WO2017183924A1 - 단풍나무 잎 추출물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

단풍나무 잎 추출물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2017183924A1
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dry eye
kiom
eye syndrome
maple leaf
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PCT/KR2017/004239
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마진열
오유창
임남희
유재명
조원경
황윤환
김연희
오태우
박은희
박광일
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한국한의학연구원
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of dry eye syndrome comprising maple leaf extract, specifically, the composition for the prevention or treatment of dry eye syndrome comprising maple leaf extract as an active ingredient, using the pharmaceutical composition It relates to a method for preventing or treating dry eye syndrome, a food composition and a cosmetic composition for preventing or improving dry eye syndrome comprising maple leaf extract as an active ingredient.
  • Dry eye syndrome is a condition called dry eye syndrome or dry eye syndrome, and has a foreign body feeling as if the eyes are frosted and contains sand grains.
  • the pathogenesis has not yet been fully understood, but evidence of the inflammatory disease has been secured, and in the tears of dry eye patients, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN- Inflammation-related cytokines such as ⁇ , TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and inflammation-related chemokines such as IL-8 have been reported to be overexpressed (Massingale ML., 2009, Cornea, 28 (9): 1023-7).
  • Dry eye can be treated with drugs using artificial tear drops, inflammation eye drops, vitamin eye drops, and the like.
  • drugs used for the treatment of dry eye include cyclosporin A, Fluorometholone, and the like.
  • Cyclosporin A is a drug widely used as an immunosuppressive agent, and inhibits the activity and growth of T cells related to IL-2, IL-4, IL-12, etc., thereby reducing the activity of the immune system and reducing inflammation on the ocular surface.
  • Fluorometholone is also a corticosteroid, the most commonly used drug after laser-based refractive surgery. Fluorometholone-acetate suspensions have been used for the treatment of steroid reactive inflammatory conditions caused on the ocular surface, such as eyelids and bulbar conjunctiva, corneas.
  • Acer palmatum Thunb Is a deciduous tree growing tree, reaching 10m in height, small branches without hairs, reddish brown, and the leaves are facing each other and deeply divided into 5-7.
  • the root bark and branches of maple trees are used as anti-inflammatory and detoxifying medicines, and when knee pain is severe, they are put in water and taken when broken.
  • maple dry eye treatment there is no known effect of maple dry eye treatment.
  • maple leaf extract not only regulates the inflammatory state of corneal epithelial cells, but also increases tear secretion in an animal model in which dry eye is induced,
  • the present invention has been completed by confirming that dry eye can be treated by reducing the degree of damage and inflammation of the surface.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising maple leaf extract of Acer palmatum Thunb. As an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating dry eye syndrome comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • Still another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving dry eye syndrome comprising maple leaf extract of Acer palmatum Thunb. As an active ingredient.
  • Yet another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving dry eye syndrome including maple leaf (Acer palmatum Thunb.) Leaf extract as an active ingredient.
  • the maple leaf extract of the present invention has the effect of preventing, improving and treating dry eye syndrome to a degree similar to or better than that of the conventionally known agent for treating dry eye syndrome.
  • composition of the present invention is derived from natural products, it can be safely used without side effects in the prevention, treatment and improvement of dry eye syndrome.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect on apoptosis of maple leaf hydrothermal extract KIOM-2015W of the present invention.
  • Human corneal epithelial cells (HCEC) induced by osmotic stress (HOS) induced dry eye syndrome were treated with KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml.
  • Cytosporin A (CsA) 5 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml of Fluorometholone (FML) was incubated for 24 hours, the cytotoxicity and apoptosis inhibitory effect was measured by MTT assay.
  • FIG. 2 is an image showing the apoptosis inhibitory effect of KIOM-2015W.
  • Human corneal epithelial cells (HCEC) induced by osmotic stress (HOS) were treated with KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml, and the positive control group was treated with 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ml of FML 10. ⁇ g / ml was used. The picture was taken at 40 ⁇ magnification.
  • FIG. 3 is a Western blot image showing the effect of inhibiting the expression of apoptosis-related proteins Cleaved caspase-3 and Cleaved PARP of KIOM-2015W, and increasing the expression of Bcl-2, a cell survival-related protein.
  • ⁇ -actin was used as a control gene (loading control) for comparison of expression levels.
  • FIG. 4 is an image of FACS results showing the apoptosis inhibitory effect of KIOM-2015W, the analysis of the staining of Annexin V-FIEC and propidium iodide (PI) in response to changes in cell membrane permeability occurs during apoptosis.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect of KIOM-2015W TNF- ⁇ protein (a and b), IL-1 ⁇ protein (c and d) and IL-6 protein (e and f) expression, respectively, mild osmotic pressure of 3 hours
  • This is the result of 24 hours of KIOM-2015W treatment after stress, or 24 hours of osmotic stress and KIOM-2015W at the same time.
  • Results obtained from three independent experiments, and statistical significance of each result confirmed by Tukey's test are indicated as follows: ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs. control; # p ⁇ 0.05, ## p ⁇ 0.01, ### p ⁇ 0.001 vs. HOS.
  • FIG. 6 is an image showing the inhibitory effect of KIOM-2015W TNF- ⁇ protein (a), IL-1 ⁇ protein (b) and IL-6 protein (c) expression, using the specific antibody having a green color The expression pattern of the protein was confirmed. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • Figure 7 is an image (a) and graph (b) showing the inhibitory effect of KIOM-2015W TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA expression
  • b is a control by measuring the density of the mRNA expression amount shown in a Shows the result of calculating the ratio for.
  • GAPDH was used as a loading control for comparison of expression levels. The statistical significance of each result was confirmed by Student's test, and the subscripts marked with * indicate a significant difference at p ⁇ 0.01.
  • FIG. 8 is a graph showing the apoptosis inhibitory effect of the maple leaf ethanol extract KIOM-2015E of the present invention.
  • FIG. 9 is an image showing the apoptosis inhibitory effect of KIOM-2015E.
  • the ECOM-2015E was treated with 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml and KIOM-2015W at 0.2 mg / ml, and the control group was treated with HCOS, which induced dry eye with HOS. And 10 ⁇ g / ml of FML were used. The picture was taken at 100 ⁇ magnification.
  • FIG. 10 shows the staining of Annexin V-FIEC and propidium iodide (PI) in response to changes in cell membrane permeability resulting from apoptosis as a result showing the apoptosis inhibitory effect of KIOM-2015E.
  • Figure 11 is an image showing the effect of inhibiting the expression of TNF- ⁇ protein (a), IL-1 ⁇ protein (b) and IL-6 protein (c), the expression pattern of the protein using each specific antibody having a green color It was confirmed. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • FIG. 12 is an image (a) and graph (b) showing the inhibitory effect of KIOM-2015E TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA expression
  • b is a control by measuring the density of the mRNA expression amount shown in the a Shows the result of calculating the ratio for.
  • GAPDH was used as a loading control for comparison of expression levels. The statistical significance of each result was confirmed by Student's test, and the subscripts marked with * indicate a significant difference at p ⁇ 0.01.
  • Figure 13 is a schematic diagram showing the production of dry eye animal model, and how to administer the maple leaf extract to the model.
  • FIG. 14 is a graph showing tear secretion of maple leaf hydrothermal or ethanol extracts (KIOM-2015W or KIOM-2015E, respectively) for dry eye animal model.
  • Normal control group was normal mouse, BAC was dry eye induced by BAC (Benzalkonium chloride) treatment, PBS vehicle was saline-treated negative control mouse, CsA was cyclosporin A, CML was Fluorometholone stands for, ED stands for topical eye drop, PO stands for oral administration.
  • 0 Day is before the drug treatment, and means 14 days after the BAC treatment.
  • the statistical significance of each result confirmed by two-way ANOVA is expressed as follows: # P ⁇ 0.05 vs. Normal; ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001 vs. BAC.
  • FIG. 15 is an image and graph showing the ocular surface damage reduction effect of KIOM-2015W or KIOM-2015E on dry eye animal model. Lysamine green B (1%) was used to measure the degree of damage.
  • Normal control group was normal mice, BAC was dry eye induced by BAC treatment, PBS vehicle was saline treated negative control mice, CsA is cyclosporin A, FML is fluorometholone, ED is Topical administration, PO means oral administration.
  • the statistical significance of each result confirmed by Two-way ANOVA is expressed as follows: # P ⁇ 0.05 vs. Normal; ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001 vs. BAC.
  • FIG. 16 is an image and graph showing the ocular surface inflammation reduction effect of KIOM-2015W or KIOM-2015E on a dry eye animal model, where a is TNF-a, b is IL-1b and c is IL-6. Tissues were identified by immunofluorescence staining. Endo means endothelium, Epi means epithelium, and Stroma means corneal stroma, normal control group is normal mouse, BAC is dry-mouth-induced mouse by BAC treatment, PBS vehicle ) Denotes a negative control mouse treated with saline, CsA represents cyclosporin A, FML represents fluorometholone, ED represents eye drop, and PO represents oral administration. The statistical significance of each result confirmed by Two-way ANOVA is expressed as follows: *** P ⁇ 0.001 vs. Normal; ### P ⁇ 0.001 vs. 0.2% BAC. Scale bar represents 100 ⁇ m.
  • FIG. 17 is an image and graph showing the apoptosis inhibitory effect of KIOM-2015W or KIOM-2015E on dry eye animal model.
  • Cell death was measured via TUNEL assay.
  • Endo means endothelium
  • Epi means epithelium
  • Stroma means corneal stroma
  • normal control group is normal mouse
  • BAC dry-mouth-induced mouse by BAC treatment
  • PBS vehicle Denotes a negative control mouse treated with saline
  • CsA represents cyclosporin A
  • FML represents fluorometholone
  • ED represents eye drop
  • PO oral administration.
  • the statistical significance of each result confirmed by Two-way ANOVA is expressed as follows: *** P ⁇ 0.001 vs. Normal; ### P ⁇ 0.001 vs. 0.2% BAC. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • FIG. 18 is an image and graph showing the morphological improvement effect of KIOM-2015W or KIOM-2015E on the dry eye animal model, a is H & E staining, b is PAS staining, c is corneal thickness results.
  • Normal control group was normal mice, BAC was dry eye induced by BAC treatment, PBS vehicle was saline treated negative control mice, CsA is cyclosporin A, FML is fluorometholone, ED is Topical administration, PO means oral administration.
  • the statistical significance of each result confirmed by Two-way ANOVA is expressed as follows: *** P ⁇ 0.001 vs. Normal; ### P ⁇ 0.001 vs. 0.2% BAC. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • One embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of dry eye syndrome comprising maple (Acer palmatum Thunb.) Leaf extract as an active ingredient.
  • the maple leaf extract was confirmed that effectively control the inflammation of the dry eye induced corneal epithelial cells, it was confirmed that the extract can be used as an active ingredient of dry eye treatment.
  • Maple is a deciduous tree growing tree having the scientific name of Acer palmatum Thunb., And refers to a plant having a circular shape of about 10 to 20m in height.
  • Roots, stems, leaves, berries, flowers, etc. of the maple tree may be used for the prevention or treatment of dry eye syndrome, and more specifically, leaves may be used, but are not particularly limited thereto as long as they have the effect of preventing or treating dry eye syndrome. Do not.
  • the maple leaf may be purchased commercially, or may be used collected or grown in nature.
  • extract refers to an extract obtained by extracting the maple leaves, a diluent or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a crude or purified product of the extract, a mixture thereof, and the like, It includes the extract itself and extracts of all formulations that can be formed using the extract.
  • the method of extracting the maple leaves is not particularly limited and may be extracted according to a method commonly used in the art.
  • the kind of the extraction solvent used to extract the maple leaves in the present invention is not particularly limited, and any solvent known in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the extraction solvent may include water, alcohols having 1 to 4 carbon atoms or mixed solvents thereof, and these may be used alone or in combination of one or more thereof.
  • water or ethanol may be used, but is not limited thereto.
  • the ethanol may be 10 to 99%, more specifically 20 to 50% ethanol, but is not limited thereto.
  • the maple leaf extract may be one of the maple leaf hydrothermal extract.
  • the maple leaf extract may be a maple leaf ethanol extract.
  • the maple leaf pulverized product is immersed in water and then immersed in a vacuum extractor and then lyophilized to extract maple leaf hydrothermal extract.
  • the extract may be concentrated under reduced pressure and lyophilized to prepare the maple leaf ethanol extract.
  • the extract may be prepared and used in the form of a dry powder after extraction, but is not limited thereto.
  • dry eye refers to a disease of the eye in which the surface of the eye is damaged to feel irritation symptoms such as irritation, foreign bodies, and dryness.
  • the dry eye may be caused by tear secretion or abnormal tear evaporation due to inflammation of the tear gland or Meibomian gland and denervation of the cornea. If the dry eye syndrome is intensified and the tears are excessively dry, corneal conjunctival epithelial disorders, which appear as scarring of the cornea, may be caused.
  • cyclosporin A and fluorometholone which exhibit anti-inflammatory activity, are being used as a treatment for dry eye syndrome, and dry eye syndrome can be achieved by treating inflammation and reducing the effects of inflammation. It is self-evident.
  • prevention means any action that inhibits or delays dry eye syndrome by administration of a pharmaceutical composition of the present invention comprising maple leaf extract.
  • treatment refers to any action in which dry eye syndrome is improved or advantageously changed by administration of the pharmaceutical composition.
  • maple leaf extract of the present invention can be used as an active ingredient for treating dry eye syndrome.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include 0.000001 to 80% by weight of the maple leaf extract relative to the weight of the total composition, and may specifically include 0.00001% to 40% by weight, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition, the carrier comprising a non-naturally occuring carrier. can do.
  • the pharmaceutical composition may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. .
  • “Pharmaceutically acceptable” means to exhibit properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • the type of the carrier is not particularly limited, and any carrier can be used as long as it is a conventionally used and pharmaceutically acceptable carrier in the art.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • ком ⁇ онентs such as antioxidants, buffers and / or bacteriostatic agents may be added and used, and diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, and the like may be additionally added to provide a solution such as an aqueous solution, a suspension, an emulsion, or the like. It may be formulated into a use formulation, pills, capsules, granules or tablets.
  • the mode of administration of the pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome in accordance with the present invention is not particularly limited, and may be in accordance with methods commonly used in the art.
  • the composition may be administered by oral or parenteral administration.
  • the composition for preventing, ameliorating or treating dry eye of the present invention may be prepared in various formulations according to the desired mode of administration.
  • the pharmaceutical composition may be an external topical formulation, and may be specifically formulated into any one selected from the group including eye ointments, eye drops, and sprays, but formulations used for administration to the eye in the art. Is not limited.
  • Another embodiment provides a method of preventing or treating dry eye syndrome comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the term "administration” means the introduction of certain substances into an individual in a suitable manner.
  • the term "individual” means all animals, such as rats, mice, and livestock, including humans that may develop or may develop dry eye syndrome. As a specific example, it may be a mammal including a human.
  • the method for preventing or treating dry eye syndrome of the present invention may include administering to the individual a pharmaceutical composition comprising a maple leaf extract in a pharmaceutically effective amount.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and that does not cause side effects, and the effective dose level refers to the sex, Factors including age, weight, health, type of disease, severity, drug activity, drug sensitivity, method of administration, time of administration, route of administration, and rate of excretion, duration of treatment, combination or drug used and other medicines It can be easily determined by those skilled in the art according to factors well known in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at 0.000001 to 100 mg / kg body weight per day, more specifically at 0.0001 to 100 mg / kg body weight based on solids. Dosing may include administering the recommended dose once daily, or in divided doses.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. It may also be single or multiple doses. Taking all of these factors into consideration it is important to administer an amount that will achieve the maximum effect in a minimum amount without causing side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the route of administration and the mode of administration of the composition are not particularly limited, and any route of administration can be reached as long as the composition comprising the composition can be reached at the desired site.
  • the composition may be administered through various routes, oral or parenteral, and non-limiting examples of the route of administration include oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, nasal What is administered through intralateral or inhalation etc. are mentioned.
  • Nature of the maple leaf extract of the present invention is effective in the prevention or treatment of dry eye, the route of administration of the composition may be administered through the eye.
  • Another embodiment provides a food composition for improving dry eye syndrome comprising maple leaf extract of Acer palmatum Thunb. As an active ingredient.
  • the term " improvement" means any action that at least reduces the parameters associated with the condition to be treated with the administration of the compositions of the present invention, eg the extent of symptoms.
  • the term "food” of the present invention meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, alcoholic beverages , Vitamin complexes, nutraceuticals and health foods, and includes all foods in the usual sense.
  • the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, high dry eye improvement effects can be expected, and thus can be very useful for health promotion purposes.
  • the functional food is the same term as a food for special health use (Food for special health use, FoSHU), in addition to the nutritional supply, the processed food, so that the bioregulatory function appears efficiently, high medical effect Means food.
  • Food for special health use Food for special health use, FoSHU
  • the term 'function (sex)' refers to obtaining a useful effect for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the food of the present invention may be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation may be performed by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the food may be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in a variety of dosage forms, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a natural product, and because the portability is excellent,
  • the food of the present invention can be taken as an adjuvant for enhancing the dry eye improvement effect.
  • the health food refers to foods having active health maintenance or promotion effect as compared to general foods
  • the health supplement food refers to foods for health supplementation purposes.
  • nutraceutical, health food, dietary supplement are used.
  • the health functional food is a food prepared by adding the compound of the present invention to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, etc.
  • food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, etc.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier, and the type of carrier is not particularly limited and may be any carrier that is commonly used in the art.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • additional ingredients may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) and chromium (Cr); And amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • the food composition is a preservative (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetic acid, etc.), fungicides (bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisol (BHA), butylhydride) Oxytoluene (BHT), etc.), colorant (such as tar pigment), colorant (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasoning (MSG glutamate, etc.), sweetener (ducin, cyclate, saccharin Foods such as sodium, etc.), fragrances (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (foils), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, modifiers It may include food additives.
  • the additive may be selected according to
  • An example of the food composition of the present invention may be used as a health beverage composition, in which case it may contain various flavors or natural carbohydrates and the like as additional ingredients, such as a general beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumartin, stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame;
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.0001 to 0.4 g, specifically about 0.0002 to 0.3 g per 100 mL of the health beverage composition of the present invention.
  • the health beverage composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, Alcohol or carbonation agent and the like.
  • Others may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks, or vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • the ratio of such additives is not critical, but is generally selected from 0.0001 to 0.10 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present invention.
  • the extracted maple leaf extract was filtered using a standard test sieve (150 ⁇ m, Retsch, Han, Germany) and concentrated to dryness in a freeze dryer.
  • the freeze-dried maple leaf extract powder (50 mg) was dissolved in 1 ml of distilled water, filtered through a 0.22 ⁇ m disk filter, and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • Example 1-1 Inhibition of Toxicity and Apoptosis of Human Corneal Epithelial Cells
  • HCEC was grown in growth medium and stabilized, and then osmotic stress (HOS) was added to DMEM / F-12 serum free medium of 450 mOsM.
  • HOS osmotic stress
  • KIOM-2015W was treated at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml in the HCEC exposed to the same environment causing dry eye syndrome by HOS and incubated for 24 hours.
  • 100 ⁇ l of MTT reagent at a concentration of 5 mg / ml was added and incubated for 2 hours. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) was dissolved, and the absorbance was measured at 570 nm.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HCOS added HOS significantly reduced the survival of the cell, but HCEC treated with KIOM-2015W did not increase the cytotoxicity by HOS.
  • HCEC treated with KIOM-2015W did not increase the cytotoxicity by HOS.
  • the cells treated with KIOM-2015W increased viability rather than the cells treated with CsA or FML, which is currently used as a treatment for dry eye.
  • KIOM-2015W of the present invention exhibits the effect of inhibiting the toxicity of cells in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress to increase cell protection and viability.
  • Example 1-2 Morphological Inhibition Effect of Human Corneal Epithelial Cells
  • the HCEC exposed to the same environment causing dry eye syndrome by HOS was treated with KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml, and then cultured for 24 hours to observe the morphology of cells. At this time, 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ⁇ g / ml of FML used as a dry eye treatment were used as positive controls.
  • HOS added HCEC shows a typical characteristic of apoptosis, such as a decrease in the total number of cells, the appearance of cells outside the epithelial form, and a significant increase in the number of condensed cells It was confirmed. However, it was confirmed that HCEC treated with KIOM-2015W increased in number and maintained the morphology of epithelial cells, and this effect was improved as the concentration of KIOM-2015W increased. In addition, it was confirmed that the type and number of cells treated with KIOM-2015W were similar to or rather increased than those treated with CsA or FML, which is currently used as a treatment for dry eye.
  • KIOM-2015W of the present invention has an effect of inhibiting cell death in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress.
  • the cells were treated with osmotic stress and KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml for 24 hours, and the positive control group used 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ⁇ g / ml of FML. It was.
  • the expression level of the protein involved in apoptosis in the cells was confirmed by Western blot analysis.
  • the incubated cells were rinsed three times with 1 ⁇ PBS and then lysed using lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ⁇ g / ml aprotinin). . Then, the supernatant was recovered to quantify the protein present in each sample, and 30 ⁇ g of protein was mixed with 4 ⁇ sample buffer to prepare 12% SDS-polyacrylamide gel (1.5 M Trisma base, 10% SDS, 30% acrylamide, 10% ammonium). persulfate, TEMED).
  • the electrophoresed gel-like proteins were transferred to NC membranes, and each membrane was blocked by reaction for 1 hour at room temperature with 5% skim milk to prevent nonspecific binding with antibodies.
  • the primary antibody associated with apoptosis was reacted overnight at 4 ° C., washed three times with TBS containing 0.05% Tween, and then reacted with the secondary antibody anti-IgG conjugated HRP for 1 hour at room temperature. After washing three times with TBS containing 0.05% Tween, the amount of protein expression was detected using ECL solution.
  • KIOM-2015W inhibits the expression of apoptosis inducing proteins and at the same time increases the expression of cell survival inducing proteins, thereby inhibiting the death of human corneal cells induced by HOS.
  • Example 1-4 Inhibition of cell membrane permeability change during cell death
  • the cells were treated with osmotic stress and KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml for 24 hours, and the positive control group used 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ⁇ g / ml of FML. It was.
  • the cells were washed with DPBS, treated with Trypsin-EDTA, centrifuged to collect the cells isolated from the culture dish, and then 100 ⁇ l of the binding buffer prepared before dilution was added, and 5 ⁇ l of Annexin V-FITC and 5 ⁇ l of PI was added and mixed lightly, followed by reaction at room temperature under dark conditions for 15 minutes. Then, 400 ⁇ l of the binding buffer was added and analyzed in a flow cytometer.
  • HCOS added HOS was confirmed that the deformation of the cell membrane caused by increasing the number of cells distributed in the positive region of Annexin V-FITC and PI.
  • HCEC treated with KIOM-2015W was found to inhibit the change of HOS-induced cell membranes, thereby reducing the reaction between Annexin V-FITC and PI.
  • KIOM-2015W has an effect of inhibiting apoptosis in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress.
  • the maple leaf hydrothermal extract KIOM-2015W of the present invention inhibits cell death in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress, dry eye syndrome It has been confirmed that it can be usefully used for the improvement and treatment of.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to measure the expression levels of the inflammation-inducing cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 proteins.
  • the dry eye in vitro model of HCEC was prepared by the method according to Example 1. Thereafter, the cells were subjected to osmotic stress for 3 hours, and then treated with KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml for 24 hours, or simultaneously treated with osmotic stress and KIOM-2015W for 24 hours. The supernatant was recovered. Then, secreted from cells using Human TNF ELISA kit II (BD catalog No. 550610), Human IL-1 ⁇ ELISA kit II (BD catalog No. 557966), Human IL-6 ELISA kit II (BD catalog No. 550799). Of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 contained in the culture medium. Expression level was measured.
  • KIOM-2015W has a similar or superior effect of IL-6 to CsA or FML. It was confirmed to further reduce the amount of expression.
  • KIOM-2015W of the present invention is the same environment of dry eye syndrome induced TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 protein of HCEC Since inflammation is improved by reducing expression, it has been confirmed that it can be usefully used for the improvement and treatment of dry eye syndrome.
  • Immunostaining was performed using TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 specific antibodies to confirm the protein expression patterns of inflammation-inducing cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6.
  • HOS and KIOM-2015W were treated with HCEC at a concentration of 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml for 24 hours, followed by TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 specific antibodies (green).
  • the cells were reacted and the expression of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 in the cells was confirmed by confirming the staining pattern with a fluorescence microscope.
  • a certain number of HCECs were inoculated in a petri dish to stabilize for one day, and then treated with HOS, and treated with KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml, and harvested by incubating for 24 hours.
  • the harvested cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then reacted with 0.3% Triton X-100 / TBS for 10 minutes to allow the antibody to penetrate the cell membrane and then blocking to prevent nonspecific binding of the antibodies.
  • Buffer 5% BSA, TBS containing 5% normal goat serum
  • the primary antibody TNF- ⁇ was reacted and removed for 1 hour at room temperature, and then further reacted with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG for 1 hour at room temperature. Nuclear staining with DAPI was performed for 10 minutes and observed by fluorescence microscope to image.
  • KIOM-2015W of the present invention is the same environment of dry eye syndrome induced TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 protein of HCEC Since inflammation is improved by reducing expression, it has been confirmed that it can be usefully used for the improvement and treatment of dry eye syndrome.
  • Example 2-3 MRNA expression level through PCR
  • PCR was performed to determine the expression levels of the inflammation-causing cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA.
  • HCOS was treated with HOS and KIOM-2015W at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml and incubated for 4 hours. Then, the mRNA expression level of the cells was observed by PCR.
  • mRNA was extracted using TRIzol Reagent, Chloroform, Isopropanol from cells harvested after KIOM-2015W treatment, and AccuPower® CycleScript RT PreMix (dT20) (BIONEER) was used.
  • CDNA was synthesized by repeating the reaction 12 times at 30 ° C. for 30 seconds, at 48 ° C. for 4 minutes, and at 55 ° C. for 30 seconds.
  • KIOM-2015W of the present invention improves inflammation by reducing the expression of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA of HCEC induced the same environment as dry eye syndrome, thereby improving and treating dry eye syndrome. It was confirmed that it can be usefully used in.
  • Example 3-1 Inhibition of Toxicity and Increased Viability of Human Corneal Epithelial Cells
  • HCEC was prepared by the method according to Example 1-1 exposed to the same environment causing dry eye syndrome by HOS. While treating HCEC with HOS, KIOM-2015E was incubated at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml, and KIOM-2015W at a concentration of 0.2 mg / ml for 24 hours. The viability of the cultured cells was observed by MTT assay. At this time, 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ⁇ g / ml of FML used as a dry eye treatment were used as positive controls.
  • HCOS added HOS significantly reduced the viability, but HCEC treated with KIOM-2015E did not increase the cytotoxicity by HOS.
  • the cells treated with KIOM-2015E was confirmed to increase the viability rather than the cells treated with CsA or FML, which is currently used as a treatment for dry eye syndrome.
  • KIOM-2015E of the present invention suppresses the toxicity of cells in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress, thereby increasing the cell protection and viability.
  • HCOS to which HOS was applied showed typical characteristics of apoptosis, such as a decrease in the total number of cells, a cell shape outside the epithelial cell shape, and a significant increase in the number of condensed cells. It was confirmed. However, it was confirmed that HCEC treated with KIOM-2015E increased in number and maintained the morphology of epithelial cells, and this effect was improved as the concentration of KIOM-2015E increased. In addition, it was confirmed that the type and number of cells treated with KIOM-2015E were similar to or rather increased than those treated with CsA or FML, which is currently used as a treatment for dry eye.
  • KIOM-2015E of the present invention has an effect of inhibiting cell death in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress.
  • Example 3-3 Inhibition of cell membrane permeability change during cell death
  • the cells were cultured for 24 hours with osmotic stress and KIOM-2015E at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml, KIOM-2015W at a concentration of 0.2 mg / ml, and the positive control group was CsA. 5 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml of FML were used. Thereafter, the expression level of the protein involved in apoptosis in the cell was confirmed by the method according to Example 1-4.
  • HCEC was confirmed that the deformation of the cell membrane caused by the increase in the number of cells distributed in the positive region of Annexin V-FITC and PI.
  • HCEC treated with KIOM-2015E was found to inhibit the change of HOS-induced cell membranes, thereby reducing the reaction between Annexin V-FITC and PI.
  • KIOM-2015E of the present invention has an effect of inhibiting apoptosis in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress.
  • KIOM-2015E of the present invention inhibits cell death in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress, thereby improving and treating dry eye syndrome. It was confirmed that it can be usefully used.
  • inflammation-related cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ are overexpressed. Accordingly, in order to confirm the anti-inflammatory effects of KIOM-2015E on HCEC in the same environment as dry eye syndrome induced by osmotic stress, proteins or mRNAs of the inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 Expression levels were analyzed through Examples 4-1 and 4-2.
  • Immunostaining was performed using TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 specific antibodies to confirm the protein expression patterns of inflammation-inducing cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6.
  • KIOM-2015E was incubated at a concentration of 0.05, 0.1, or 0.2 mg / ml, and KIOM-2015W at a concentration of 0.2 mg / ml for 24 hours. Thereafter, the cells were reacted using TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 specific antibodies (green) by the method according to Example 2-2, and the staining pattern was confirmed by fluorescence microscopy. ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 expression was confirmed.
  • KIOM-2015E of the present invention is the same environment of dry eye syndrome induced TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 protein of HCEC Since inflammation is improved by reducing expression, it has been confirmed that it can be usefully used for the improvement and treatment of dry eye syndrome.
  • PCR was performed to determine the expression levels of the inflammation-causing cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA.
  • KIOM-2015E was incubated at a concentration of 0.05, 0.1 or 0.2 mg / ml and KIOM-2015W at a concentration of 0.2 mg / ml and incubated for 4 hours. Thereafter, mRNA levels of the cells were observed according to the method of Example 2-3. At this time, 5 ⁇ g / ml of CsA and 10 ⁇ g / ml of FML were used as positive controls.
  • KIOM-2015E of the present invention improves inflammation by reducing the expression of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA of HCEC induced the same environment as dry eye syndrome, thereby improving and treating dry eye syndrome. It was confirmed that it can be usefully used in.
  • Dry eye animal model was made by injecting C57BL / 6 mice with 0.2% Benzalkonium chloride (BAC) twice a day for 2 weeks (9 am, 9 pm).
  • BAC Benzalkonium chloride
  • cyclosporin A As a positive control group, 0.5 mg / ml of cyclosporin A (CsA, Hallim Pharmaceuticals, Tisporin) and 1 mg / ml of Fluorometholone (FML, Hulim Pharmaceutical) were used. At this time, a schematic diagram of the experiment is shown in FIG.
  • maple leaf extract of the present invention increases the tear secretion in the dry eye animal model, can be useful for the improvement and treatment of dry eye syndrome.
  • Example 5-3 Identify the effect of reducing damage to the ocular surface
  • the ocular surface damage detection reagent was used as a reagent.
  • the staining index was confirmed by instilling 5 ⁇ l of lisamine green B (1%).
  • the ocular surface was scored as 1 point for staining less than 25%, 2 points for 25% to 50%, 3 points for 50% to 75%, 4 points for 75% or more, and 4 independent
  • the score of the phosphorus observer was averaged and quantified.
  • the maple leaf extract of the present invention can be useful for the improvement and treatment of dry eye syndrome because it reduces the damage of the eye surface in the animal model of dry eye syndrome.
  • Example 5-4 Identify the effect of reducing inflammation on the ocular surface
  • the eyeballs of the mice were extracted on day 14 of administration, and paraffin embedded, The tissue was cut to a thickness of 3 ⁇ m. Thereafter, immunofluorescence staining was performed using TNF-a, IL-1 ⁇ , and IL-6 antibodies, and images were acquired by fluorescence microscopy.
  • the maple leaf extract of the present invention is TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 protein of dry eye animal model Since the inflammation of the surface of the eye is improved by reducing the expression, it was confirmed that it can be usefully used for the improvement and treatment of dry eye.
  • TUNEL assay in situ cell death detection kit, fluorescein (Roche Diagnostics, Cat. No. 11 684 795 910)) that detects cells with advanced cell death. It was. The number of TUNEL-positive cells was statistically analyzed by averaging the results of each of the five photographs obtained in each individual.
  • the maple leaf extract of the present invention can be useful for the improvement and treatment of dry eye syndrome because it suppresses the death of cells present on the eye surface in the dry eye animal model.
  • the eyeballs of the mice were extracted on day 14 of administration, and paraffin embedded, The tissue was cut to a thickness of 3 ⁇ m. Thereafter, H & E and PAS staining were performed, and the thickness of the ocular surface was measured in the image obtained after staining.
  • the ocular surface of the mouse is detached, the parenchyma contracts, and the thickness becomes thin when BAC is administered, and cells present on the ocular surface Indicates an irregular or dropping out shape, cell boundary is lost, and a non-uniform floating cell is observed.
  • the degree of ocular surface detachment decreased by the administration of BAC, the tissues became uniform, and cell boundaries and ocular surface thickness were restored.
  • it shows a more improved tissue morphology similar to normal mice, it was confirmed to show a similar or better tissue morphology improvement effect when administered with CsA or FML.
  • the maple leaf extract of the present invention improves the shape of the modified ocular surface tissue in the dry eye animal model, it can be useful for the improvement and treatment of dry eye syndrome.

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Abstract

본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물을 이용한 안구건조증의 예방 또는 치료 방법, 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 기존에 안구건조증의 치료제로 알려진 약제와 유사하거나 더 우수한 정도로 안구건조증을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 것이므로, 안구건조증의 예방, 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.

Description

단풍나무 잎 추출물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물을 이용한 안구건조증의 예방 또는 치료 방법, 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
안구건조증은 건성안증후군 또는 눈마름증후군으로 불리는 질환으로, 눈이 시리고 모래알이 들어간 듯한 이물감이 있으며, 눈이 쉽게 피로하여 잘 뜰 수가 없는 증상을 나타낸다. 발병기전은 아직 완전히 규명되지 않았으나, 염증질환의 일종이라는 증거가 확보되고 있으며, 안구건조증 환자의 눈물에는 정상인보다 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β 등의 염증 관련 사이토카인과 IL-8 등의 염증 관련 케모카인이 과발현됨이 보고되었다(Massingale ML., 2009, Cornea, 28(9):1023-7).
이러한 안구건조증은 인공 눈물 안약이나 염증 치료 안약, 비타민 안약 등을 사용한 약물을 통해 치료할 수 있다. 안구건조증의 치료에 사용되는 약물의 예로서, 시클로스포린 A(Cyclosporin A), 플루오로메톨론(Fluorometholone)등이 있다. 시클로스포린 A는 면역억제제로 널리 사용되는 약물이며, IL-2, IL-4, IL-12 등과 관련한 T 세포의 활성 및 생장을 저해하여 면역 시스템의 활성을 감소시켜 안구 표면의 염증을 감소시키는 효과를 나타낸다. 1,200명을 대상으로 한 임상 시험에서는 15% 정도의 사람들에게서 눈물 생산 증가의 효과를 나타냈다(Michelle Meadows, 2005, FDA Consumer Magazine). 그러나, 발적, 눈의 통증, 이물감, 가려움 등의 부작용을 발생시키며, 고용량으로 장기 사용할 경우에는 암의 발병 위험이 증가한다고 보고되었다(Dantal J., 1998, The Lancet 351 (9103): 623-628). 또한, 플루오로메톨론은 코르티코스테로이드(corticosteroid)로서, 레이저 기반의 굴절 수술 후에 가장 흔히 사용되는 약물이다. 플루오로메톨론-아세테이트 현탁액은 눈꺼풀 및 안구 결막(bulbar conjunctiva), 각막 등 안구 표면에 야기된 스테로이드 반응성 염증 상태의 치료에 사용되고 있다.
그러나, 인공 눈물 안약에 의한 눈물의 보충은 일시적인 증상의 개선에 그칠 뿐이며, 인공 눈물에 포함된 보존제 성분에 의하여 불필요한 자극을 느낄 수 있고, 스테로이드 성분이나 혈관수축제성분이 들어있는 염증 치료 안약을 장기적으로 사용할 때에 이들 성분에 의한 안압상승, 녹내장, 백내장 등의 부작용이 발생할 수 있어 사용에 주의를 요한다. 이에 따라, 천연물을 이용한 안구건조증 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 마퀴 베리(Maqui Berry) 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료제(한국 공개특허 10-2015-0109354), 어류 안구 추출물을 포함하는 안구건조증 치료용 조성물(한국 등록특허 10-1211969) 등이 개발된 바 있다.
한편, 단풍나무(Acer palmatum Thunb.)는 낙엽 활목 교목으로, 높이는 10m에 달하고, 작은 가지는 털이 없으며 붉은빛을 띤 갈색이고, 잎은 마주나며 손바닥 모양으로 5∼7개로 깊게 갈라진다. 한방에서는 단풍나무의 뿌리껍질과 가지를 소염 작용과 해독 효과의 약재로 사용하는데, 무릎관절염으로 통증이 심할 때 물에 넣고 달여서 복용하고, 골절상을 입었을 때 오가피를 배합해서 사용한다. 그러나, 단풍나무의 안구건조증 치료 효과에 대해서는 알려진 바 없었다.
본 발명자들은 천연물을 이용한 안구건조증 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 단풍나무 잎 추출물이 각막 상피세포의 염증 상태를 조절하고, 안구건조증이 유발된 동물 모델에서 눈물 분비량을 증가시킬 뿐만 아니라, 안구 표면의 손상 및 염증 정도를 감소시킴으로써 안구건조증을 치료할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 기존에 안구건조증의 치료제로 알려진 약제와 유사하거나 더 우수한 정도로 안구건조증을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 것이므로, 안구건조증의 예방, 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 단풍나무 잎 열수 추출물 KIOM-2015W의 세포사멸에 대한 효과를 보여주는 그래프이다. 삼투압 스트레스(hyperosmolar stress; HOS)를 가하여 안구건조증을 유도한 인간 각막 상피세포(Human corneal epithelial cell; HCEC)에 상기 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로 처리하였으며, 양성대조군으로 시클로스포린 A(Cyclosporin A; CsA) 5 ㎍/ml과 플루오로메톨론(Fluorometholone; FML) 10 ㎍/ml을 사용하여 24 시간 동안 배양 후, MTT assay를 통하여 세포 독성 및 세포사멸 억제 효과를 측정하였다.
도 2는 KIOM-2015W의 세포사멸 억제 효과를 보여주는 이미지이다. 삼투압 스트레스(HOS)를 가하여 안구건조증을 유도한 인간 각막 상피세포(HCEC)에 상기 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로 처리하였으며, 양성대조군으로 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다. 사진은 40x 배율로 촬영하였다.
도 3은 KIOM-2015W의 세포사멸 관련 단백질인 Cleaved caspase-3 및 Cleaved PARP의 발현 억제, 및 세포 생존 관련 단백질인 Bcl-2의 발현 증가 효과를 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다. β-actin은 발현량 비교를 위한 대조군 유전자(loading control)로 사용되었다.
도 4는 KIOM-2015W의 세포사멸 억제 효과를 보여주는 FACS 결과의 이미지로서, 세포사멸 시 일어나는 세포막 투과성의 변화에 대한 반응으로 Annexin V-FIEC와 propidium iodide(PI)의 염색의 정도를 분석하였다.
도 5는 KIOM-2015W의 TNF-α 단백질(a 및 b), IL-1β 단백질(c 및 d) 및 IL-6 단백질(e 및 f) 발현 억제 효과를 보여주는 그래프로서, 각각 3시간의 경미한 삼투압 스트레스 가한 뒤 KIOM-2015W를 24시간 동안 처리, 또는 삼투압 스트레스와 KIOM-2015W를 동시에 24시간 동안 처리한 결과이다. 세 번의 독립적인 실험을 통해 얻은 결과이며, Tukey's test를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: **p<0.01, ***p<0.001 vs. control; #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. HOS.
도 6은 KIOM-2015W의 TNF-α 단백질(a), IL-1β 단백질(b) 및 IL-6 단백질(c) 발현 억제 효과를 보여주는 이미지로서, 초록색을 갖는 각각의 특이적 항체를 이용하여 상기 단백질의 발현 양상을 확인하였다. 스케일바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 7은 KIOM-2015W의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 발현 억제 효과를 보여주는 이미지(a) 및 그래프(b)로서, b는 상기 a에 나타낸 mRNA 발현량의 밀도를 측정하여 대조군에 대한 비율을 계산한 결과를 보여준다. GAPDH는 발현량 비교를 위한 대조군 유전자(loading control)로 사용되었다. 각 결과의 통계적 유의성은 Student's test를 통해 확인하였으며, *로 나타나는 첨자는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 의미한다.
도 8은 본 발명의 단풍나무 잎 에탄올 추출물 KIOM-2015E의 세포사멸 억제 효과를 보여주는 그래프이다. HOS를 가하여 안구건조증을 유도한 HCEC에 상기 KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로, KIOM-2015W를 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 독성 및 세포사멸에 대한 효과를 측정하였다. 양성대조군으로 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
도 9는 KIOM-2015E의 세포사멸 억제 효과를 보여주는 이미지이다. HOS를 가하여 안구건조증을 유도한 HCEC에 상기 KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로 그리고, KIOM-2015W를 0.2 mg/ml의 농도로 처리하였으며, 양성대조군으로 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다. 사진은 100x 배율로 촬영하였다.
도 10은 KIOM-2015E의 세포사멸 억제 효과를 보여주는 결과로 세포사멸 시 일어나는 세포막 투과성의 변화에 대한 반응으로 Annexin V-FIEC와 propidium iodide(PI)의 염색의 정도를 분석하였다.
도 11은 TNF-α 단백질(a), IL-1β 단백질(b) 및 IL-6 단백질(c) 발현 억제 효과를 보여주는 이미지로서, 초록색을 갖는 각각의 특이적 항체를 이용하여 상기 단백질의 발현 양상을 확인하였다. 스케일바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 12는 KIOM-2015E의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 발현 억제 효과를 보여주는 이미지(a) 및 그래프(b)로서, b는 상기 a에 나타낸 mRNA 발현량의 밀도를 측정하여 대조군에 대한 비율을 계산한 결과를 보여준다. GAPDH는 발현량 비교를 위한 대조군 유전자(loading control)로 사용되었다. 각 결과의 통계적 유의성은 Student's test를 통해 확인하였으며, *로 나타나는 첨자는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 의미한다.
도 13은 안구건조증 동물 모델의 제작을 제작하고, 상기 모델에 단풍나무 잎 추출물을 투여하는 방식을 보여주는 모식도이다.
도 14는 안구건조증 동물 모델에 대한 단풍나무 잎 열수 또는 에탄올 추출물(각각 KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E)의 눈물 분비량을 보여주는 그래프이다. 정상 대조군은 정상 마우스, BAC은 BAC(Benzalkonium chloride) 처리에 의해 안구건조증이 유발된 마우스, PBS 베히클(vehicle)은 식염수를 처리한 음성 대조군 마우스, CsA는 시클로스포린 A(Cyclosporin A), FML는 플루오로메톨론(Fluorometholone)을 나타내며, E.D.는 점안투여(topical eye drop), P.O.는 구강투여(per oral administration)를 의미한다. 이때, 0 Day는 약물 처리 전으로서, BAC을 처리한 14일째를 의미한다. Two-way ANOVA를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: #P<0.05 vs. Normal; **P<0.01, ***P<0.001 vs. BAC.
도 15는 안구건조증 동물 모델에 대한 KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구 표면 손상 감소 효과를 보여주는 이미지 및 그래프이다. 리사민 그린 B(Lissamine green B, 1%)를 이용하여 손상 정도를 측정하였다. 정상 대조군은 정상 마우스, BAC은 BAC 처리에 의해 안구건조증이 유발된 마우스, PBS 베히클(vehicle)은 식염수를 처리한 음성 대조군 마우스, CsA는 시클로스포린 A, FML는 플루오로메톨론을 나타내며, E.D.는 점안투여, P.O.는 구강투여를 의미한다. Two-way ANOVA를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: #P<0.05 vs. Normal; **P<0.01, ***P<0.001 vs. BAC.
도 16은 안구건조증 동물 모델에 대한 KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구 표면 염증 감소 효과를 보여주는 이미지 및 그래프로서, a는 TNF-a, b는 IL-1b 및 c는 IL-6에 관한 것이다. 면역형광염색을 통해 조직을 확인하였다. Endo는 내피(endothelium), Epi는 상피(epithelium) 및 Stroma는 실질층(corneal stroma)을 의미하고, 정상 대조군은 정상 마우스, BAC은 BAC 처리에 의해 안구건조증이 유발된 마우스, PBS 베히클(vehicle)은 식염수를 처리한 음성 대조군 마우스, CsA는 시클로스포린 A, FML는 플루오로메톨론을 나타내며, E.D.는 점안투여, P.O.는 구강투여를 의미한다. Two-way ANOVA를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: ***P<0.001 vs. Normal; ###P<0.001 vs. 0.2% BAC. 스케일바(Scale bar)는 100 ㎛를 나타낸다.
도 17은 안구건조증 동물 모델에 대한 KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 세포 사멸(apoptosis) 억제 효과를 보여주는 이미지 및 그래프이다. TUNEL 어세이를 통해 세포 사멸을 측정하였다. Endo는 내피(endothelium), Epi는 상피(epithelium) 및 Stroma는 실질층(corneal stroma)을 의미하고, 정상 대조군은 정상 마우스, BAC은 BAC 처리에 의해 안구건조증이 유발된 마우스, PBS 베히클(vehicle)은 식염수를 처리한 음성 대조군 마우스, CsA는 시클로스포린 A, FML는 플루오로메톨론을 나타내며, E.D.는 점안투여, P.O.는 구강투여를 의미한다. Two-way ANOVA를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: ***P<0.001 vs. Normal; ###P<0.001 vs. 0.2% BAC. 스케일바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 18은 안구건조증 동물 모델에 대한 KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구 표면 조직의 형태 개선 효과를 보여주는 이미지 및 그래프로서, a는 H&E 염색, b는 PAS 염색, c는 각막두께 결과에 관한 것이다. 정상 대조군은 정상 마우스, BAC은 BAC 처리에 의해 안구건조증이 유발된 마우스, PBS 베히클(vehicle)은 식염수를 처리한 음성 대조군 마우스, CsA는 시클로스포린 A, FML는 플루오로메톨론을 나타내며, E.D.는 점안투여, P.O.는 구강투여를 의미한다. Two-way ANOVA를 통해 확인한 각 결과의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시하였다: ***P<0.001 vs. Normal; ###P<0.001 vs. 0.2% BAC. 스케일바는 100 ㎛를 나타낸다.
본 발명의 하나의 양태는 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증이 유도된 인간 각막 상피세포의 염증을 효과적으로 조절함을 확인함으로써, 상기 추출물은 안구건조증 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어, "단풍나무"는 Acer palmatum Thunb.의 학명을 갖는 낙엽 활목 교목으로, 수고 10 내지 20m 내외이며 수형이 원형 형태인 식물을 의미한다.
상기 단풍나무의 뿌리, 줄기, 잎, 열매, 꽃 등이 안구건조증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 더욱 구체적으로 잎이 사용될 수 있으나, 안구건조증의 예방 또는 치료효과를 갖는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 단풍나무 잎은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어, "추출물"은 상기 단풍나무 잎을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 단풍나무 잎을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 단풍나무 잎을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 물 또는 에탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 에탄올은 10 내지 99%, 더욱 구체적으로 20 내지 50% 에탄올일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 단풍나무 잎 열수 추출물인 것일 수 있다. 또한, 상기 단풍나무 잎 추출물은 단풍나무 잎 에탄올 추출물인 것일 수 있다.
상기 단풍나무 잎 열수 추출물을 제조하는 일 예로, 단풍나무 잎 분쇄물을 물에 넣고 침적한 후, 진공 추출기를 이용하여 열수 추출 후 동결건조하여 단풍나무 잎 열수 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 상기 단풍나무 잎 에탄올 추출물을 제조하는 일 예로, 단풍나무 잎 분쇄물을 에탄올에 넣고 실온 침적하여 추출한 뒤, 상기 추출물을 감압농축하고 동결건조하여 단풍나무 잎 에탄올 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "안구건조증"은 안구 표면이 손상되어 자극감, 이물감, 건조감 같은 자극증상을 느끼게 되는 눈의 질환을 의미한다. 상기 안구건조증은 눈물샘 또는 마이봄선(Meibomian gland)의 염증 및 각막의 탈신경화에 의하여 눈물 분비가 억제되거나 비정상적인 눈물 증발 등에 의하여 발생할 수 있다. 이러한 안구건조증이 심화되어 눈물이 과다 건조되면 각막의 상처로 나타나는 각결막 상피장애가 야기될 수 있다. 현재, 안구건조증의 치료제로 항염증 활성을 나타내는 시클로스포린 A(Cyclosporin A), 플루오로메톨론(Fluorometholone) 등이 사용되고 있음에 따라, 안구건조증은 염증의 감소에 인하여 치료 또는 개선의 효과가 달성될 수 있음은 자명하다.
본 발명의 용어, "예방"은 단풍나무 잎 추출물을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 안구건조증을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 안구건조증이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 삼투압 스트레스에 의하여 안구건조증이 유도된 인간 각막 상피세포에 단풍나무 잎 열수 추출물 또는 단풍나무 잎 에탄올 추출물을 처리한 결과, 각막 상피세포의 사멸 및 형태 변형이 억제되고(도 1, 2, 4, 8, 9 및 10), 세포사멸 단백질의 발현이 억제되고(도 3), 염증 유발 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질, 및 mRNA 발현량이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 5 내지 7, 11 및 12). 또한, 안구건조증이 유발된 동물 모델에서 눈물 분비량을 증가시키고(도 14), 안구 표면의 손상 및 염증을 감소시키며(도 15 및 16), 안구 표면에 존재하는 세포의 사멸을 억제하고(도 17), 안구 표면 조직의 형태를 개선시킴을 확인하였다(도 18). 이는, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 단풍나무 잎 추출물을 0.000001 내지 80 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.00001 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 안구건조증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물은 안구 외용제형일 수 있으며, 구체적으로 안연고, 점안제, 및 스프레이를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제형화 되는 것일 수 있으나, 당업계에서 안구에 투여하기 위하여 사용되는 제형이라면 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 안구건조증, 예방 및 치료의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "개체"는 안구건조증이 발병하였거나, 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 안구건조증의 예방 또는 치료 방법은 개체에 단풍나무 잎 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.000001 내지 100 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.0001 내지 100 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 안구건조증의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다. 본 발명의 단풍나무 잎 추출물이 안구 건조증의 예방 또는 치료에 효과가 있는 특성상, 조성물의 투여 경로는 안구를 통하여 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 단풍나무, 추출물, 안구건조증 및 예방의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 안구건조증 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 안구건조증 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.0001 ~ 0.4 g, 구체적으로 약 0.0002 ~ 0.3 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.0001 ~ 0.10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 단풍나무 잎 추출물의 제조
제조예 1-1. 단풍나무 잎 열수 추출물(KIOM-2015W)의 제조
단풍나무 잎 분쇄물 1700g을 물 17ℓ에 넣고 1시간 동안 침적한 후, 경서 초고속 진공 추출기(Gyeongseo Extractor, COSMOS 660, Incheon, Korea)를 이용하여 3시간 동안 열수추출하였다. 그 후, 상기 추출물을 동결건조하여 단풍나무 잎 열수 추출물 98.77g을 수득하였다.
상기 추출된 단풍나무 잎 추출물을 표준 시험 시브(체)(150 ㎛, Retsch, Han, 독일)를 이용하여 필터링하고, 동결 건조기에서 건조될 때까지 농축하였다. 상기 동결 건조된 단풍나무 잎 추출물 분말(50 ㎎)을 1 ㎖의 증류수에 녹이고, 0.22 ㎛의 디스크 필터를 통해 필터링 한 다음, 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
제조예 1-2. 단풍나무 잎 에탄올 추출물(KIOM-2015E)의 제조
단풍나무 잎 분쇄물 1700g을 17ℓ의 25% 에탄올에 넣고 24시간 실온 침적하여 추출하였다. 그 후, 상기 추출물을 감압농축하고 동결건조하여 단풍나무 잎 25% 에탄올 추출물 78.57g을 수득하였다.
실시예 1. KIOM-2015W의 인간 각막 세포의 사멸 억제 효과 확인
본 발명의 단풍나무 잎 열수 추출물(KIOM-2015W)의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 인간 각막 상피세포(Human corneal epithelial cell; HCEC)에 대한 KIOM-2015W의 세포 보호 효과를 관찰하였다.
실시예 1-1. 인간 각막 상피세포의 독성 및 세포사멸 억제 효과 확인
우선, 안구건조증 in vitro 모델을 제작하였다. HCEC를 성장 배지에 키워 안정화시킨 다음, 450 mOsM의 DMEM/F-12 serum free 배지를 넣어 삼투압 스트레스(hyperosmolar stress; HOS)를 가하였다. 이후, HOS에 의하여 안구건조증을 유발하는 동일한 환경에 노출된 상기 HCEC에 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 5 mg/ml 농도의 MTT 시약 100 ㎕를 추가하여 2시간 동안 배양하였고, 상층액을 제거한 뒤 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 넣어 침전물을 용해한 뒤, 흡광도를 570nm에서 측정하였다. 이때, 양성대조군으로 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 시클로스포린 A(Cyclosporin A; CsA, 한림제약, 티스포린) 5 ㎍/ml과 플루오로메톨론(Fluorometholone; FML, 한림제약 후메론) 10 ㎍/ml을 사용하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, HOS가 가해진 HCEC는 세포의 생존이 현저하게 떨어졌으나, KIOM-2015W가 처리된 HCEC는 HOS에 의한 세포 독성이 증가하지 않았다. 또한, KIOM-2015W가 처리된 세포의 경우는 현재 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 또는 FML이 처리된 세포보다 생존능이 오히려 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015W는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 독성을 억제하여 세포 보호 및 생존능을 증가시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-2. 인간 각막 상피세포의 형태 변형 억제 효과 확인
HOS에 의하여 안구건조증을 유발하는 동일한 환경에 노출된 상기 HCEC에 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포의 형태를 관찰하였다. 이때, 양성대조군으로 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 5 ㎍/ml와 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, HOS가 가해진 HCEC은 전체 세포의 수가 감소하고, 상피세포 형태를 벗어난 세포 모양을 나타내었으며, 응축된 세포의 수가 현저히 증가하는 등의 세포사멸의 전형적인 특징을 나타냄을 확인하였다. 그러나, KIOM-2015W가 처리된 HCEC은 그 수가 증가하고, 상피세포의 형태를 유지함을 확인하였고, 이러한 효과는 KIOM-2015W의 농도가 증가할수록 향상됨을 확인하였다. 또한, KIOM-2015W가 처리된 세포의 형태 및 수는 현재 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 또는 FML이 처리된 세포와 유사하거나 오히려 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015W는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 사멸을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-3. 세포사멸 단백질의 발현 억제 효과 확인
KIOM-2015W의 삼투압 스트레스에 의한 HCEC의 세포사멸 억제 효과를 평가하기 위하여, 세포사멸 관련 단백질의 발현양을 조사하였다.
구체적으로, 상기 세포에 삼투 스트레스와 동시에 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
이후, 상기 세포에서 세포사멸에 관련된 단백질의 발현 정도를 웨스턴블롯 분석을 통해 확인하였다. 배양이 끝난 세포를 1x PBS로 3회 헹군 후, 용해 버퍼(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ㎍/ml aprotinin)를 이용하여 용해시켰다. 이후, 상등액을 회수하여 각 샘플에 존재하는 단백질을 정량하였고, 단백질 30 ㎍을 4x sample buffer와 섞어 12% SDS-폴리아크릴아마이드 젤(1.5 M Trisma base, 10% SDS, 30% acrylamide, 10% ammonium persulfate, TEMED) 상에서 전기영동시켰다. 전기영동이 끝난 젤상의 단백질을 NC 멤브레인으로 이동시키고, 각 멤브레인은 항체와 비특이적 결합을 막기 위해 5% 스킴 밀크(skim milk)로 실온에서 1시간 반응시켜 블로킹(blocking)하였다. 세포사멸과 관련된 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰고, 0.05% Tween이 포함된 TBS로 3회 세척한 후, 2차 항체인 anti-IgG conjugated HRP와 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 다시 0.05% Tween이 포함된 TBS로 3회 세척한 후 ECL용액을 이용하여 단백질 발현양을 탐지하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리한 경우에는 HOS에 의해 증가한 세포사멸 유도 단백질인 Cleaved caspase-3 및 Cleaved PARP 의 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였으며, 세포생존 단백질인 Bcl-2의 발현은 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, KIOM-2015W는 세포사멸 유도 단백질들의 발현을 억제시킴과 동시에 세포생존 유도 단백질들의 발현을 증가시킴으로써, HOS에 의하여 유도된 인간 각막 세포의 사멸을 저해함을 확인하였다.
실시예 1-4. 세포사멸 시 세포막 투과성 변화 억제 효과 확인
KIOM-2015W의 삼투압 스트레스에 의한 HCEC의 세포사멸 억제 효과를 평가하기 위하여, 유세포 분석기(Fluorescence activated cell sorter; FACS)를 통해 세포막 투과성의 변화를 관찰하였다.
구체적으로, 상기 세포에 삼투 스트레스와 동시에 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
배양이 끝난 세포를 DPBS로 수세하고, Trypsin-EDTA를 처리하여 배양접시에서 분리된 세포를 원심분리하여 모은 뒤, 미리 희석하여 준비한 결합 버퍼(binding buffer) 100 ㎕를 넣고 Annexin V-FITC 5 ㎕ 및 PI 5 ㎕를 넣어 가볍게 섞어 준 뒤, 암조건의 상온에서 15분간 반응시켰다. 이후, 결합버퍼 400 ㎕를 추가하여 유세포 분석기에서 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, HOS가 가해진 HCEC는 Annexin V-FITC와 PI의 양성부위에 분포하는 세포의 수가 증가함을 확인함으로써 세포막의 변형이 야기됨을 알 수 있었다. 그러나, KIOM-2015W가 처리된 HCEC는 HOS에 의한 세포막의 변화가 억제되어 Annexin V-FITC와 PI와의 반응이 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, KIOM-2015W는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포사멸을 억제시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
아울러, 상기 실시예 1-1 내지 1-4의 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 열수 추출물 KIOM-2015W는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 사멸을 억제하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. KIOM-2015W의 염증 관련 사이토카인의 발현 억제 효과 확인
안구건조증이 유발되면 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β 등의 염증 관련 사이토카인이 과발현된다. 이에 따라, 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 HCEC에 대한 KIOM-2015W의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 염증 유발 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 또는 mRNA 발현량을 하기 실시예 2-1 내지 2-3을 통해 분석하였다.
실시예 2-1. EILSA를 통한 단백질 발현량 확인
염증 야기 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 단백질의 발현량을 측정하기 위하여 효소-연결면역흡수측정검사(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 HCEC의 안구건조증 in vitro 모델을 제작하였다. 이후, 상기 세포에 3시간의 삼투압 스트레스 가한 뒤, 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도의 KIOM-2015W를 24시간 동안 처리, 또는 삼투압 스트레스와 KIOM-2015W를 동시에 24시간 동안 처리하여 세포 배양액의 상층액을 회수하였다. 이후, Human TNF ELISA kit II(BD catalog No. 550610), Human IL-1β ELISA kit II(BD catalog No. 557966), Human IL-6 ELISA kit II(BD catalog No. 550799)를 이용하여 세포로부터 분비되어 상기 배양액에 포함된 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 5의 a 및 b에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리하면 HOS에 의해 증가한 TNF-α의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 또한, 0.2 ㎎/ml의 KIOM-2015W를 처리한 경우에는 CsA 또는 FML을 처리한 경우 뿐만아니라, HOS가 처리되지 않는 대조군 세포보다도 TNF-α의 발현량이 더욱 감소함을 확인하였다.
또한, 도 5의 c 및 d에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리하면 HOS에 의해 증가한 IL-1β의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 또한, KIOM-2015W는 CsA 또는 FML과 유사하거나 더욱 우수한 정도로 IL-1β의 발현량을 더욱 감소시킴을 확인하였다.
아울러, 도 5의 e 및 f에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리하면 HOS에 의해 증가한 IL-6의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 또한, KIOM-2015W는 CsA 또는 FML과 유사하거나 더욱 우수한 정도로 IL-6의 발현량을 더욱 감소시킴을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015W는 안구건조증과 동일한 환경이 유도된 HCEC의 TNF-α, IL-1β, IL-6 단백질의 발현을 감소시킴으로써 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-2. 면역염색을 통한 단백질 발현량 확인
염증 야기 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 세포 내 단백질 발현 양상을 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 특이적 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다.
구체적으로, HCEC에 HOS와 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후, TNF-α, IL-1β, IL-6 특이적 항체(초록색)를 이용하여 세포를 반응시켰으며, 형광현미경으로 염색 양상을 확인함으로써 세포 내 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현 양상을 확인하였다. 일정 수의 HCEC를 배양 접시에 접종하여 하룻동안 안정화 시킨 다음, HOS를 처리함과 동시에, KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하여 수확하였다. 수확한 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 이어서 항체가 세포막을 잘 투과할 수 있도록 하기 위하여 0.3% Triton X-100/TBS로 10분간 반응시킨 다음 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 blocking buffer(5% BSA, 5% normal goat serum을 함유한 TBS)를 첨가하여 1시간 동안 코팅하였다. 이어서 1차 항체인 TNF-α를 상온에서 1시간 반응 시키고 제거한 후, 2차 항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG와 상온에서 1시간 추가 반응하였다. DAPI로 핵 염색 10분간 수행하고 형광현미경으로 관찰하여 이미지화 하였다.
그 결과, 도 6의 a 내지 c에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리한 경우에는 HOS에 의해 증가한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 이러한 KIOM-2015W의 효과는 CsA 또는 FML과 유사하거나 더욱 우수할 뿐만 아니라, HOS가 처리되지 않는 대조군 세포와 비슷한 수준으로 상기 단백질의 발현량을 감소시킴을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015W는 안구건조증과 동일한 환경이 유도된 HCEC의 TNF-α, IL-1β, IL-6 단백질의 발현을 감소시킴으로써 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-3. PCR을 통한 mRNA 발현량 확인
염증 야기 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA의 발현량을 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, HCEC에 HOS와 KIOM-2015W를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포의 mRNA 발현 정도를 PCR을 통해 관찰하였다. PCR을 수행하기 위하여, KIOM-2015W를 처리한 이후 수확한 세포에서 TRIzol Reagent, 클로로포름(Chloroform), 이소프로판올(Isopropanol)을 이용하여 mRNA를 추출하였고, AccuPower® CycleScript RT PreMix (dT20) (BIONEER)를 사용하여 30℃에서 30초, 48℃에서 4분, 55℃에서 30초의 반응을 12번 반복하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 하기 표 1에 명시된 프라이머 서열을 사용하였고, 95℃에서 2분, 95℃에서 20초, 각 Tm 온도에서 30초, 72℃에서 30초, 72℃에서 5분의 조건으로 2x PCR Master Mix를 사용하여 PCR 결과를 도출하였다.
프라이머
구분 이름 서열 Tm(℃) 반복수
서열번호 1 TNF-α F: 5'-gcggtgcttgttcctcag-3' 58 40
서열번호 2 R: 5'-ctggcaggggctcttgat-3'
서열번호 3 IL-1β F: 5'-tcagcacctctcaagcagaa-3' 58 30
서열번호 4 R: 5'-atcagaatgtgggagcgaatg-3'
서열번호 5 IL-6 F: 5'-caatctggattcaatgaggagactt-3' 58 30
서열번호 6 R: 5'-ccattaacaacaacaatctgaggtg-3'
서열번호 7 GAPDH F: 5'-gaaggtgaaggtcggagt-3' 56 35
서열번호 8 R: 5'-gaagatggtgatgggatttc-3'
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W를 처리한 경우에는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 모두 mRNA의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였고, 0.2 ㎎/ml의 KIOM-2015W를 처리한 경우에는 HOS가 처리되지 않는 대조군 세포와 유사하거나 더 우수한 정도로 상기 사이토카인들의 mRNA 발현량이 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015W는 안구건조증과 동일한 환경이 유도된 HCEC의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA의 발현을 감소시킴으로써 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. KIOM-2015E의 인간 각막 세포의 사멸 억제 효과 확인
본 발명의 단풍나무 잎 에탄올 추출물(KIOM-2015E)의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 인간 각막 상피세포(Human corneal epithelial cell; HCEC)에 대한 KIOM-2015E의 세포 보호 효과를 관찰하였다.
실시예 3-1. 인간 각막 상피세포의 독성 억제 및 생존능 증가 효과 확인
상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 HOS에 의하여 안구건조증을 유발하는 동일한 환경에 노출된 HCEC를 제작하였다. 상기 HCEC에 HOS를 처리함과 동시에, KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로, KIOM-2015W를 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT assay를 통해 배양된 세포의 생존능을 관찰하였다. 이때, 양성대조군으로 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, HOS가 가해진 HCEC는 생존능이 현저하게 감소하였으나, KIOM-2015E가 처리된 HCEC는 HOS에 의한 세포 독성이 증가하지 않았다. 또한, KIOM-2015E가 처리된 세포의 경우는 현재 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 또는 FML이 처리된 세포보다 생존능이 오히려 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 독성을 억제하여 세포 보호 및 생존능을 증가시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-2. 인간 각막 상피세포의 형태 변형 억제 효과 확인
HOS에 의하여 안구건조증을 유발하는 동일한 환경에 노출된 상기 HCEC에 KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 mg/ml의 농도로, KIOM-2015W 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포의 형태를 관찰하였다. 이때, 양성대조군으로 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, HOS가 가해진 HCEC은 전체 세포의 수가 감소하고, 상피세포 형태를 벗어난 세포 모양을 나타내었으며, 응축된 세포의 수가 현저히 증가하는 등의 세포사멸의 전형적인 특징을 나타냄을 확인하였다. 그러나, KIOM-2015E가 처리된 HCEC은 그 수가 증가하고, 상피세포의 형태를 유지함을 확인하였고, 이러한 효과는 KIOM-2015E의 농도가 증가할수록 향상됨을 확인하였다. 또한, KIOM-2015E가 처리된 세포의 형태 및 수는 현재 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 또는 FML이 처리된 세포와 유사하거나 오히려 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 사멸을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-3. 세포사멸 시 세포막 투과성 변화 억제 효과 확인
KIOM-2015E의 삼투압 스트레스에 의한 HCEC의 세포사멸 억제 효과를 평가하기 위하여, FACS를 통해 세포막 투과성의 변화를 관찰하였다.
구체적으로, 상기 세포에 삼투 스트레스와 동시에 KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로, KIOM-2015W를 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다. 이후, 상기 실시예 1-4에 따른 방법으로 상기 세포에서 세포사멸에 관련된 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, HCEC는 Annexin V-FITC와 PI의 양성부위에 분포하는 세포의 수가 증가함을 확인함으로써 세포막의 변형이 야기됨을 알 수 있었다. 그러나, KIOM-2015E가 처리된 HCEC는 HOS에 의한 세포막의 변화가 억제되어 Annexin V-FITC와 PI와의 반응이 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포사멸을 억제시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
아울러, 상기 실시예 3-1 내지 3-3의 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 세포의 사멸을 억제하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. KIOM-2015E의 염증 관련 사이토카인의 발현 억제 효과 확인
안구건조증이 유발되면 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β 등의 염증 관련 사이토카인이 과발현 된다. 이에 따라, 삼투압 스트레스에 의하여 유도되는 안구건조증과 동일한 환경에서 HCEC에 대한 KIOM-2015E의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 염증 유발 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 또는 mRNA 발현량을 하기 실시예 4-1 및 4-2를 통해 분석하였다.
실시예 4-1. 면역염색을 통한 단백질 발현량 확인
염증 야기 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 세포 내 단백질 발현 양상을 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 특이적 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다.
구체적으로, HCEC에 HOS를 처리함과 동시에, KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로, KIOM-2015W를 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 2-2에 따른 방법으로 TNF-α, IL-1β, IL-6 특이적 항체(초록색)를 이용하여 세포를 반응시켰으며, 형광현미경으로 염색 양상을 확인함으로써 세포 내 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 11의 a 내지 c에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015E를 처리한 경우에는 HOS에 의해 증가한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 이러한 KIOM-2015E의 효과는 CsA 또는 FML과 유사하거나 더욱 우수할 뿐만 아니라, HOS가 처리되지 않는 대조군 세포와 비슷한 수준으로 상기 단백질의 발현량을 감소시킴을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 안구건조증과 동일한 환경이 유도된 HCEC의 TNF-α, IL-1β, IL-6 단백질의 발현을 감소시킴으로써 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-2. PCR을 통한 mRNA 발현량 확인
염증 야기 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA의 발현량을 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, HCEC에 HOS를 처리함과 동시에, KIOM-2015E를 0.05, 0.1 또는 0.2 ㎎/ml의 농도로, KIOM-2015W를 0.2 ㎎/ml의 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 2-3의 방법에 따라 상기 세포의 mRNA 발현 정도를 관찰하였다. 이때, 양성대조군으로는 CsA 5 ㎍/ml과 FML 10 ㎍/ml을 사용하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015E를 처리한 경우에는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 모두 mRNA의 발현량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였고, 0.2 ㎎/ml의 KIOM-2015E를 처리한 경우에는 HOS가 처리되지 않는 대조군 세포와 유사하거나 더 우수한 정도로 상기 사이토카인들의 mRNA 발현량이 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 KIOM-2015E는 안구건조증과 동일한 환경이 유도된 HCEC의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA의 발현을 감소시킴으로써 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 안구건조증 동물 모델에서의 안구건조증 개선 효과 확인
실시예 5-1. 안구건조증 동물 모델의 제작 및 단풍나무 잎 추출물의 투여 방법
C57BL/6 마우스에 0.2% BAC(Benzalkonium chloride)을 하루에 두 번(오전 9시, 오후 9시) 2주간 점안하여 안구건조증 동물 모델을 제작하였다.
이후, 1 mg/mL의 단풍나무 잎 열수 추출물(KIOM-2015W); 또는 0.5 mg/mL 또는 1 mg/mL의 단풍나무 잎 에탄올 추출물(KIOM-2015E)을 하루에 세 번(오전 9시, 오후 3시, 오후 9시) 2주간 점안(E.D)하거나, 또는 100 mg/kg의 KIOM-2015E을 하루에 한 번(오후 3시) 2주간 경구투여(P.O)하였다.
양성대조군으로서 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 시클로스포린 A(Cyclosporin A; CsA, 한림제약, 티스포린) 0.5 mg/ml과 플루오로메톨론(Fluorometholone; FML, 한림제약 후메론) 1 mg/ml을 사용하였다. 이때, 실험의 모식도는 도 13에 나타내었다.
실시예 5-2. 눈물 분비량 증가 효과 확인
KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 이들의 투여 후 안구건조증 동물 모델의 눈물 분비량을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에 따라 제작한 안구건조증 동물 모델에, KIOM-2015W, KIOM-2015E, CsA 또는 FML를 투여한 뒤, 각각 투여 1, 4, 7 또는 14일째에 마우스의 아래쪽 눈꺼풀에 면사(cotton threads, Zone-Quick; Yokota, Tokyo, Japan)을 사용하여 60초간 눈물 분비량을 측정하였다. 오렌지색에서 빨간색으로 변한 부분을 mm 단위로 측정하였다.
그 결과, 도 14에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E를 투여한 경우에는 BAC의 투여에 의해 감소된 눈물 분비량이 증가하였으며, 이는 정상 마우스보다도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 현재 안구건조증 치료제로 사용되고 있는 CsA 또는 FML를 투여하는 경우보다 우수한 눈물 분비량 증가 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 동물 모델에서 눈물 분비량을 증가시키므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-3. 안구 표면의 손상 감소 효과 확인
KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 이들의 투여 후 안구건조증 동물 모델의 안구 표면의 손상 정도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에 따라 제작한 안구건조증 동물 모델에, KIOM-2015W, KIOM-2015E, CsA 또는 FML를 투여한 뒤, 투여 14일째에 마우스의 눈에 안구 표면의 손상 탐지 시약인 리사민 그린 B(Lissamine green B, 1%) 5 ㎕를 점안하여 염색지수를 확인하였다. 이후, 안구 표면이 25% 미만으로 염색된 경우 1점, 25% 내지 50%인 경우 2점, 50% 내지 75%인 경우 3점, 75% 이상인 경우 4점으로 점수를 매겼고, 4명의 독립적인 관찰자의 점수를 평균하여 수치화하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E를 투여한 경우에는 BAC의 투여에 의한 안구 표면 손상 정도가 감소함을 확인하였다. 또한, 이는 정상 마우스와 유사하거나 더 낮은 손상 정도를 나타내는 것으로서, CsA 또는 FML를 투여하는 경우보다 우수한 손상 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 동물 모델에서 안구 표면의 손상을 감소시키므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-4. 안구 표면의 염증 감소 효과 확인
KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 이들의 투여 후 안구건조증에 의해 야기되는 염증 관련 사이토카인의 발현량을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에 따라 제작한 안구건조증 동물 모델에, KIOM-2015W, KIOM-2015E, CsA 또는 FML를 투여한 뒤, 투여 14일째에 마우스의 안구를 적출하여 파라핀 포매한 후, 3 ㎛의 두께로 조직을 박절하였다. 이후, TNF-a, IL-1β, IL-6 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였고, 형광현미경을 통해 이미지를 획득하였다.
그 결과, 도 16의 a 내지 c에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E를 투여한 경우에는 BAC의 투여에 의해 증가한 염증 관련 사이토카인의 발현량이 감소함을 확인하였다. 또한, 이는 정상 마우스와 유사하거나 더 낮은 발현량을 나타내는 것으로서, CsA 또는 FML를 투여하는 경우와 유사하거나 더 우수한 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 동물 모델에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 단백질의 발현을 감소시킴으로써 안구 표면의 염증을 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-5. 세포 사멸(apoptosis) 억제 효과 확인
KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 이들의 투여 후 안구건조증 동물 모델의 안구 표면에 존재하는 세포의 사멸 정도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에 따라 제작한 안구건조증 동물 모델에, KIOM-2015W, KIOM-2015E, CsA 또는 FML를 투여한 뒤, 투여 14일째에 마우스의 안구를 적출하여 파라핀 포매한 후, 3 ㎛의 두께로 조직을 박절하였다. 이후, 세포 사멸이 진행된 세포를 탐지하는 TUNEL 어세이(in situ cell death detection kit, fluorescein (Roche Diagnostics, Cat. No. 11 684 795 910))를 이용하여 염색에 양성 반응을 보이는 세포의 수를 분석하였다. TUNEL-양성 세포의 수는 각 개체에서 획득한 각 5장의 사진의 결과를 평균내어 통계 분석하였다.
그 결과, 도 17에서 볼 수 있듯이, KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E를 투여한 경우에는 BAC의 투여에 의해 증가한 TUNEL 양성 반응이 안구의 상피(epithelium), 실질층(corneal stroma), 내피(endothelium) 조직 모두에서 감소함을 확인하였다. 또한, 이는 CsA 또는 FML를 투여하는 경우와 유사하거나 더 우수한 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 동물 모델에서 안구 표면에 존재하는 세포들의 사멸을 억제하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-6. 안구 표면 조직의 형태 개선 효과 확인
KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E의 안구건조증 개선 효과를 확인하기 위하여, 이들의 투여 후 안구건조증 동물 모델의 안구 표면 조직의 형태를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에 따라 제작한 안구건조증 동물 모델에, KIOM-2015W, KIOM-2015E, CsA 또는 FML를 투여한 뒤, 투여 14일째에 마우스의 안구를 적출하여 파라핀 포매한 후, 3 ㎛의 두께로 조직을 박절하였다. 이후, H&E 및 PAS 염색을 수행하였고, 염색 후 획득한 이미지에서 안구 표면의 두께를 측정하였다.
그 결과, 상기 도 18의 a 내지 c에서 볼 수 있듯이, BAC을 투여한 경우에 마우스의 안구 표면은 박리되고, 실질층이 수축되고, 두께가 얇아지는 형태를 나타내며, 또한 안구 표면에 존재하는 세포는 불규칙하거나 탈락하는 형태를 나타내고, 세포 경계가 손실되고, 균일하지 못한 형태의 부동세포가 관찰됨을 확인하였다. 그러나, KIOM-2015W 또는 KIOM-2015E를 투여한 경우에는 BAC의 투여에 의해 안구 표면 박리 정도가 감소하며, 조직이 균일화되고, 세포 경계 및 안구 표면 두께가 회복됨을 확인하였다. 또한, 이는 정상 마우스와 유사한 더 개선된 조직 형태를 나타내며, CsA 또는 FML를 투여한 경우와 유사하거나 더 우수한 조직 형태 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 안구건조증 동물 모델에서 변형된 안구 표면 조직의 형태를 개선하므로, 안구건조증의 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 단풍나무 잎 열수 추출물인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 단풍나무 잎 에탄올 추출물인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단풍나무 잎 추출물을 총 조성물의 중량 대비 0.000001 내지 80 중량%로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 안구 외용제형인 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료 방법.
  8. 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3747453A4 (en) * 2018-01-29 2021-11-03 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University <SMALLCAPS /> AUCUBA COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF DRY EYES WITH <NS1: I> JAPONICA </ NS1: I> EXTRACT

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180065933A (ko) * 2016-12-07 2018-06-18 한국 한의학 연구원 단풍잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2019190014A1 (ko) * 2018-03-27 2019-10-03 제주동백 주식회사 동백꽃 추출물 분말 함유 식품 제조방법 및 그 조성물

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070259021A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-08 Friedlaender Mitchell H Compositions, Methods, and Kits for Treating Dry Eye
KR101089779B1 (ko) * 2011-04-29 2011-12-07 주식회사 청진바이오텍 정제봉독, 단풍나무 추출물 및 작살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 천연 화장료 조성물
KR101211969B1 (ko) * 2012-06-14 2012-12-12 주식회사 코씨드바이오팜 어류 안구 추출물을 포함하는 안구건조증 치료용 조성물
KR101484948B1 (ko) * 2013-08-08 2015-01-22 한국과학기술연구원 돌단풍 추출물을 포함하는 항알러지용 조성물
KR20150109354A (ko) * 2012-12-18 2015-10-01 오리자유화주식회사 드라이 아이 예방·치료제
KR101662720B1 (ko) * 2015-07-08 2016-10-07 한국 한의학 연구원 각막질환 또는 결막질환의 치료용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4567278B2 (ja) 2001-08-02 2010-10-20 丸善製薬株式会社 皮膚化粧料

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070259021A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-08 Friedlaender Mitchell H Compositions, Methods, and Kits for Treating Dry Eye
KR101089779B1 (ko) * 2011-04-29 2011-12-07 주식회사 청진바이오텍 정제봉독, 단풍나무 추출물 및 작살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 천연 화장료 조성물
KR101211969B1 (ko) * 2012-06-14 2012-12-12 주식회사 코씨드바이오팜 어류 안구 추출물을 포함하는 안구건조증 치료용 조성물
KR20150109354A (ko) * 2012-12-18 2015-10-01 오리자유화주식회사 드라이 아이 예방·치료제
KR101484948B1 (ko) * 2013-08-08 2015-01-22 한국과학기술연구원 돌단풍 추출물을 포함하는 항알러지용 조성물
KR101662720B1 (ko) * 2015-07-08 2016-10-07 한국 한의학 연구원 각막질환 또는 결막질환의 치료용 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3747453A4 (en) * 2018-01-29 2021-11-03 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University <SMALLCAPS /> AUCUBA COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF DRY EYES WITH <NS1: I> JAPONICA </ NS1: I> EXTRACT

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