WO2023075430A1 - 큐티박테리움 속 균주를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents

큐티박테리움 속 균주를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023075430A1
WO2023075430A1 PCT/KR2022/016508 KR2022016508W WO2023075430A1 WO 2023075430 A1 WO2023075430 A1 WO 2023075430A1 KR 2022016508 W KR2022016508 W KR 2022016508W WO 2023075430 A1 WO2023075430 A1 WO 2023075430A1
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WO
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strain
gene encoding
cutibacterium
crispr
kda
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PCT/KR2022/016508
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신창식
이지영
권보은
김현정
김한설
박현경
최종은
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씨제이바이오사이언스 주식회사
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/318—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on skin health and hair or coat

Definitions

  • the present application relates to the use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof to prevent, improve, or treat inflammatory skin diseases.
  • the skin protects the human body from various oxidizing substances, air pollution, heavy metals, ultraviolet radiation (UV), etc., prevents bacteria, fungi, viruses, etc. from invading the skin, and acts as a protective barrier to prevent moisture loss.
  • the structure of the skin is largely classified into three layers: epidermis, dermis, and subcutaneous fat, and the dermis layer, which accounts for 90% of these, is composed of collagen, elastin, hyaluronic acid, and glycoproteins.
  • Collagen is an important fibrous protein that accounts for about 25% of the total protein mass in the human body, and accounts for most of connective tissue. It serves important functions such as providing
  • fatty acids, higher alcohols, and proteins in sebum, sweat, and cosmetic ingredients discharged from the body are decomposed into highly toxic substances by the skin flora present on the skin, which can cause skin inflammation.
  • various skin diseases such as acne, itching, dermatitis, and allergies are caused by exposure to secondary infection by pathogenic microorganisms due to damage to the skin barrier by ultraviolet rays of the sun.
  • Patent Document 1 KR 10-2032546 B1
  • Lrp / AsnC family transcriptional regulator Lrp / AsnC family transcriptional regulator
  • a gene encoding it Lrp / AsnC family transcriptional regulator
  • lactococcin 972 family bacteriocin lactococcin 972 family bacteriocin
  • Cutibacterium genus containing a gene encoding the same ( Cutibacterium ) strain.
  • Another object of the present application is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory skin diseases comprising the strain, culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another object of the present application is to provide an antibacterial composition for inflammatory skin disease-causing bacteria including the strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another object of the present application is to provide a food composition for preventing or improving inflammatory skin disease comprising the strain, culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another object of the present application is to provide a feed composition for preventing or improving inflammatory skin disease comprising the strain, culture of the strain, or a combination thereof.
  • the present application provides a novel strain of the genus Cutibacterium.
  • the present application provides a use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for the prevention, improvement, and/or treatment of inflammatory skin diseases.
  • An example of the present application provides a composition for preventing, improving, and/or treating inflammatory skin diseases including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • the composition may be a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, a food composition, or a feed composition.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating, and/or treating inflammatory skin diseases including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another example provides a food composition for preventing and/or improving inflammatory skin disease comprising a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • the food composition may be a food additive or health functional food.
  • Another example provides a feed composition for preventing and/or improving inflammatory skin disease comprising a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • the feed composition may be a feed additive.
  • Another example provides a cosmetic composition for preventing and/or improving inflammatory skin diseases, or for improving skin, including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another example is an inflammatory skin disease comprising administering an effective amount of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof to a subject in need of prevention, improvement, and/or treatment of the inflammatory skin disease.
  • Preventive, ameliorative, and/or therapeutic methods are provided.
  • Another example is a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a composition for preventing, improving, and/or treating inflammatory skin diseases of a combination thereof (e.g., pharmaceutical composition, cosmetic composition, food composition, or feed composition). ) It provides uses for use in the manufacture of
  • Another example provides the use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof to inhibit inflammatory skin disease-causing bacteria.
  • Another example provides an antibacterial composition for inflammatory skin disease-causing bacteria including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another example provides a method for inhibiting inflammatory skin disease-causing bacteria comprising applying an effective amount of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof to a subject in need of antibacterial action against the inflammatory skin disease-causing bacteria. do.
  • Another example provides a use for the preparation of an antibacterial composition against inflammatory skin disease-causing bacteria of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another example provides a disinfectant containing a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof as an active ingredient.
  • Another example provides the use of the strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for use in preparing a disinfectant.
  • Another example provides a disinfection method comprising applying the disinfectant to a subject in need of disinfection.
  • Another example provides a detergent containing a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof as an active ingredient.
  • Another example provides the use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for use in preparing a detergent.
  • Another example provides a cleaning method comprising applying the cleaning agent to a subject in need of cleaning.
  • One aspect provides a strain of the genus Cutibacterium.
  • the strains of the genus Cutibacterium may include all strains of the genus Cutibacterium.
  • the cutibacterium genus strain is selected from the group consisting of, for example, cutibacterium acnes ( C. acnes ), cutibacterium avidum ( C. avidum ), and cutibacterium granulosum ( C. granulosum ) It may be one or more (one, two, or three), but is not limited thereto.
  • the strain of the genus Cutibacterium may be C. acnes subspecies acnes (Type I), C. acnes subspecies defendens (Type II), or C. acnes subspecies elongatum (Type III), but is not limited thereto.
  • the strain of the genus Cutibacterium may be C. acnes subspecies defendens (Type II).
  • the ribotype of the Cutibacterium genus strain may be RT1, RT2, RT3, RT4, RT5, RT6, RT7, RT8, RT9, or RT10, but is not limited thereto.
  • the cutibacterium genus strain may be RT2.
  • the strain of the genus Cutibacterium may have a sequence type of 69 or 153.
  • the strain of the genus Cutibacterium may have a clonal complex (CC) of CC72 (Type II).
  • the cutibacterium genus strain the cutibacterium genus strain
  • (b) contains lactococcin 972 family bacteriocin (NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) and/or one or more (one or two) selected from the group consisting of genes encoding them; and/or or
  • One or more proteins (1, 2, 3, 4, 5, or 6) selected from the group consisting of (1) to (6) below and/or genes encoding them can be:
  • beta-glucuronidase NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1
  • a gene encoding it NBI Reference Sequence: WP_002518535.
  • type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) or a gene encoding the same;
  • type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1 or a gene encoding it, and
  • CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3 CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1 or a gene encoding the same.
  • the cutibacterium genus strain the cutibacterium genus strain
  • lactococcin 972 family bacteriocin (NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) and/or one or more (one or two) selected from the group consisting of genes encoding them,
  • One or more proteins (1, 2, 3, 4, 5, or 6) selected from the group consisting of (1) to (6) below and/or genes encoding them can be:
  • beta-glucuronidase NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1
  • a gene encoding it NBI Reference Sequence: WP_002518535.
  • type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) or a gene encoding the same;
  • type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1 or a gene encoding it, and
  • CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3 CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1 or a gene encoding the same.
  • the cutibacterium genus strain the cutibacterium genus strain
  • lactococcin 972 family bacteriocin (b) lactococcin 972 family bacteriocin (NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) or a gene encoding the same;
  • beta-glucuronidase NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1
  • a gene encoding it NBI Reference Sequence: WP_002518535.
  • type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) or a gene encoding the same;
  • type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1 or a gene encoding it, and
  • CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3 CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1 or a gene encoding the same.
  • the strain of the genus Cutibacterium may include a gene consisting of SEQ ID NO: 8 as 16S rRNA.
  • the cutibacterium genus strain may be selected from the group consisting of:
  • the strain selected from the group consisting of the CJRS-10651 strain, the CJRS-10652 strain, the CJRS-10653 strain, the CJRS-10654 strain, the CJRS-10655 strain, and the CJRS-10656 strain commonly contains the 16S rRNA of SEQ ID NO: 8 it could be
  • the CJRS-10651 strain may have accession number KCCM13032P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10651" by the depositor).
  • the CJRS-10652 strain may have accession number KCCM13033P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10652" by the depositor).
  • the CJRS-10653 strain may have accession number KCCM13034P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10653" by the depositor).
  • the CJRS-10654 strain may have accession number KCCM13035P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10654" by the depositor).
  • the CJRS-10655 strain may have accession number KCCM13036P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10655" by the depositor).
  • the CJRS-10656 strain may have accession number KCCM13037P (named " Cutibacterium acnes CJRS-10656" by the depositor).
  • culture of a strain of the genus Cutibacterium may mean a product obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium.
  • the culture of the strain of the genus Cutibacterium may be in a form in which the strain (cell) is removed or in which the strain is not removed.
  • the culture of the strain of the genus Cutibacterium in which the strain is not removed may include the strain of the genus Cutibacterium in the culture.
  • the culture may be a whole culture of a strain of the genus Cutibacterium, a dilution thereof, a concentrate, a dried product (eg, lyophilized product, etc.), a lysate, and/or a fraction thereof, and the concentrate is obtained by centrifuging the culture. It can be obtained by separation or evaporation, and the dried product can be obtained by drying the culture using a dryer, etc., and the lyophilisate can be obtained by freeze-drying the culture using a freeze dryer, etc.
  • the lysate may be obtained by physically or ultrasonically treating the strain or culture, and the fraction may be obtained by applying a method such as centrifugation or chromatography to the culture or lysate.
  • the culture may be in a solid phase (solid, eg, dry matter), liquid phase (liquid), or fluidized phase, but is not limited thereto.
  • the culture may refer to a cultured strain obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium for a certain period of time, a metabolite thereof, and/or an entire medium including extra nutrients.
  • the culture may be a cell-free culture obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium in a medium and then removing the microbial body (strain).
  • the microbial cell removal may be by a conventional method such as separation (eg, centrifugation), filtration, or the like, and may be, for example, by centrifugation.
  • the cell-free culture may be a supernatant obtained by centrifuging a culture obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium in a medium.
  • the culture may be a liquid (or culture filtrate) remaining after filtering a culture obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium in a medium or a cell-free culture from which the strain is removed.
  • the culture may be one in which the molecular weight of components included in the culture satisfies a specific numerical range.
  • the culture may be in a form in which the strain is removed or in a form in which the strain is not removed.
  • the culture has a molecular weight of 10 kDa or less, 9 kDa or less, 8 kDa or less, 7 kDa or less, 6 kDa or less, 5 kDa or less, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2.5 kDa or less, 2 kDa or less, 1.5 kDa or less, It may be 1 kDa or less, 0.5 kDa or less, but is not limited thereto.
  • kDa means kilodalton
  • dalton means atomic mass unit (g/mol).
  • “less than or equal to” should be construed as including a range exceeding zero.
  • 3 kDa or less may mean a numerical range of more than 0 and 3 kDa or less.
  • the culture has a molecular weight of 10 kDa or less, 9 kDa or less, 8 kDa or less, 7 kDa or less, 6 kDa or less, 5 kDa or less, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2.5 kDa or less, 2 kDa or less, 1.5 kDa or less. or less, 1 kDa or less, 0.5 kDa or less, or
  • filtration may be used interchangeably with “separation”, and may refer to all kinds of processes performed to obtain components included in the culture in a size or molecular weight within a specific numerical range.
  • the culture is 0.3 ⁇ m or less, 0.29 ⁇ m or less, 0.28 ⁇ m or less, 0.27 ⁇ m or less, 0.26 ⁇ m or less, 0.25 ⁇ m or less, 0.24 ⁇ m or less by using a filter cultured with a strain of the genus Cutibacterium.
  • 0.23 ⁇ m or less, 0.22 ⁇ m or less, 0.21 ⁇ m or less, or 0.2 ⁇ m or less may be a culture obtained by filtration, but is not limited thereto.
  • the culture may be a culture obtained by filtering a culture cultured with a strain of the genus Cutibacterium using a filter to 0.22 ⁇ m.
  • any filter commonly used for filtering the culture may be used without limitation.
  • the culture may be in a form in which the strain of the genus Cutibacterium is removed, or in a form in which it is not removed.
  • the culture is 10 kDa or less, 9 kDa or less, 8 kDa or less, 7 kDa or less, 6 kDa or less, 5 kDa or less, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2.5 kDa or less by using a filter for culturing a strain of the genus Cutibacterium.
  • 2 kDa or less, 1.5 kDa or less, 1 kDa or less may be a filtrate obtained by filtering to 0.5 kDa or less, but is not limited thereto.
  • the culture may be a culture culture obtained by culturing a strain of the genus Cutibacterium and filtering the culture to 3 kDa or less using a filter.
  • a filter any filter commonly used for filtering the culture may be used without limitation.
  • a culture obtained by filtration at a specific value of kDa or less may be mixed with an isolate obtained by separation at a specific value of kDa or less. That is, a culture obtained by filtering at a specific value of kDa or less (or an isolate obtained by separation) may mean that a substance included in the culture has a molecular weight of a specific value of kDa or less.
  • the culture obtained by filtration at 3 kDa or less may mean that substances included in the culture have a molecular weight of 3 kDa or less. That is, in the present specification, the culture obtained by filtration in a specific numerical range (kDa) may mean that all molecular weights of substances included in the culture satisfy the specific numerical range (kDa).
  • the culture is 10 kDa or less, 9 kDa or less, 8 kDa or less, 7 kDa or less, 6 kDa or less, 5 kDa or less, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2.5 kDa or less, 2 kDa or less, 1.5 kDa or less, 1 kDa or less, 0.5 kDa or less, or
  • the culture obtained by filtration within the above range may have excellent (1) prevention, improvement, and/or treatment effects of inflammatory skin diseases, and/or (2) antibacterial effects against acne-causing bacteria.
  • the culture of the strain of the genus Cutibacterium is a culture obtained by culturing the strain of the genus Cutibacterium in a medium for a certain period of time, or the culture is heat-treated (or sterilized (eg, autoclave or hot air drying)) It may be a culture containing dead cells of a strain of the genus Cutibacterium obtained by
  • culture refers to a series of activities for growing microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the culture may use any culture conditions and culture methods known in the art.
  • the culture may be carried out continuously in a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, batch process or fed batch or repeated fed batch process.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but a suitable pH (eg, pH 5 to 9, pH 6) using a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) to 8, or pH 6.8) can be adjusted.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters may be used to inhibit foam formation and/or oxygen or oxygen-containing gas mixtures may be introduced into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the culture temperature may be 20 to 45 ° C, 25 to 40 ° C, 30 to 40 ° C, 30 to 35 ° C, or 35 to 40 ° C
  • the culture conditions may be 100 to 500 rpm, 150 to 300 rpm, 150 to 300 rpm. 250 rpm, or 200 rpm
  • the incubation time (period) is 1 to 160 hours, 10 to 100 hours, 12 to 72 hours, 24 to 72 hours, 30 to 60 hours, 40 to 50 hours, 45 to 50 hours, or It can be 48 hours.
  • the culture may be performed at a culture temperature in the above range for a culture time in the above range.
  • the medium used for culture must meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner, and those skilled in the art can appropriately use it according to known contents.
  • the survival requirements of a specific strain can be met in an appropriate manner while controlling temperature, pH, etc. under anaerobic conditions in a normal medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, etc. there is.
  • Carbon sources that can be used in the medium include sugars and carbohydrates (eg, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, and cellulose), fats and fats (eg, glucose, sucrose, lactose, cellulose) , soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil), fatty acids (eg palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (eg glycerol and ethanol) and organic acids (eg acetic acid), etc. These may be used individually or in combination, but are not limited thereto.
  • sugars and carbohydrates eg, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, and cellulose
  • fats and fats eg, glucose, sucrose, lactose, cellulose
  • soybean oil sunflower oil, peanut oil and coconut oil
  • fatty acids eg palmitic acid, stearic acid and linole
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like may be used individually or in combination, but are not limited thereto. Potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and sodium-containing salts corresponding thereto may be used individually or in combination as a phosphorus source, but are not limited thereto.
  • the culture medium may contain other metal salts required for growth (eg, magnesium sulfate or iron sulfate) and/or may contain essential growth substances such as, but not limited to, amino acids and vitamins.
  • the strain of the genus Cutibacterium and / or the culture of the strain consists of anti-inflammatory activity, antibacterial activity, skin regeneration activity, skin moisturizing activity, and prevention, improvement, and / or treatment activity of inflammatory skin diseases. It may have at least one activity (one, two, three, four, or all five) selected from the group, or the activity may be enhanced.
  • the enhancement of activity may include both exhibiting activity that was not originally possessed, or exhibiting enhanced activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • anti-inflammatory activity may refer to any activity that reduces inflammation, such as inhibiting the occurrence of inflammation or reducing the degree of inflammation.
  • the anti-inflammatory activity inhibits the proliferation of inflammatory cells (eg, macrophages, etc.) that cause inflammation, or suppresses gene transcription or protein translation of inflammatory substances (eg, inflammatory cytokines, histamine, etc.) produced by inflammatory cells. activity such as inhibition.
  • the anti-inflammatory activity is inflammatory substances produced by an immune response (eg, inflammatory cytokines (interleukin-6, etc.), chemokine ligands (CCL2 (C-C Motif Chemokine Ligand 2, chemokine ligand 2), etc.), tumor necrosis factor) (TNF- ⁇ (tumor necrosis factor alpha), etc.) may mean reducing.
  • an immune response eg, inflammatory cytokines (interleukin-6, etc.), chemokine ligands (CCL2 (C-C Motif Chemokine Ligand 2, chemokine ligand 2), etc.), tumor necrosis factor) (TNF- ⁇ (tumor necrosis factor alpha), etc.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • antibacterial activity may mean an activity such as inhibiting and/or killing the growth of bacteria that cause inflammation.
  • the bacteria causing the inflammation may be bacteria causing inflammatory skin diseases.
  • the term “skin” may be a concept that includes not only the face, but also the scalp and the whole body.
  • skin improvement activity refers to skin regeneration, skin moisturizing, skin whitening, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin aging prevention, skin hydration, skin nutrition supply, skin tone improvement, pore reduction, skin texture improvement , exfoliation, skin volume improvement, scalp protection, scalp or skin sebum prevention, hair loss prevention, hair moisture supply, hair nutrition supply, hair volume improvement, skin protection (e.g., for relieving or improving skin inflammation, for improving skin itching, or for improving atopy), or skin condition improvement, and the like.
  • the skin improvement may be at least one selected from the group consisting of skin wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, skin moisturizing improvement, skin moisture supply, and skin nutrition supply.
  • the skin improvement may be at least one selected from the group consisting of scalp protection, hair loss prevention, hair moisture supply, and hair nutrition supply.
  • the skin improvement may mean improvement of sensitive skin.
  • the sensitive skin improvement is a skin reaction (eg, skin trouble) caused by temperature (eg, high or low temperature), wind, harmful substances (eg, fine dust, sebum, oil, bacteria, etc.), chemicals (eg, hormones, etc.) , immune response, inflammatory response, etc.) may be improved.
  • skin regeneration activity and “skin moisturizing activity” may refer to any activity that maintains a healthy skin condition or improves or promotes a skin condition deteriorated due to a disease.
  • the “skin regeneration activity” and “skin moisturizing activity” may promote or induce the growth of cells existing in the epidermis, dermis, and/or subcutaneous tissue of the skin.
  • a disease that exacerbates the skin condition may be an inflammatory skin disease.
  • the "skin regeneration activity” and “skin moisturizing activity” are to increase the expression level of skin regeneration related markers (eg proteins or genes such as Src or MMP2 (metalloproteinase-2)), respectively, or skin moisturizing related It may mean increasing the expression level of a marker (for example, a protein or gene such as HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3) or AQP3 (Aquaporin 3)).
  • a marker for example, a protein or gene such as HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3) or AQP3 (Aquaporin 3).
  • the strain of the genus Cutibacterium and / or the culture of the strain is not limited to the strain of the genus Cutibacterium and / or the culture of the strain
  • (b) does not contain lactococcin 972 family bacteriocin (NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) or one or more species (one or two species) selected from the group consisting of genes encoding them, and/or
  • beta-glucuronidase NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1
  • a gene encoding it NBI Reference Sequence: WP_002518535.
  • type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) or a gene encoding the same;
  • type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1 or a gene encoding it, and
  • CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3 CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1 or a gene encoding the same.
  • a pharmaceutical composition comprising a strain of the genus Cutibacterium and/or a culture thereof
  • Another aspect provides a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a pharmaceutical (red) composition for preventing, improving, and/or treating inflammatory skin diseases including a combination thereof.
  • Another example is an inflammatory skin disease comprising administering an effective amount of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof to a subject in need of prevention, improvement, and/or treatment of the inflammatory skin disease.
  • Preventive, ameliorative, and/or therapeutic methods are provided.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of a disease (disease) by administration of a composition according to one embodiment, and “treatment” is suspected of a disease by administration of a composition according to one embodiment. And means all actions that improve or beneficially change the symptoms of an affected subject, and “improvement” refers to all parameters related to the state in which the disease is treated by administration of the composition according to one embodiment, for example, all that at least reduces the severity of the symptoms. can mean action.
  • the disease may mean an inflammatory skin disease.
  • inflammatory skin disease refers to hair loss, Rosacea, skin redness, bumps, blisters, hives, itching, skin peeling, rash, allergic drug rash, non-allergic drug rash (e.g., antipsychotics) , tetracycline, sulfa antibiotics, hydrochlorothiazide, or drug rash caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)), Stevens-Johnson syndrome, toxic epidermal necrosis, erythema nodosum, erythema multiforme, keratosis pilaris, psoriasis, eczema, Bacterial dermatitis (e.g., dermatitis caused by bacteria of the genus Cutibacterium (e.g., Cutibacterium acnes, Cutibacterium avidum, and/or Cutibacterium granulosum)), viral dermatitis, atopic dermatitis, rosacea
  • NSAIDs
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment is not limited in the administration method as long as it can reach the target tissue.
  • parenteral administration such as, for example, intraperitoneal administration, intraperitoneal injection, intraarticular injection, intraarterial injection, intravenous injection, transdermal administration (eg applied to the scalp or skin), transdermal injection, topical application, intramuscular administration, intraperitoneal administration; , oral administration, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may further include suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition is formulated in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders (powders), granules, capsules, etc. These solid preparations contain at least one excipient in the composition, for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • a base for the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogeratin and the like may be used.
  • composition according to one embodiment can be administered in a pharmaceutically effective amount, and in the present application, "pharmaceutically effective amount” means to treat or prevent a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention. means a sufficient amount, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the administration time of the composition of the present application used, the route of administration and the excretion rate , duration of treatment, factors including drugs used in combination or simultaneous use with the composition of the present application used, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, or may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to one embodiment (based on the dry weight of the culture of the strain of the genus Cutibacterium) is, for example, about 0.0001 to 10000 mg/kg, 0.0001 to 5000 mg/kg, 0.0001 to 1000 mg/kg for one day in a mammal.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition provided herein may be mammals including humans, dogs, cats, horses, cows, pigs, goats, rabbits, mice, rats, etc., or cells, tissues, or cultures thereof isolated therefrom.
  • the subject requires prevention, improvement, and/or treatment of an inflammatory skin disease as described above, or an individual (a mammal such as a human) having an inflammatory skin disease or a cell or tissue isolated therefrom. , or a culture thereof.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment includes 1 to 80% by weight, 5 to 80% by weight, 5 to 75% by weight, 5 to 70% by weight, 5% by weight of the cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof. to 65% by weight, 50 to 70% by weight, 55 to 65% by weight, 60 to 65% by weight, 10 to 60% by weight, 15 to 60% by weight, 20 to 60% by weight, 1 to 50% by weight, 5 to 50% by weight 10 to 50% by weight, 15 to 50% by weight, 20 to 50% by weight, 1 to 40% by weight, 5 to 40% by weight, 10 to 40% by weight, 15 to 40% by weight, 20 to 40% by weight , 1 to 30% by weight, 5 to 30% by weight, 10 to 30% by weight, 15 to 30% by weight, 20 to 30% by weight, 1 to 25% by weight, 5 to 25% by weight, 10 to 25% by weight, 15 to 25% by weight, 20 to 25% by weight, or 23 to 25% by weight.
  • Another aspect provides a food composition for preventing and/or improving inflammatory skin diseases including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • the food composition may be a food itself, a food additive form added to food, or a health functional food.
  • the food composition according to one embodiment is meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamins It may mean a complex, health functional food, health food, etc., and includes all foods in a conventional sense.
  • the functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and means a food with high medical and medical effects processed to efficiently display bioregulatory functions in addition to nutrient supply. do.
  • “function” means obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the food of the present application can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art during the manufacture.
  • the formulation of the food may also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a food.
  • composition for food of the present application can be prepared in various types of dosage forms, and unlike general drugs, it has the advantage of using food as a raw material and has no side effects that may occur when taking drugs for a long time, and is excellent in portability. Of the foods can be consumed as supplements to enhance the effect of preventing or improving inflammatory skin diseases.
  • the health food means a food that has an active health maintenance or promotion effect compared to general food
  • health supplement food means a food for the purpose of health supplement.
  • the terms health functional food, health food, and health supplement food may be used interchangeably.
  • the health functional food is a food prepared by adding the composition according to the example to food materials such as beverages, teas, spices, gum, confectionery, etc., or encapsulated, powdered, suspended, etc., when ingested. It means to bring a specific effect, but unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that can occur when taking a drug for a long time by using food as a raw material.
  • the food composition according to one embodiment can be consumed on a daily basis, a high effect on preventing or improving inflammatory skin diseases can be expected, so it can be used very usefully.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • a physiologically acceptable carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions and can improve smell, taste, and vision.
  • vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like may be included.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chrome (Cr) may be included.
  • amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine may be included.
  • the food composition may include preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), bactericides (bleaching powder, high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butyl hydroxy Loxytoluene (BHT), etc.), coloring agents (tar color, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleaching agents (sodium sulfite, etc.), seasonings (MSG sodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcin, cyclemate, saccharin) , sodium, etc.), flavoring (vanillin, lactones, etc.), expanding agent (alum, D-potassium hydrogen stannate, etc.), strengthening agent, emulsifier, thickener (thickener), coating agent, gum base agent, foam inhibitor, solvent, improver, etc. food May contain food additives.
  • the additive may be
  • the composition according to one example may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present application may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less, based on the food or beverage when preparing food or beverage.
  • the amount below the above range may be included, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the food composition may be used as a health beverage composition, and in this case, as in conventional beverages, various flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional components.
  • the aforementioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; disaccharides such as maltose and sucrose; polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, or erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the ratio of the natural carbohydrates may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the health drink composition of the present application.
  • the health beverage composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, alginic acid salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or a carbonating agent, and the like. In addition, it may contain fruit flesh for the manufacture of natural fruit juice, fruit juice beverages, or vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present application.
  • the food composition according to one embodiment may contain various weight% if it can exhibit an effect of preventing or improving inflammatory skin disease, but, for example, the composition according to one embodiment may be 0.00001 to 100% by weight relative to the total weight of the food composition, or It may be included in 0.01 to 80% by weight, but is not limited thereto.
  • Feed composition comprising a cutibacterium genus strain and / or a culture thereof
  • Another aspect provides a feed composition for preventing and/or improving inflammatory skin disease comprising a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • feed may mean any natural or artificial diet, meal, etc., or a component of said meal, for or suitable for eating, ingesting, and digesting by an animal.
  • a feed composition for preventing and/or improving inflammatory skin disease comprising a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof is used as a feed itself or in the form of a feed additive added to the feed.
  • the type of feed is not particularly limited, and feeds commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meal or grain by-products;
  • Examples include animal feed such as proteins, inorganic materials, oils and fats, mineral products, single cell proteins, zooplankton, or food. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the feed composition may further include excipients, diluents, and/or additives.
  • the feed composition includes ingredients effective in promoting animal growth, nutrients, nutritional supplements, ingredients that increase storage stability, coating ingredients, amino acids for disease prevention, vitamins, enzymes, and non-protein nitrogen compounds.
  • the feed composition may further include other nutrients within a range expected by those skilled in the art.
  • the subject (animal) capable of feeding the feed containing the composition according to one embodiment is not particularly limited, but may be mammals, fish, crustaceans and / or shellfish, for example, pigs, cows, horses, goats, deer, It can be sheep, chicken, duck, goose, turkey, dog, cat, rabbit or fish.
  • the feed composition When used in the form of a feed additive, it may be prepared as a form in which the feed additive according to one example is added to a commercially available feed.
  • the feed in which the feed additive according to one embodiment may be used is preferably a powder or pellet formulation, or a liquid formulation, but is not limited thereto.
  • the amount of the feed additive of the present application added to the feed is not particularly limited.
  • the feed may be prepared by separately preparing the composition of the present application in the form of a feed additive and mixing it with feed, or by directly adding it during feed preparation.
  • the feed additive of the present application included in the feed may be in a liquid or dry state, for example, in a dry powder form.
  • the feed additive is 0.005 to 10% by weight, 0.05 to 10% by weight, 0.1 to 10% by weight, 0.005 to 5% by weight, 0.05 to 5% by weight, 0.1 to 5% by weight, 0.005 to 2% by weight, It may be included in an amount of 0.05 to 2% by weight, or 0.1 to 2% by weight, but is not limited thereto.
  • the feed may further include conventional additives capable of increasing the preservability of the feed in addition to the feed additives.
  • the feed to which the feed additive may be added is commercially available feed, grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meal, grain by-products, proteins, and inorganics. It may be selected from the group consisting of logistics, mineral species, single cell protein, zooplankton, leftover food, etc., but is not limited thereto.
  • Antibacterial composition comprising a cutibacterium genus strain and/or a culture thereof
  • Another aspect provides an antibacterial composition for inflammatory skin disease-causing bacteria including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • Another example provides a method for inhibiting inflammatory skin disease-causing bacteria comprising applying an effective amount of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof to a subject in need of antibacterial action against the inflammatory skin disease-causing bacteria. do.
  • Another example provides a use for the preparation of an antibacterial composition against inflammatory skin disease-causing bacteria of a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • antibacterial composition may mean a composition having antibacterial activity.
  • the antibacterial activity is as described above, and may mean inhibiting and/or killing the growth of inflammatory skin disease-causing bacteria.
  • the antibacterial activity may be used in combination with the antibiotic activity, and the antibacterial composition encompasses all types of preparations having the ability to inhibit growth and/or kill the bacteria causing inflammatory skin diseases, unless otherwise specified.
  • compositions, antibacterial agents, antibiotics, preservatives, bactericides and the like can be used interchangeably.
  • the inflammatory skin disease causing bacteria are Cutibacterium acnes ( C. acnes ), Cutibacterium avidum ( C. avidum ), Cutibacterium granulosum ( C. granulosum ), Staphylococcus aureus ( S. aureus ), Bacteroid fragilis ( B. fragilis ), and Staphylococcus epidermidis ( S. epidermidis ) At least one selected from the group consisting of (one, two, three, four, 5 species, or all 6 species), but is not limited thereto.
  • the inflammatory skin disease is as described above, and may be, for example, a disease such as acne or rosacea, but is not limited thereto.
  • Another example provides a disinfectant containing a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof as an active ingredient. Another example provides the use of the strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for use in preparing a disinfectant. Another example provides a disinfection method comprising applying the disinfectant to a subject in need of disinfection. Another example provides a detergent containing a cutibacterium genus strain, a culture of the strain, or a combination thereof as an active ingredient. Another example provides the use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for use in preparing a detergent. Another example provides a cleaning method comprising applying the cleaning agent to a subject in need of cleaning.
  • the disinfectant is a general term for agents for preventing pathogen infection, and is a general life disinfectant, a disinfectant for food and cooking places and facilities, a chicken farm, a building such as a barn, livestock, drinking water, litter, eggs, transport vehicles, tableware, etc. It can be used for disinfection of products and the like.
  • the antimicrobial composition has an antibacterial effect against the causative agent of inflammatory skin disease, for the purpose of washing (washing) the skin surface or each body part of an object exposed to or likely to be exposed to the inflammatory skin disease-causing bacteria can be applied
  • Another aspect provides a cosmetic composition for preventing and/or improving inflammatory skin diseases, or for improving skin, including a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof.
  • the cosmetic composition according to one embodiment may be a cosmetic composition or a composition for external application for skin, and such a cosmetic composition or composition for external application for skin has an anti-inflammatory or skin improving activity, such as promoting skin regeneration activity, and/or enhancing skin moisturizing activity (function). ) can have.
  • the skin improvement activity is as described above.
  • compositions for external application for skin or cosmetic composition there is no particular limitation on the formulation of the composition for external application for skin or cosmetic composition provided herein, and examples include solutions, suspensions (anhydrous and aqueous), emulsions (emulsion), pastes, gels, creams (oil-in-water type, oil-in-oil type). water-drop type, multi-phase, etc.), powder, ointment, patch, lotion, essence, gel, lotion, solution, anhydrous product (oil and glycol-based), mask, pack, powder, or gelatin-coated capsule (soft capsule, It can be formulated as a hard capsule) dosage form or a spray.
  • solutions suspensions (anhydrous and aqueous), emulsions (emulsion), pastes, gels, creams (oil-in-water type, oil-in-oil type). water-drop type, multi-phase, etc.), powder, ointment, patch, lotion, essence, gel, lotion, solution, anhydrous product (oil
  • the cosmetic composition is any one selected from the group consisting of solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, powders, ointments, patches, lotions, essences, gels, lotions, masks, packs, powders, capsules, and sprays It may be a formulation of
  • the skin in this application is a concept that includes not only the face, but also the scalp and the whole body.
  • a composition for external application for skin that can be applied to such a scalp there are shampoo, rinse, treatment, hair growth agent, etc., and body cleanser that can be applied to the whole body It can be manufactured in various forms for uses such as
  • the composition includes a conventional surfactant (emulsifier) and includes oil in water (O/W), water in oil (W/O), W/O/W, or O It may have the appearance of an emulsified or solubilized form of /W/O formulation.
  • the surfactant may be at least one selected from all surfactants commonly used in the preparation of compositions for external application for skin and/or cosmetic compositions, and for example, at least one selected from the group consisting of nonionic surfactants and anionic surfactants. However, it is not limited thereto.
  • the nonionic surfactant may be at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene surfactants, polyglycerin surfactants, sugar ester surfactants, and the like, and examples thereof include polyglyceryl-methylglucose distearate and polyglycerol.
  • Lyl-methylglucose stearate polyglyceryl-distearate (e.g., polyglyceryl-10 distearate, etc.), polyglyceryl-stearate, hydrogenated lecithin, cetearyl olivate, sorbitan olivate , PEG(poly(ethylene glycol))-stearates (e.g., PEG-100 stearate, PEG-40 stearate, etc.), glyceryl stearate, glyceryl stearate SE, decyl glucoside, coco-glucoside, lauryl Glucoside, caprylyl/caprylglucoside, arachidylglucoside, C12-20 (straight chain or branched) alkyl glucoside, cetearylglucoside, ceteareth (eg, ceteareth-20, etc.), steareth (eg, steareth-2, steareth-21, etc.), polyethylene
  • Anionic surfactants include sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, triethanolamine lauryl sulfate, polyoxyethylene sodium lauryl sulfate, polyoxyethylene ammonium lauryl sulfate, sodium cocoamphoacetate, ammonium laureth sulfate, ammonium Lauryl Sulfate, Cocamide MEA, Disodium Laureth Sulfosuccinate, TEA-Cocoyl Glutamate, Sodium Cocoyl Apple Amino Acid, Cocamide DEA, Sodium Laureth Sulfate, Sodium Lauryl Sulfate, Potassium Cocoyl Gly It may be at least one selected from the group consisting of cinate, sodium stearoyl glutamate, potassium cetyl phosphate, and the like, but is not limited thereto.
  • the composition for external application for skin and/or the cosmetic composition includes, in addition to a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof, components, oils, polymers, thickeners, additives, etc. It may include one or more selected from the group consisting of.
  • the components commonly included and their contents may be appropriately adjusted according to the desired function, properties, and the like of the composition.
  • the oil is a silicone oil such as cyclopentasiloxane, dimethicone, dimethicone, cyclomethicone, trisiloxane, amodimethicone, phenyltrimethicone, disiloxane, cyclohexasiloxane, PEG-dimethicone.
  • silicone oil such as cyclopentasiloxane, dimethicone, dimethicone, cyclomethicone, trisiloxane, amodimethicone, phenyltrimethicone, disiloxane, cyclohexasiloxane, PEG-dimethicone.
  • polysilicones e.g., polysilicone-11, etc.
  • simethicone diphenyldimethicone, PEG-9 polydimethicone at least one selected from the group consisting of siloxyethyl dimethicone;
  • Non-silicone oils such as caprylic/capric triglyceride, butylene glycol dicaprylate/dicaprate, hydrogenated polyisobutene, isopropyl myristate, cetylethylhexanoate, hydrogenated polydecene, at least one selected from the group consisting of diethoxyethylsuccinate, hexyllaurate, triethylhexanoin, isononylisononanoate, and polyisobutene; triglycerides; It may be one or more selected from the group
  • the polyol is butylene glycol, glycerin, glycereth (eg, glycereth-26, etc.), methyl propanediol, PEG (poly (ethylene glycol)) / PPG (poly (propylene glycol)) copolymers (eg, PEG /PPG-17/6 copolymer, etc.), methylgluses (e.g., methylgluses-20, etc.), dipropylene glycol, propylene glycol, propanediol, caprylyl glycol, pentylene glycol It may be one or more selected from the group consisting of and the like.
  • the thickener is carbomer, ammonium acryloyldimethyltaurate/Vpicopolymer, xanthan gum, sodium polyacrylate, hydroxyethyl cellulose, acrylate/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer, sodium polyacrylate, sodium It may be at least one selected from polymeric compounds composed of acrylate/sodium acryloyldimethyltaurate copolymer, magnesium aluminum silicate, and sodium carbomer.
  • the additives are ion sequestering agents, emulsion stabilizers, pH adjusting agents, skin conditioning agents, fragrances, preservatives, bactericides, oxidation stabilizers, antioxidants, free radical destroyers, and opaque agents commonly used in the manufacture of skin external preparations and/or cosmetics. It may include one or more selected from the group consisting of topical agents, stabilizers, emollients, vitamins, insect repellents, preservatives, anti-inflammatory agents, basicizing or acidifying agents, colorants (pigments), solubilizers, carriers, etc. Not limited.
  • the composition may include a solvent commonly used in the preparation of skin external preparations and/or cosmetic compositions, and the usable solvent may be selected from the group consisting of purified water, rock water, hot spring water, glacial water, sea water, deep sea water, plant extract water, and the like. It may be one or more, but is not limited thereto.
  • the composition may further include active ingredients that exert beneficial effects on skin (skin) care and/or hair/scalp care.
  • the advantageous effects include skin whitening, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin aging prevention, skin moisture supply, skin moisturizing, skin nutrition supply, pore reduction, skin texture improvement, exfoliation, skin volume improvement, scalp protection, scalp
  • it may mean prevention of skin sebum, prevention of hair loss, hair moisture supply, hair nutrition supply, hair volume improvement, etc., but is not limited thereto, and may be any effect desired in the skin/hair/scalp of the application target.
  • the active ingredient is various plant extracts (eg, hair extract, green tea extract, grape extract, lotus extract, tomato extract, gold silver flower extract, camellia extract, seaweed extract, etc.), plant callus culture or culture extract, yeast extract, cells Contains or cell-free yeast cultures or culture extracts, vitamins, various peptides, lipids, or fatty acids (eg, lipids, fatty acids, peptides, etc. derived from various fish and shellfish), hyaluronic acid, glycosides (eg, arbutin, etc.), and various other skin uses It may be one or more selected from the group consisting of compounds, etc., but is not limited thereto, and an appropriate active ingredient may be selected and used according to a desired effect.
  • the active ingredient may be a mixture of hydrogenated polyisobutene and hair extract, but is not limited thereto.
  • the product may be a product for skin, hair, and/or scalp care, for example, all types of cosmetics for application to the skin, scalp, hair, etc. of the face, hands, feet, whole body, etc. and/or for cleansing (cleansing ) product.
  • the product is skin, lotion, cream, essence, pack, foundation, color cosmetics, sunscreen (sunscreen), BB cream, two-way cake, face powder, compact, makeup base, skin cover, eye shadow, lipstick, cosmetics such as lip gloss, lip fix, eyebrow pencil, and lotion; And it may be at least one selected from the group consisting of shampoo, soap, cleansing foam, and cleaning products such as body cleanser.
  • Subjects of the cutibacterium genus strain provided herein, the culture of the strain, or a composition containing a combination thereof (pharmaceutical composition, cosmetic composition, food composition, feed composition, and/or antibacterial composition) and method May be a mammal, including humans, dogs, cats, horses, cows, pigs, goats, rabbits, mice, rats, etc., or cells, tissues, or cultures thereof isolated therefrom, and in one example, the subject is described above It may be an individual (mammal such as a human) or a cell, tissue, or culture thereof, which requires prevention, improvement, and/or treatment of an inflammatory skin disease, or has an inflammatory skin disease.
  • the present application relates to the use of a strain of the genus Cutibacterium, a culture of the strain, or a combination thereof for the prevention, improvement, and/or treatment of inflammatory skin diseases, the strain of the genus Cutibacterium, the culture of the strain, Or a composition comprising a combination thereof is excellent in preventing, improving, and/or treating inflammatory skin diseases.
  • CJRS-10651 shows the presence or absence of toxicity due to hemolytic activity of six strains (CJRS-10651, CJRS-10652, CJRS-10653, CJRS-10654, CJRS-10655, and CJRS-10656 strains; the same below) selected in this application. This is the result of a hemolytic test to confirm.
  • 2a and 2b are graphs shown in the form of a phylogenetic tree to confirm the common genetic characteristics of the six strains whose Ribotype is RT2 selected in the present application.
  • control group Cell only w/ stimuli; group inducing only inflammatory response
  • positive control group Dex treatment group after inducing inflammatory response
  • negative Control group negative Control group
  • control group type I (ATCC 6919), Type II (ATCC 11828), Type I (CJIN1-1), Type I (CJIN1-2 after inflammatory response induction) ), Type II (CJIN2-1), Type II (CJIN2-2), Type III (CJIN3-1), B. fragilis and S. epidermidis culture treatment group), compared to the immune response in immune cells (immunity It is a graph confirming cell proliferation and expression levels of IL-6, CCL2, and TNF-a).
  • Figure 5 is a graph confirming the antimicrobial activity (antimicrobial activity) for each of the acne-causing strain C. acnes (ATCC 6919) of the culture of the six strains selected in the present application. (NC: nothing treated, Doxy: group treated with doxycycline as a positive control group)
  • FIG. 6 is a graph confirming the biofilm formation inhibitory effect of each bacteria ( S. epidermidis ) of cultures of six strains selected in the present application. (NC: nothing treated, Doxy: group treated with doxycycline as a positive control group)
  • Figure 7 shows the cytotoxic effect when each of the cultures of the six strains selected in the present application is treated with concentrations (5% (v / v), 10% (v / v), 20% (v / v)) This is the graph confirming
  • 8a and 8b are pictures and graphs confirming skin efficacy (skin cell regeneration efficacy) when the cultures of the six strains selected in the present application are treated, respectively (0 hour, 4 hours, and 8 hours after wounding) .
  • FIGS. 9 and 10 show the expression level of skin regeneration-related markers Src and MMP2 (metalloproteinase-2), and skin moisturizing-related marker HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3) and the graph confirming the expression level of AQP3 (Aquaporin 3).
  • Figure 11 shows inflammatory cytokines (IL-6) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) secreted by Raw264.7 macrophages by culturing Raw264.7 macrophages with six strains (live bacteria) selected in the present application. The amount of secretion was calculated as the ratio of IL-10/IL-6 and shown as a graph. ( B. fragilis strain was used as a control.)
  • 14a, 14b, and 15 show skin erythema and epithelial tissue when cultures of two strains (CJRS-10652 strain and CJRS-10653 strain) selected in the present application were intraperitoneally administered to mice induced with Rosacea, respectively. These are graphs and photos confirming the degree of hyperplasia and skin inflammation.
  • CJRS-10652 strain and CJRS-10653 strain selected in the present application were intraperitoneally administered to mice induced with Rosacea, respectively.
  • 16 and 17 show the result of processing the strain culture selected in the present application on the skin model T&R HuSkin and confirming the expression levels of Filaggrin, a barrier improvement index, and Aquaporin-3, a moisturizing improvement index.
  • 18 and 19 are the results of treating the culture of the strain selected in the present application to human fibroblasts and confirming the presence or absence of cytotoxicity and collagen production function.
  • the sebum sample was diluted in PBS (10 0 to 10 3 ), streaked on an RCM agar plate, and then placed in an anaerobic gas pack jar and cultured at 37°C for 96 hours. 10 to 20 single colonies per individual plate were placed in RCM broth and activated in an anaerobic gas pack jar (37°C) for 24 hours. After 24 hours, 1% of the sample was inoculated into fresh RCM broth, put into an anaerobic gas pack jar, and cultured at 37°C for 48 hours to obtain a total of 1735 strains derived from human skin. The obtained strains were subjected to 16S rRNA and RecA sequencing using the primers listed in Table 1 below, and 166 specific C. acnes strains were selected based on sequencing. Six specific C. acnes strains were selected through macrophage-based proliferation and inflammatory markers (IL-6, CCL2, TNF- ⁇ ) inhibition test.
  • CJRS-10651 strain CJRS-10652 strain
  • CJRS-10653 strain CJRS-10654 strain
  • CJRS-10655 strain CJRS-10656 strain
  • CJRS-10656 strain commonly contain 16S rRNA of SEQ ID NO: 8. It was confirmed that The sequence type, ribotype, and immunological phenotype of the obtained strains were confirmed and are shown in Table 2 below.
  • the sequence type and ribotype of the obtained C. acnes strain were classified according to the eMLST analysis results of Example 2-2 below, and the immunological phenotype was based on the immunological index analysis results of Example 3-3 below.
  • the six strains selected in this application are CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain. It was confirmed that the strains have in common the characteristics that the sequence type is Type II, the ribotype is RT2, and the immunological phenotype is effective.
  • strains shown in Table 2 were cultured in RCM medium (BD Difco) or vegetable medium (the composition of the vegetable medium is shown in Table 3 below) for 48 hours, and then centrifuged using a centrifuge (4000g, 20 minutes, room temperature) to strain the strain. Except for the culture (Cell free supernatant) was obtained.
  • RCM medium BD Difco
  • vegetable medium the composition of the vegetable medium is shown in Table 3 below
  • the culture was filtered with a 0.22 ⁇ m pore size filter, and a culture filtered to 3 kDa or less was obtained through a 3 kDa amicon filter as the final test material.
  • the culture of the C. acnes (ATCC 6919) strain in Table 2 was adjusted to pH 7 as a substance for inducing an inflammatory response, and then the culture was filtered through a 0.22 ⁇ m pore size filter. prepared and used.
  • CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain The presence or absence of toxicity due to hemolytic activity of the six skin-derived strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain) selected in this application was examined. A hemolytic test was performed to confirm.
  • the skin-derived strains activated in RCM broth were plated on sheep blood agar, respectively, and incubated in an anaerobic chamber at 37° C. for 48 hours. It was confirmed that red blood cells were lysed around the colony to create a clear zone, and this is shown in FIG. 1 .
  • Example 2-1 Identification of phylogenetic features of strains.
  • C. acnes is known to have large genetic differences between strains within a species (intraspecies level). In fact, due to the large difference in genome between strains within a species, they are currently classified as the same C. acnes species, but type I is C. acnes subspecies acnes , type II is C. acnes subspecies defendens , and type III is C. acnes subspecies elongatum . It is suggested that it should be reclassified. These types also have different 16S rDNA sequences and are known to be divided into several ribotypes (RT) by the relative abundance of the skin metagenome of various people.
  • RT ribotypes
  • ribotype (RT) of the strains prepared in Experimental Example 1 was confirmed through whole genome sequencing (WGS) of each strain (these results are shown in Table 2 above).
  • Six strains CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain) with RT2 ribotype selected in this application, and NCBI genome site Using the whole genome data of 37 strains (reference strains) with ribotype RT2 obtained from , core and accessory genes were obtained based on the roary tool.
  • FIGS. 2a and 2b After confirming the phylogenetic features using the sequence of the whole genome, alignment was performed using the MUSCLE algorithm, and the tree shape was expressed using the maximum likelihood method, which is shown in FIGS. 2a and 2b. That is, a phylogenetic tree using the core gene set and a matrix-type picture including the core gene and accessory gene sets are shown in FIGS. 2A and 2B. The score on the edge is the confidence value obtained when the bootstrap is repeated 10,000 times.
  • the six strains selected in this application are written in red in a red box in FIG. 2a and indicated by left arrows, and the reference strain is written in black.
  • the JCM 18920 strain shown in black had an additional accessory gene compared to the 6 strains isolated in the present application, as can be seen in FIG. 2b. This point indicates that the JCM 18920 strain has a different appearance from the 6 strains isolated in this application, and it was confirmed that it is different from the 6 strains isolated in this application (this part is indicated by a downward arrow in FIG. 2b) ).
  • Example 2-2 Expanded Multi-locus Sequence Typing (eMLST) analysis of strains
  • eMLST analysis was performed using the eBURSTv3 program (http://eburst.mlst.net/default.asp) (Dreno et al. 2018). The eMLST analysis is to isolate using sequences of genes that are conserved in C. acnes strains and have improved phylogenetic resolution compared to 16S rRNA sequences.
  • STs divided into specific sequence types (STs) according to sequence variation of genes were grouped into specific clonal complexes (CCs) according to frequency as shown in Table 4 below.
  • ST is a method of dividing based on the diversity of sequences
  • CC is a method of classifying the divided STs into one cluster using differences in sequences.
  • Table 4 below shows the sequence type (ST) and clonal complex of selected RT2 C. acnes through eMLST analysis:
  • C. acnes strain KCOM 1861 ( ChDC B594) 17 4 2 4 2 12 10 28 6 CC6 (type II)
  • the six strains selected in this application were confirmed to have ST (sequence type) 69 or 153 as a result of eMLST analysis (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10654 strain) , CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain, ST 69, CC (clonal complex) CC72 (Type II), CJRS-10653 strain ST 153, CC NA (not confirmed)).
  • ST sequence type
  • the difference between ST 69 and ST 153 was identified as a difference in the single nucleotide sequence of camp2 , a gene related to hemolytic factor, and the difference was insignificant. It can be determined that it is close to CC72 (Type II), which is the CC of CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain.
  • CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, and CJRS-10656 strain have similar eMLST distributions
  • C. acnes JCM 18920 and C. acnes CA17 strains were identified as strains
  • the six strains selected in this application were found to be different from C. acnes JCM 18920 and C. acnes CA17 strains for the following reasons.
  • Example 2-1 the C. acnes JCM 18920 strain was different from the 6 strains selected in this application as it appeared to have an additional accessory gene, unlike the 6 strains selected in this application. .
  • BLASTP was used to select strain-specific genes through specific thresholds (identity > 40% and coverage > 80%), and genes that were not well-annotated as hypothetical proteins or specific family proteins were excluded.
  • a strain-specific literature search was conducted, and the genes mentioned in the literature related to C. acnes and immunophenotyping were divided into categories and organized. Some of these results are shown in Table 5 below.
  • CJRS-10651 strain CJRS-10652 strain
  • CJRS-10653 strain CJRS-10654 strain
  • CJRS-10655 strain CJRS-10655 strain
  • CJRS-10656 strain CJRS-10656 strain
  • the 6 strains whose ribotype is RT2 selected in this application are Lrp/AsnC family transcriptional regulators (NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) or genes encoding them , and lactococcin 972 family bacteriocin (NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) or a gene encoding the same.
  • the 6 strains whose ribotype is RT2 selected in this application do not contain beta-glucuronidase (NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) or a gene encoding it. It was confirmed that no It is well known that the beta-glucuronidase aggregates bile from the gallbladder to form stones and is known to cause colon cancer.
  • the 6 strains whose ribotype is RT2 selected in this application have 2-isopropylmalate synthase (NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) or a gene encoding it, and It was confirmed that it did not contain 3-isopropylmalate dehydratase (NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) or the gene encoding it (L-Leucine pathway was deleted).
  • NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1 2-isopropylmalate synthase
  • WP_002513330.1 3-isopropylmalate dehydratase
  • the six strains with RT2 ribotype selected in this application have type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) Or a gene encoding the same, a type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) or a gene encoding the same, and a CRISPR-associated helicaria It was confirmed that it did not contain CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3 (NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) or the gene encoding it.
  • Immune cells (Raw264. 7 macrophage) immune markers were confirmed.
  • Example 3-1 Immune cell culture
  • the immune cells used in this experiment were Raw264.7 (KCLB 40071) macrophages were used.
  • Raw264.7 macrophages were cultured and maintained in FBS 10% (v/v) DMEM.
  • FBS 10% (v/v) DMEM 18 hours before the experiment, Raw264.7 macrophages were seeded in a flat bottom 96 well plate at 5 x 10 4 /well.
  • Example 3-2 Strain culture and immune cell co-culture:
  • Raw264.7 macrophages were treated with a culture of the pathogen C. acnes (ATCC 6919) strain prepared in Experimental Example 2 at 5 ⁇ l/well and RPMI Media (gibco) 95 ⁇ l Put a total of 100 ⁇ l was treated for 1 hour in a 37 °C incubator.
  • all groups except for the normal cell (top left of FIG. 3, Cell only) group were treated with a culture of the pathogen C. acnes (ATCC 6919) strain at 5 ⁇ l/well to stimulate inflammation.
  • dexamethasone (sigma) (100 nM) (Dex in FIG. 3) was used.
  • normal cells Cell only
  • RPMI Media fresh RPMI Media
  • Inflammatory cytokines IL-6 (interleukin 6, interleukin 6), CCL2 (C-C Motif Chemokine Ligand 2, chemokine ligand 2) secreted from Raw264.7 macrophages using the obtained supernatant, TNF- ⁇ ( The amount of tumor necrosis factor alpha)
  • TNF- ⁇ The amount of tumor necrosis factor alpha
  • IL-6 interleukin 6, interleukin 6
  • CCL2 C-C Motif Chemokine Ligand 2, chemokine ligand 2 secreted from Raw264.7 macrophages using the obtained supernatant, TNF- ⁇ ( The amount of tumor necrosis factor alpha)
  • TNF- ⁇ The amount of tumor necrosis factor alpha
  • the lower graph of FIG. 3 shows the degree of proliferation of Raw264.7 macrophages that induce an inflammatory response in %, based on normal cells (Raw264.7 macrophages are not treated with anything; Cell only).
  • Raw264.7 macrophages were treated with a culture of the pathogen C. acnes (ATCC 6919) strain to induce an inflammatory response (Cell only w/ stimuli). .7 Increased proliferation of macrophages.
  • CJRS-10651 strain Cultures of six strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) selected in this application are known as acne-causing bacteria .
  • Antibacterial activity against acnes (ATCC 6919) was confirmed.
  • Doxycycline (0.025 ⁇ g/ml) was used as a positive control.
  • the C. acnes ATCC 6919 strain was diluted to 10 ⁇ 6 CFU/mL using RCM broth and 10% (v /v) inoculated. After inoculation of the strain, after incubation in an anaerobic camber at 37° C. for 48 hours, absorbance was measured at 600 nm, and the results are shown in FIG. 5 .
  • Figure 5 is a graph showing the growth inhibitory effect as % (Antimicrobial activity (% of inhibition)) based on the case where nothing was treated in the ATCC 6919 strain (Negative Control; NC).
  • the cultures of the six strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) selected in this application are the biosynthesis of S. epidermidis bacteria. It was confirmed that the film (biofilm) formation was inhibited. Doxycycline (Doxy) (4 ⁇ g/ml) was used as a positive control.
  • S. epidermidis bacteria stored in a deep freezer were taken out, inoculated into TSB (Tryptic Soy Broth, BD difco) at 3% (v/v), and cultured at 37° C. for 16 hours.
  • the grown culture medium was diluted to 1x10 7 CFU/mL in fresh TSB medium. Samples were prepared by diluting the lyophilized culture solution, which was the experimental group, with distilled water according to the concentration.
  • the supernatant except for the biofilm on the bottom of the strain plate was removed by suction.
  • Each well was washed once using 100 ⁇ l of 1XPBS solution.
  • the washed biofilm was stained using 0.1% crystal violet solution at room temperature without light for 20 minutes. After dyeing, it was washed using 100ul of 1XPBS solution.
  • the stained biofilm was removed from the plate using a 33% acetic acid solution.
  • the dissolved biofilm was evaluated for formation / inhibition through the value at OD570nm wavelength using an optical density plate reader, and these results are shown in FIG. 6.
  • CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain were each cultured in S. epidermidis bacteria. Even in the case of treatment, the effect of inhibiting biofilm formation was shown, and these results confirmed that the effect of using doxycycline (Doxy), a positive control, inhibits biofilm formation equal to or more than that.
  • Doxy doxycycline
  • HaCaT cells were attached to a 96-well cell culture plate at 2x10 ⁇ 4/well for 24 hours, and then broth (vegetable medium) was concentrated and added (0% (v/v) or 5% (v/v) ), 10% (v / v), or 20% (v / v)) (Negative Control; Broth), the cultures of the six strains selected in the present application were concentrated and added (5% (v / v) ), 10% (v/v), 20% (v/v)) 5% CO2, and incubated for 24 hours at 37°C. After 24 hours, the cultured cell medium was removed, the cells were treated with the cell counting kit-8 solution and reacted for 2 hours, and then the absorbance was measured at 450 nm with Tecan. Subsequently, the survival rate (cell viability) of the HaCaT cell line was calculated by converting the formula of O.D sample / O.D control ⁇ 100, and the results are shown in FIG. 7 .
  • CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS -10655 strain or CJRS-10656 strain did not affect the viability of HaCaT cells even when each treatment was performed, but rather, it was confirmed that the cell viability could be increased.
  • CJRS-10651 strain As shown in FIGS. 8A and 8B , six strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain) selected in the present application were compared to the case where nothing was treated on HaCaT cells (Cell only). , CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain), it was confirmed that wound closure was increased and the skin cell regeneration efficacy was excellent.
  • Src and MMP2 skin regeneration-related markers Src and MMP2 (metalloproteinase-2) was confirmed.
  • Increased Src activity means that regeneration of epidermal epithelial cells, dermal layer, and vascular endothelium is promoted, and MMP2 helps regeneration of extracellular matrix, which is important for tissue regeneration, and migration of cells important for re-epithelialization, such as keratinocytes and fibroblasts. It is known to play a role in promoting Src and MMP2 (metalloproteinase-2) was confirmed.
  • Src activity means that regeneration of epidermal epithelial cells, dermal layer, and vascular endothelium is promoted, and MMP2 helps regeneration of extracellular matrix, which is important for tissue regeneration, and migration of cells important for re-epithelialization, such as keratinocytes and fibroblasts. It is known to play a role in promoting
  • HaCaT cells were seeded in a 24-well cell culture plate in an amount of 1x10 ⁇ 5 and then cultured for 24 hours at 5% CO2 and 37°C. After 24 hours of cell culture, the medium is replaced with a medium that does not contain FBS, and nothing is treated (Cell only), or the 6 strains selected in this application (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS -10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) was added at 15% (v/v), respectively, and reacted for 24 h under 5% CO2 and 37 ° C conditions to confirm the expression of Src and MMP2 on RNA And the results are shown in Figure 9.
  • HaCaT cells were seeded in a 24 well cell culture plate in an amount of 1x10 ⁇ 5 and then cultured for 24 hours at 5% CO2 and 37 °C. After 24 hours of cell culture, the medium is replaced with a medium that does not contain FBS, and nothing is treated (Cell only), or the 6 strains selected in this application (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS -10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) were added at 15% (v/v) and reacted for 24 hours under 5% CO2 and 37°C conditions, and HAS3 (Hyaluronic Acid, a marker of skin moisturizing function) acid Synthase 3) and AQP3 (Aquaporin 3) expressions were confirmed on RNA, and the results are shown in FIG. 10 .
  • HAS3 Hydrouronic Acid, a marker of skin moisturizing function
  • CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain selected in this application were cultured in a vegetable medium (Table 3). After centrifugation (4000g, 20 minutes, room temperature), viable cells excluding strain cultures were obtained. After co-culture of the obtained viable cells and immune cells (Raw264.7 macrophages) at the same ratio (1:1) of 5x10 ⁇ 4 / well for 24 hours in a 96 well plate, the anti-inflammatory efficacy of the strain was confirmed.
  • a B. fragilis strain known as an anti-inflammatory strain was used as a control group. After measuring the amount of inflammatory cytokine (IL-6) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) secreted from Raw264.7 macrophages by ELISA, the value was calculated as the ratio of IL-10/IL-6, and 11 shows.
  • the six strains selected in the present application are B fragilis strain, it reduced the secretion of inflammatory cytokine (IL-6) and promoted the secretion of anti-inflammatory cytokine (IL-10), resulting in excellent overall anti-inflammatory activity.
  • Immunity index of immune cells when treating cultures of six strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) selected in this application confirmed.
  • the immune cells used in this experiment were mouse-derived marrow derived macrophages (mouse BMDM, Hanlim) and human monocyte derived macrophage (HMDM, ATCC). Cells were cultured under the following conditions one week prior to entering the experiment. Cells were cultured in BMDM with 10ng/ml of mouse M-CSF or HMDM with 50ng/ml of human M-CSF in 10% RPMI Media, and fresh RPMI Media containing M-CSF was changed every 3 days. 18 hours before the experiment, the immune cells to be tested were seeded in a flat bottom 96 well plate at 5 x 10 4 /well.
  • Mouse BMDM (FIG. 12) or HMDM (FIG. 13) in a 96-well cell culture plate was seeded 5x10 ⁇ 4/well using medium containing M-CSF, and then cultured for 24 hours at 5% CO2 and 37°C.
  • the culture of C. acnes (ATCC 6919) strain was treated with 5 ⁇ l/well, and 95 ⁇ l of RPMI Media was added to the immune cells, and a total of 100 ⁇ l was treated in a 37° C. incubator for 1 hour.
  • all groups except for the normal cell (Cell only) group were treated with cultures of C. acnes (ATCC 6919) strains to induce inflammation.
  • cell counting kit-8 (5 ⁇ l well) + fresh media (95 ⁇ l) was used to check the proliferation of the remaining immune cells, reacted in an incubator at 37°C for 2 hours, and then irradiated with 450nm. Absorbance was measured, and the degree of cell proliferation was expressed as % based on Cell only. The amount of cytokines (IL-6, IL-8) secreted from immune cells using the obtained cell supernatant was measured by ELISA.
  • Figure 13 is a result of confirming the secretion of inflammatory cytokines (IL-6, IL-8) using HMDM cells instead of mouse BMDM cells.
  • IL-6, IL-8 inflammatory cytokines
  • IL-6, IL-8 inflammatory cytokines
  • mice For this animal efficacy test, 32 5-week-old female BALB/c mice were purchased from Orient Bio Inc., brought into a breeding room with a 12-hour artificial photoperiod, acclimatized for one week, and then used in the experiment.
  • LL37 peptide (Peptron) was injected intradermally using an insulin syringe in an amount of 50 ⁇ l to induce rosacea lesions.
  • LL37 injection was performed twice a day for 2 days (a total of 4 times), and the culture of the strain (CJRS-10652 strain or CJRS-10653 strain) selected in this application was injected once a day by 150 ⁇ l at the same time as the second LL37 injection , administered intraperitoneally for 3 days (total 3 times).
  • Doxycycline one of the existing Rosacea treatment regimens, was intraperitoneally administered at 1 mg/kg once a day for 3 days (3 times in total).
  • the size (width) of erythema was measured using a caliper, and after euthanasia of the animal using CO2 gas, the extent of erythema was visually observed by taking a picture of the lesion area, and a photograph of the tissue and the area of inflammation were taken. The area of is graphically shown in FIGS. 14a and 14b.
  • the skin of the LL37 peptide administration site was extracted and used for tissue staining It was fixed in 4% formaldehyde (formaldehyde) solution and embedded in paraffin. After making sections from paraffin-embedded tissue, hematoxyline-eosin (H&E) staining was performed to observe histological changes and observed under a microscope. Histological photographs are shown in FIG. It is shown in Table 6 below.
  • mice were treated with cultures of the strains selected in the present application (CJRS-10652 strain or CJRS-10653 strain), respectively, it was confirmed that the increased epithelial hyperplasia and dermal inflammation were greatly reduced.
  • the main causes of skin wrinkles and aging include a collapsed barrier in the dermal layer of the skin, water loss, and reduced collagen production.
  • collagen is a major protein constituting the skin dermis and plays a role in maintaining skin structure and elasticity.
  • Collagen deficiency is one of the causes of skin wrinkles, and it is known that as aging progresses, its production decreases and its decomposition increases, leading to depression of the dermal layer of the skin to create wrinkles on the skin.
  • loss of moisture slows down skin regeneration, reduces elasticity, causes fine wrinkles, and accelerates skin aging. Therefore, skin wrinkle improvement and anti-aging effects can be confirmed by checking important indicators of skin barrier (Filaggrin) improvement, collagen (Procollagen type I) production level, and moisturizing (Aquaporin-3) improvement.
  • Inflammation was induced using poly I:C in T&R HuSkin, a skin 3D mini-tissue (organoid) manufactured by TNR Biofab Co., Ltd. Then, by applying the strain culture selected in this application, changes in skin improvement index (barrier improvement and moisturizing) were confirmed.
  • T&R HuSkin is a full thickness skin model composed of dermal and epidermal layers and was produced using 3DXPrinter bioprinter of T&R Biofab Co., Ltd.
  • bioink was printed by mixing porcine skin-derived extracellular matrix-based hydrogel and human-derived fibroblasts (fibroblast; Lonza, Basel, Switzerland) at a concentration of 100 ⁇ 10 ⁇ 4 cells/ml 37 It was gelled by exposing for 40 minutes in a °C incubator.
  • keratinocytes human-derived keratinocytes (keratinocytes; Lonza) were dispensed at 55 ⁇ 10 ⁇ 4 cells/insert on the gelated dermal layer and completely submerged in keratinocytes growth media (KGM; Lonza) for 1 day. cultured.
  • KGM keratinocytes growth media
  • ALI air-liquid interface
  • CJRS-10651, CJRS-10653, CJRS-10654, or CJRS-10655 strain culture treatment group recovered the expression level of Filaggrin to the same level as the normal control group (non-treated), and the CJRS-10656 strain In the case of the culture treated group, it was confirmed that the expression level of Filaggrin increased more than that of the normal control group (non-treated).
  • the six strains (CJRS-10651 strain, CJRS-10652 strain, CJRS-10653 strain, CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain) selected in the present application
  • the expression level of Aquaporin-3 increased more than equal to that of the negative control group (Poly I:C alone treatment).
  • the CJRS-10654 strain, CJRS-10655 strain, or CJRS-10656 strain culture treatment group recovered the expression level of Aquaporin-3 to the same level as that of the normal control group (non-treated).
  • human fibroblast cells CCD-986sk cells
  • human fibroblasts were used.
  • human fibroblasts were cultured and maintained in FBS 10% (v/v) DMEM.
  • human fibroblasts were seeded in a flat bottom 96 well plate at 1x10 4 /well.
  • the strain culture stock solution ((in Experiment 2, the strain culture was centrifuged and the culture except for the strain (cell free supernatant)) and the concentration of the strain culture filtered to 3 kDa or less prepared in Experiment 2 were 10, 20, After preparing using FBS 10% (v/v) DMEM to 30, 40% (v/v), add 100 ⁇ L each to a plate containing 100 ⁇ L of human fibroblasts to obtain a final concentration of 5, 10, 15, or 20% (v/v) (200 ⁇ L/well in total) and cultured in a 37° C. incubator for a total of 24 hours.
  • PIP Procollagen type I C-peptide

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Abstract

본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도에 관한 것으로, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 세포 독성을 보이지 않고, 피부염증을 유발하는 면역세포의 증식을 억제하고, 면역반응을 억제하며, 여드름 유발균에 대한 항균 효과가 있고, 피부세포의 재생을 촉진시켜 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.

Description

큐티박테리움 속 균주를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 또는 치료 용도에 관한 것이다.
피부는 각종 산화 물질, 대기오염, 중금속, 자외선 (ultraviolet radiation, UV) 등으로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 피부의 구조는 표피, 진피, 피하지방의 3개 층으로 크게 분류되며, 이 중 90% 차지하는 진피층은 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당 단백질로 구성되어 있다. 주요 구성물질 콜라겐은 인체의 단백질 총 질량 중 약 25%를 차지하는 중요한 섬유성 단백질로, 결체조직의 대부분을 차지하며, 세포간 매트릭스 역할, 구조적 지지체 기능, 세포의 분할과 분화 유도, 피부의 인장강도 제공 등의 중요한 기능을 한다.
뿐만 아니라, 체내로부터 배출된 피지성분, 땀 성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 등이 피부상에 존재하는 피부 상재균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 이들에 의해 피부염증이 유발될 수도 있으며, 태양의 자외선에 의한 피부장벽 손상으로 인한 병원성 미생물에 의한 2차 감염 노출로 여드름, 가려움, 피부염, 알레르기 발생 등 각종 피부질환을 유발한다는 것은 잘 알려진 사실이다.
이와 같은 각종 유해 환경으로부터 피부를 보호하기 위하여, 피부 유해균의 성장을 효과적으로 저해하면서 부작용이 없는 물질의 발굴 및 이를 적용한 의약품 및/또는 화장품의 개발이 요구된다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) KR 10-2032546 B1
본 출원의 목적은 (a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 큐티박테리움 속 (Cutibacterium) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원인은 여드름(acne), 로사세아(rosacea) 등의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 효과가 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물이 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 효과가 있음을 확인하고 본 출원을 완성하였다.
이에, 본 출원은 신규한 큐티박테리움 속 균주를 제공한다.
본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원의 일 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 일 예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 또는 사료 조성물일 수 있다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품 첨가제 또는 건강기능식품일 수 있다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 조성물은 사료 첨가제일 수 있다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용, 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물 (예컨대, 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 또는 사료 조성물)의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균을 억제하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환 원인균에 대한 억제 방법을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.
다른 예는 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 소독제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 소독제를 소독이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 세척제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 세척제를 세척이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다.
이하, 본 출원을 보다 자세히 설명한다.
큐티박테리움 속 균주 및 이의 배양물
일 양상은 큐티박테리움 속 균주를 제공한다.
본 명세서에서, 큐티박테리움 속 균주는 모든 큐티박테리움 속 균주를 포함할 수 있다. 상기 큐티박테리움 속 균주는 예를 들면, 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 및 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 또는 3종)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 C. acnes 아종 acnes (Type I), C. acnes 아종 defendens (Type II), 또는 C. acnes 아종 elongatum (Type III)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 C. acnes 아종 defendens (Type II)일 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 리보타입(Ribotype)이 RT1, RT2, RT3, RT4, RT5, RT6, RT7, RT8, RT9, 또는 RT10일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 RT2일 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는, 시퀀스 타입(Sequence type)이 69 또는 153인 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는, CC (clonal complex)가 CC72 (Type II)인 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하거나, 및/또는
하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)의 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있다:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하고,
하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)의 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있다:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는,
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하고,
하기 (1) 내지 (6)의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 16S rRNA로 서열번호 8로 이루어지는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다:
CJRS-10651,
CJRS-10652,
CJRS-10653,
CJRS-10654,
CJRS-10655, 및
CJRS-10656.
상기 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주로 이루어지는 군에서 선택된 균주는, 공통적으로 서열번호 8의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다.
상기 CJRS-10651 균주는 기탁번호 KCCM13032P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10651"로 명명)인 것일 수 있다.
상기 CJRS-10652 균주는 기탁번호 KCCM13033P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10652"로 명명)인 것일 수 있다.
상기 CJRS-10653 균주는 기탁번호 KCCM13034P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10653"으로 명명)인 것일 수 있다.
상기 CJRS-10654 균주는 기탁번호 KCCM13035P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10654"로 명명)인 것일 수 있다.
상기 CJRS-10655 균주는 기탁번호 KCCM13036P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10655"로 명명)인 것일 수 있다.
상기 CJRS-10656 균주는 기탁번호 KCCM13037P (기탁자에 의해 "Cutibacterium acnes CJRS-10656"으로 명명)인 것일 수 있다.
본 명세서에서, 큐티박테리움 속 균주의 "배양물"은 큐티박테리움 속 균주를 배양하여 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 큐티박테리움 속 균주의 배양물은 균주(균체)가 제거된 형태이거나, 균주가 제거되지 않은 형태일 수 있다. 상기 균주가 제거되지 않은 형태의 큐티박테리움 속 균주의 배양물은, 배양물 내 큐티박테리움 속 균주를 포함하는 것일 수 있다.
상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주의 전체 배양물, 이의 희석액, 농축물, 건조물 (예, 동결건조물 등), 파쇄물, 및/또는 분획물 등이 될 수 있으며, 상기 농축물은 상기 배양물을 원심분리 또는 증발시켜 수득할 수 있으며, 상기 건조물을 상기 배양물을 건조기 등을 이용하여 건조하여 수득할 수 있으며, 상기 동결건조물은 상기 배양물을 동결건조기 등을 이용하여 동결건조하여 수득할 수 있으며, 파쇄물은 상기 균주 또는 배양물을 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
상기 배양물은 고상(고체, 예를 들면 건조물), 액상(액체), 또는 유동상일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 일정기간 배양하여 얻은 배양된 균주, 이의 대사물, 및/또는 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 후 균체(균주)를 제거한 무세포 (cell-free) 배양물일 수 있다. 상기 균체 제거는 분리(예컨대, 원심분리), 여과 등의 통상적인 방법에 의한 것일 수 있으며, 예컨대, 원심분리에 의한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 무세포 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 배양물을 원심분리하여 얻어진 상등액 (supernatant)일 수 있다.
또한, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 배양하여 얻어진 배양물 또는 균주를 제거한 무세포 배양물을 여과한 뒤에 남은 액체(또는 배양여액)일 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분의 분자량이 특정 수치범위를 만족하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 균주가 제거된 형태이거나, 균주가 제거되지 않은 형태일 수 있다.
예컨대, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 kDa는 kilodalton을 의미하며, dalton은 원자 질량 단위(g/mol)를 의미한다. 또한 본 명세서에서, "이하"는 0을 초과하는 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예컨대, 3kDa 이하는 0 초과 3kDa 이하의 수치범위를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 배양물은 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하, 또는
0.5 내지 4kDa, 0.5 내지 3.75kDa, 0.5 내지 3.5kDa, 0.5 내지 3.25kDa, 0.5 내지 3kDa, 0.5 내지 2.75kDa, 0.5 내지 2.5kDa, 0.5 내지 2.25kDa, 0.5 내지 2kDa, 0.5 내지 1.75kDa, 0.5 내지 1.5kDa, 0.5 내지 1.25kDa, 0.5 내지 1kDa, 0.5 내지 0.75kDa, 0.75 내지 4kDa, 0.75 내지 3.75kDa, 0.75 내지 3.5kDa, 0.75 내지 3.25kDa, 0.75 내지 3kDa, 0.75 내지 2.75kDa, 0.75 내지 2.5kDa, 0.75 내지 2.25kDa, 0.75 내지 2kDa, 0.75 내지 1.75kDa, 0.75 내지 1.5kDa, 0.75 내지 1.25kDa, 0.75 내지 1kDa, 1 내지 4kDa, 1 내지 3.75kDa, 1 내지 3.5kDa, 1 내지 3.25kDa, 1 내지 3kDa, 1 내지 2.75kDa, 1 내지 2.5kDa, 1 내지 2.25kDa, 1 내지 2kDa, 1 내지 1.75kDa, 1 내지 1.5kDa, 1 내지 1.25kDa, 1.25 내지 4kDa, 1.25 내지 3.75kDa, 1.25 내지 3.5kDa, 1.25 내지 3.25kDa, 1.25 내지 3kDa, 1.25 내지 2.75kDa, 1.25 내지 2.5kDa, 1.25 내지 2.25kDa, 1.25 내지 2kDa, 1.25 내지 1.75kDa, 1.25 내지 1.5kDa, 1.5 내지 4kDa, 1.5 내지 3.75kDa, 1.5 내지 3.5kDa, 1.5 내지 3.25kDa, 1.5 내지 3kDa, 1.5 내지 2.75kDa, 1.5 내지 2.5kDa, 1.5 내지 2.25kDa, 1.5 내지 2kDa, 1.5 내지 1.75kDa, 1.75 내지 4kDa, 1.75 내지 3.75kDa, 1.75 내지 3.5kDa, 1.75 내지 3.25kDa, 1.75 내지 3kDa, 1.75 내지 2.75kDa, 1.75 내지 2.5kDa, 1.75 내지 2.25kDa, 1.75 내지 2kDa, 2 내지 4kDa, 2 내지 3.75kDa, 2 내지 3.5kDa, 2 내지 3.25kDa, 2 내지 3kDa, 2 내지 2.75kDa, 2 내지 2.5kDa, 2 내지 2.25kDa, 2.25 내지 4kDa, 2.25 내지 3.75kDa, 2.25 내지 3.5kDa, 2.25 내지 3.25kDa, 2.25 내지 3kDa, 2.25 내지 2.75kDa, 2.25 내지 2.5kDa, 2.5 내지 4kDa, 2.5 내지 3.75kDa, 2.5 내지 3.5kDa, 2.5 내지 3.25kDa, 2.5 내지 3kDa, 2.5 내지 2.75kDa, 2.75 내지 4kDa, 2.75 내지 3.75kDa, 2.75 내지 3.5kDa, 2.75 내지 3.25kDa, 2.75 내지 3kDa, 3 내지 4kDa, 3 내지 3.75kDa, 3 내지 3.5kDa, 3 내지 3.25kDa, 3.25 내지 4kDa, 3.25 내지 3.75kDa, 3.25 내지 3.5kDa, 3.5 내지 4kDa, 3.5 내지 3.75kDa, 또는 3.75 내지 4kDa 범위를 만족하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 배양물 내 포함되는 성분들의 분자량이 상기 수치범위를 만족하도록 하기 위하여 적절한 수단, 절차, 공정 등을 수행할 수 있으며, 예컨대 여과, 분리 과정 등을 수행할 수 있다. 본 명세서에서, "여과"는 "분리"와 상호 호환되어 혼용될 수 있으며, 배양물 내 포함되는 성분을 특정 수치범위의 크기 또는 분자량으로 획득하기 위하여 수행되는 모든 종류의 공정을 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 0.3μm 이하, 0.29μm 이하, 0.28μm 이하, 0.27μm 이하, 0.26μm 이하, 0.25μm 이하, 0.24μm 이하, 0.23μm 이하, 0.22μm 이하, 0.21μm 이하, 또는 0.2μm 이하로 여과하여 수득한 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 0.22μm로 여과하여 수득한 배양물일 수 있다. 본 명세서에서 "이하"는 0을 초과하는 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다 (예컨대, "0.3μm 이하"는 0 초과 0.3μm 이하의 수치범위를 의미함). 상기 필터는 상기 배양물을 여과하는데 통상적으로 사용되는 것이라면 어느 것이든 제한없이 사용할 수 있다. 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주가 제거된 형태이거나, 제거되지 않은 형태일 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하로 여과하여 수득한 여과물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 3kDa 이하로 여과한 배양물일 수 있다. 상기 필터는 상기 배양물을 여과하는데 통상적으로 사용되는 것이라면 어느 것이든 제한없이 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 특정 수치의 kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물은 특정 수치의 kDa 이하로 분리하여 수득한 분리물로 혼용하여 사용될 수 있다. 즉, 특정 수치의 kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물(또는 분리하여 수득한 분리물)은, 상기 배양물 내 포함되는 물질이 특정 수치의 kDa 이하의 분자량을 가진 것임을 의미하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 3kDa 이하로 여과하여 수득한 배양물은, 상기 배양물 내 포함되는 물질이 3kDa 이하의 분자량을 가진 것임을 의미하는 것일 수 있다. 즉, 본 명세서에서 특정 수치범위(kDa)로 여과하여 수득한 배양물이라 함은, 상기 배양물 내 포함되는 물질의 분자량이 모두 상기 특정 수치범위(kDa)를 만족하는 것을 의미할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배양한 배양물을 필터를 이용하여 10kDa 이하, 9kDa 이하, 8kDa 이하, 7kDa 이하, 6kDa 이하, 5kDa 이하, 4kDa 이하, 3kDa 이하, 2.5kDa 이하, 2kDa 이하, 1.5kDa 이하, 1kDa 이하, 0.5kDa 이하, 또는
0.5 내지 4kDa, 0.5 내지 3.75kDa, 0.5 내지 3.5kDa, 0.5 내지 3.25kDa, 0.5 내지 3kDa, 0.5 내지 2.75kDa, 0.5 내지 2.5kDa, 0.5 내지 2.25kDa, 0.5 내지 2kDa, 0.5 내지 1.75kDa, 0.5 내지 1.5kDa, 0.5 내지 1.25kDa, 0.5 내지 1kDa, 0.5 내지 0.75kDa, 0.75 내지 4kDa, 0.75 내지 3.75kDa, 0.75 내지 3.5kDa, 0.75 내지 3.25kDa, 0.75 내지 3kDa, 0.75 내지 2.75kDa, 0.75 내지 2.5kDa, 0.75 내지 2.25kDa, 0.75 내지 2kDa, 0.75 내지 1.75kDa, 0.75 내지 1.5kDa, 0.75 내지 1.25kDa, 0.75 내지 1kDa, 1 내지 4kDa, 1 내지 3.75kDa, 1 내지 3.5kDa, 1 내지 3.25kDa, 1 내지 3kDa, 1 내지 2.75kDa, 1 내지 2.5kDa, 1 내지 2.25kDa, 1 내지 2kDa, 1 내지 1.75kDa, 1 내지 1.5kDa, 1 내지 1.25kDa, 1.25 내지 4kDa, 1.25 내지 3.75kDa, 1.25 내지 3.5kDa, 1.25 내지 3.25kDa, 1.25 내지 3kDa, 1.25 내지 2.75kDa, 1.25 내지 2.5kDa, 1.25 내지 2.25kDa, 1.25 내지 2kDa, 1.25 내지 1.75kDa, 1.25 내지 1.5kDa, 1.5 내지 4kDa, 1.5 내지 3.75kDa, 1.5 내지 3.5kDa, 1.5 내지 3.25kDa, 1.5 내지 3kDa, 1.5 내지 2.75kDa, 1.5 내지 2.5kDa, 1.5 내지 2.25kDa, 1.5 내지 2kDa, 1.5 내지 1.75kDa, 1.75 내지 4kDa, 1.75 내지 3.75kDa, 1.75 내지 3.5kDa, 1.75 내지 3.25kDa, 1.75 내지 3kDa, 1.75 내지 2.75kDa, 1.75 내지 2.5kDa, 1.75 내지 2.25kDa, 1.75 내지 2kDa, 2 내지 4kDa, 2 내지 3.75kDa, 2 내지 3.5kDa, 2 내지 3.25kDa, 2 내지 3kDa, 2 내지 2.75kDa, 2 내지 2.5kDa, 2 내지 2.25kDa, 2.25 내지 4kDa, 2.25 내지 3.75kDa, 2.25 내지 3.5kDa, 2.25 내지 3.25kDa, 2.25 내지 3kDa, 2.25 내지 2.75kDa, 2.25 내지 2.5kDa, 2.5 내지 4kDa, 2.5 내지 3.75kDa, 2.5 내지 3.5kDa, 2.5 내지 3.25kDa, 2.5 내지 3kDa, 2.5 내지 2.75kDa, 2.75 내지 4kDa, 2.75 내지 3.75kDa, 2.75 내지 3.5kDa, 2.75 내지 3.25kDa, 2.75 내지 3kDa, 3 내지 4kDa, 3 내지 3.75kDa, 3 내지 3.5kDa, 3 내지 3.25kDa, 3.25 내지 4kDa, 3.25 내지 3.75kDa, 3.25 내지 3.5kDa, 3.5 내지 4kDa, 3.5 내지 3.75kDa, 또는 3.75 내지 4kDa로 여과하여 수득한 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 범위로 여과하여 수득한 배양물은 (1) 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과, 및/또는 (2) 여드름 유발균에 대한 항균 효과가 우수한 것일 수 있다.
일 예에서, 큐티박테리움 속 균주의 배양물은 큐티박테리움 속 균주를 배지에서 일정기간 배양하여 얻은 배양물이거나, 상기 배양물을 열처리(또는 멸균(예를 들면, 오토클레이브 또는 열풍건조))하여 수득된 큐티박테리움 속 균주의 사균체가 포함된 배양물일 수 있다.
본 명세서에서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 상기 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양은 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, pH 6 내지 8, 또는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 일 예에서, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고/있거나, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다
일 예에서, 배양 온도는 20 내지 45℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 30 내지 35℃, 또는 35 내지 40℃일 수 있고, 배양 조건은 100 내지 500 rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 250rpm, 또는 200rpm일 수 있으며, 배양 시간(기간)은 1 내지 160 시간, 10 내지 100시간, 12 내지 72 시간, 24 내지 72시간, 30 내지 60시간, 40 내지 50시간, 45 내지 50시간, 또는 48시간일 수 있다. 일 예에서 배양은 상기 범위의 배양 온도에서 상기 범위의 배양 시간 동안 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며 당업자는 공지된 내용에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
상기 큐티박테리움 속 균주를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시킬 수 있다. 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예를 들면, 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예를 들면, 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예를 들면, 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 기타 금속염(예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있고/있거나 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물의 효과
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주 및/또는 상기 균주의 배양물은 항염증 활성, 항균 활성, 피부 재생 활성, 피부 보습 활성, 및 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 또는 5종 모두)의 활성을 가지는 것이거나, 상기 활성이 강화된 것일 수 있다. 상기 활성 강화는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항염증 활성"은 염증 발생을 억제하거나, 염증의 정도를 경감하는 등 염증을 감소시키는 모든 활성을 의미할 수 있다. 일 예에서 상기 항염증 활성은 염증을 유발하는 염증 세포(예컨대, 대식 세포 등)의 증식을 억제하거나 염증 세포가 생성하는 염증 물질(예컨대, 염증성 사이토카인, 히스타민 등)의 유전자 전사 억제 또는 단백질 번역 억제 등의 활성을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 항염증 활성은 면역 반응으로 생성된 염증 물질(예컨대, 염증성 사이토카인(인터류킨-6 등), 케모카인 리간드(CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2, 케모카인 리간드 2) 등), 종양괴사인자(TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 등) 등)을 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 상기 염증은 염증성 피부질환으로 인한 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "항균 활성"은 염증을 유발하는 세균의 성장을 저해하거나, 및/또는 사멸시키는 등의 활성을 의미할 수 있다. 상기 염증을 유발하는 세균은 염증성 피부질환 유발균일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "피부"는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "피부 개선 활성"은 피부 재생, 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 수분 공급, 피부 영양 공급, 피부 톤 개선, 모공 축소, 피부결 개선, 각질 제거, 피부 볼륨 개선, 두피 보호, 두피 또는 피부의 피지 방지, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 모발 영양 공급, 모발 볼륨 개선, 피부 보호 (예컨대, 피부 염증 완화 또는 개선용, 피부 가려움증 개선용, 또는 아토피 개선용), 또는 피부 상태 개선 등을 모두 포함하는 개념일 수 있다.
상기 피부 개선은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 노화 방지, 피부 보습 개선, 피부 수분 공급, 및 피부 영양 공급으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 피부 개선은 두피 보호, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 및 모발 영양 공급으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 피부 개선은 민감성 피부 개선을 의미할 수 있다. 상기 민감성 피부 개선은, 온도 (예컨대, 고온 또는 저온), 바람, 유해물질 (예컨대, 미세먼지, 피지, 기름, 세균 등), 화학물질 (예컨대, 호르몬 등)에 의하여 일어나는 피부 반응 (예컨대 피부 트러블, 면역 반응, 염증 반응 등)을 개선하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 피부 상태를 건강한 상태로 유지하거나 질환으로 인해 악화된 피부 상태를 개선하거나 증진하는 모든 활성을 의미할 수 있다. 상기 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 피부의 표피, 진피, 및/또는 피하 조직에 존재하는 세포들의 증식을 촉진하거나 생장을 유도하는 것일 수 있다. 상기 피부 상태를 악화시키는 질환은 염증성 피부질환일 수 있다. 일 예에서, 상기 "피부 재생 활성" 및 "피부 보습 활성"은 각각 피부 재생 관련 마커(예컨대 Src 또는 MMP2 (metalloproteinase-2) 등의 단백질 또는 유전자)의 발현량을 증가시키는 것이거나, 피부 보습 관련 마커(예컨대 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3) 또는 AQP3 (Aquaporin 3) 등의 단백질 또는 유전자)의 발현량을 증가시키는 것 등을 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 큐티박테리움 속 균주 및/또는 상기 균주의 배양물은
(a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (1종 또는 2종)을 포함하지 않거나, 및/또는
하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 균주(예컨대, 큐티박테리움 속 균주) 및/또는 이의 배양물과 비교하여, 상기 활성이 우수할 수 있다:
(1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자,
(5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
(6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 약학 조성물
다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 약학(적) 조성물을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 출원에서, "예방"이란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환(질병)의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란, 일 예에 따른 조성물의 투여로 질환이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 상기 질환은 염증성 피부질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, "염증성 피부질환"은 탈모, 로사세아(Rosacea), 피부 붉어짐, 돌기, 물집, 두드러기, 가려움, 피부 벗겨짐, 발진, 알러지성 약물 발진, 비알러지성 약물 발진 (예컨대, 항정신병약, 테트라사이클린, 술파제 항생제, 히드로클로로티아지드, 또는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)에 의한 약물 발진), 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 세균성 피부염(예컨대, 큐티박테리움 속 세균(예컨대, 큐티박테리움 아크네, 큐티박테리움 아비덤, 및/또는 큐티박테리움 그래눌로섬)에 의한 피부염), 바이러스성 피부염, 아토피 피부염, 주사피부염, 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여 방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 복강 투여, 복강 주사, 관절강 내 주사, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 투여(예컨대, 두피 또는 피부에 도포), 경피 주사, 국소 도포, 근육 투여, 복막내 투여와 같은 비경구 투여이거나, 경구 투여일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제(분말제), 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고상 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있고, 본 출원에서, "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 출원 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 출원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
일 예에 따른 약학 조성물의 투여량 (큐티박테리움 속 균주의 배양물의 건조물 중량 기준)은 예를 들면, 포유동물에 하루 동안 약 0.0001 내지 10000mg/kg, 0.0001 내지 5000mg/kg, 0.0001 내지 1000mg/kg, 0.0001 내지 900mg/kg, 0.0001 내지 800mg/kg, 0.0001 내지 700mg/kg, 0.0001 내지 600mg/kg, 0.0001 내지 500mg/kg, 0.0001 내지 400mg/kg, 0.0001 내지 300mg/kg, 0.0001 내지 200mg/kg, 1 내지 1000mg/kg, 1 내지 900mg/kg, 1 내지 800mg/kg, 1 내지 700mg/kg, 1 내지 600mg/kg, 1 내지 500mg/kg, 1 내지 450mg/kg, 1 내지 400mg/kg, 1 내지 350mg/kg, 1 내지 300mg/kg, 1 내지 250mg/kg, 10 내지 1000mg/kg, 10 내지 900mg/kg, 10 내지 800mg/kg, 10 내지 700mg/kg, 10 내지 600mg/kg, 10 내지 500mg/kg, 10 내지 450mg/kg, 10 내지 400mg/kg, 10 내지 350mg/kg, 10 내지 300mg/kg, 10 내지 250mg/kg, 100 내지 1000mg/kg, 100 내지 900mg/kg, 100 내지 800mg/kg, 100 내지 700mg/kg, 100 내지 600mg/kg, 100 내지 500mg/kg, 100 내지 450mg/kg, 100 내지 400mg/kg, 100 내지 350mg/kg, 100 내지 300mg/kg, 100 내지 250mg/kg, 200 내지 1000mg/kg, 200 내지 900mg/kg, 200 내지 800mg/kg, 200 내지 700mg/kg, 200 내지 600mg/kg, 200 내지 500mg/kg, 200 내지 450mg/kg, 200 내지 400mg/kg, 200 내지 350mg/kg, 200 내지 300mg/kg, 또는 200 내지 250mg/kg으로 투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 약학 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 출원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있으며, 일 예에서 상기 대상은 앞서 설명한 바와 같은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하거나, 염증성 피부질환을 가지는 개체 (인간 등의 포유동물) 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있다.
일 예에 따른 약학 조성물은 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 1 내지 80중량%, 5 내지 80중량%, 5 내지 75중량%, 5 내지 70중량%, 5 내지 65중량%, 50 내지 70중량%, 55내지 65중량%, 60 내지 65중량%, 10 내지 60중량%, 15 내지 60 중량%, 20 내지 60 중량%, 1 내지 50중량%, 5 내지 50중량%, 10 내지 50중량%, 15 내지 50 중량%, 20 내지 50 중량%, 1 내지 40중량%, 5 내지 40중량%, 10 내지 40중량%, 15 내지 40 중량%, 20 내지 40 중량%, 1 내지 30중량%, 5 내지 30중량%, 10 내지 30중량%, 15 내지 30 중량%, 20 내지 30 중량%, 1 내지 25중량%, 5 내지 25중량%, 10 내지 25중량%, 15 내지 25중량%, 20 내지 25중량%, 또는 23 내지 25중량%로 포함할 수 있다.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물
또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품 자체이거나, 식품에 첨가되는 식품 첨가제 형태이거나, 또는 건강 기능 식품일 수 있다.
일 예에 따른 식품 조성물은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등을 의미할 수 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 출원의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 출원의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 출원의 식품은 염증성 피부질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반 식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 알 예에 따른 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
일 예에 따른 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 염증성 피부질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 출원의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강 음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강 음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
일 예에 따른 식품 조성물은 염증성 피부질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 예를 들면, 일 예에 따른 조성물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물
또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용 사료 조성물은 사료 자체로 사용되거나, 사료에 첨가되는 사료 첨가제 형태로 사용될 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 부형제, 희석제, 및/또는 첨가제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 상기 구성 성분 외에도 동물의 성장 촉진에 유효한 성분, 영양 성분, 영양 보조 성분, 보존 안정성을 높이는 성분, 피복제 성분, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 생균제; 아밀라아제, 리파아제 등의 효소; L-아스코르브산, 염화콜린, 이노시톨 등의 비타민; 염화칼륨, 시트르산철, 산화마그네슘, 인산염류 등의 미네랄; 리신, 알라닌, 메티오닌 등의 아미노산; 푸마르산, 부티르산, 락트산 등의 유기산 또는 이의 염; 비타민 C, 비타민 E 등의 항산화제, 프로피온산칼슘 등의 곰팡이 방지제; 레시틴, 글리세린 지방산 에스테르 등의 유화제; 및/또는 색소 등을 포함할 수 있다. 상기에 기술되지 않았더라도 일 예에 사료 조성물은 통상의 기술자가 예상할 수 있는 범위 내의 다른 기타 영양성분을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에 따른 조성물을 포함하는 사료를 급여할 수 있는 개체(동물)는 특별히 제한은 없으나 포유류, 어류, 갑각류 및/또는 패각류일 수 있고, 예를 들면, 돼지, 소, 말, 염소, 사슴, 양, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 개, 고양이, 토끼, 물고기일 수 있다.
상기 사료 조성물이 사료 첨가제 형태로 사용되는 경우, 시판되는 사료에 일 예에 따른 사료 첨가제를 첨가한 형태로서 제조될 수 있다. 일 예에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 사료는 분말 또는 펠렛 제형, 또는 액상 제형인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것을 아니다. 또한, 사료에 첨가되는 본 출원의 사료 첨가제의 첨가량은 특별한 한정을 요하는 것은 아니다.
상기 사료는 본 출원의 조성물을 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합하거나, 사료 제조 시 직접 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 사료 내 포함되는 본 출원의 사료 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예컨대, 건조된 분말형태일 수 있다. 상기 사료 첨가제는 전체 사료 중량의 0.005 내지 10 중량%, 0.05 내지 10 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.005 내지 5 중량%, 0.05 내지 5 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.005 내지 2 중량%, 0.05 내지 2 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료는 상기 사료 첨가제 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제가 첨가될 수 있는 사료는 시판되는 사료, 또는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물
또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 유효량을 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 염증성 피부질환 원인균에 대한 억제 방법을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서 "항균용 조성물"은 항균 활성을 가지는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 항균 활성은 앞에서 설명한 바와 같으며, 염증성 피부질환 유발균의 성장을 저해하거나, 및/또는 사멸시키는 것 등을 의미할 수 있다. 상기 항균 활성은 항생 활성과 혼용되어 사용될 수 있으며, 상기 항균용 조성물은 염증성 피부질환의 유발균에 대하여 성장 저해능 및/또는 사멸능을 갖는 모든 형태의 제제를 포괄하는 것으로, 특별한 언급이 없는 한 항생용 조성물, 항균제, 항생제, 방부제, 살균제 등과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
상기 염증성 피부질환의 유발균은 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum), 스타필로코쿠스 오레우스(S. aureus), 박테로이드 후라길리스 (B. fragilis), 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스(S. epidermidis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종 모두)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 염증성 피부질환은 앞에서 설명한 바와 같으며, 예컨대 여드름 또는 로사세아 등의 질환일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 다른 예는 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 소독제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 소독제를 소독이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다. 다른 예는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 세척제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 세척제를 세척이 필요한 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다.
상기 소독제는 병원균 감염을 막기 위한 제제를 총칭하는 것으로, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.
상기 항균용 조성물이 염증성 피부질환의 유발균에 대하여 항균 효과를 가지므로, 염증성 피부질환의 유발균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척(세정)하는 용도로 적용될 수 있다.
큐티박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 화장료 조성물
또 다른 양상은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 피부질환의 예방 및/또는 개선용, 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 예에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 이러한 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 항염증, 또는 피부 개선 활성 예컨대, 피부 재생 활성 촉진, 및/또는 피부 보습 활성(기능) 강화 효과)를 가질 수 있다. 상기 피부 개선 활성은 앞에서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 제공되는 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물의 제형에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 용액, 현탄액(무수 및 수계), 유탁액(에멀젼), 페이스트, 겔, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상 등), 파우더, 연고, 패치, 화장수, 에센스, 젤, 로션, 용액, 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 또는 분무제 등으로 제형화 될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탄액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 연고, 패치, 화장수, 에센스, 젤, 로션, 마스크, 팩, 분말, 캅셀, 및 분무제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
본 출원에 있어서의 피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
일 예에서, 상기 조성물은 통상적인 계면활성제(유화제)를 포함하고, O/W (oil in water; 수중유), W/O (water in oil; 유중수), W/O/W, 또는 O/W/O 제형의 유화 또는 가용화 형태의 성상을 갖는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 피부외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 모든 계면활성제들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예컨대, 비이온 계면활성제 및 음이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비이온 계면활성제는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제, 폴리글리세린계 계면활성제, 슈가 에스테르계 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 폴리글리세릴-메칠글루코오스디스테아레이트, 폴리글리세릴-메칠글루코오스스테아레이트, 폴리글리세릴-디스테아레이트 (예컨대, 폴리글리세릴-10 디스테아레이트 등), 폴리글리세릴-스테아레이트, 하이드로제네이티드레시틴, 세테아릴올리베이트, 소르비탄올리베이트,　PEG(poly(ethylene glycol))-스테아레이트류 (예컨대, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트 등), 글리세릴스테아레이트, 글리세릴스테아레이트에스이, 데실글루코사이드, 코코-글루코사이드, 라우릴글루코사이드, 카프릴릴/카프릴글루코사이드, 아라키딜글루코사이드, C12-20 (직쇄 또는 분지형) 알킬 글루코사이드, 세테아릴글루코사이드, 세테아레스류 (예컨대, 세테아레스-20 등),　스테아레스류 (예컨대, 스테아레스-2, 스테아레스-21, 등), 올레일 알코올의 폴리에틸렌글리콜에테르 (예컨대, 올레스-20, 등), 메칠글루코스세스퀴스테아레이트, 소르비탄스테아레이트, 슈크로스코코에이트, 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트60 등), 소르비탄세스퀴올리에이트, 소르비탄올리베이트, 기름야자오일, 기름야자커넬오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온 계면 활성제는 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산암모늄, 라우릴 황산마그네슘, 라우릴 황산트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산암모늄, 소듐코코암포아세테이트, 암모늄라우레스설페이트, 암모늄라우릴설페이트, 코카마이드엠이에이, 디소듐라우레스설포석시네이트, 티이에이-코코일글루타메이트, 소듐코코일애플아미노산, 코카마이드디이에이, 소듐라우레스설페이트, 소듐라우릴설페이트, 포타슘코코일글리시네이트, 소듐스테아로일글루타메이트, 포타슘세틸포스페이트 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 피부 외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물은, 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합 이외에, 피부에 적용하기 위하여 통상적으로 함유되는 성분들, 오일, 폴리머, 점증제, 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적으로 함유되는 성분들 및 이들의 함량은 목적하는 조성물의 기능, 성상 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다.
예컨대, 상기 오일은 실리콘 오일, 예컨대, 사이클로펜타실록산, 디메치콘, 디메치콘올, 사이클로메치콘, 트리실록산, 아모디메치콘, 페닐트리메치콘, 디실록산, 사이클로헥사실록산, PEG-디메치콘류 (예컨대, PEG-12 디메치콘, PEG-10 디메치콘, PEG-7 디메치콘 등), 폴리실리콘류 (예컨대, 폴리실리콘-11 등), 시메치콘, 디페닐디메치콘, PEG-9폴리디메칠실록시에칠디메치콘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 비실리콘 오일, 예컨대, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 부틸렌글라이콜디카프릴레이트/디카프레이트, 하이드로제네이티드폴리이소부텐, 이소프로필미리스테이트, 세틸에틸헥사노에이트, 하이드로제네이티드폴리데센, 디에톡시에틸석시네이트, 헥실라우레이트, 트리에틸헥사노인, 이소노닐이소노나노에이트, 폴리이소부텐 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 트리글리세라이드; 왁스 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 폴리올은 부틸렌글라이콜, 글리세린, 글리세레스 (예컨대, 글리세레스-26 등), 메틸프로판디올, PEG(poly(ethylene glycol))/PPG(poly(propylene glycol)) 코폴리머류 (예컨대, PEG/PPG-17/6코폴리머 등), 메틸글루세스류 (예컨대, 메틸글루세스-20 등), 디프로필렌글라이콜, 프로필렌글라이콜, 프로판디올, 카프릴릴글라이콜, 펜틸렌글라이콜 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 점증제는 카보머, 암모늄아크릴로일디메틸타우레이트/브이피코폴리머, 잔탄검, 소듐폴리아크릴레이트, 하이드록시에틸셀룰로오스, 아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머, 소듐폴리아크릴레이트, 소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메틸타우레이트코폴리머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 소듐카보머 등으로 이루어진 고분자 화합물들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 첨가제는 피부 외용제 및/또는 화장료의 제조에 통상적으로 사용되는, 이온 봉쇄제, 유화 안정제, pH 조절제, 피부컨디셔닝제, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트 (emollient), 비타민, 곤충 기피제, 보존제, 소염제, 염기성화 또는 산성화제, 착색제 (안료), 용해제, 담체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 피부 외용제 및/또는 화장료 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 용제를 포함할 수 있으며, 사용 가능한 용제는 정제수, 암반수, 온천수, 빙하수, 해수, 심층 해양수, 식물 추출수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 앞서 설명한 성분 이외에 스킨(피부) 케어 및/또는 모발/두피 케어에 유리한 효과를 발휘하는 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 유리한 효과는 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 수분 공급, 피부 보습, 피부 영양 공급, 모공 축소, 피부결 개선, 각질 제거, 피부 볼륨 개선, 두피 보호, 두피 또는 피부의 피지 방지, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 모발 영양 공급, 모발 볼륨 개선 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 적용 대상의 피부/모발/두피에서 소망하는 모든 효과일 수 있다. 예컨대, 상기 활성 성분은 각종 식물 추출물 (예컨대, 지모 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 연꽃 추출물, 토마토 추출물, 금은화 추출물, 동백꽃 추출물, 해조류 추출물 등), 식물 캘러스 배양물 또는 배양 추출물, 효모 추출물, 세포 함유 또는 무세포 효모 배양물 또는 배양 추출물, 비타민, 각종 펩타이드, 지질, 또는 지방산 (예컨대, 각종 어패류 유래의 지질, 지방산, 펩타이드 등) 히알루론산, 글리코시드 (예컨대, 알부틴 등), 이외의 각종 피부용 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 소망하는 효과에 따라서 적절한 활성 성분을 선택하여 사용할 수 있다. 일 예에서, 상기 활성 성분은 수소첨가 폴리이소부텐 (hydrogenated polyisobutene)과 지모추출물의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 예는 상기 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 피부, 모발, 및/또는 두피 케어용 제품일 수 있고, 예를 들어 얼굴, 손, 발, 온몸 등의 피부, 두피, 모발 등에 적용하기 위한 모든 형태의 화장품 및/또는 세정용 (클렌징) 제품일 수 있다. 일 예에서, 상기 제품은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림(자외선차단제), 비비크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품; 및 샴푸, 비누, 클렌징폼, 바디클렌저 등의 세정용 제품 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 제공하는 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물(약학 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물, 및/또는 항균용 조성물) 및 방법의 투여 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있으며, 일 예에서 상기 대상은 앞서 설명한 바와 같은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하거나, 염증성 피부질환을 가지는 개체 (인간 등의 포유동물) 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있다.
본 출원은 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합의 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도에 관한 것으로, 상기 큐티박테리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.
도 1은 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651, CJRS-10652, CJRS-10653, CJRS-10654, CJRS-10655, 및 CJRS-10656 균주; 이하 같다.)의 용혈 활성으로 인한 독성 유무를 확인하기 위하여 용혈성 시험을 수행한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 본 출원에서 선별한 리보타입(Ribotype)이 RT2인 6개 균주가 가지는 공통적인 유전적인 특징을 확인하기 위하여 phylogenetic tree 형태로 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 처리하였을 때 대조군(Cell only w/ stimuli; 염증반응만 유도한 군), 양성대조군(염증반응 유도 후 Dex 처리군), 음성대조군(염증반응 후 식물성 공배지(Broth) 처리군) 및 비교군(염증반응 유도 후 Type I(ATCC 6919), Type II(ATCC 11828), Type I(CJIN1-1), Type I(CJIN1-2), Type II(CJIN2-1), Type II(CJIN2-2), Type III(CJIN3-1), B. fragilis 및 S. epidermidis의 배양물 처리군)과 비교하여, 면역세포에서 면역반응(면역세포의 증식(proliferation) 및 IL-6, CCL2, 및 TNF-a의 발현량)을 확인한 그래프이다.
도 5는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각의 여드름 유발 균주인 C. acnes(ATCC 6919)에 대한 항균 활성(antimicrobial activity)을 확인한 그래프이다. (NC: 아무 것도 처리하지 않음, Doxy: 양성대조군으로 독시사이클린(doxycycline)을 처리한 군)
도 6은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각의 세균(S. epidermidis)의 바이오필름(biofilm) 형성 억제 효과를 확인한 그래프이다. (NC: 아무 것도 처리하지 않음, Doxy: 양성대조군으로 독시사이클린(doxycycline)을 처리한 군)
도 7은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물 각각을 농도별(5%(v/v), 10%(v/v), 20%(v/v))로 처리하였을 때 세포 독성 효과를 확인한 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리하였을 때 피부 효능(피부 세포 재생 효능)을 확인한 그림 및 그래프이다 (상처 후 0시간, 4시간 후 및 8시간 후).
도 9, 및 도 10은 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리하였을 때 피부 재생 관련 마커인 Src, MMP2 (metalloproteinase-2)의 발현량과, 피부 보습 관련 마커인 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3)와 AQP3 (Aquaporin 3)의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 출원에서 선별한 6개 균주 (생균)를 Raw264.7 대식세포를 함께 배양하여 Raw264.7 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 (IL-6)과 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 IL-10/IL-6의 비율로 계산하여 그래프로 나타낸 것이다. (대조군으로 B. fragilis 균주를 사용하였다.)
도 12 및 도 13은 본 출원에서 선별한 2개 균주(CJRS-10652 균주 및 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였을 때 면역세포의 증식과 염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-8)의 발현량을 확인한 그래프이다. (양성대조군: 덱사메타손(Dex)을 사용한 군)
도 14a, 도 14b, 및 도 15는 본 출원에서 선별한 2개 균주(CJRS-10652 균주 및 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 로사세아가 유도된 마우스에 복강 투여하였을 때 피부 홍반, 상피조직과형성 및 피부 염증의 정도를 확인한 그래프 및 사진이다. (Vehicle: 아무 것도 처리하지 않은 대조군, LL37: LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아 병변을 유도한 군, Doxy: 양성대조군으로, 병변을 유도한 마우스에 독시사이클린(doxycycline)을 복강 투여한 군)
도 16 및 도 17은 피부 모델 T&R HuSkin에 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 처리하고 장벽개선 지표인 Filaggrin 및 보습개선 지표인 Aquaporin-3의 발현양을 확인한 결과이다.
도 18 및 도 19는 인간섬유아세포에 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 처리하고 세포독성 유무 및 콜라겐 생성 기능을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실험예 1. 균주 확보
1) 피시험자 선정
만 18세 이상 39세 이하의 건강한 성인 남녀 73명을 대상으로 (씨알에이코리아社를 인체 피지 채취 위탁 기관으로 선정, IRB 승인(승인번호: CRAIRB20-030502)) 본 시험을 진행하였다.
2) 피부 피지 채취
물로 가볍게 세안 후 멸균수를 거즈에 적셔 코를 가볍게 닦아내었다. 따뜻한 물에 적신 멸균 거즈를 약 5분간 코에 올려 놓고 기다렸다. 순간접착제 (Cyanoacrylate) 1방울을 테이프에 묻힌 후 약 10초간 기다렸다. 테이프를 코에 적용 후 1분간 기다린 후에 피지를 추출하였다 (SSB, Skin Surface Biopsy). 피지가 묻은 테이프를 1.5ml e-tube (glycerol 50% + RCM (Reinforced Clostridial Medium, BD Difco) 50%)에 넣어서, 피부 피지 샘플을 채취하였다.
3) 피부 균주 배양 및 확보
상기 피지 샘플을 PBS에 희석한(100~103) 후 RCM agar plate에 streaking 후 anaerobic gas pack jar에 넣어 37℃에서 96시간 동안 배양하였다. 개별 plate당 10~20개의 single colony를 RCM broth에 넣고 24시간 동안 anaerobic gas pack jar (37℃)에서 활성화시켰다. 24시간 후 fresh RCM broth에 샘플의 1%를 접종한 후 anaerobic gas pack jar에 넣고 37℃ 에서 48시간 동안 배양하여 총 1735개의 사람 피부유래 균주를 확보하였다. 확보된 균주들을 아래 표 1에 기재된 primer를 이용하여 16S rRNA와 RecA sequencing을 진행하였고, sequencing 기반으로 166개의 특이적인 C. acnes 균주를 선별하였다. 대식세포 기반의 증식및 염증지표(IL-6, CCL2, TNF-α)억제 시험을 통하여 6개의 특이적인 C. acnes 균주를 선별하였다.
본 출원에서 선별한 6개 균주인 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주는 공통적으로 서열번호 8의 16S rRNA를 포함하는 것으로 확인되었다. 확보된 균주들의 시퀀스 타입(Sequence type), 리보타입(Ribotype), 및 면역학적 표현형(Immunological phenotype)을 확인하고 이를 아래 표 2에 나타내었다.
16S 및 RecA PCR sequencing primer와 16S rRNA gene sequence
16S PCR
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (서열번호 1)
1482R TACGGYTACCTTGTTACGACTT (서열번호 2)
16S sequencing
515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA (서열번호 3)
518F CCAGCAGCCGCGGTAATACG (서열번호 4)
RecA PCR
recA_F AGCTCGGTGGGGTTCTCTCATC (서열번호 5)
recA_R GCTTCCTCATACCACTGGTCATC (서열번호 6)
RecA sequencing
recA_F GGTACCACTGCCATCTTCATTA (서열번호 7)
16S rRNA gene sequence TTCACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCACTGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCAGTGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGTGGCGAGCCTGTGAGGGTGAGCGAATCTCGGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGGCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCGTTGTGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACTGGTGATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT (서열번호 8)
확보된 C. acnes 균주 분류 및 면역 특성
Strains Sequence type Ribotype Immunological phenotype
ATCC 6919 Type I RT1 비유효
CJIN-1-1
CJIN-1-2
CJRS-10651 Type II RT2 유효
CJRS-10652
CJRS-10653
CJRS-10654
CJRS-10655
CJRS-10656
ATCC 11828 Type II RT2 비유효
CJIN-2-1
CJIN-2-2
CJIN-3-1 Type III RT9 비유효
확보된 C. acnes 균주의 시퀀스 타입(Sequence type) 및 리보타입(Ribotype)은 아래 실시예 2-2의 eMLST 분석 결과에 따라 분류하였고, Immunological phenotype은 아래 실시예 3-3의 면역지표 분석 결과에 따라 분류하였다.상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주인 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주는 Sequence type이 Type II, 리보타입(Ribotype)이 RT2, Immunological phenotype이 유효인 특징을 공통적으로 갖는 것으로 확인되었다.
실험예 2. 배양물 확보
상기 표 2에 나타난 균주, 및 비교군으로 사용되는 B. fragilis(Bacteroides fragilis, 박테로이드 후라길리스, KCTC5013) 균주, 및 S. epidermidis(Staphylococcus epidermidis, 스타필로코커스 에피더미디스, 표피포도구균, KCTC3958) 균주를 각각 48시간 동안 RCM 배지(BD Difco) 또는 식물성 배지(아래 표 3에 식물성 배지의 조성을 나타내었음)에서 배양한 후, 원심분리기(4000g, 20분, 상온)를 사용하여 원심분리하여 균주를 제외한 배양물(Cell free supernatant)을 확보하였다.
식물성 배지 조성
성분 회사 %(w/v) Volume (g/L)
Glucose Sigma aldrich 0.5 5
Peptone from vegetable Sigma aldrich 2.5 25
Sodium chloride Oxoid 0.5 5
Sodium acetate Sigma aldrich 0.3 3
Cysteine HCl Sigma aldrich 0.05 0.5
상기 확보된 배양물의 pH를 NaOH를 이용하여 pH 7로 조정한 후, 배양물을 0.22μm 포어 사이즈 필터로 여과하고, 3kDa amicon filter를 통해 3kDa 이하로 여과된 배양물을 수득하여 이를 최종 시험 물질로 준비하였다.이하의 실시예에서, 염증반응을 유도하기 위한 물질로 상기 표 2의 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 pH 7로 조정한 후 0.22μm 포어 사이즈 필터로 여과된 배양물을 준비하여 사용하였다.
실시예 1. 피부유래 균주의 용혈활성 시험
본 출원에서 선별한 6개의 피부 유래 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)의 용혈 활성으로 인한 독성 유무를 확인하기 위하여 용혈성 시험을 수행하였다.
RCM broth에서 활성화시킨 상기 피부 유래 균주들을 각각 sheep blood agar에 도말하여 anaerobic chamber에서 37℃ 에서 48시간 배양하였다. 콜로니 집락 주위에 적혈구가 용해되어 clear zone이 생성되는지 확인하고 이를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 시험 결과 본 출원에서 선별한 모든 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)에 대해서 용혈성을 보이지 않아 본 출원에서 선별한 균주는 안전한 것으로 판단되었다.
실시예 2. 선별된 균주 유전자 분석
실시예 2-1. 균주의 phylogenetic feature 확인.
C. acnes는 종 내 균주간 (intraspecies level) 유전체의 차이가 큰 것으로 알려져 있다. 실제로 종 내 균주간의 유전체의 차이가 크기에, 현재는 같은 C. acnes 종으로 분류되고 있지만 type I은 C. acnes 아종 acnes로 type II는 C. acnes 아종 defendens로 type III는 C. acnes 아종 elongatum로 재분류(reclassification)되어야 한다고 제안된다. 이들 type들도 16S rDNA sequence가 다르며 여러 다양한 사람들의 피부 메타지놈(metagenome)의 relative abundance에 의해서 여러 리보타입(ribotype; RT)들로 나누어지는 것으로 알려져 있다.
실험예 1에서 제조된 균주들의 리보타입(ribotype; RT)을 각 균주들의 전장유전체 분석(Whole Genome Sequencing; WGS)을 통해서 확인하였다 (이러한 결과를 상기 표 2에 나타내었음). 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)와, NCBI genome site로부터 확보한 리보타입이 RT2인 37개 균주 (reference 균주)들의 전장유전체 데이터를 이용하여, roary tool 기반으로 core gene과 accessory gene을 구하였다. 전장유전체의 sequence를 이용하여 phylogenetic feature를 확인한 후, MUSCLE algorithm을 이용해서 alignment를 진행하고 maximum likelihood 방법으로 tree 모양을 표현하여 이를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 즉, Core gene set을 이용해서 phylogenetic tree를 그리고 core gene과 accessory gene set들을 포함하여 matrix 형태의 그림으로 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. Edge에 있는 score는 bootstrap을 10,000번 반복 시 나온 신뢰값이다. 본 출원에서 선별한 6개 균주는 도 2a에 빨간색 박스 내에 빨간색 글씨로 기재하고 왼쪽 화살표로 표시하였으며, reference 균주는 검정색으로 기재하였다.
도 2b에서, 균주가 가지고 있는 유전자 클러스터(gene clusters)를 파란색으로 표시하였다.
도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리보타입이 RT2인 reference 균주(도 2a에서, 빨간색 박스로 포함되지 않은 나머지 균주)들은 특정 유전자 클러스터(gene clusters)를 가지고 있지만, 본 출원에서 분리한 6개 균주는 상기와 같은 특정 유전자 클러스터가 없는 것을 확인하였다 (이러한 부분을 도 2b에서 위쪽 화살표로 표시하였음).
도 2a에서 빨간색 박스로 포함된 균주 중 검정색으로 표시된 JCM 18920 균주는, 도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 분리한 6개 균주와 비교하여 추가적인 accessory gene을 가지고 있었다. 이러한 점은 JCM 18920 균주가 본 출원에서 분리한 6개 균주와 다른 모습을 가지고 있는 것임을 나타내는 것으로, 본 출원에서 분리한 6개 균주와 상이한 것임을 확인하였다 (이러한 부분을 도 2b에서 아래쪽 화살표로 표시하였음).
실시예 2-2. 균주의 eMLST(Expanded Multi-locus Sequence Typing) 분석
추가적으로, 상기 NCBI genome site로부터 확보한 리보타입이 RT2인 37개 균주 (reference 균주)와 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)를 비교하기 위하여 eBURSTv3 program (http://eburst.mlst.net/default.asp)을 이용해서 eMLST 분석을 수행하였다 (Dreno et al. 2018). eMLST 분석은 C. acnes 균주들에 보존되어(conserved) 있으면서 16S rRNA sequence보다 phylogenetic resolution을 향상시켜주었던 유전자들의 sequence들을 이용해서 분리하는 것이다. 유전자들의 sequence variation에 따라서 특정한 sequence type (ST)로 나뉘고 나뉜 ST들은 frequency에 따라서 아래 표 4와 같이 특정한 clonal complex (CC)로 그룹핑되었다. ST는 서열의 다양성을 기반으로 나누는 방법이며, CC는 나누어진 ST를 서열의 차이를 이용하여 하나의 클러스터로 분류하는 방법이다. 아래의 표 4는 선별된 RT2 C. acnes들의 eMLST 분석을 통한 sequence type (ST) 및 clonal complex를 보여준다:
Strains aroE atpD gmk guaA lepA sodA tly camp2 ST Clonal complex (CC)
C. acnes strain KCOM 1861 (= ChDC B594) 17 4 2 4 2 12 10 28 6 CC6 (type II)
C. acnes HL082PA2 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes HL060PA1 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes strain T20574 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes strain T20670 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes strain T20736 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes strain T20758 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes strain T20816 17 4 2 4 2 3 10 10 6 CC6 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 09-109 17 9 2 4 2 3 10 10 25 CC6 (type II)
C. acnes HL103PA1 17 9 2 4 2 3 10 10 25 CC6 (type II)
C. acnes HL050PA2 17 4 2 17 2 3 11 11 26 CC6 (type II)
C. acnes subsp. defendens ATCC 11828 17 4 2 4 2 12 10 13 27 Singleton (type II)
C. acnes J139 17 4 2 16 2 12 10 12 27 Singleton (type II)
KCTC 3320 17 4 2 4 2 12 10 13 27 Singleton (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 09-323 17 4 2 16 2 12 10 12 28 CC30 (previously CC72) (type II)
C. acnes HL001PA1 17 4 2 4 2 6 10 12 30 CC30 (previously CC72) (type II)
C. acnes strain 09-9 17 4 2 4 2 3 10 19 65 CC6 (type II)
C. acnes strain T29350 17 4 2 4 2 3 10 19 65 CC6 (type II)
C. acnes strain T29362 17 4 2 4 2 3 10 19 65 CC6 (type II)
C. acnes strain T29420 17 4 2 4 2 3 10 19 65 CC6 (type II)
CJRS-10651 17 4 2 4 4 6 10 12 69 CC72 (type II)
CJRS-10652 17 4 2 4 4 6 10 12 69 CC72 (type II)
CJRS-10654 17 4 2 4 4 6 10 12 69 CC72 (type II)
CJRS-10655 17 4 2 4 4 6 10 12 69 CC72 (type II)
CJRS-10656 17 4 2 4 4 6 10 12 69 CC72 (type II)
C. acnes isolate MGYG-HGUT-00111 17 4 2 4 2 12 10 12 72 CC72 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 11-49 17 4 2 4 2 12 10 12 72 CC72 (type II)
C. acnes subsp. defendens strain 10-482 17 4 14 16 2 12 10 39 130 Singleton (type II)
C. acnes strain MIT 1857-A1 20 4 2 4 2 6 10 42 137 CC72 (type II)
C. acnes strain P15-071 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T45496 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T45374 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T28840 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T28811 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T45321 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T45-496 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T45-374 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T28-811 17 4 2 16 2 20 10 12 139 CC72 (type II)
C. acnes strain T55820 17 4 2 4 2 3 36 10 150 CC6 (type II)
C. acnes strain P15-087 17 4 2 4 2 3 36 10 150 CC6 (type II)
C. acnes strain CA17 17 4 2 4 4 6 10 46 153 NA
CJRS-10653 17 4 2 4 4 6 10 46 153 NA
C. acnes strain 09-23 17 9 2 4 2 3 32 10 25 or 128 CC6 (type II)
C. acnes JCM 18920 17 - 2 4 - 6 10 - NA NA
상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주는 eMLST 분석 결과 ST (sequence type)가 69 또는 153인 것으로 확인되었다 (CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주의 경우 ST가 69, CC (clonal complex)가 CC72 (Type II), CJRS-10653 균주의 경우 ST 153, CC는 NA(확인되지 않음)).
ST 69와 ST 153의 차이는 hemolytic factor 관련 유전자인 camp2의 single nucleotide sequence 차이로 확인되어 그 차이가 미약하므로, ST 153으로 확인된 CJRS-10653 균주의 CC는 CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주의 CC인 CC72 (Type II)와 가까울 것으로 판단할 수 있다.
eMLST 분석 결과, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)와 유사한 eMLST 분포를 가지고 있는 균주로 C. acnes JCM 18920 및 C. acnes CA17 균주로 확인되었으나, 아래와 같은 이유로 본 출원에서 선별한 6개 균주는 C. acnes JCM 18920 균주 및 C. acnes CA17 균주와 상이한 것으로 확인되었다.
C. acnes JCM 18920 균주는 상기 실시예 2-1에서도 확인한 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주와 달리 추가적인 accessory gene을 가지고 있는 것으로 보여 본 출원에서 선별한 6개 균주와 상이함을 확인하였다.
본 출원에서 선별한 6개 균주가 C. acnes CA17 균주와 상이한 점을 확인하기 위하여 C. acnes CA17 균주의 유전체 비교를 실시하였다. 본 출원에서 선별한 6개 균주와 C. acnes CA17 균주의 WGS과 genome sequence alignment 결과를 통해서 확인한 결과, 4번 scaffold에 1-3467 영역의 plasmid가 C. acnes CA17 균주에만 특이적으로 존재함을 확인하였다. 상기 영역을 BLAST를 통해서 nucleotide sequence database (GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, 그리고 RefSeq)와 매칭한 결과, 상기 영역은 Salmonella enterica 균주에서 유래한 plasmid sequence로 확인되었다. 즉, C. acnes CA17 균주는 Salmonella enterica 균주에서 유래 plasmid가 있으므로, 본 출원에서 선별한 6개 균주와 상이한 것을 확인하였다.
실시예 2-3. 균주의 Orthologous Gene 분석
본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)의 orthologous gene을 Orthofinder를 통해서 분석하였다.
BLASTP을 이용해서 특정 thresholds (identity > 40 % 그리고 coverage > 80 %)를 통한 균주 특이적으로 존재하는 유전자들을 선별하였으며, Hypothetical protein이나 특정 family protein으로써 annotation이 잘되지 않은 유전자들은 제외하였다. 또한, 균주 특이적인 문헌조사를 실시하였고 C. acnes와 면역표현형과 관련된 문헌들에서 언급된 유전자들을 위주로 category들을 나눠서 정리하였다. 이러한 결과 중 일부를 아래 표 5에 나타내었다.
선별된 균주들의 특이적인 유전적 구성
Gene product Function
 Accession No. Selected‡
ATCC 11828
Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) Branched amino acid metabolic pathway regulator WP_002531510.1 + -
락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) Bacteriocin WP_070651130.1 + -
베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) Bacterial oncogene WP_002518535.1 - +
2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) L-Leucine metabolic pathway WP_142263178.1 - +
3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) WP_002513330.1
타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) CRISPR adaptive immune system WP_002514606.1 - +
타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) WP_002514608.1
CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) WP_002514605.1
(Selected‡: 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주); ATCC 11828: 기존의 리보타입이 RT2인 균주 (reference))
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 및 CJRS-10656 균주)는 기존에 밝혀졌던 리보타입이 RT2인 균주(대조군, ATCC 11828 균주)와 상이한 것을 확인하였다.
즉, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator; NCBI Reference Sequence: WP_002531510.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin; NCBI Reference Sequence: WP_070651130.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다.
또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase; NCBI Reference Sequence: WP_002518535.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것으로 확인되었다. 상기 베타-글루큐로니다제는 쓸개에서 나오는 담즙을 응집(aggregation)시켜서 결석을 만드는 것임이 잘 알려져 있으며 대장암(colon cancer)를 유발하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase; NCBI Reference Sequence: WP_142263178.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase; NCBI Reference Sequence: WP_002513330.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것(L-Leucine pathway가 결실(deletion)되었음)으로 확인되었다.
또한, 본 출원에서 선별한 리보타입이 RT2인 6개 균주는 ATCC 11828 균주와 달리, 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA; NCBI Reference Sequence: WP_002514606.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC; NCBI Reference Sequence: WP_002514608.1) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및 CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3; NCBI Reference Sequence: WP_002514605.1) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 면역지표 분석
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물에 대한 면역세포(Raw264.7 대식세포)의 면역지표를 확인하였다.
실시예 3-1. 면역세포 배양
본 실험에 사용한 면역세포는 Raw264.7(KCLB 40071) 대식세포를 사용하였다. 본 실험에 들어가기 일주일 전에 Raw264.7 대식세포를 FBS 10%(v/v) DMEM에 배양 및 유지하였다. 실험 18시간 전에 Raw264.7 대식세포를 5 x 104/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.
실시예 3-2. 균주 배양물과 면역세포 co-culture:
Raw264.7 대식세포에 염증반응을 유도하기 위해 Raw264.7 대식세포에 실험예 2에서 제조된 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하고 RPMI Media(gibco) 95ul를 넣어 총 100μl를 37℃ incubator에서 1시간 동안 처리하였다. 염증 반응 유도 시, 정상세포(도 3의 제일 왼쪽, Cell only) 그룹을 제외한 모든 그룹에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하여 염증자극을 주었다.
1시간 후, 실험예 2에서 제조된 균주의 배양물(20μl)과 fresh RPMI Media(80μl)를 더하여 총 100μl를 염증 유도 물질인 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 처리된 plate에 추가하여 (총 200μl/well) 총 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.
즉, Raw264.7 대식세포에 면역반응을 유도하기 위하여 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하였고, 그 후 다양한 균주의 배양물을 처리하고 면역지표를 확인하여 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
양성 대조군(Positive control)으로는 덱사메타손(dexamethasone, sigma)(100nM) (도 3의 Dex)을 사용하였다. 음성 대조군(negative control)으로는 식물성 공배지 (도 3의 Broth) 또는 fresh RPMI Media(gibco)를 넣은 정상세포(Cell only)를 사용하였다.
실시예 3-3. 면역지표 분석
24시간 후 상층액(cultured supernatant)을 모두 확보하고 남은 Raw264.7 대식세포의 viability 및 증식(proliferation) 정도를 확인하기 위해 cell counting kit 8 (Enzo, 5μl/well) + fresh RPMI media (95μl)를 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하였다.
확보된 상층액(supernatant)을 이용하여 Raw264.7 대식세포에서 분비된 염증성 사이토카인(IL-6(interleukin 6, 인터루킨 6), CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2, 케모카인 리간드 2), TNF-α(tumor necrosis factor alpha))의 양을 ELISA를 통해 측정하였다. Raw264.7 대식세포를 사용하여 균주의 타입별로 상기 염증성 사이토카인 수준의 감소 및 Raw264.7 대식세포의 증식(proliferation) 억제 정도를 확인하여 이를 도 3, 및 도 4에 나타내었고, 염증억제 기능의 정도에 따라 유효 또는 비유효 균주로 표기하였다 (유효/비유효 결과는 상기 표 2에 나타내었음).
도 3의 위쪽 그래프 및 도 4에 나타난 바와 같이, 정상 세포(Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않음; Cell only)는 염증성 사이토카인이 분비되지 않았으나, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증반응을 유도한 경우(Cell only w/ stimuli) 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)이 크게 증가하였다. 양성 대조군으로서, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응을 유도하고 덱사메타손(Dex)를 처리한 경우, 염증성 사이토카인의 양이 감소한 것을 확인하였다. 음성 대조군으로서 Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응을 유도하고 식물성 공배지(Broth)를 처리한 경우 염증 반응이 감소되지 않았다.
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에는 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응이 유도되어 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)의 분비량을 현저히 감소시켰으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상으로 염증성 사이토카인의 분비량을 감소시키는 것임을 확인하였다.
다른 종류의 큐티박테리움 속 균주(ATCC6919, ATCC11828, CJIN1-1, CJIN1-2, CJIN2-1, CJIN2-2, CJIN3-1) 또는 다른 세균(B. fragilis 또는 S. epidermidis)의 배양물을 처리한 경우에는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리한 경우와 상반되게, pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물로 염증반응이 유도되어 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, CCL2, TNF)의 분비량에 변화가 없거나, 오히려 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다.
도 3의 아래쪽 그래프는 정상 세포(Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않음; Cell only)를 기준으로, 염증반응을 유발하는 Raw264.7 대식세포의 증식 정도를 %로 나타낸 것이다. 도 3의 아래쪽 그래프에 나타난 바와 같이, Raw264.7 대식세포에 pathogen C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증반응을 유도한 경우(Cell only w/ stimuli) 염증반응을 유발하는 Raw264.7 대식세포의 증식이 증가하였다.
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에는 Raw264.7 대식세포의 증식이 Raw264.7 대식세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우와 동등하거나 그 이하로 감소한 것을 확인하였다.
실시예 4. 여드름 유발 균주 C. acnes (ATCC 6919) 성장 저해 효과
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 여드름 유발균으로 알려진 C. acnes(ATCC 6919)에 대한 항균 활성을 확인하였다. 양성 대조군으로 독시사이클린(doxycycline)(0.025μg/ml)을 사용하였다.
상기 균주의 배양물 농축액을 RCM broth에 희석하여 96-well plate에 첨가한 후 C. acnes ATCC 6919 균주를 RCM broth를 이용하여 10^6 CFU/mL까지 희석하여 96-well plate에 10%(v/v) 접종하였다. 균주 접종 후 anaerobic camber에서 48시간동안 37℃ 환경에서 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 ATCC 6919 균주에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Negative Control; NC)를 기준으로 성장 저해 효과를 %로(Antimicrobial activity (% of inhibition))로 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 독시사이클린(Doxy)를 처리한 경우 C. acnes ATCC 6919 균주의 성장이 저하된 것을 확인하였다. 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 처리한 경우에도 C. acnes ATCC 6919 균주의 성장이 저하되었으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린(Doxy)을 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상이었음을 확인하였다.
실시예 5. 바이오필름(Biofilm) 형성 억제
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 S. epidermidis 세균의 바이오필름(biofilm) 형성을 억제하는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 독시사이클린(doxycycline; Doxy)(4μg/ml)을 사용하였다.
96-well 세포배양 플레이트에 S. epidermidis 세균을 1X107CFU/mL로 24시간 동안 배양하여 부착시켜준 다음, 아무 것도 처리하지 않거나 (Negative Control; NC), 양성 대조군으로 독시사이클린(Doxy)을 처리하거나, 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 처리하고, TSB(Tryptic Soy Broth, BD difco) 배지, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 바이오필름 형성 정도를 측정하기 위해 Crystal violet(0.1% v/v)으로 처리하여 바이오필름을 염색하고 Tecan으로 570nm에서 측정하였다. 이후, O.D. sample/O.D. control X 100의 공식으로 환산하여 바이오필름(biofilm) 형성 억제율(inhibition rate)를 계산하였다.
구체적으로, Deep freezer에 보관되어 있던 S. epidermidis 세균을 꺼내어 TSB(Tryptic Soy Broth, BD difco)에 3%(v/v)으로 접종하고, 37℃ 에서 16시간동안 배양하였다. 키워진 배양액을 fresh TSB 배지에 1x107CFU/mL이 되도록 희석하였다. 실험군인 동결건조 된 배양액은 농도에 맞게 증류수로 희석하여 샘플을 준비하였다.
96-well microtiter polystyrene plate 각 well에 100μl의 바이오필름(biofilm)을 형성시킬 S. epidermidis 세균와 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물 5%(v/v) 10μl, TSB 배지 90ul을 함께 처리하여 총 200μl로 각 well을 구성하였다. 24시간동안 37℃ 인큐베이터에서 plate 상태로 배양하였다. 24시간 배양한 미생물 균주는 crystal violet 용액 염색을 위해 전처리 과정을 하였다. 균주 plate 밑면의 생물막을 제외한 상등액은 suction하여 제거하였다. 각 well에 100μl의 1XPBS 용액을 이용하여 1번 wash 하였다. Wash된 생물막은 0.1% crystal violet 용액을 이용하여 20분간 빛이 없는 상온 조건에서 염색하였다. 염색이 끝난 후, 1XPBS용액 100ul을 이용하여 wash하였다. 33%의 Acetic acid 용액을 이용하여 염색된 생물막을 plate에서 떼어내었다. 용해된 생물막은 optical density plate reader기를 이용하여 OD570nm 파장에서의 값을 통해 형성/억제를 평가하고 이러한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, S. epidermidis 세균에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Negative Control; NC), 바이오필름(Biofilm) 형성 억제 효과가 나타나지 않았다. 양성 대조군으로 S. epidermidis 세균에 독시사이클린(Doxy)을 처리한 경우, Biofilm 형성 억제 효과가 나타났다.
S. epidermidis 세균에 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에도 Biofilm 형성 억제 효과가 나타났으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린(Doxy)을 사용한 경우의 효과와 동등하거나 그 이상으로 Biofilm 형성을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 독성 시험
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물이 세포 독성이 없음을 확인하였다.
96-well 세포배양 플레이트에 HaCaT 세포를 각각 2x10^4/well로 24시간 동안 부착한 다음, Broth(식물성 공배지)를 농축하여 첨가하거나(0%(v/v), 5%(v/v), 10%(v/v), 또는 20%(v/v)) (Negative Control; Broth), 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 각각 농축 후 첨가하여(5%(v/v), 10%(v/v), 20%(v/v)) 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양한다. 24시간 후에 배양된 세포배지를 제거하고 cell counting kit-8 용액을 세포에 처리하여 2시간동안 반응시킨 후 Tecan으로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후, O.D sample /O.D control Х 100의 공식으로 환산하여 HaCaT 세포주의 survival rate(Cell viability)을 계산하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우에도 HaCaT 세포의 생존율에 영향을 끼치지 않았고, 오히려 세포 생존율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물은 세포 독성이 없으며, 오히려 세포 독성 감소 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 피부 효능 시험
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물의 피부 재생 효능을 확인하였다.
Cell culture insert(Ibidi)에 HaCaT 세포를 각각 1x10^6/ml의 양으로 70μl씩 seeding 후 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 멸균된 포셉을 이용해 insert를 제거하여 wound healing assay에 필요한 wound 조건을 만들어 준 후, PBS로 2번 washing한다. FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양한다. 배양물 처리 후 0시간, 4시간, 8시간에 현미경을 이용하여 세포사진을 촬영하고 cell profiler 프로그램을 이용해 wound 면적을 계산, (0시간 면적-n시간 면적)/0시간 면적x100의 공식으로 환산하여 HaCaT 세포주의 wound closure를 확인하고 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.
도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 wound closure가 증가하여 피부 세포 재생 효능이 우수한 것을 확인하였다.
또한, HaCaT 세포주에 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물을 첨가하여 피부 재생 관련 마커인 Src, MMP2 (metalloproteinase-2) 발현을 확인하였다. Src의 활성 증가는 표피 상피세포, 진피층 및 혈관내피의 재생이 촉진되는 것을 의미하며, MMP2는 조직재생에 중요한 세포외 기질의 재생을 도와주고 각질세포, 섬유아세포와 같이 재상피화에 중요한 세포의 이동을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
HaCaT 세포를 24 well 세포배양 플레이트에 1x10^5의 양으로 seeding 후 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24h동안 반응시켜 Src와 MMP2의 발현을 RNA상에서 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 Src, MMP2의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물의 피부 재생 효능을 나타낸다.
또한, 피부 보습 효과를 확인하기 위해 HaCaT 세포를 24 well 세포배양 플레이트에 1x10^5의 양으로 seeding 후 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고, 아무 것도 처리하지 않거나 (Cell only), 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 15%(v/v) 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24h동안 반응시켜 피부 보습 기능의 마커인 HAS3 (Hyaluronic acid Synthase 3)와 AQP3 (Aquaporin 3)의 발현을 RNA상에서 확인하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Cell only)와 비교하여, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우 HAS3, AQP3의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 선별한 6개 균주의 배양물의 피부 보습 기능 강화 효능이 우수함을 나타낸다.
실시예 8. 생균의 염증조절 유효성 평가 시험
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)를 식물성 배지(표 3)에서 배양한 후 원심분리하여 (4000g, 20분, 상온), 균주 배양물을 제외한 생균을 확보하였다. 확보된 생균과 면역세포(Raw264.7 대식세포)를 각각 5x10^4 / well의 동일한 비율(1:1)로 96 well plate에서 24시간 co-culture한후 균주의 염증조절 효능을 확인하였다. 대조군으로는 염증완화 균주로 알려져 있는 B. fragilis 균주를 사용하였다. Raw264.7 대식세포에서 분비된 염증성 사이토카인 (IL-6)과 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 ELISA로 측정한 후 그 값을 IL-10/IL-6의 비율로 계산하고 이를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)는 B. fragilis 균주와 비교하여 염증성 사이토카인 (IL-6)의 분비량을 감소시키고 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 분비량을 촉진시켜 전체적으로 항염증 활성이 우수하였다.
실시예 9. Primary 면역세포 배양 및 면역지표 분석
본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물 처리 시 면역세포의 면역지표를 확인하였다.
본 실험에 사용한 면역세포는 마우스 유래의 marrow derived macrophages(mouse BMDM, ㈜한림)와 human monocyte derived macrophage(HMDM, ATCC)이다. 실험에 들어가기 일주일 전에 다음의 조건하에 세포를 배양하였다. BMDM with 10ng/ml of mouse M-CSF 또는 HMDM with 50ng/ml of human M-CSF in 10% RPMI Media의 조건에서 세포를 배양하고, M-CSF를 넣은 fresh RPMI Media 를 3일 간격으로 바꾸어 주었다. 실험 18시간 전에 시험하고자 하는 면역세포를 5 x 104/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.
96 well 세포배양 플레이트에 mouse BMDM (도 12) 또는 HMDM (도 13)을 M-CSF가 포함된 배지를 이용하여 5x10^4/well seeding 후 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 본 실험시 염증반응을 유도하기 위해 면역세포에 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 5μl/well로 처리하고 RPMI Media 95μl를 넣어 total 100μl를 37℃ incubator에서 1시간 동안 처리하였다. 염증반응 유도시 정상세포(Cell only) 그룹을 제외한 모든 그룹에는 C. acnes(ATCC 6919) 균주의 배양물을 처리하여 염증자극을 주었다. 1시간 후 본 출원에서 선별한 CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주 각각의 배양물(20μl)와 fresh Media(80μl)를 더하여 총 100μl를 염증 유도 물질이 처리된 plate에 추가하여 (total 200μl/well) 총 24시간 동안 37℃ incubator에서 배양하였다. 양성 대조군(Positive control)로는 덱사메타손(dexamethasone; Dex)(100nM)을 사용하였다. 음성 대조군(negative control)로는 fresh Media가 처리된 정상세포(Cell only)를 사용하였다. 24시간 배양 후 cultured supernatant를 모두 확보하고 남은 면역세포의 증식 정도를 확인하기 위해 cell counting kit-8 (5μl well) + fresh media (95μl)를 처리하여 37℃ incubator에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하고, Cell only 기준으로 세포 증식 정도를 %로 표기하였다. 확보된 세포 상등액을 이용하여 면역세포에서 분비된 cytokines (IL-6, IL-8)의 양을 ELISA를 통해 측정하였다.
도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, mouse BMDM 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only) 염증성 사이토카인(IL-6)이 분비되지 않았다. Cell w/ stimuli 경우 염증성 사이토카인(IL-6)의 분비가 크게 증가하였고, 면역세포인 mouse BMDM 세포의 증식이 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only)와 비교하여 크게 증가하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우에는 mouse BMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6의 양과 증가한 mouse BMDM 세포의 증식이 크게 낮아지는 것을 확인하였다.
본 출원에서 선별한 CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주의 배양물을 각각 처리한 경우에는 mouse BMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6의 양과 증가한 mouse BMDM 세포의 증식이 크게 낮아지는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 덱사메타손을 사용한 경우와 동등하거나 그보다 우수한 효과를 나타내는 것임을 확인하였다.
도 13은 mouse BMDM 세포 대신 HMDM 세포를 사용하여 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)의 분비량을 확인한 결과로, HMDM 세포에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Cell only) 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)이 거의 분비되지 않았다. Cell w/ stimuli의 경우 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8)의 분비가 크게 증가하였으나, 양성대조군으로 덱사메타손(Dex)를 사용한 경우에는 HMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6, IL-8의 양이 크게 감소하였다.
본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리한 경우도 HMDM 세포에 염증반응이 유도되어 증가한 IL-6, IL-8의 분비량이 크게 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 10. 로사세아 동물 모델 유효성 평가
본 동물 유효성 시험을 위하여 32마리의 5주령 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오사에서 구입하였으며, 12시간 인공 광주기를 주는 사육실에 반입하고 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다.
로사세아 동물 모델을 만들기 위하여 마우스의 등쪽 부위의 털을 제모기와 제모 크림을 이용하여 제거한다. 제모 24시간 후에 로사세아 병변을 유도하기 위해 320μM의 LL37 펩타이드(㈜펩트론)를 50μl씩 인슐린 주사기를 이용하여 피내주사 (intradermal injection) 하였다. LL37 주사는 1일 2회, 2일간 (총 4회) 실시하였으며, 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물은 두번째 LL37 주사와 동시에 150μl씩 1일 1회, 3일간 (총 3회) 복강으로 투여한다. 기존 로사세아 치료용법의 하나인 독시사이클린 (doxycycline)은 1mg/kg 1일 1회, 3일간 (총 3회) 복강으로 투여하였다.
마지막 균주 배양물 투여 24시간 후 캘리퍼를 이용하여 홍반의 크기 (넓이)를 측정하였으며 CO2 가스를 사용하여 동물을 안락사 시킨 후, 병변 부위를 사진으로 찍어 홍반의 정도를 육안 관찰하고 조직 사진과 염증 부위의 넓이를 그래프로 도 14a 및 도 14b에 나타내었다.
도 14a 및 도 14b에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우 피부에 홍반이 크게 나타나는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 피부에 홍반이 다소 감소하는 것을 확인하였다.
마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리(복강 투여)하였더니 피부에 홍반이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린을 처리한 경우와 비교하여도 월등하게 우수한 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물 투여에 따른 주사 동물 모델의 병리학적 검사 결과를 알아보기 위하여, LL37 펩타이드 투여 부위의 피부를 적출하여 조직 염색용으로 4% 포름알데하이드(formaldehyde) 용액에 고정하여 파라핀 포매하였다. 파라핀 포매한 조직으로 절편을 만든 후 조직학적 변화 관찰을 위해 헤마톡실린-에오신(hematoxyline-eosin; H&E)염색을 실시하여 현미경으로 관찰하고, 조직사진을 도 15에 나타내고, 조직병리학적 평가 점수를 아래 표 6에 나타내었다.
Epithelial hyperplasia Dermal inflammation Total
Vehicle 0 0 0
LL37 2.75 2.5 5.25
CJRS-10653 1.6 1.8 3.4
CJRS-10652 1.8 1.4 3.2
Doxy 1.2 2.4 3.6
도 15에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우(LL37) 염증 부위의 넓이가 크게 증가하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 염증 부위의 넓이가 다소 감소한 것을 확인하였다. 마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였더니 염증 부위의 넓이가 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 독시사이클린을 처리한 경우와 비교하여도 월등하게 우수한 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
또한 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 마우스에 아무 것도 처리하지 않은 경우(Vehicle)와 비교하여, 마우스에 LL37 펩타이드를 처리하여 로사세아를 유도한 경우(LL37) 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)과 피부염증 (Dermal inflammation)이 크게 증가하였다. 양성 대조군으로 마우스에 독시사이클린(Doxy)를 처리하였더니 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)은 감소하였지만, 피부염증 (Dermal inflammation)은 감소시키지 못하는 것을 확인하였다.
그러나 마우스에 본 출원에서 선별한 균주(CJRS-10652 균주 또는 CJRS-10653 균주)의 배양물을 각각 처리하였더니 증가된 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia)과 피부염증 (Dermal inflammation)이 크게 감소한 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터, 본 출원에서 선별한 균주의 배양물을 마우스에 복강 처리하였을 때, 홍반, 상피조직과형성 (Epithelial hyperplasia) 및 피부염증 (Dermal inflammation)이 모두 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 11. 피부 장벽 개선 및 보습효과 확인
피부 주름 및 노화의 주 원인으로는 피부 진피층의 무너진 장벽, 수분 손실 및 콜라겐 생성 감소 등이 있다. 특히, 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐의 결핍은 피부 주름의 발생 원인 중 하나이며, 노화가 진행됨에 따라 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 더하여, 수분 손실은 피부 재생을 더디게 만들어 탄력이 줄어들어 잔주름의 원인이 되고 피부 노화를 촉진시킨다. 따라서 피부 장벽(Filaggrin) 개선, 콜라겐(Procollagen type I)의 생성정도 및 보습(Aquaporin-3)개선의 중요 지표들을 확인하여 피부 주름개선 및 항노화 효과를 확인할 수 있다.
㈜티앤알바이오팹에서 제작한 피부 3D 미니티슈 (organoid)인 T&R HuSkin에 poly I:C를 이용하여 염증을 유도하였다. 그 후 본 출원에서 선별한 균주 배양물을 적용하여, 피부 개선 지표(장벽 개선 및 보습)의 변화를 확인하였다.
시험방법
1) T&R HuSkin은 진피층과 표피층으로 구성된 전층 (full thickness) 피부 모델이며 ㈜티앤알바이오팹의 3DXPrinter바이오프린터를 이용하여 제작되었다.
2) 진피층의 제작을 위하여 돼지 피부유래 세포외기질 기반 하이드로젤과 인간 유래 섬유아세포 (fibroblast; Lonza, Basel, Switzerland) 를 100×10^4 cells/ml의 농도로 혼합한 바이오잉크를 프린팅하였으며 37 ℃ 인큐베이터에서 40분간 노출시켜 겔화 하였다.
3) 이후 겔화된 진피층 위에 인간 유래 각질형성세포 (keratinocyte; Lonza)를 55×10^4 cells/insert로 분주하고 1일동안 각질형성세포 배양액(Keratinocytes growth media, KGM; Lonza)에 완전히 잠긴 상태로 배양하였다.
4) 1일 이후 피부와 같은 배양조건을 부여해주기 위하여 각질형성세포가 분주된 진피층 표면만을 공기중에 노출시키는 Air-liquid interface(ALI) 조건을 구현하여 7일간 조직화하였다.
5) 7일간 ALI조건에서 배양하여 확보한 T&R HuSkin에 염증유도 물질(poly I:C, 20μg/mL) 및 시험물질(본 출원에서 선별한 균주 배양물, 0.5x 농도, 5%(v/v))을 동시에 처리하여 2일간 HuSkin 추가 배양 후 피부개선 관련 지표들의 변화를 확인하였다. (각 조건당 N=2).
6) IF 형광 사진 확보 후 Image J의 mean gray value를 통해 각 사진(area of interest: 사진 전체 면적)의 형광Intensity값을 수치화 하였다.
시험결과
1) 장벽 개선
T&R HuSkin에서 장벽개선 지표인 Filaggrin의 발현양을 IF염색을 통하여 비교분석 하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 처리한 군 모두에서 Filaggrin의 발현양이 음성대조군(Poly I:C 단독 처리) 대비 동등 이상으로 증가하였다. 그 중에서 CJRS-10651, CJRS-10653, CJRS-10654, 또는 CJRS-10655 균주 배양물 처리군은 Filaggrin의 발현양이 정상대조군(non-treated) 동등 수준까지 회복된 것을 확인할 수 있었고, CJRS-10656 균주 배양물 처리군의 경우는 Filaggrin의 발현양이 정상대조군(non-treated) 대비 더 증가한 것을 확인하였다.
2) 보습 개선
T&R HuSkin에서 보습개선 지표인 Aquaporin-3의 발현양을 IF를 통하여 비교분석 하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 6개 균주(CJRS-10651 균주, CJRS-10652 균주, CJRS-10653 균주, CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주)의 배양물을 처리한 군 모두에서 Aquaporin-3의 발현양이 음성대조군(Poly I:C 단독 처리) 대비 동등 이상으로 증가하였다. 그 중에서 CJRS-10654 균주, CJRS-10655 균주, 또는 CJRS-10656 균주 배양물 처리군은 정상대조군(non-treated) 대비 Aquaporin-3의 발현양이 동등 수준까지 회복된 것을 확인하였다.
실시예 12. 콜라겐 지표 확인.
본 출원에서 선별한 균주 배양물을 인간섬유아세포에 처리 시 배양물의 독성 및 배양물에 의한 콜라겐 생성 및 분비 정도를 확인하였다.
실험방법
1) 인간섬유아세포 배양
본 실험에서는 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk cell)를 사용하였다. 본 실험에 들어가기 일주일 전에 인간섬유아세포를 FBS 10%(v/v) DMEM에 배양 및 유지하였다. 실험 18시간 전에 인간섬유아세포를 1x104/well 로 flat bottom 96 well plate에 seeding하였다.
2) 균주 배양물과 인간섬유아세포 co-culture
균주 배양물 원액((실험예 2에서, 균주 배양물을 원심분리하여 균주를 제외한 배양물(cell free supernatant)) 및 실험예 2에서 제조된 3kDa 이하로 여과된 균주 배양물의 농도가 10, 20, 30, 40 %(v/v)가 되도록 FBS 10%(v/v) DMEM을 이용해 제조한 뒤, 인간섬유아세포 100 μL가 있는 plate에 100 μL씩 추가하여 최종 농도 5, 10, 15, 20 %(v/v)로 처리하고 (총 200 μL/well) 총 24시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다.
배양액이 인간섬유아세포의 viability에 미치는 영향 및 콜라겐 생성 정도를 확인하여 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. 음성 대조군 (negative control)으로는 FBS 10%(v/v) DMEM을 넣은 정상세포 (Cell only)를 사용하였다.
3) 인간섬유아 세포 독성 테스트
24시간 후 상층액(cultured supernatant)을 모두 확보하고 남은 인간섬유아세포의 viability 정도를 확인하기 위해 cell counting kit 8 (Enzo, 5μL/well) 및 fresh RPMI media (95μL)를 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간동안 반응한 후 450nm로 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 균주 배양물 원액 및 3kDa 이하로 여과한 배양물을 처리하였을 때, 모든 농도에서 인간섬유아세포에서의 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
4) 인간섬유아세포 콜라겐 생성 기능 측정
상기 3)에서 확보된 상층액(supernatant)을 이용하여 인간섬유아세포에서 분비된 프로콜라겐 타입 I C-펩티드(Procollagen type I C-peptide; PIP)를 ELISA 키트를 사용하여 콜라겐 생성 기능을 확인하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 선별한 균주 배양물 원액 및 3kDa 이하로 여과한 배양물을 처리하였을 때, 모든 농도에서 PIP 분비가 대조군(cell only)과 비교하여 동등 이상 증가되었음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
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Claims (16)

  1. 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 큐티박테리움 속 균주는,
    (a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
    를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물:
    (1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
  4. 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 큐티박테리움 속 균주는,
    (a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
    를 포함하는 것인, 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물:
    (1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 염증성 피부질환 유발균은 큐티박테리움 아크네(C. acnes), 큐티박테리움 아비덤(C. avidum), 큐티박테리움 그래눌로섬(C. granulosum), 스타필로코쿠스 오레우스(S. aureus), 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스(S. epidermidis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 항균용 조성물.
  7. 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 큐티박테리움 속 균주는,
    (1) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (2) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
    를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
    (1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 식품 조성물.
  10. 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 큐티박테리움 속 균주는,
    (1) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (2) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자
    를 포함하는 것인, 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물:
    (1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 탈모, 로사세아(Rosacea), 결절성 홍반, 다형 홍반, 모공성 각화증, 건선, 습진, 아토피 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 사료 조성물.
  13. (a) Lrp/AsnC 계열 전사 조절자 (Lrp/AsnC family transcriptional regulator) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (b) 락토코신 972 계열 박테리오신 (lactococcin 972 family bacteriocin) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 큐티박테리움 속(Cutibacterium) 균주.
  14. 제13항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 하기 (1) 내지 (6)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 것인, 큐티박테리움 속 균주:
    (1) 베타-글루큐로니다제 (beta-glucuronidase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (2) 2-아이소프로필말산 합성효소 (2-isopropylmalate synthase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (3) 3-아이소프로필말산 탈수효소 (3-isopropylmalate dehydratase) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (4) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cse1/CasA (type I-E CRISPR-associated protein Cse1/CasA) 또는 이를 암호화하는 유전자,
    (5) 타입 I-E CRISPR-연관 단백질 Cas7/Cse4/CasC (type I-E CRISPR-associated protein Cas7/Cse4/CasC) 또는 이를 암호화하는 유전자, 및
    (6) CRISPR-연관 헬리카아제/엔도튜클라아제 Cas3 (CRISPR-associated helicase/endonuclease Cas3) 또는 이를 암호화하는 유전자.
  15. 제13항에 있어서, 상기 큐티박테리움 속 균주는 서열번호 8의 16S rRNA 유전자를 포함하는 것인, 큐티박테리움 속 균주.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 항염증 활성, 염증성 피부질환 유발균에 대한 항균 활성, 피부 재생 활성, 피부 보습 활성, 및 염증성 피부질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 활성을 가지는 것인, 큐티박테리움 속 균주.
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