム、ミクロスフェア、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、およびワックスなどの制御放出剤または吸収遅延剤；(18)乳白剤；(19)アジュバント；(20)湿潤剤；(21)乳化剤および懸濁化剤；(22)エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油(特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤；(23)クロロフルオロ炭化水素ならびに揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンなどの推進剤；(24)酸化防止剤（抗酸化剤）；(25)糖および塩化ナトリウムなどの、製剤と、意図されるレシピエントの血液とを等張性にする物質；(26)増粘剤；(27)レシチンなどのコーティング材料；ならびに(28)甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤が挙げられる。それぞれのそのような成分または材料は、製剤の他の成分と適合し、対象にとって有害ではないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。選択された剤形および意図された投与経路にとって好適な成分および材料は、当業界で周知であり、選択された剤形および投与方法のための許容し得る製剤および材料を、当業界における通常の知識を使用して決定することができる。

局所または経皮投与のための剤形としては、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液剤、パッチ、点滴剤および吸入剤が挙げられる。活性薬剤/化合物を、好適な製薬上許容し得る希釈剤または担体と、無菌条件下で混合することができる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、賦形剤を含有してもよい。散剤およびスプレーは、賦形剤および推進剤を含有してもよい。

非経口投与にとって好適な本発明の医薬組成物は、1以上の薬剤/化合物を、1以上の製薬上許容し得る滅菌等張性水性もしくは非水性溶液剤、分散剤、懸濁液剤もしくはエマルジョン、または滅菌散剤と共に含んでもよく、これは使用直前に滅菌注射溶液もしくは分散剤に再構成することができ、これは、好適な酸化防止剤、バッファー、製剤と、意図されるレシピエントの血液とを等張性にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有してもよい。例えば、コーティング材料の使用により、分散体の場合、必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。これらの医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および分散化剤などの、好適なアジュバントを含有してもよい。また、等張剤を含有させることも望ましい。さらに、注射可能な医薬形態の吸収の延長を、吸収を遅延させる物質の含有によってもたらすことができる。

以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提供される。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
(実施例)

以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提供される。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。

細菌
それぞれのLEKTI-D6発現株は、異なるセットのプロモーターからhLEKTI-D6を発現するpUBTR119の異なる誘導体で形質転換されたS. epidermidisのSE_ΔΔΔである。プラスミド構築物を、以下に記載されるように作製した。

元のpUBTR119プラスミドは、Kan-R遺伝子ならびに1)プラスミド複製にとって必須のhpaII天然プロモーター、2)リン酸飢餓誘導性yxiEプロモーター、および3)下流の発現されるタンパク質に融合されたSsaA1分泌シグナルのオープンリーディングフレーム(ORF)を有する構成的sarAプロモーターを含むトリプルプロモーター発現カセットを含む。

誘導性xylAプロモーター、PxylAの制御下でhLEKT1-D6を発現する、プラスミド構築物#27aを作製するために、IDT,Inc.(Gibsonら、Nature Methods 6:343-345 (2009))によって設計および合成された、Gibsonアセンブリープロトコールのために設計された重複プライマーのセット、ベクターについては配列番号1および配列番号2、ならびに挿入物については配列番号3、配列番号4および配列番号5(表3)を使用した。xylR/PxylAプロモーターを含有するpUBTR(Km-、カナマイシン耐性遺伝子を含まない)プラスミドの骨格を使用した。pRKK-Blueベクター中のyfhKSP-pro-LEKTI-D6-6xHisを、組換えタンパク質のORFを増幅するための鋳型として用いた。Q5(登録商標)高忠実度(HiFi)ポリメラーゼ(NEB, Inc., Ipswich, MA)を、全てのPCR反応のために用いた。PCR産物を、凍結-解凍法によって0.7%アガロースゲルから精製し、NEBuilder(登録商標)HiFi DNAアセンブリー反応において用いた。HiFi反応液全体(20μl)を、37℃で90min、220μlの枯草菌コンピテント細胞と共にインキュベートし、37℃での一晩のインキュベーションのためにLuria-Bertani(LB)寒天プレート上に播種した。プラスミドDNAを、得られた枯草菌コロニーから接種されたLB中の4mlの一晩培養物中で精製した。構築物を、xylRリプレッサーのORFからLEKTI-D6 ORFの停止コドンまで配列検証した。配列検証した培養物から、ストックを20%グリセロール中で作製し、-80℃で保存した。枯草菌から精製されたプラスミドDNAを、S. epidermidisのSE_ΔΔΔのコンピテント細胞中に形質転換した。４つのSE_ΔΔΔ形質転換体を完全に配列検証し、-80℃で預託した。

構築物SE27aおよびSE27dを、SE27eのDNAから作製して、プライマーである配列番号7および配列番号4、または配列番号6および配列番号8を用いてPCR増幅することによって、XylR/PxylAカセット(SE27a)、またはPyxiEプロモーター(SE27d)を欠失させた(表3)。線状化された構築物のDNAをゲル精製した後、KLD反応(キナーゼ、リガーゼおよびDpnI酵素のブレンド、NEB,Inc.を含有する)における部位特異的突然変異誘発によって再環状化し、枯草菌細胞中に形質転換した。枯草菌クローンから調製したプラスミドDNAを、配列決定によって検証し、SE_ΔΔΔ中に形質転換した。形質転換体からのプラスミドを、PCRおよびDNA調製物の配列決定によって検証した。全ての確認されたクローンを、-80℃で20%グリセロール中で保存した。SE27a、SE27d、およびSE27d中のORF構造の概要を、表4中に表す。

SE27aの凍結乾燥粉末の調製
SE27a株を、2LのバッフルErlenmeyerフラスコ中の2つの500mL培養物中に接種した。培養物を30℃および250rpmで24h増殖させた。インキュベーション後、培養物をプールし、4℃、10,000xgで10min遠心分離し、その上清を廃棄した。プールしたペレットを、磁気撹拌下で、80mLのオートクレーブした抗凍結剤溶液(120g/Lラクトース、25g/Lフルクトオリゴ糖および1g/Lアスコルビン酸)中に完全に懸濁した(Chenら、2019, Artif. Cells Nanomed. Biotechnol.)。ホモジェネートの2つの100μLアリコートを、播種およびCFU評価のために保存した。残りの細菌懸濁液を、UV滅菌した凍結乾燥フラスコに入れ、一定の手動によるスピニング下、エタノール-ドライアイス浴中で凍結した。凍結したペーストを、48hにわたって凍結乾燥し、無菌条件下で擦り取り、得られた粉末を、ストマッカーバッグ中、手で破砕した。粉末の3つの試料を採取し、計量し、12.5%Tween 80(v/v)を添加した10mLのオートクレーブした0.1xTSB(トリプチックソイブロス培地)中に懸濁した。懸濁後、ホモジェネートを連続希釈し、CFU評価のために播種した。

この方法により、回収された総粉末から抗凍結剤の質量を減算することによって算出した場合、約34%の乾燥細菌量を含有する合計14.5gの粉末を得た。凍結乾燥の前に、抗凍結剤中の細菌懸濁液は、合計9.1x10¹²CFUを含有し、そのうちの6.7x10¹²CFUを凍結乾燥後に回収した。かくして、このプロセスにより、初期入力の74%の回収率が得られ、粉末中の最終細菌密度は1.4x10¹²CFU/gの粉末であった。表5は、成分およびパーセント(w/w)をまとめたものである。

方法
30g/L TSB培地、人工汗培地(ASM、20.9g/L MOPS、2g/L NaCl、1g/L酵母抽出物、0.1g/L Tween80および0.65mg/Lタラ肝脂肪酸メチルエステル)、ASM+1%コロイド性オートミール(wt/v)またはASM+0.5%コロイド性オートミール抽出部(wt/v)の液体培養物中でSE27aを増殖させることによって、溶液中での増殖およびLEKTI発現のスクリーニングを実行した。実施例2で調製したSE27a粉末を用いて、約108CFU/mLの細胞密度で250mLのフラスコ中の50mLの液体培養物に接種し、培養物を30℃および250rpmで増殖させた。時間で、100μLの培養物を採取し、1xPBSを使用して10倍段階で連続希釈し、37℃で24hの増殖後、CFU評価のために30g/L TSB、15g/L NaClおよび15g/L寒天培地上に播種した。さらに、培養物の1mLのアリコートを、上清の収集のために12,000xgで10min、4℃で遠心分離した。これらの使用済み培地試料を、2回再遠心分離し、以下に記載されるアッセイを使用して活性LEKTI決定にかけた。

活性LEKTI濃度を、KLK14阻害アッセイを使用して試験した。アッセイのためにプロKLK14形態を活性化するために、3.5μMのこのタンパク質を、50mM Tris、10mM CaCl₂、150mM NaCl、0.05%(wt/v)Brij-35、pH8.0を含有する溶液中、37℃で1h、0.3μMサーモリシンを使用して活性化した。反応を50mM EDTAでクエンチし、試料を50mM Tris、150mM NaCl、0.05% (wt/v) Brij-35および10%グリセロール、pH8.0中に1:1(v/v)で希釈した。アリコートを-80℃で凍結し、それぞれのアッセイにおいて全部使用して、凍結-解凍サイクルを回避した。ブロスおよび抽出物中の活性LEKTIの量を、1.5nMの活性化KLK14および30μMのBoc-VPR-AdMCを含有する50mM Tris、150mM NaClおよび0.05%(wt/v)Brij-35(pH8.0)の溶液を使用して黒色96ウェルプレート中でアッセイした。反応を、培地の連続希釈液および抽出物(最終ウェル容量の10～0.08%)中で実施し、プレートリーダー(Ex/Em=380/460nm)中、23℃で1min間隔で10minにわたって追跡した。Boc-VPR-AdMCのKLK14媒介性切断の阻害を、±阻害剤での反応率(%)として決定した。試料中の活性LEKTIの濃度を、0.0～5.0nMの精製組換えHisタグ付LEKTI-d6の存在下で、反応率(%)の較正曲線を使用して決定した。

溶液中の添加される栄養素の評価
人工汗培地(「ASM」-20.9g/L MOPS、2g/L NaCl、1g/L酵母抽出物、0.1g/L Tween80および0.65mg/Lタラ肝脂肪酸メチルエステル(OatesおよびMcBain, Biofouling 32(1): 25-33 (2016)によって記載された)(図1A)、トリプチックソイブロス(TSB)(図1B)、ASM+1%コロイド性オートミール(CO)(図1C)、およびASM+0.5%コロイド性オートミール抽出物(COE)(図1D)中、フラスコ中の規定容量でのS. epidermidisタンパク質発現株SE27aの液体培養。試料を、治療のタイムラインを表す選択された時点で採取した。細菌数を、標準的な希釈プロトコールを使用して測定し(CFU/ml)、「活性タンパク質濃度」を、ASM(図1E)、TSB(図1F)、ASM+1%コロイド性オートミール(CO)(図1G)、およびASM+0.5%コロイド性オートミール抽出物(COE)(図1H)のためのin vitroでのKLK14阻害アッセイを使用して測定した。

TSB対照溶液は、予想通り、増殖し(図1B)、LEKTIを発現した(図1F)。ASM単独については(図1A)、溶液は、SE27aの6.0x10⁷CFU/mlの接種材料を含有していた。3時間の時点で、細菌数は、6.3x10⁷CFU/mlであり、10%の増殖を表していた。活性LEKTI濃度は、検出限界未満であった(図1E)。ASM+1%コロイド性オートミールを含有する溶液は、5.6x10⁷CFU/mlの接種材料を有していた(図1C)。3時間の時点で、細菌数は、6.3x10⁷CFU/ml、または71%の増殖であった。活性LEKTI濃度は、6.5nMであった(図1G)。ASM+0.5%コロイド性オートミール抽出物の溶液については、SE27aの接種材料は、5.8x10⁷CFU/mlであった(図1D)。3時間の時点で、細菌数は、6.2x10⁷CFU/mlであり、7%の増殖を表していた。活性LEKTI濃度は、215nMであった(図1C)。

コロイド性オートミールまたはコロイド性オートミール抽出物の添加は、LEKTI発現を、3時間で、検出限界未満からかなりのレベルまで増加させる。これらの結果は、オートミール製品の添加が発現を確実にするのに有用であることを示している。

方法
異なる寒天調製物中での増殖およびLEKTI発現を、以下の手順によって評価した。SE27a株の粉末を、1xPBS中に、10¹¹CFU/mLの細胞密度で溶解し、これらの懸濁液の100μLアリコートを、15g/L細菌寒天を含有する以下の寒天プレート(78.5cm²の面積)上に広げた: 30g/L TSB、ASM培地、ASM+1%コロイド性オートミール(wt/v)およびASM+0.5%コロイド性オートミール抽出物(wt/v)。それぞれの培地について、プレートは、約10⁸CFU/cm²を含有し、実験あたり4つのプレートに接種した。プレートを、30℃で8hインキュベートし、この時間の終わりに、同じ培地条件の4つのプレートをプールし、200mLの滅菌H₂Oを含有するキッチンブレンダーを使用してホモジェナイズした。ホモジェネートの100μLのアリコートを、播種およびCFU評価のために収集したが、残りは4℃で20min、12,000xgで遠心分離した。寒天を含有するペレットを廃棄し、同じ条件下で上清を再遠心分離した。最終的な液相を、ドライアイス-エタノール浴中で凍結し、48hにわたって凍結乾燥した。得られた乾燥材料を、Milli-Q H₂Oに溶解し、1%トリフルオロ酢酸(TFA、v/v)で酸性化し、分取HPLCカートリッジ中に注入し、表6に記載される勾配に従って、(A)H₂O+0.1%TFA(v/v)および(B)アセトニトリル(ACN)+0.1%TFA(v/v)を含有する移動相中、10.9mL/minの流量で分画した。

20.2～30.2minで溶出する溶出液画分を収集し、プールし、SpeedVac中で完全に乾燥させた。得られたペレットを、100μLの0.5M Tris、75mM NaClおよび0.03%(wt/v)Brij-35(pH8.0)に溶解し、上記のように、活性LEKTI決定にかけた。

寒天に添加される栄養素の評価
コロイド性オートミール(CO)およびコロイド性オートミール抽出物(COE)を、ASM寒天プレート中で混合し、細菌を塗布し、30℃で8時間インキュベートした。T0および8時間(T8)で測定された、細菌の量(CFU/cm²)および発現された活性LEKTI-d6タンパク質(KLK14阻害アッセイ)を、図2上に提示する。図3は、それぞれの条件に関する活性LEKTI-d6レベルを示す。

その結果、コロイド性オートミールまたはコロイド性オートミール抽出物条件で細菌増殖がわずかであることが示された(図2)。コロイド性オートミールおよびコロイド性オートミール抽出物の存在下では、高レベルの活性LEKTI(図3)があった。コロイド性オートミールの存在下では、3ng/cm²のLEKTIおよびコロイド性オートミール抽出物の存在下では、7ng/cm²が存在していた。
（実施例４）

方法
オレイルアルコール:セチルアルコール1:1±1%コロイド性オートミール(wt/wt)または0.5%コロイド性オートミール抽出物(wt/wt)を、セチルアルコールが完全に融解するまで、60℃で全ての成分をインキュベートすることによって調製した。冷却および固化まで、混合物を手動で振とうさせた。最終製剤を、ストマッカーバッグを使用して、10:1(wt/wt)の割合でSE27aの凍結乾燥粉末に添加した。簡単に述べると、細菌粉末をストマッカーバッグに入れ、ガラス棒を使用して穏やかに破砕した。次いで、製剤を添加し、細菌粉末および製剤を、バッグに対して外側に回転する動きの25回の上下サイクルを使用して、ガラス棒でホモジェナイズした。約100mgの製剤のアリコートを、15g/L細菌寒天を含有するASMプレート(78.5cm²の面積)上に広げ、約10⁸CFU/cm²の細菌密度を得た。プレートを、30℃で8hインキュベートし、この時間の終わりに、同じ培地条件の4つのプレートをプールし、200mLの滅菌H₂Oを含有するキッチンブレンダーを使用してホモジェナイズした。ホモジェネートの100μLのアリコートを、播種およびCFU評価のために収集したが、残りは4℃で20min、12,000xgで遠心分離した。寒天を含有するペレットを廃棄し、同じ条件下で上清を再遠心分離した。最終的な液相を、ドライアイス-エタノール浴中で凍結し、48hにわたって凍結乾燥した。得られた乾燥材料をMilli-Q H2Oに溶解し、1%トリフルオロ酢酸(TFA、v/v)で酸性化し、HPLCで分画し、乾燥し、上記のように活性LEKITレベルについてアッセイした。

コロイド性オートミールのアルカリ抽出物を、以下のように調製した。コロイド性オートミールのロットを、商業的供給源から取得し、磁気撹拌下、水性50mM NaOH中に3%wt/vで溶解した。次いで、懸濁液を、室温で48h、撹拌せずにインキュベートした。この時間の終わりに、懸濁液を、50mM HClで中和し、上清を注意深く収集して、デカンテーションされた材料の回収を回避した。上清を、4℃で20min、12,000xgで2回遠心分離し、ドライアイス浴中で凍結し、72hにわたって凍結乾燥した。乾燥材料を擦り取り、計量し、使用まで室温で密閉されたストマッカーバッグ中で保存した。

出発材料として使用したコロイド性オートミールおよびその対応するアルカリ性抽出物を、ヨウ素試験を使用して特性評価して、そのデンプン含量を測定した。簡単に述べると、コロイド性オートミールおよびアルカリ性コロイド性オートミール抽出物を、10mg/mLの濃度で6mLのMilliQ水に溶解した。10mg/mLのヨウ素のエタノール溶液0.2mLを、混合物に添加した。黒色への色の変化は、懸濁液中のデンプンの存在を示していた。コロイド性オートミールは黒色に変化したが(デンプンについて陽性)、アルカリ性コロイド性オートミール抽出物は透明であった(デンプンについて陰性)。

製剤に添加される栄養素の評価
SE27aを、オレイルアルコールおよびセチルアルコール1:1(OA:CA)、コロイド性オートミール(CO)を含むOA:CAならびにコロイド性オートミール抽出物(COE)を含むOA:CA中で製剤化し、ASM寒天プレート上に塗布した後、30℃で8時間インキュベートした。これらの条件下での細菌増殖を、図4に提示し、LEKTI発現を、図5に提示する。

オレイルアルコールおよびセチルアルコール1:1中のSE27aは、増殖もせず、活性LEKTIも発現しなかった。図4に示されるように、コロイド性オートミールまたはコロイド性オートミール抽出物の存在下では、有意な細菌増殖はなかった。しかしながら、本発明者らは、1%コロイド性オートミール(CO)または0.5%コロイド性オートミール抽出物(COE)と共にOA:CA中で製剤化されたSE27aが、図5に示されるように、表面(ASMを含有する寒天)上で活性LEKTIを発現する有益な効果を有することを観察した。

方法
プラセボおよびオレイルアルコール:セチルアルコール1:1±1%コロイド性オートミール(wt/wt)の製剤を含有する27aを、実施例4の下で記載されたように調製した。27aの粉末を、実施例4の下で記載されたように、ストマッカーバッグを使用して、10:1(wt/wt)の割合で製剤と混合した。簡単に述べると、細菌粉末をストマッカーバッグに入れ、ガラス棒を使用して穏やかに破砕した。約100～150mgの製剤のアリコートを、地元の肉屋からの脱脂し、毛剃りしたブタ皮膚(64cm²の面積)上に広げ、約10⁸CFU/cm²の細菌密度を得た。プラセボまたは27a製剤を含有する皮膚片を、30℃で0、8hおよび24hインキュベートした。それぞれの時点で、4cm2の2つの領域を独立に拭き取り、2つの処置にかけた。第1に、1つのスワブを、3g/L TSB粉末および1%Triton X-100(wt/v)を含有する1mLの溶液を含有する15mLのFalconチューブに入れた。チューブを1minボルテックスし、その内容物を連続希釈し、CFU評価のために播種した。第2のスワブを、50mM Tris(pH=8.0)、150mM NaClおよび0.05%Brij-35(wt/v)の1mLの溶液を含有する15mLのFalconチューブに入れた。試料を1minボルテックスし、12,000xgで1min遠心分離し、その上清を収集した。この画分を、同じ条件下で2回遠心分離し、最初の上清を、実施例3の下で記載されたように、活性LEKTIの測定のために使用した。

ブタ皮膚に塗布された製剤化された27aからの細菌回収およびLEKTI活性
SE27aを、オレイルアルコールおよびセチルアルコール1:1(OA:CA)中でコロイド性オートミール(CO)と共に製剤化し、ブタ皮膚上に塗布した後、30℃で8時間インキュベートした。これらの条件下での細菌含量を、図6に提示し、LEKTI活性を、図7に提示する。

製剤化されたSE27aの細菌含量は、図7に示されるように、ブタ皮膚上で24hにわたって安定であった。T=0で、ブタ皮膚に塗布された試料からLEKTI活性は観察されなかった。図7に示されるように、LEKTI活性は、T=8で製剤化された27aに由来するスワブ試料中で60ng/cm²に鋭く達した後、T=24で34ng/cm²に低下した。実施例5からの観察と一致して、COを含有するOA:CA中で製剤化された27a細菌は、そのCFU含量の実質的な拡大なく、ブタ皮膚表面上で活性LEKTIを産生することができる。

栄養要求株の増殖および天然抗微生物剤の産生
SE484株は、抗微生物化合物を産生し、分泌する、D-アラニン表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)栄養要求株である。皮膚のような条件、すなわち、人工汗培地(ASM)中では、この株の増殖は低下し(図8A)、それは抗微生物剤を産生および分泌することができない(図8B)。コロイド性オートミールの添加時に、SE484は、8h以内にCFU/mLの10倍の増加を示す(図8A)。さらに、コロイド性オートミールを添加した培地中で増殖したSE484の使用済み培地は、プレーンなASM培地と比較して、枯草菌168QCに対する有意な抗細菌活性を示す。

ex vivoのブタ皮膚上での製剤化されたSE351による細菌生存および活性LEKTI産生
SE351は、プロテアーゼ阻害剤LEKTIのドメイン6を発現する染色体に組み込まれた構築物を担持するS. epidermidisのD-アラニン栄養要求株である。この株を、1%コロイド性オートミール(w/w)および2%D-アラニン(w/w)を添加したオレイルアルコール:セチルアルコール1:1(w/w)中で製剤化し、10⁶(図9A)、10⁷(図9B)および10⁸CFU/cm²(図9C)でex vivoでブタ皮膚上に塗布した場合、それは、最初の6h以内にCFU/cm²の10倍の増加を示し、24hにわたって、細菌集団は、全ての細胞密度において約10⁶CFU/cm²で安定化する(図9A～図9C)。10⁶CFU/cm²で、10～24hで検出可能な活性LEKTIレベルが観察され、24hで約200ng/cm²のピークに向かって徐々に増加する。

10⁷CFU/cm²では、活性LEKTIレベルは、6～8hで最初のピークを示し、そのレベルは150ng/cm²に達する(図9B)。これらのレベルは10～14hで100ng/cm²に低下するにも拘わらず、それらは20～24h以内に250ng/cm²の第2のピークを生じる(図9B)。同様の傾向は、10⁸CFU/cm²についても観察され(図9C)、LEKTI活性は、3h以内に150ng/cm²で最初にピークに達した後、低下し、24hで第2のスパイクで300ng/cm²に達する。これらの細胞密度で存在する活性LEKTIレベルの異なる反応速度論にも拘わらず、コロイド性オートミールを含有する軟膏中で製剤化されたSE351は、皮膚表面上に実質的なレベルの活性組換えLEKTIを送達することができる。

栄養要求株SE351およびSE484の凍結乾燥粉末の調製
SE351およびSE484株を、2LのバッフルErlenmeyerフラスコに入れた500mLのTSB+2% D-アラニン(w/v)培地中に接種した。培養物を、SE351については6hおよびSE484については16hにわたって、37℃および250rpmで増殖させた。インキュベーション後、培養物をプールし、4℃、10,000xgで10min遠心分離し、その上清を廃棄した。プールしたペレットを、磁気撹拌下、80mLのオートクレーブした抗凍結剤溶液(120g/Lラクトース、25g/Lフルクトオリゴ糖および1g/Lアスコルビン酸)中に完全に懸濁した。ホモジェネートの2つの100μLアリコートを、播種およびCFU評価のために保存した。残りの細菌懸濁液を、UV滅菌した凍結乾燥フラスコに入れ、一定の手動によるスピニング下、エタノール-ドライアイス浴中で凍結した。凍結したペーストを、48hにわたって凍結乾燥し、無菌条件下で擦り取り、得られた粉末を、ストマッカーバッグ中、手で破砕した。粉末の3つの試料を採取し、計量し、12.5%Tween 80(v/v)を添加した10mLのオートクレーブした0.1xTSB中に懸濁した。懸濁後、ホモジェネートを連続希釈し、CFU評価のために播種した。この方法により、回収された総粉末から抗凍結剤の質量を減算することによって算出した場合、約34%の乾燥細菌量を含有する培養物1Lあたり合計8 gの粉末が得られた。CFU/g含量は、1.0～2.5x10¹¹CFU/gで変化した。

栄養要求株の増殖および天然抗微生物剤の産生の説明
このスクリーニングを、2%D-アラニン(w/v)±1%コロイド性オートミール(w/v)を添加した人工汗培地(ASM、20.9g/L MOPS、2g/L NaCl、1g/L酵母抽出物、0.1g/L Tween 80および0.65mg/Lタラ肝脂肪酸メチルエステル)の液体培養物中でSE484を増殖させることによって実行した。実施例8で調製したSE484粉末を用いて、約10⁸CFU/mLの細胞密度で250mLのフラスコ中の50mLの液体培養物に接種し、培養物を30℃および250rpmで増殖させた。時間で、100μLの培養物を採取し、1xPBSを使用して10倍段階で連続希釈し、37℃で24hの増殖後、CFU評価のために30g/L TSB、15g/L NaClおよび15g/L寒天培地上に播種した。さらに、培養物の1mLのアリコートを、上清の収集のために12,000xgで10min、4℃で遠心分離した。これらの使用済み培地試料を96ウェルマイクロプレートに入れ、2倍段階を使用してTSB培地中で連続希釈した。使用済みブロスの連続希釈液を、2x10⁵CFU/mLで枯草菌168QCの1:1 v/vのTSB細菌懸濁液と混合し、マイクロプレートを37℃で16hインキュベートした。細菌増殖を示す、プレートの濁度を、視覚的に検査した。培地が半透明であったウェルを、高い抗細菌活性を含有するものと考え、そのような効果をもたらした、最も低い濃度の使用済みブロス、すなわち、最も高い希釈率を、試料の最小阻害濃度(MIC)と考えた。

SE351製剤化された生成物の調製
プラセボ製剤は、1%コロイド性オートミール(w/w)および2%D-アラニン(w/w)を添加したオレイルアルコール:セチルアルコール1:1(w/w)を含有し、セチルアルコールが完全に融解するまで60℃で全ての成分をインキュベートすることによって調製した。冷却および固化まで、混合物を手動で振とうさせた。最終プラセボ製剤を、ストマッカーバッグを用いて、20:1(w/w)の割合でSE351凍結乾燥粉末(実施例8のように調製)に添加した。簡単に述べると、細菌粉末をストマッカーバッグに入れ、ガラス棒を使用して穏やかに破砕した。次いで、製剤を添加し、細菌粉末および製剤を、バッグに対して外側に回転する動きの25回の上下サイクルを使用して、ガラス棒でホモジェナイズした。このプロセスにより、10¹⁰CFU/gの製剤が得られた。10¹⁰CFU/gの製剤のアリコートを、それぞれ、1:10および1:100w/wの割合で新鮮なプラセボと混合することによって、10⁹および10⁸CFU/gのより低い力価の製剤を得た。混合を、上記のように、ガラス棒を援用してストマッカーバッグ中で実行した。

ex vivoのブタ皮膚上での製剤化されたSE351による細菌生存および活性LEKTI産生
新鮮に調製された、毛剃りし、脱脂したブタ皮膚を、地元の肉屋から取得し、調製の24h以内に用いた。それぞれの実験のために、ブタ皮膚の大きい小片を、3つの36cm²の長方形の試料に分割し、それぞれの部分を、約10mg/cm²でプラセボまたはSE351製剤で処理した。簡単に述べると、製剤を皮膚に添加し、手袋で覆った指で圧迫した。次いで、塗布された製剤を、水平の動きで15回、擦って、皮膚の上に、軟膏の均一な薄いフィルムを形成させた。ブタ皮膚と保持された製剤との重量を決定した。SE351軟膏の塗布により、10⁶～10⁸CFU/cm²の細菌密度が得られた。次いで、皮膚片を30℃でインキュベートし、時間で、4cm²の領域を、垂直の向きに10回のストロークおよび水平の向きに10回のストロークを使用して、ポリエステルの先端のフロックスワブで擦った。それぞれの処置(プラセボおよびSE351)について、1時点あたり2セットのスワブを収集した:CFU/cm²の決定のために用いたセットは、収集後すぐにプロセシングしたが、タンパク質抽出物調製のために収集したセットはPrecellysホモジェナイゼーションチューブに入れ、使用まで-20℃で保存した。

CFU/cm²の決定のために、製剤で処置されたブタ皮膚から収集されたスワブを、15mLのFalconチューブにすぐに移し、そこで、それらを3g/L TSBおよび1%Triton X-100(w/v)の滅菌溶液0.5mLで処理した。チューブを1minボルテックスし、ホモジェネートのアリコートを、10倍段階の増分を使用してPBS中で連続希釈した。希釈された試料を、15g/L NaClを添加したTSB寒天プレート上に播種し、37℃で24h増殖させた。CFU含量を評価し、スワブした面積によって正規化した。

活性LEKTI測定のために調製されるタンパク質抽出物を、生化学的測定におけるマトリックスの境界面を除去するための広範囲清浄化手順によってブタ皮膚に由来する第2のセットのスワブから調製した。簡単に述べると、Precellysホモジェナイゼーションチューブ中のスワブを、1mLのホモジェナイゼーション溶液(90%メタノールv/vおよび0.5%ギ酸v/v)で処理した。チューブをキャップし、2,500rpmで30s、ビーズビーター中でホモジェナイズした。スワブをチューブから取り出し、ホモジェネートを12,000xgで20℃で5min遠心分離した。混合物の上清を収集し、完全に乾固するまで室温で3～4h、SpeedVacにかけた。乾燥ペレットを、250μLのホモジェナイゼーション溶液中に再懸濁し、1minにわたって超音波処理し、750μLの8Mグアニジン-HCl溶液で処理した。反転による混合後、250μLの純粋ヘキサンを各チューブに添加した後、5回の手動による反転を行った。チューブを12,000xgで5min、20℃で遠心分離し、残留製剤成分を含有する上側の相および境界面を廃棄した。製造業者の明細書に従って、下側の相を3kDaのAmicon濃縮器に移し、500μLの50mM Tris pH8.0で6回洗浄した。最終保持液を、水性50%アセトニトリル(v/v)、0.025%Brij-35(w/v)および0.25%ギ酸(v/v)の250μLを用いた逆スピンによってフィルターから除去した。懸濁した保持液を、室温で24h、SpeedVacにかけ、最終ペレットを50μLの0.25M Tris pH8.0中で再構成させた。これらの試料を、実施例2に記載されたような、KLK14阻害的活性および総トリプシン様活性の滴定のために使用した。
参照による組込み

特許出願文献、科学論文、政府報告、ウェブサイト、および本明細書に記載の他の参考文献を含む、それぞれの特許文献の開示全体が、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。用語において矛盾する場合、本明細書が制御する。本明細書に開示される全ての配列表、または配列番号は、その全体が本明細書に組み込まれる。

以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度で、参照により本明細書に具体的に組み込まれるものとする。

本発明の例示的実施形態を本明細書に記載してきたが、本発明は、記載されたものに限定されず、当業者であれば、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、様々な他の変更または改変を加えることができることが理解されるべきである。

Claims (46)

1以上の生きている微生物および第1の混合物を含む組成物であって、前記1以上の微生物が治療剤を産生し、前記第1の混合物が1以上の二糖類、1以上のオリゴ糖、および1以上の酸化防止剤を含み、前記組成物が少なくとも1x10¹⁰ CFU/gの生存能力を有する、前記組成物。

1以上の脂肪アルコールまたはアルコールをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

前記1以上の二糖類が、ラクトース、トレハロース、スクロース、マルトース、およびセロビオースからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。

前記1以上のオリゴ糖が、フルクト-オリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、マンナンオリゴ糖(MOS)、イソマルト-オリゴ糖、キシロ-オリゴ糖、ガラクト-オリゴ糖、およびラフィノースからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

前記1以上の酸化防止剤は、アスコルビン酸、ビタミンA、ビタミンE、a-カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、および親油性酸化防止剤の水溶性誘導体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

前記親油性酸化防止剤の水溶性誘導体が、アルファ-トコフェロールリン酸またはアルファ-トコフェロールポリエチレングリコールエステルである、請求項５に記載の組成物。

前記1以上の二糖類がラクトースであり、前記1以上のオリゴ糖がフルクト-オリゴ糖(FOS）であり、前記1以上の酸化防止剤がアスコルビン酸である、請求項１に記載の組成物。

前記1以上の脂肪アルコールが、飽和脂肪アルコールおよび不飽和脂肪アルコールからなる群から選択される、請求項２～７のいずれか１項に記載の組成物。

前記飽和脂肪またはアルコール酸がセチルアルコールであり、前記不飽和脂肪アルコールがオレイルアルコールである、請求項８に記載の組成物。

オレイルアルコールとセチルアルコールとの混合物が、約25%のオレイルアルコール/75%のセチルアルコールから約50%のオレイルアルコール/50%のセチルアルコール(w/w)の範囲である、請求項９に記載の組成物。

前記第2の混合物が、約1:1の比のオレイルアルコールおよびセチルアルコールを含む、請求項９に記載の組成物。

前記1以上の二糖類が約50%(w/w)～約55%(w/w)であり、前記1以上のオリゴ糖が約10%(w/w)～約15%(w/w)であり、前記1以上の酸化防止剤が約0.1%(w/w)～約2%(w/w)であり、前記1以上の微生物が約30%(w/w)～約35%(w/w)である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

微生物および第1の混合物の組成物は、約10:1の比であり、第2の混合物は、1以上の脂肪アルコールを含む、請求項２～１２のいずれか１項に記載の組成物。

前記第2の混合物が、コロイド性オートミールおよび/またはアルカリ性オートミール抽出物をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。

前記第2の混合物が、脂肪アルコールと組み合わせた場合、約1%(wt/wt)のコロイド性オートミールおよび約0.5%(wt/wt)のアルカリ性オートミール抽出物を含む、請求項１４に記載の組成物。

前記微生物が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、オエノコッカス(Oenococcus)、またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)およびその混合物からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。

前記微生物が、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)である、請求項１６に記載の組成物。

前記治療剤が、微生物によって天然に産生される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。

前記微生物が、治療剤を産生するように遺伝子操作されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。

前記治療剤が、ポリペプチド、低分子、および代謝物から選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。

前記治療剤が、1以上のLEKTIタンパク質ドメイン、フィラグリン、インターフェロン、エンケファリン、インターロイキン、および抗微生物剤からなる群から選択される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

前記1以上のLEKTIタンパク質ドメインが、LEKTI-d6である、請求項２１に記載の組成物。

前記1以上の抗微生物剤が、キチナーゼ、グルカナーゼ、またはペプチドグリカンヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。

前記微生物が、栄養要求性によって弱毒化されている、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。

前記微生物が、D-アラニン栄養要求株である、請求項２４に記載の組成物。

前記微生物が、alr1、alr2、およびdat遺伝子のうちの1以上の欠失を含む、請求項２５に記載の組成物。

前記組成物が、哺乳動物の皮膚に投与されるものである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合に、前記治療剤の発現が増加する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合に、前記治療剤の発現が、8時間後に、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、または少なくとも13倍である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合に、前記治療剤の発現が、8時間後に、少なくとも5倍である、請求項２９に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合に、前記治療剤の発現が、8時間後に、少なくとも10倍である、請求項２９に記載の組成物。

前記組成物が、少なくとも2.5x10¹⁰CFU/g、少なくとも5x10¹⁰CFU/g、少なくとも1x10¹¹CFU/g、少なくとも2.5x10¹¹CFU/g、少なくとも5x10¹¹CFU/g、少なくとも1x10¹²CFU/g、または少なくとも2.5x10¹²CFU/gの生存能力を有する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の組成物。

前記組成物が、約1x10¹⁰CFU/g～約1x10¹¹CFU/g、約5x10¹⁰CFU/g～約5x10¹¹CFU/g、約1x10¹¹CFU/g～約1x10¹²CFU/g、または約5x10¹¹CFU/g～約5x10¹²CFU/gの生存能力を有する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の組成物。。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、前記抗微生物活性が、8時間後に、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、または少なくとも5倍である、請求項２１又は２３に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、前記抗微生物活性が、8時間後に、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、または少なくとも12倍である、請求項２１又は２３に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、LEKTIタンパク質ドメイン活性が、8時間後に、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、または少なくとも5倍である、請求項２１又は２２に記載の組成物。

第2の混合物を含まない組成物と比較した場合、前記LEKTIタンパク質ドメイン活性が、24時間後に、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、または少なくとも12倍である。

請求項１～３７に記載の異組成物のいずれか1つ、および製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。

前記製薬上許容し得る担体が、水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される、請求項３８に記載の医薬組成物。

請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３８に記載の医薬組成物のいずれか1つを調製するための方法であって、
(a)前記1以上の微生物と、前記1以上の二糖類、前記1以上のオリゴ糖、および前記1以上の酸化防止剤を含む前記第1の混合物とを組み合わせるステップ;
(b)ステップ(a)の結果、得られる組成物を凍結乾燥するステップ;および
(c)前記1以上の脂肪アルコールを含む前記第2の混合物と、ステップ(b)の結果、得られる凍結乾燥組成物とを組み合わせるステップを含む、
前記方法。

対象における疾患、障害、または状態を処置する方法であって、対象に、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３８若しくは３９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

疾患、障害、または状態が、皮膚疾患または障害、炎症疾患、およびがんである、請求項４１に記載の方法。

皮膚疾患または障害が、ネザートン症候群、乾癬、にきび、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥肌、アレルギー、発疹、UV刺激性皮膚、洗剤刺激性皮膚、皮膚菲薄化、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑、脱毛症、および/または多毛症である、請求項４２に記載の方法。

疾患または障害が、疼痛と関連し、急性疼痛、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、外傷性疼痛、炎症性疼痛、術後切断痛、がんと関連する疼痛、骨折痛、骨粗鬆症性疼痛、骨肉腫疼痛、および痛風関節痛からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。

前記がんが、悪性黒色腫、結腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、口腔舌扁平上皮癌、扁平上皮がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、脳腫瘍および口腔がんからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。

微生物による治療剤の発現を増加させる方法であって、
(a)前記1以上の微生物と、前記1以上の二糖類、前記1以上のオリゴ糖、および前記1以上の酸化防止剤を含む第1の混合物とを組み合わせるステップ;
(b)ステップ(a)の結果、得られる組成物を凍結乾燥するステップ;および
(c) 前記1以上の脂肪アルコールを含む前記第2の混合物と、ステップ(b)の結果、得られる凍結乾燥組成物とを組み合わせるステップ
を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３８若しくは３９に記載の医薬組成物を調製することを含む、前記方法。

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