WO2018212598A1

WO2018212598A1 - 참빗살나무 추출물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2018212598A1
Application number: PCT/KR2018/005631
Authority: WO
Inventors: 양현옥; 천윤선; 장리준; 이택주; 강정화; 성상현; 이상빈; 박정윤; 구밍야오; 조동
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2018-11-22
Also published as: KR101877860B1

Abstract

본 발명은 참빗살나무 추출물(Euonymus hamiltonianus Wall.)을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물은 기억능력 및 인지능력 향상 효과를 나타내므로, 치매, 알츠하이머병, 기억장애 등의 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

참빗살나무 추출물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

본 발명은 참빗살나무 추출물(Euonymus hamiltonianus Wall.)을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

인지능력은 기억능력, 시공간파악능력, 판단력, 언어능력, 계산능력 등을 포괄하는 것으로서, 다른 사람의 도움 없이 일상생활을 수행할 수 있도록 한다. 그러나, 다양한 원인에 의해 뇌기능이 손상되어 인지능력이 저하되면 치매, 알츠하이머병 등의 질환을 앓게 되며, 예전 수준의 일상생활을 유지할 수 없게 된다.

치매, 알츠하이머병 등 인지능력 장애와 관련한 질환의 정확한 발병원인은 밝혀진 바 없으나, 많은 연구 결과에 따르면 뇌 신경세포에서 베타 아밀로이드(β-amyloid; Aβ)의 축적과 그로 인한 신경독성이 중요한 발병 원인으로 지목되고 있다(Probst A. et al., Brain Pathol., 1:229-239, 1991). 특히, 알츠하이머병의 경우에는 베타 아밀로이드가 뇌에 축적되어 엉키게 되는 노인반(senile plaque)에 의해 발병하는 것으로 알려져 있으며(Breimer LH, et al. Nature, 326: 749-750, 1987), 베타 아밀로이드 중에서도 아미노산이 40개 또는 42개로 구성된 Aβ40 또는 Aβ42가 주요한 병인물질이며, 플라그를 쉽게 만드는 특성을 나타낸다고 알려져 있다(Selkoe, Science 298: 789-891, 2002).

이와 관련하여, 베타 아밀로이드의 축적뿐만 아니라, 아세틸콜린(acetylcholine; Ach)계, 글루타민산(glutamic acid), 신경펩티드(neuropeptides)계 및 모노아민(monoamine)계의 기능저하 또한 치매 및 알츠하이머병의 원인으로 추정되고 있는바(Coyle JT, et al. Science, 219, 1184-1190, 1983; Gottfries CG, et al. Psychopharmacology, 86, 245-252, 198), 시냅스에서 아세틸콜린이 제거되는 비율을 늦춤으로써 증상을 개선하기 위한 방법이 개발되었다. 그 예로, 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil) 등의 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase; AchE) 활성 저해제가 치료제로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 약물들은 간독성, 구토, 오심 설사 등 심각한 부작용의 문제점을 가지고 있을뿐만 아니라 증상을 완화하는 목적으로 사용되고 있어, 근본적인 치료 효과를 나타내는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, 부작용을 최소화하기 위해 천연 물질을 이용한 치료제가 개발되고 있으며, 그 예로 오스모틴을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물(한국 등록특허 제10-1689681호), 자색당근 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애의 예방 또는 치료용 조성물(한국 등록특허 제10-1495815호) 등이 개발된 바 있었다.

한편, 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.)는 국내 자생 식물로, 노박덩굴과(Celastraceae), 화살나무속(Euonymus)에 속한다. 인슐린분비를 촉진시켜 당뇨병 완화에 효과를 나타내며, 지속적으로 꾸준히 복용해주면 혈액순환을 원활하게 해주어 동맥경화, 고혈압 등 혈관질환예방에 탁월하다고 알려져 있다. 그러나, 인지장애와 관련한 효과는 공지된 바 없었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 치매, 알츠하이머, 기억장애 등의 인지장애 관련 질환을 치료할 수 있는 천연 물질을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 참빗살나무 추출물 및 이의 분획물이 우수한 인지능력 및 기억력 개선 효과를 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물의 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 인지장애 관련 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인지장애 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물은 기억능력 및 인지능력 향상 효과를 나타내므로, 치매, 알츠하이머병, 기억장애 등의 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 베타 아밀로이드(Amyloid beta; Aβ) 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 다양한 Aβ 중에서도 Aβ42에 대한 결과를 보여준다. 이때, Control은 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군을 의미한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 Aβ 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 다양한 Aβ 중에서도 Aβ40에 대한 결과를 보여준다. 이때, Control은 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군을 의미한다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 sAPPα(soluble peptide APPα) 생성 촉진 효과를 보여주는 그래프이다. 이때, Control은 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군을 의미한다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 sAPPβ(soluble peptide APPβ) 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 이때, Control은 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군을 의미한다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 α-세크리테아제(α-secretease) 발현 촉진 효과를 보여주는 그래프이다. α-세크리테아제의 일종인 ADAM(A Disintegrin and Metalloproteinases) 단백질 중에서도 ADAM9, ADAM10, ADAM17에 대한 결과를 보여준다. 이때, β-튜불린(β-tubulin)은 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 β-세크리테아제(β-secretease)의 발현량에 대한 영향을 보여주는 그래프로서, β-세크리테아제의 일종인 BACE1(Beta-secretase 1)에 대한 것이다. 이때, β-튜불린(β-tubulin)은 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물이 투여된 기억장애 및 인지장애 마우스에서 수중 미로 시험을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다. A는 물에 잠겨 있는 플랫폼을 찾을 때까지의 시간(escape latency), B는 플랫폼이 있던 사분원에 머무르는 시간(time in target quadrant)을 보여준다. 이때, Control은 정상대조군, Scop은 스코폴라민(scopolamine)만을 투여한 음성대조군, Scop+Don은 스코폴라빈 및 도네페질(donepezil)을 투여한 양성대조군, Scop+참빗살 75 mg/kg은 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 75 mg/kg을 투여한 실험군 1, 및 Scop+참빗살 150 mg/kg은 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 150 mg/kg을 투여한 실험군 2를 의미한다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물이 투여된 기억장애 및 인지장애 마우스에서 Y자형 미로 시험을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 자발작인 교차횟수(Spontaneous alternation)를 보여준다. 이때, Control은 정상대조군, Scop은 스코폴라민(scopolamine)만을 투여한 음성대조군, Scop+Don은 스코폴라빈 및 도네페질(donepezil)을 투여한 양성대조군, Scop+참빗살 75는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 75 mg/kg을 투여한 실험군 1, 및 Scop+참빗살 150는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 150 mg/kg을 투여한 실험군 2를 의미한다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물이 투여된 기억장애 및 인지장애 마우스에서 신기물체 인식 시험을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 신기물체 탐색시간의 비율(novel objecting exploring index)을 보여준다. 이때, Control은 정상대조군, Scop은 스코폴라민(scopolamine)만을 투여한 음성대조군, Scop+Don은 스코폴라빈 및 도네페질(donepezil)을 투여한 양성대조군, Scop+참빗살 75는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 75 mg/kg을 투여한 실험군 1, 및 Scop+참빗살 150는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 150 mg/kg을 투여한 실험군 2를 의미한다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물이 투여된 기억장애 및 인지장애 마우스에서 신기물체 수동회피 시험을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 어두운 방에서 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간(acquisition latency time) 및 밝은 방에서 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간(retention latency time)을 보여준다. 이때, Control은 정상대조군, Scop은 스코폴라민(scopolamine)만을 투여한 음성대조군, Scop+Don은 스코폴라빈 및 도네페질(donepezil)을 투여한 양성대조군, Scop+참빗살 75는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 75 mg/kg을 투여한 실험군 1, 및 Scop+참빗살 150는 스코폴라민 및 참빗살나무 추출물 150 mg/kg을 투여한 실험군 2를 의미한다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 참빗살나무 추출물의 분획물의 Aβ42 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 이때, CTL은 식염수를 처리한 음성대조군을 의미하며, 각각 total은 참빗살나무 추출물, Hexane은 상기 추출물의 헥산 분획물, EA는 상기 추출물의 에틸 아세테이트 분획물, BuOH는 상기 추출물의 부탄올을 처리한 실험군, Water는 물을 처리한 실험군을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 하나의 양태는 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명에서는, 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물은 인지장애 관련 질환의 발병 원인인 베타 아밀로이드의 생성을 감소시키고, 신경세포 보호 효과를 가지며, 기억장애 및 인지장애가 유도된 마우스에서 기억력 향상 및 인지기능 향상 효과를 나타냄을 확인함에 따라, 상기 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물은 인지장애 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, "참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.)"는 한국, 일본, 중국, 부탄, 아프가니스탄 등지에 분포하는 낙엽활엽 소교목이다. 산기슭, 산 중턱 이하의 하천 유역에서 흔히 자라며, 내한성과 염기에 강해 해안지방에서도 잘 자란다. 참빗살나무는 인슐린분비를 촉진시켜 당뇨병 완화에 효과를 나타내며, 지속적으로 꾸준히 복용해주면 혈액순환을 원활하게 해주어 동맥경화, 고혈압 등 혈관질환 예방에 탁월한 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 또한, 위암과 식도암 완화에 효과가 있으며, 각종 염증의 완화에 효과적이다. 그러나, 참빗살나무의 인지장애 개선 효과는 알려진바 없으며, 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.

상기 참빗살나무의 뿌리, 줄기, 잎, 열매, 꽃 등이 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 더욱 구체적으로 잎 또는 줄기가 사용될 수 있으나, 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료효과를 갖는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 참빗살나무는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "추출물"은 상기 참빗살나무를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 참빗살나무를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서, 상기 참빗살나무를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 에탄올이 사용될 수 있으며, 상기 에탄올은 10 내지 50%(v/v), 더욱 구체적으로 20 내지 40%(v/v) 에탄올일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 참빗살나무 추출물은 참빗살나무의 20 내지 40%(v/v) 에탄올 추출물인 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에서, 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 참빗살나무를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 분획물은 참빗살나무 추출물의 부탄올(buthanol) 또는 에틸 아세테이트 분획물인 것일 수 있다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "인지장애 관련 질환"은 뇌손상에 의해 기억능력, 시공간 파악능력, 판단력, 언어능력, 계산능력 등의 인지기능(인지능력)이 저하되어 유발된 질환을 의미한다. 구체적인 예로, 상기 인지장애 관련 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 기억장애(memory impairment)일 수 있으나, 인지기능에 장애가 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

치매는 다양한 원인에 의해 인지기능에 장애가 생긴 상태로서, 원인에 따라 다양한 하위질병이 존재한다. 구체적인 예로 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매 등이 존재한다. 본 발명의 인지장애 관련 질환은 상기의 하위 질환을 모두 포함한다. 치매의 다양한 발병 원인 중에서도, 베타 아밀로이드(beta amyloid)가 과도하게 생성되어 뇌에 침착되면서 뇌 세포에 유해한 영향을 주는 것이 핵심 기전으로 알려져 있다.

알츠하이머병은 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 서서히 발병하여 인지기능의 악화가 점진적으로 진행되는 병이다. 정확한 발병 기전과 원인에 대해서는 정확히 알려져 있지는 않지만, 현재로는 베타 아밀로이드(beta amyloid)의 과도한 생성이 하나의 발병 원인인 것으로 알려져 있다. 기억력 감퇴, 언어능력 저하, 시공간 파악능력 저하, 판단력 및 일상생활 수행능력의 저하, 보행장애, 거동장애 등의 인지장애 증상을 나타낸다.

기억장애는 사물을 기억하거나 과거의 경험을 생각해내는 일이 어렵거나 아주 불가능한 병적인 상태로서, 발병 원인이 매우 다양한 것이 특징이다. 구체적인 예로, 건망증, 순간기억상실, 단기기억상실, 장기기억상실, 일과성 기억장애 등이 기억장애에 해당한다.

본 발명에서, 상기 조성물은 ADAM9 단백질의 발현을 촉진하여 베타 아밀로이드 생성을 억제하고, sAPPα 생성을 촉진하여 신경세포 보호효과를 나타내며, 기억력 손상을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 베타 아밀로이드 생성에 의해 신경세포가 손상되어 발병되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 기억력 장애의 예방 또는 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "예방"은 상기 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 인지장애 관련 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 참빗살나무 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 인지장애 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 참빗살나무 30% 에탄올 추출물; 또는 이의 부탄올 또는 에틸 아세테이트 분획물은 베타 아밀로이드(Aβ42 또는 Aβ40)의 생성을 억제하고(도 1, 2 및 11), 베타 아밀로이드 전구체의 생성을 억제하며(도 3 및 4), 베타 아밀로이드의 생성을 촉진하는 α-세크리테아제 단백질의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 5). 또한, 상기 참빗살나무 추출물은 기억장애 및 인지장애가 유발된 마우스에서 기억력 향상 및 인지기능 향상 효과를 나타냄을 확인하였다(도 7 내지 10). 이는, 상기 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물은 기억능력 및 인지능력 향상 효과를 나타내므로, 이들을 포함하는 본 발명의 조성물은 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 0.001 내지 80, 구체적으로 0.001 내지 70, 더욱 구체적으로 0.001 내지 60 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있으며, 상기 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제 등이 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제 등이 사용될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 하나의 양태는 상기 조성물을 인지장애 관련 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인지장애 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.

이때, 상기 "인지장애 관련 질환" 및 "치료"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 상기 약학적 조성물을도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어, "개체"는 인지장애 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg, 더욱 구체적으로 0.05 내지 200 mg/kg, 가장 구체적으로 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물의 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선용도를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 양태는 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 "참빗살나무", "추출물", "분획물", "인지장애 관련 질환" 및 "예방"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 인지장애 관련 질환의 우수한 개선 효과를 기대할 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있으므로, 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "개선"은 상기 식품 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능(성)식품(health functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강기능식품은 본 발명의 참빗살나무 추출물 또는 이의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 식품으로 인정되는 제형이면 다양한 형태의 제형으로 제한 없이 제조될 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 참빗살나무 추출물의 제조

참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 는 한택식물원에서 자생하는 것을 채집하여 사용하였다. 참빗살나무 잎 및 줄기 847g에 30% 에탄올 6L를 가하고 65℃에서 3시간 추출한 다음 이를 여과하여 추출액을 수득하였다. 상기의 추출 과정은 2회 반복하였다. 최종적으로 수득한 추출액을 40℃ 이하에서 감압 농축한 후, 동결 건조하여 분말 형태의 추출물 118g(수율 13.9%)을 수득하였다.

제조예 2. 참빗살나무 추출물의 분획물의 제조

상기 실시예 1을 통해 수득한 참빗살나무 추출물을 증류수에 혼탁하고, n-헥산(n-Hexane)을 가하여 충분히 흔들어 준 후, 일정시간 정치하였다. 상기 과정을 2회 이상 반복하여 헥산 분획층을 수득하였으며, 이를 여과한 후 감압 농축하여 최종적으로 헥산 분획물을 얻었다. 상기와 같은 방법에 따라, 에틸 아세테이트(ethyl acetatel; EA), n-부탄올(n-Buthanol; BuOH), 물의 순서로 순차 분획하여 각각의 최종 분획물을 얻었고, 참빗살나무 추출물로부터 헥산 분획물(110mg, 수율 0.08%), EA 분획물(1.51g, 수율 1.3%), BuOH 분획물(14g, 수율 11.9%), 물 분획물(101g, 수율 85.6%)을 수득하였다.

실시예 1. 참빗살나무 추출물의 베타 아밀로이드(Amyloid beta; Aβ) 생성 억제 효과 확인

상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 베타 아밀로이드(Amyloid beta; Aβ) 생성 억제 효과를 분석하였다. 한편, Aβ는 알츠하이머병의 중요한 병인물질로 알려져 있다.

구체적으로, 인간에서 유래된 아밀로이드 전구체(amyloid precursor protein, APP)의 스웨덴 돌연변이(Swedish mutation)로 형질감염(transfection)된 자궁경부암 HeLa 세포주를 DMEM 배양액(Cat. # 11995, Gibco, USA)에서 배양하여 사용하였다. 상기 세포주(swAPP HeLa cell)는 콜롬비아 대학 의료센터의 김태완 교수(Prof. Tae-Wan Kim, Department of Pathology, Columbia University Medical Center, New York, NY10032, USA)로부터 제공받았다. 상기 세포주에 실시예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물을 5, 10 또는 25 ㎍/㎖로 첨가한 다음, 5% CO₂, 37℃에서 8시간 동안 배양하고, 배양액으로 분비된 Aβ42 또는 Aβ40의 베타 아밀로이드를 ELISA 키트(각각 #KHB3482 또는 #KHB3442; Thermo Fisher scientific, 미국)를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 상기 추출물을 첨가한 경우에는 배양액으로 분비된 Aβ42의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 10 또는 25 ㎍/㎖의 참빗살나무 추출물을 첨가하는 경우에는 대조군에 비하여 감소 정도가 각각 41% 또는 58%임을 확인하였다.

또한, 도 2에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 상기 추출물을 첨가한 경우에는 배양액으로 분비된 Aβ40의 양이 농도 의존적으로 감소하며, 10 또는 25 ㎍/㎖의 참빗살나무 추출물을 첨가하는 경우에는 대조군에 비하여 감소 정도가 각각 35% 및 69%임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 Aβ를 감소시키는 효과를 나타내므로, Aβ에 의해 야기되는 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2. 참빗살나무 추출물의 베타 아밀로이드 전구체(amyloid precursor protein, APP)에 대한 영향 확인

Aβ는 알츠하이머병의 중요한 병인물질로서 아밀로이드 전구체(amyloid precursor protein, APP)가 단백질 분해 효소의 연속적인 작용을 통해 형성된다고 알려져 있다(Selkoe, Science 298: 789-891, 2002). 구체적으로, APP가 β-세크리테아제(β-secretease)에 의해 sAPPβ(soluble peptide APPβ)와 Aβ 아미노산 서열을 포함하는 C-말단 절편 β(C-terminal fragment β; CTFβ)로 잘려진 다음 CTFβ가 γ-세크리테아제(γ-secretease)에 의해 잘려지면서 ACID(APP intracellular domain)와 Aβ가 형성된다. 양자택일로, APP는 α-세크리테아제(α-secretease)에 의해 Aβ 아미노산 서열 사이가 절단되어 sAPPα(soluble peptide APPα)와 CTFα로 잘려진 다음 CTFα가 γ-세크리테아제에 의해 잘려지면서 ACID(APP intracellular domain)와 P3가 형성된다. 따라서, α-세크리테아제는 β-세크리테아제와 경쟁적으로 APP를 분해하여 Aβ 생성을 억제하므로, α-세크리테아제의 활성을 증가시키거나 β-세크리테아제의 활성을 감소시키는 것은 알츠하이머병, 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 예방 또는 치료의 한 방법이 될 수 있다.

이에 따라, 상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 베타 아밀로이드 전구체(amyloid precursor protein, APP)에 대한 영향을 분석하였다. Aβ로부터 α-세크리테아제에 의해 형성되는 sAPP의 생성량, Aβ로부터 β-세크리테아제에 의해 형성되는 sAPPβ의 생성량, α-세크리테아제의 발현량 및 β-세크리테아제의 발현량을 하기 실시예 2-1 내지 2-4에서 분석하였다.

실시예 2-1. sAPPα의 생성 촉진 효과

상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 sAPPα(soluble peptide APPα) 생성 촉진 효과를 분석하였다. 한편, sAPPα는 α-세크리테아제(α-secretease)의 활성이 증가할수록 그 생성량이 증가한다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 참빗살나무 추출물을 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 배양액으로 분비된 sAPPα는 Human sAPPα high sensitive ELISA 키트(#27734; Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd., 일본)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 상기 추출물을 첨가한 경우에는 배양액으로 분비된 sAPPα의 양이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 10 또는 25 ㎍/㎖의 참빗살나무 추출물을 첨가하는 경우에는 대조군에 비하여 증가 정도가 각각 99% 및 129%임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 Aβ의 전구체인 sAPPβ가 생성되는 것을 경쟁적으로 억제하므로, Aβ에 의해 야기되는 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-2. sAPPβ의 생성 억제 효과

상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 sAPPβ(soluble peptide APPβ) 생성 억제 효과를 분석하였다. 한편, sAPPβ는 β-세크리테아제(α-secretease)의 활성이 감소할수록 그 생성량이 감소한다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 참빗살나무 추출물을 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 배양액으로 분비된 sAPPβ는 Human sAPPβ-sw high sensitive ELISA 키트(#27733; Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd., 일본)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 상기 추출물을 첨가한 경우에는 배양액으로 분비된 sAPPβ의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 10 또는 25 ㎍/㎖의 참빗살나무 추출물을 첨가하는 경우에는 대조군에 비하여 감소 정도가 각각 28% 및 54%임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 Aβ의 전구체인 sAPPβ의 생성량을 감소시키므로, Aβ에 의해 야기되는 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-3. α-세크리테아제 단백질의 발현 증가 효과

상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 α-세크리테아제 단백질 발현 증가 효과를 확인하였다. 한편, α-세크리테아제의 활성이 증가할수록 베타 아밀로이드의 전구체인 sAPPβ의 생성량은 감소한다.

구체적으로, α-세크리테아제의 일종인 ADAM(A Disintegrin and Metalloproteinases) 단백질의 발현량을 분석하였다. ADAM은 번역 후 가공(post-translational processing)에 따라 전구체 형태와 활성 형태가 존재하므로, 전구체 형태 및 활성 형태의 ADAM9, ADAM10, ADAM17 단백질의 발현량을 분석하였다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 참빗살나무 추출물을 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 세포 용해(cell lysis)를 통해 총 단백질을 추출하였고, ADAM9(#2099; polyclonal; Cell signaling Technology, 미국), ADAM10(#ab1997; polyclonal; abcam, 영국) 및 ADAM17(#ab2051; polyclonal; abcam, 영국) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 통해 세포 용해물 내의 ADAM9, ADAM10, ADAM17 단백질 발현량을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 상기 추출물을 첨가한 경우에는 ADAM9 단백질의 발현량이 농도 의존적으로 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 전구체 형태의 ADAM9 단백질의 발현량은 대조군에 비하여 약 3배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 반면, ADAM10 및 ADAM17 단백질의 발현량은 변화하지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 ADAM9의 단백질 발현량을 증가시켜 α-세크리테아제의 활성을 증가시킴으로써, β-세크리테아제에 의한 APP 대사를 경쟁적으로 억제하여 Aβ의 생성을 억제하는 것임을 알 수 있었다.

실시예 2-4. β-세크리테아제 단백질에 대한 영향 확인

상기 제조예 1에서 수득한 참빗살나무 추출물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 추출물의 β-세크리테아제 단백질에 대한 영향을 확인하였다.

구체적으로, β-세크리테아제의 일종인 BACE1(Beta-secretase 1) 단백질의 발현량을 분석하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 참빗살나무 추출물을 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 세포 용해(cell lysis)를 통해 총 단백질을 추출하였고, BACE1(#ab108394; monoclonal; abcam, 영국) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 방법을 통해 BACE1 발현량을 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 BACE1 단백질의 발현량에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, β-세크리테아제에 작용하지 않고, α-세크리테아제에 작용하여 Aβ의 생성을 억제하는 것임을 알 수 있었다.

실시예 3. 동물에 대한 참빗살나무 추출물의 기억력 및 인지기능 개선 효과 확인

실시예 3-1. 동물 실험 조건

본 발명에는 ICR 웅성 마우스(8주령)를 사용하였고, 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였다. 이후, 상기 제조예 1에 따라 제조한 참빗살나무 추출물을 75 mg/kg 또는 150 mg/kg로 일주일간 1회 경구 투여하였다. 양성대조군으로는 치매증상의 치료제로 사용되고 있는 도네페질(donepezil) 4 mg/kg을 경구 투여하였고, 정상대조군으로는 식염수를 경구 투여하였다.

또한, 상기 추출물의 기억력 및 인지기능 개선 효과를 확인하기 위하여, 하기 실시예 3-2 내지 3-5에 따라 수중 미로 시험, Y자형 미로 시험, 신기물체 인식 시험, 수동회피실험을 실시하였다. 이때, 각각의 시험을 실시하기 30분 전에, 스코폴라민(scopolamine) 1 mg/kg을 피하 투여하여 마우스에 뇌기능 기억 장애 및 인지 장애를 유발하였다. 시험 물질의 투여에 따른 대조군 및 실험군의 구분은 하기 표 1에 정리하였다.

표 1

구분	투여 물질
정상대조군	식염수
음성대조군	스코폴라민 1 mg/kg
양성대조군	스코폴라민 1 mg/kg + 도네페질 4 mg/kg
실험군 1	스코폴라민 1 mg/kg + 참빗살나무 추출물 75 mg/kg
실험군 2	스코폴라민 1 mg/kg + 참빗살나무 추출물 150 mg/kg

실시예 3-2. 수중 미로 시험

수중 미로 시험의 획득시행(acquisition phase)은 5일 동안 매일 3회 30분 간격으로 물에 잠겨 있는 플랫폼을 찾을 때까지의 시간(escape latency, 단위: 초)을 측정하는 방법으로 수행하였고, 최대 허용 시간은 90초로 제한하였다. 플랫폼에 올라가면 적어도 5초간 머무르게 하였다.

또한, 수중 미로 시험의 파지시행(retention phase)은 획득시행 시험을 종료하고 24시간 후에 플랫폼을 치운 수조에서 자유롭게 수영하게 하여 플랫폼이 있던 사분원에 머무르는 시간(time in target quadrant)을 측정하는 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 7의 A에서 볼 수 있듯이, 스코폴라민만을 투여한 음성대조군에 비하여, 스코폴라민과 본 발명의 참빗살나무 추출물을 150 mg/kg으로 투여한 실험군 2는 플랫폼을 더 빠르게 찾을 수 있으며, 이러한 상기 추출물의 효과는 치매 치료 약물인 도네페질보다도 더 우수하고, 정상대조군과도 유사한 정도임을 확인하였다. 또한, 도 7의 B에서 볼 수 있듯이, 음성대조군에 비하여 실험군 2는 플랫폼이 있던 사분원에 머무른 시간이 더 증가함을 확인하였다.

실시예 3-3. Y자형 미로 시험

Y자형 미로 시험은 3개의 통로(arm)가 동일한 각도로 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며, 각 가지는 길이 30cm, 높이 12cm, 폭 5cm로 이루어진 Y자형 미로 측정장치를 이용하여 수행하였다. 미로의 한 통로 끝에 마우스를 두고 5분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 하였다. 마우스의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 인정하여 움직임을 교차횟수(alternation)로 기록하였다. 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때를 실제 교차횟수로 하여 1점을 부여하였고, 실제 교차 횟수는 최대 가능한 교차횟수(총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 비율로 자발적인 교차행동량을 구하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 스코폴라민만을 투여한 음성대조군의 교차행동량은 53.2 ± 2.5%인 반면에, 스코폴라민과 본 발명의 참빗살나무 추출물을 150 mg/kg으로 투여한 실험군 2는 65.8 ± 4%로서, 기억 개선 효과가 약 23.8% 증가함을 확인하였다. 또한, 이러한 상기 추출물의 효과는 치매 치료 약물인 도네페질보다도 더 우수하고, 정상대조군과도 유사한 정도임을 확인하였다.

실시예 3-4. 신기물체 인식 시험

신기물체(novel objecting) 인식 시험에는 50cm × 50cm × 50cm의 상자를 실험 장치로 사용하였고, 마우스를 2일 동안 매일 1회, 5분 동안 자유롭게 실험 장치 내를 탐색하도록 하였다. 탐색 후 다음날에 획득시행(acquisition phase)을 위해 실험 장치 내에 2개의 물체(A와 B)를 설치한 후, 마우스를 5분간 넣고, 마우스가 각 물체에 대해 1cm 이내에 접근하여 탐색한 시간을 측정하였다. 4일째 되는 날에 파지시행(retention phase)을 위해 2개의 물체 중 하나를 상이한 물체(신기 물체, A와 C)로 바꾼 후, 마우스를 실험 장치에 5분간 넣고 각 물체에 대해 1cm 이내에 접근하여 탐색한 시간을 측정하였다. 시험 종료 후, 각 물체에 대한 탐색시간의 비율을 구하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 스코폴라민만을 투여한 음성대조군의 신기물체 탐색 시간 비율은 57.1 ± 1.8%인 반면에, 스코폴라민과 본 발명의 참빗살나무 추출물을 150 mg/kg으로 투여한 실험군 2는 64.3 ± 1.1%로서, 탐색 시간 비율이 약 7.2% 증가함을 확인하였다. 또한, 이러한 상기 추출물의 효과는 치매 치료 약물인 도네페질 및 정상대조군과도 유사한 정도임을 확인하였다.

실시예 3-5. 수동회피 시험

수동회피 시험에는 칸막이 문으로 2개의 구획으로 구분된 셔틀박스(shuttle box)를 실험장치로 사용하였다. 한쪽 구획은 조명을 비추어 밝게 하고 다른 구획은 조명이 없고 검은 천으로 어둡게 하였다. 첫날 마우스를 밝은 방에 30초간 놓고 탐색하게 한 후, 칸막이 문을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하여 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간(acquisition latency time)을 측정하고, 어두운 방에 들어가면 칸막이 문을 닫고 격자 바닥을 통해 0.3 mA의 전기 충격을 3초간 주어 마우스가 전기 자극을 기억하게 하였다. 24시간 후, 마우스를 밝은 방에 두고 칸막이 문을 열어 어두운 방으로 마우스의 모든 발이 들어가는데 걸리는 시간(retention latency time)을 측정하였고, 최대 시간을 180초로 제한하였다. 밝은 곳에서 어두운 곳으로 들어가는 시간(retention latency time)이 클수록 수동 회피에 대한 기억이 잘 유지되는 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, 스코폴라민만을 투여한 음성대조군의 전기 자극 학습 후 어두운 방으로 들어가는 시간이 53.2 ± 7.3초인 반면에, 스코폴라민과 본 발명의 참빗살나무 추출물을 150 mg/kg으로 투여한 실험군 2는 92.8 ± 18.4초로서, 시간(retention latency time)이 약 31 ± 2초 증가함을 확인하였다. 또한, 이러한 상기 추출물의 효과는 치매 치료 약물인 도네페질보다도 더 우수함을 확인하였다.

이상 상기 실시예 3의 내용을 종합한 결과, 본 발명의 참빗살나무 추출물은 뇌기능이 저하된 마우스에 대하여 우수한 기억 능력 및 인지기능 개선 효과를 나타내므로, 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 참빗살나무 추출물의 분획물의 베타 아밀로이드(Aβ42) 생성 억제 효과 확인

상기 제조예 2에서 수득한 참빗살나무 추출물의 분획물의 치매 또는 인지장애 등에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 분획물의 Aβ 생성 억제 효과를 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 참빗살나무 추출물을 세포의 배양액에 처리하였고, 배양액으로 분비된 Aβ42를 측정하였다.

그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 참빗살나무 추출물의 분획물 중에서도, 에틸 아세테이트(EA) 분획물 및 부탄올(BuOH) 분획물이 Aβ42의 생성을 유의하게 감소시킬 수 있음을 확인하였고, 그 효과는 참빗살나무 추출물보다 더 우수함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 참빗살나무 추출물의 분획물은 베타 아밀로이드를 감소시키는 효과를 나타내므로, 상기 추출물뿐만 아니라 이의 분획물도 베타 아밀로이드에 의해 야기되는 치매, 기억력 장애, 인지장애 등의 뇌 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 참빗살나무는 참빗살나무의 잎과 줄기인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 참빗살나무를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 제조되는 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 추출물은 참빗살나무의 20 내지 40%(v/v) 에탄올 추출물인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 참빗살나무 추출물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 제조되는 것인, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 분획물은 참빗살나무 추출물의 부탄올(buthanol) 또는 에틸 아세테이트 분획물인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인지장애 관련 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 기억장애로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 참빗살나무추출물 또는 이의 분획물을 총 조성물의 중량 대비 0.001 내지 80 중량%로 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 ADAM9 단백질의 발현을 촉진하여 베타 아밀로이드 생성을 억제하고, sAPPα 생성을 촉진하여 신경세포 보호효과를 나타내며, 기억력 손상을 억제하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 인지장애 관련 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인지장애 관련 질환의 치료 방법.
참빗살나무(Euonymus hamiltonianus Wall.) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 인지장애 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 인지장애 관련 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 기억장애로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.