JP5954828B2 - 皮膚状態の改善用組成物 - Google Patents
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Description
そこで、本発明者らは、整腸作用が認められているProfecの摂取が肌状態を改善するか否かの検討を試みた。その結果から、本発明者らは、プラセボ群と比較してProfec摂取群において、角層水分量とキメスコアが有意に改善することを見出した。また、Profecの有効成分であるDHNAに、シミの原因となるメラニンの生成を抑制する作用があることを確認した。すなわち、本発明は、以下の組成物並びにその用途に関する。
〔1〕以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、皮膚状態の改善用組成物;
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。
〔2〕プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)である〔1〕に記載の組成物。
〔3〕乳発酵成分を付加的に配合する、〔1〕または〔2〕に記載の組成物。
〔4〕乳発酵成分が、乳をLactobacillus属に属する乳酸菌およびStreptococcus属に属する乳酸菌のいずれか、または両方で発酵させた乳、またはその混合物である、〔3〕に記載の組成物。
〔5〕プロピオン酸菌の培養物が殺菌されている〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の組成物。
〔6〕DHNAまたはACNQの類似体が、1,4−ナフトキノン、2−メチル−1,4−ナフトキノン、4−アミノ−2−メチル−1−ナフトール、および2−アミノ−3−クロロ−1,4−ナフトキノンからなる群より選択される、〔1〕に記載の組成物。
〔7〕皮膚状態の改善が、キメ密度の改善、角層水分量の増加、色素沈着の減少からなる群より選択される、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の組成物。
〔8〕乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、乳製品または発酵乳である〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の組成物。
〔9〕皮膚状態の改善組成物を製造するための〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の組成物の使用。
〔10〕以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、皮膚における色素形成阻害剤;
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。
〔11〕以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を動物に経口投与する工程を含む皮膚状態の改善方法;
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。
〔12〕錠剤(タブレット)に成型された、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の組成物。
〔13〕錠剤(タブレット)に成型された、〔10〕に記載の色素形成阻害剤。
本発明の組成物は、既に食品等としてヒトに投与されていた成分を配合して製造することができる。したがって、本発明の組成物は、高度な安全性が既に保証されており、継続的に摂取することができる。すなわち、本発明の組成物により、皮膚状態の継続的な改善を期待することができる。
本発明の組成物は、その好ましい態様において、既に一般食品や流動食等として広く摂取されている成分の組み合わせによって提供される。したがって、本発明の組成物をヨーグルト等の食品として継続的に摂取することで、皮膚におけるメラニンの生成が阻害された状態を継続できる。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
本発明の皮膚状態の改善用組成物、あるいは皮膚における色素形成阻害剤は、プロピオン酸菌の培養物を含む。プロピオン酸菌とは、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)に属するグラム陽性の嫌気性細菌で、糖類から無酸素的にプロピオン酸を生成する微生物を言う。具体的には、次のような微生物の培養物を本発明の組成物に加えることができる。すなわち、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)、プロピオニバクテリウム・トエニー(P. thoenii)、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ(P. acidipropionici)、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー(P. jensenii)等である。これらのプロピオン酸菌は、チーズの製造に利用される微生物である。その他、次の微生物もプロピオン酸菌として示すことができる。すなわち、プロピオニバクテリウム・アビダム(P. avidum)、プロピオニバクテリウム・アクネス(P. acnes)、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム(P. lymphophilum)、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム(P. granulosam)である。
ホエイタンパク質濃縮物(WPC)の標準的な製造方法は、以下の通りである。
(1)ホエイを膜分離した後に、濃縮する段階。または
(2)ホエイを膜分離した後に、濃縮、乾燥する段階。
なお、濃縮処理には、一般的な装置や方法を用いることができ、たとえば、真空蒸発缶(エバポレーター)、真空釜、薄膜垂直上昇管状型濃縮機、薄膜垂直下降管状型濃縮機、プレート型濃縮機等により減圧下で加熱する方法を用いることができる。そして、乾燥処理にも、一般的な装置や方法を用いることができ、たとえば、噴霧乾燥(スプレードライヤー)法、ドラム乾燥法、凍結真空乾燥(フリーズドライヤー)法、真空(減圧)乾燥法等を用いることができる。
ホエイタンパク質分離物(WPI)の標準的な製造方法は、以下の通りである。
(1)ホエイを膜分離またはイオン交換樹脂処理または電気透析処理した後に、濃縮する段階。または
(2)ホエイを膜分離またはイオン交換樹脂処理または電気透析処理した後に、濃縮、乾燥する段階。
なお、濃縮処理には、一般的な装置や方法を用いることができ、たとえば、真空蒸発缶(エバポレーター)、真空釜、薄膜垂直上昇管状型濃縮機、薄膜垂直下降管状型濃縮機、プレート型濃縮機等により減圧下で加熱する方法を用いることができる。そして、乾燥処理にも、一般的な装置や方法を用いることができ、たとえば、噴霧乾燥(スプレードライヤー)法、ドラム乾燥法、凍結真空乾燥(フリーズドライヤー)法、真空(減圧)乾燥法等を用いることができる。
(i) 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)またはその類似体、および
(ii) 2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone (ACNQ)またはその類似体
のいずれか、または両方を含む皮膚状態の改善用組成物を提供する。
(i)1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)またはその類似体、および
(ii)2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone (ACNQ)またはその類似体
のいずれか、または両方を含む、皮膚における色素形成阻害剤を提供する。あるいは、本発明は、前記の成分(i)および(ii)のいずれか、または両方を含む、動物の皮膚における色素の形成を阻害するための医薬組成物に関する。このとき、本発明において好ましい動物はヒトである。
一方、国際規格では、「ヨーグルトと称される製品は、Lactobacillus bulgaricus(ラクトバチルス・ブルガリカス)、Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus(ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラス)の両方の菌の乳酸発酵作用により乳および脱脂粉乳等の乳製品から作られるもので、最終製品中には前述の2つの菌が多量に生存しているもの」と定義されている。
本発明においてヨーグルトには、これらの両方の定義によって特定されるものを含む。また、本発明において、ヨーグルトには、食べるヨーグルト(固形状、糊状)、飲むヨーグルト(液状)、フローズンヨーグルト(凍結状)、粉体ヨーグルト(粉末状)等のいずれをも含む。これらヨーグルトの製造方法は、当業者にとって公知である。ヨーグルトの製造方法の一例を示せば、前記したLactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1 と Streptococcus thermophilus OLS3059を使用して、混合スターターを調製する工程、その混合スターターを原料乳に接種して培養する工程、冷却する工程、フレーバーリングする工程、包材や容器に充填する工程等を経ることとなる。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
本発明の組成物、あるいは色素形成阻害剤は、好ましい態様において、乳発酵成分を付加的に配合する(含む)ことができる。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
本発明の組成物が投与される対象は、哺乳動物である。そして、哺乳動物として好ましくはヒトである。
さらに、本発明は、以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分の、皮膚状態の改善用組成物の製造における使用に関する。あるいは、本発明は、以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分の、皮膚状態の改善における使用に関する。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
・シリコンラバー等の印象剤を用いて、皮膚表面のレプリカを取り、CCDカメラで、そのレプリカ画像を写し、画像解析から表面形状を定量化する方法(レプリカ画像解析法)。
・レーザー光を用いて、レプリカ表面の凹凸を精度良く三次元で計測する方法(レプリカ三次元計測法)。
・ビデオマイクロスコープやダイレクトスキンアナライザーを用いて、皮膚表面画像を撮影し、それを画像解析する方法(ビデオマイクロスコープを用いた皮膚表面形状画像解析法)。
・格子状のパターンを皮膚に投影し、その画像の歪みから皮膚の三次元情報を得る方法(レプリカを介さない三次元直接計測法)。
本発明では、本発明の組成物を使用しない場合と比較して、キメ密度が高くなったら、キメ密度が改善されたと評価(判定)することができる。あるいは、本発明の組成物を投与する前と投与した後においてキメ密度を比較して、キメ密度が高くなっても、キメ密度が改善されたと評価することができる。
本発明では、本発明の組成物を使用しない場合と比較して、キメスコアが高くなったら、キメスコア(キメ)が改善されたと評価(判定)することができる。あるいは、本発明の組成物を投与する前と投与した後においてキメスコアを比較して、キメスコアが高くなっても、キメスコア(キメ)が改善されたと評価することができる。なお、キメスコアの改善はキメ密度の改善とも言え、つまり、キメの改善を意味している。
・高周波電流を用いて皮膚の電気伝導度や電気容量を測定する方法。
・皮膚の誘電緩和から測定する方法。
・赤外線スペクトルを用いる方法。
・光音響による測定法。
・磁気共鳴断層法。
・ラマン分光法。
画像解析による色素沈着の評価において、カラー画像(RGB)に存在する色の3要素のうち、特に「BLUE(青)」の信号成分に、色素沈着の部分を強く確認することができる。したがって、このBLUE信号を用いて作成されたモノクロ画像における濃淡と形状的な特徴(個数、面積)により、色素沈着を定義することができる。たとえば「色素沈着 小」は、モノクロ画像中において、周辺部位に比較して「やや暗い部分」と「暗い部分」として検出できる部分のうち、面積が0.6mm2〜1.2mm2の連続した領域とすることができる。あるいは、たとえば「色素沈着 大」は、モノクロ画像中において、周辺部位に比較して「やや暗い部分」と「暗い部分」として検出できる部分のうち、面積が1.2mm2以上の連続した領域とすることができる。また、「赤み」を指標とすることにより、たとえば、にきびや紅斑等を検出することもできる。
乳由来の脂質や糖類等:バター、乳清ミネラル、クリーム、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分等
ペプチドやアミノ酸類:カゼインホスホペプチド、コラーゲンペプチド等の各種ペプチド、リジン、アルギニン等の各種アミノ酸
ミネラル類:カルシウム、リン、カリウム、塩素、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、クロム、モリブデン等
有機酸類:リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等
短鎖脂肪酸類:酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸等
脂肪酸エステル:グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等
これらの付加的な栄養素には、化学的に合成した成分や、天然物に由来する成分の、いずれをも用いることができる。そして、最終的に目的とする成分を含む食品を原材料として配合することもできる。これらの成分は、最終的に目的とする栄養剤の組成に合わせて、少なくとも1種あるいは2種以上を組み合わせて配合することができる。その組成物の形態は、固体でも液体でも構わないし、ゲル状あるいは半固形状等に調製することもできる。したがって、それらの栄養剤は、機能性食品として経口投与することもできる。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
さらに本発明は、以下の栄養素を含む、皮膚状態改善用組成物を提供する。すなわち、
プロピオン酸菌の培養物
乳発酵成分
糖類
等である。
(i) 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA)またはその類似体、および
(ii)2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ)またはその類似体のいずれか、または両方であることができる。また上記組成中の乳発酵成分がタンパク質を含むときには、タンパク質としてさらに付加的に由来の異なるタンパク質を配合することもできる。たとえば、乳発酵成分に加えて、乳成分を配合することができる。本発明の組成物を構成する各成分は、機能性食品として投与する対象の体格、年齢、性別等の諸条件に応じて適宜調整することができる。より具体的には、一般的な組成として次のような組成(100mLまたは100gあたり)を示すことができる。
本発明においては、乳発酵成分を加えることによって、組成物の風味や食感等の嗜好性を改良することができる。嗜好性を改良するときには、本発明における組成物の大部分を乳発酵成分とするのが望ましい。したがって、たとえば上に例示したプロピオン酸菌の培養物添加量に加えて、乳発酵成分を配合することによって本発明における組成物とすることができる。具体的には、プロピオン酸菌の培養物1mg〜22g、通常10mg〜17g、好ましくは10mg〜11g、またはDHNA量で0.01μg〜15mg、通常0.5μg〜10mg、好ましくは0.5μg〜0.1mgに加え、1g〜100g、通常30g〜100g、好ましくは50g〜100g、より好ましくは60g〜100gの乳発酵成分を配合することができる。また糖類を0.1g〜20g、通常0.3g〜15g、好ましくは0.6g〜10g配合することもできる。
上述の組成において、DHNAを含むプロピオン酸菌の培養物を配合するときは、当該培養物の量を、DHNA換算で、上記の組成となるように配合することもできる。
ビタミン類:0〜20g、通常0〜10g、好ましくは0〜1200mg
ミネラル類:0〜5g、通常0〜3g、好ましくは0〜2g
有機酸あるいは短鎖脂肪酸:0〜5g、通常0〜3g、好ましくは0〜2g
脂肪酸エステル:0〜10g、通常0〜5g、好ましくは0〜3g。
すなわち本発明は上記栄養素を上記の組成で配合する工程を含む、皮膚状態を改善するための機能性食品あるいは医薬組成物の製造方法を提供する。本発明によって製造された機能性食品あるいは医薬組成物には、それを摂取することによって、対象における皮膚状態の改善が促進されることを表示することができる。
ビタミンA、
ビタミンB1等のビタミンB群、
ビタミンC(アスコルビン酸)やそのナトリウム塩(アスコルビン酸ナトリウム)
等である。
また本発明の機能性食品、あるいは医薬組成物に配合するための糖類は、多糖類あるいは単糖類から選択することができる。また、水溶性糖類のみならず、不溶性糖類を配合することもできる。より具体的には、以下の糖類からなる群から選択される少なくとも1つの糖類あるいはその誘導体を配合することができる。
単糖類としては、たとえばブドウ糖(グルコース)、マンノース、キシロース等があり、二糖類としては、ショ糖(スクロース、砂糖)、ラクトース(乳糖)、マルトース、トレハロース、パラチノース(イソマルツロース)等があり、オリゴ糖としては、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等があり、多糖類としては、澱粉、デキストリン等がある。また、糖アルコール等としては、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、還元パラチノース等が挙げられる。
(a)プロピオン酸菌の培養物
(b)DHNAまたはその類似体
(c)ACNQまたはその類似体
さらに付加的な成分を配合する場合には、上述した糖類等を担体として、均質に混合して調製する。通常、乳発酵成分とプロピオン酸菌培養物由来のタンパク質が組成物中の糖類の約1%以上の割合となるように、たとえば約30%以上の割合となるように、好ましくは、該組成物中の糖類の70%以上の割合となるように、より好ましくは約100%の割合となるように調製することができる。本発明の組成物を医薬組成物として調製する場合は、1mLあたり0.1〜3kcalとなるように、好ましくは0.7〜2kcalとなるように調整することが望ましい。また混合の際に、ビタミン類やミネラル類、さらに食物繊維からなる付加的な成分の少なくとも1つ以上を添加することもできる。食物繊維は水溶性食物繊維と不溶性食物繊維に分けられ、両者のいずれを用いることもできる。具体的には、水溶性食物繊維としては、たとえば以下のような成分を示すことができる。すなわち、ペクチン(プロトペクチン、ペクチニン酸、ペクチン酸)、アラビアガム、グァーガム加水分解物、グルコマンナン、ガラクトマンナン、サイリウム、コーンファイバー、アルギン酸、アルギン酸分解物、カラギーナン等である。
本発明に係る化粧料には、通常の化粧料、皮膚外用剤、医薬部外品、医薬品等に用いられる各種任意成分(油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、顔料、pH調整剤、薬効成分、紫外線吸収剤、香料等)を適宜配合することができる。そして、常法にしたがって、本発明に係る化粧料を製造することができる。
本発明に係る皮膚化粧料は、化粧水、クリーム、乳液、パックその他全ての皮膚化粧料とすることができる。本発明に係る皮膚化粧料には、常法にしたがって皮膚化粧料に常用される基剤、助剤等に有効成分(既述した乳清ミネラル)を適量、たとえば0.001%〜15%、好ましくは0.01%〜10%配合することができる。該有効成分は、食品由来のものである故、本来、毒性に問題はない。本発明に係る皮膚化粧料は皮膚に外用するものであるので、安全性は特に重要である。
クリームは次のように調製することができる。たとえば、水相部と油相部を調製し、得られた水相部と油相部をそれぞれ加熱して混合、撹拌し、乳化することにより調製することができる。水相部は、精製水に親水性成分を添加することにより調製することができる。親水性成分としては、たとえばグリセリン、ソルビット等の保湿剤が挙げられるが、これらに限定されない。また、油相部は、固形油分、液状油分、油性成分を混合することにより調製することができる。固形油分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、ミツロウ、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、高級脂肪酸等である。液状油分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、スクワラン、流動パラフィン、各種エステル油油性成分等である。一般のクリームでは、水相部に有効成分(プロピオン酸菌の培養物等)を0.01〜10%で含むことができる。
固形油分としては、ミツロウ、パラフィン等が挙げられるこれらに限定されない。半固形油分としては、ワセリン、ラノリン等が挙げられるこれらに限定されない。液状油分としては、スクワラン、流動パラフィン、各種エステル油等が挙げられるこれらに限定されない。増粘剤としては、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース等が挙げられるこれらに限定されない。一般の乳液の製造においては、水相部に本発明の有効成分を0.01%〜10%になるように加えて乳液とする。
保湿剤としては、グリセリン、ソルビット等が挙げられるが、これらに限定されない。皮膜剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。一般のパックの製造においては、本発明の有効成分を0.01%〜10%になるように加えてパックとする。
パラオキシ安息香酸エステルはパラベンとも称される。パラベンとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、メチルパラベン、 エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等である。
ペプチドやアミノ酸類:たとえば、500〜200000重量部、好ましくは、500〜1000重量部
糖類:たとえば、0.1〜100重量部、好ましくは、1〜50重量部
エステル:たとえば、0.1〜100重量部、好ましくは1.0〜50重量部、より好ましくは10〜30重量部
果汁:たとえば、0.01〜500重量部、好ましくは0.1〜100重量部、より好ましくは1〜50重量部
色素:たとえば、0.01〜500重量部、好ましくは0.1〜50重量部、より好ましくは1〜10重量部
香料:たとえば、0.01〜500重量部、好ましくは0.1〜100重量部、より好ましくは1〜50重量部
アナトー色素(アナトー、カロチノイド、カロチノイド色素、カロテノイド、カロテノイド色素)、
ウコン色素(クルクミン、ターメリック色素)、
カラメルI、カラメルII、カラメルIII、カラメルIV(カラメル、カラメル色素)、
イモカロテン、ディナリエラカロテン、ニンジンカロテン等(抽出カロチン、カロチン色素、カロチノイド色素)、
クチナシ青色素、クチナシ赤色素、クチナシ黄色素(クチナシ、クチナシ色素)、
コチニール色素(カルミン酸色素、カルミン酸、コチニール)、
食用タール系色素(食用赤色2号、食用赤色3号、食用赤色40号、食用赤色102号、食用赤色104号、食用赤色105号、食用赤色106号、食用黄色4号、食用黄色5号、食用緑色3号、食用青色1号および食用青色2号)、
銅クロロフィル、銅クロロフィリンナトリウム、
ベニコウジ色素、(モナスカス色素、紅麹、モナスカス)
ベニバナ赤色素(カーサマス赤色素)、
ベニバナ黄色素(カーサマス黄色素)
等を例示することができるが、これらに限定されない。
また、流動化剤としては、軽質無水ケイ酸(二酸化ケイ素)が挙げられる。流動化剤の1錠当たりの配合量は、0.5%〜3%であり、好ましくは0.5%〜2.0%である。
また、シェラック等を噴霧して、打錠後の錠剤をコーティングしても良い。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として、本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕Profec(プロピオン酸菌の培養物)の皮膚機能改善効果および整腸作用に対する効果の評価試験
1.被験者
(選択基準)
慢性的な便秘(排便日数が週平均4日以下)および乾燥皮膚を有する20歳から39歳までの女性。
(除外基準)
(1)妊産婦および授乳中の方
(2)便秘薬を常用している方(便秘のたび服用)
(3)アトピー性皮膚炎の方
(4)重度な心・腎・肝障害、呼吸器疾患、循環器疾患等を有し、組み入れが不適当と考えられる方
(5)牛乳に対するアレルギーのある方
(6)その他、試験担当医師あるいは試験分担医師が不適当と判断した方
(選択者数)
プラセボ食群、試験食2群の計3群
各群32例で計96例
(1)試験食
・酸性飲料(プラセボ)(試験食A)
・Profec含有酸性飲料(試験食B)
・Profec含有ヨーグルト飲料(試験食C)
(試験食A)「酸性飲料」(プラセボ)
水にペクチン、乳酸、ヨーグルトフレーバー、ビタミンC、アスパルテームを添加した酸性飲料で、乳成分および乳酸菌は含まない。
(試験食B)「Profec含有酸性飲料」
上記「酸性飲料」にProfec(プロピオン酸菌の培養物)を1%で添加した酸性飲料で、Profec由来以外の乳成分および乳酸菌は含有しない。
(試験食C)「Profec含有ヨーグルト飲料」
ヨーグルトベースミックスに明治乳業株式会社(現;株式会社明治)製「明治ブルガリアヨーグルト」(商品名)より単離した Lactobacillus bulgaricus 2038株ならびに Streptococcus thermophilus 1131株を接種、発酵させヨーグルトを調製した。このヨーグルト(60%)と「酸性飲料」に添加した成分、砂糖を添加し、さらにProfec(プロピオン酸菌の培養物)を1%で添加してヨーグルト飲料を調製した。当該ヨーグルト飲料は乳成分および乳酸菌を含有する。
(Profecの製造方法)
Profec(プロピオン酸菌の培養物)は、乳原料(ホエイ)をエメンタールチーズから分離したプロピオン酸菌(P. freudenreichii ET-3株)で発酵後、殺菌したものである。
試験食は10℃以下の冷蔵で保存した。
(3)試験食の摂取量
試験飲料1本(120mL)にDHNA量換算で6.6μg/日となるようProfec(プロピオン酸菌の培養物)を添加して製造した。
(4)摂取頻度
試験食を1日1本(120mL)、4週間摂取した。試験食摂取(朝・昼・夕・食前・食後)は被験者の任意とした。
(1)試験デザイン
デザイン:二重盲検プラセボコントロール試験
群構成:プラセボ食群、試験食群2群の計3群
各群32例で計96例
(2)被験者の割り付け
試験コントローラーが被験者を3群に割り付けた。その際、試験担当医師が顔面皮膚所見の判定基準に基づいて判定した結果にできる限り偏りが生じないよう留意した。
(3)試験スケジュール
試験食摂取前に、肌検査、採血、便の採取を行った。試験食を4週間摂取し、その後再び肌検査、採血、便の採取を行った。
被験者に洗顔後15分間恒温恒湿室(温度20±1℃,湿度42.0±2%)に在室して頂いた後、下記項目について観察・評価した。
1)顔面皮膚所見(全面)
(乾燥、鱗屑、丘疹、面疱、膿疱)
2)顔面肌測定(機器測定:頬部分)
(角層水分量・油分量・経表皮水分蒸散量・弾力性・pH)
3)顔面肌解析(画像解析:全面)
(キメスコア・色素沈着)
4)テープストリッピングによる角層採取(前腕内側部分)
(セラミド量・サイトカインIL-1ra/IL-1α、IL-8、TNF-αの測定)
5)肌状態に関するアンケートの記入(試験食摂取前後)
6)便菌叢解析(ビフィズス菌数、バクテロイデス菌数)
7)便中腐敗産物量(インドール、p-クレゾール、フェノール、スカトール)
肌解析については株式会社インフォワードにて実施した。テープストリッピングによる角層試料のセラミド・サイトカイン量測定、便菌叢解析、便中腐敗産物量測定は明治乳業株式会社(現;株式会社明治)にて実施した。
試験期間中(試験開始日から試験食摂取期間4週間終了まで)は、下記事項を禁止・制限した。
1)美容目的で新たに治療薬を内服することおよび観察部位へ外用薬を使用すること。ただし、試験開始前から行っている場合は継続使用を可とした。
2)美容目的での観察部位へのケミカルピーリング、レーザー治療、光線療法等の治療。
3)新たにサプリメントを摂取すること。
4)試験食以外の乳酸菌を含む食品(ヨーグルト、発酵乳等)およびオリゴ糖を含む食品の摂取。ただし、サプリメント(アミノ酸、ビタミン剤等)を常用している場合は継続使用を可とした。
摂取前後の変化量(率)における3群間の多重比較検定(Tukey-Kramer法)と摂取前後の群内比較検定を行った。
具体的には、離散データ(スコア、回数、個数で表記されるデータ)については全て「ウィルコクソン符号付順位和検定」を行い、連続データ(測定値)については、各データの正規性検定の結果に基づいて、「対応のあるt検定」あるいは「ウィルコクソン符号付順位和検定」を行った。
(皮膚機能評価)
・角層水分量の変化
・油分量の変化
・経表皮水分蒸散量(Transepidermal Water Loss:TEWL、経表皮水分喪失量とも言う)の変化
・弾力性の変化
・キメスコアの変化
・色素沈着(数・面積)の変化
・pHの変化
・肌状態に関するアンケート調査(摂取前後の変化)
・角層セラミド・サイトカイン(IL-1ra/IL-1α、IL-8、TNF-α)量の変化
(顔面肌測定:機器測定)
・角層水分量: Corneometer CM825(Courage + Khazaka electronic GmbH)
・油分量: Sebumeter SM810(Courage + Khazaka electronic GmbH)
・経表皮水分蒸散量: VapoMeter(Delfin Technologies)
・弾力性: Cutometer MPA580(Courage + Khazaka electronic GmbH)
・pH: Skin PH-meter PH900(Courage + Khazaka electronic GmbH)
(整腸作用評価)
・便の菌叢(ビフィズス菌、バクテロイデス菌)の変化
・便の腐敗産物測定(フェノール・p-クレゾール・インドール・スカトール)
・排便日数の変化(日誌)
(1)統計解析対象症例
試験食A摂取群 30名、試験食B摂取群 28名、試験食C摂取群 28名 の計 86症例
解析にあたり除外された症例
a)脱落例
試験職摂取開始前の来院以降一度も検査来院しなかった、あるいは被験者の非協力により脱落した症例を脱落と判断した。また、試験食摂取期間中の未摂取日が全摂取日数の10%(確率)に達した症例を脱落と判断した。本実施例においては、6例(試験食A摂取群:2名、試験食B摂取群:2名、試験食C摂取群:2名)を脱落として解析から除外した。
b)中止例
本実施例では、試験期間中に妊娠が判明した1名(試験食B摂取群)を中止事例とし、解析から除外した。
c)試験結果に影響を及ぼすと考えられる事項があった症例
3例(試験食B摂取群:1名、試験食C摂取群:2名)について腸内フローラに影響を及ぼす可能性のある薬剤の使用があり評価対象から除外した(整腸剤使用:2例、抗生物質使用:1例)。
皮膚測定結果のそれぞれの測定項目について、群ごとに試験開始時と4週間摂取後の測定結果間で「対応のあるt検定」あるいは「ウィルコクソン符号付順位和検定」を行った。
・試験食A(プラセボ)摂取群
経表皮水分蒸散量、粘弾性、皮膚pHについて有意に改善した。
・試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群
角層水分量、粘弾性、皮膚pHが有意に改善した。
・試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群
角層水分量、粘弾性、皮膚pHが有意に改善した。
各試験食接触前と後における角層水分量の比較結果を図1に示す。試験食B、C摂取群において、接触前と比較し角層水分量が有意に改善した(p<0.05)。これに対し、Profecを含まない試験食A摂取群では、角層水分量の有意な改善は認められなかった。
各群の皮膚測定結果Δ(開始時測定値−4週後測定値)について群間比較を行った。
結果、試験食A(プラセボ)摂取群と比較して、試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群および試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群が、角層水分量において有意に改善した。
画像解析結果のそれぞれの項目について、群ごとに試験開始時と4週間摂取後の解析結果の間で「対応のあるt検定」あるいは「ウィルコクソン符号付順位和検定」を行った。
(色素沈着小:0.6〜1.2mm2、大:1.2mm2以上、I〜III:色素濃度I<II<III)
・試験食A(プラセボ)摂取群
色素沈着大II(個数・面積)が有意に悪化した。
・試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群
キメが有意に改善した。
・試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群
キメ、色素沈着大II(個数)、大III(個数)が有意に改善した。
各試験食摂取前と後におけるキメスコアの比較結果を図2に示す。試験食B、C摂取群において、摂取前と比較しキメスコアが有意に改善した(p<0.05)。これに対し、Profecを含まない試験食A摂取群では、キメスコアが悪化した。
キメスコアとは、全顔画像撮影・画像解析システム(ロボスキンアナライザー、株式会社インフォワード製)のモノクロ画像における暗部を皮溝、明部を皮丘とし、明部暗部をそれぞれ強調処理して二値化した結果が、一辺0.4mmの正三角形のキメモデルを100とし、頬部上下2カ所(頬骨をほほ部上に設定)の平均を求めたものである。
各群の画像解析結果Δ(開始時測定値−4週後測定値)について群間比較を行った。
キメについては、試験食A(プラセボ)摂取群に比較して、試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群および試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群において有意に改善した。また、色素沈着大II(個数)、大III(個数)、大II(面積)について、試験食A(プラセボ)摂取群に比較して、試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群において有意に改善した。
19項目にわたる肌に関するアンケート調査を摂取前後で実施した。各項目ごとにスコア化した結果をもとに、摂取前後で「ウィルコクソン符号付順位和検定」を行った。各群で有意に改善した項目を列挙する。
・試験食A(プラセボ)摂取群
つや、はり、くすみ、たるみ、乾燥、ファンデーションののり、むくみ 計7項目
・試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群
つや、はり、くすみ、しみ、毛穴目立ち、キメ、しわ(口元)、乾燥、べたつき、透明感、ファンデーションののり、くま 計12項目
・試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群
つや、はり、くすみ、たるみ、しわ(額)、しわ(目元)、乾燥、透明感、ファンデーションののり、むくみ 計10項目
各群のアンケート調査結果Δ(4週後調査スコア−開始時調査スコア)について群間比較を行った。
結果、べたつきについて、試験食A(プラセボ)摂取群に比較して、試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群が有意に改善した。また、しわ(額)について、試験食A(プラセボ)摂取群に比較して、試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群が有意に改善した。
摂取前2週間の平均排便回数と摂取期間中の平均排便回数を「ウィルコクソン符号付順位和検定」で比較した。
・試験食A(プラセボ)摂取群
排便回数 3.7±1.2 → 4.7±2.3
・試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群
排便回数 3.6±1.2 → 4.3±1.6(有意に改善)
・試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群
排便回数 3.9±1.0 → 5.0±1.9(有意に改善)
各試験食摂取前と後における排便回数の比較結果を図3に示す。試験食B、C摂取群において、摂取前と比較し排便回数が有意に改善した(p<0.05)。これに対し、Profecを含まない試験食A摂取群では、排便回数の有意な改善は認められなかった。
(9)排便回数の群間比較
各群の排便回数変化Δ(摂取前2週間の平均排便回数−摂取期間中の平均排便回数)について群間比較を行った。
結果、3群間に有意な差は見られなかった。
測定の目的
顔面等の露光部では、衣服に隠れている非露光部に比べ、微弱な炎症状態にあることが知られている。そこで、テープストリッピングにより角層サンプルを採取し、角層中の炎症性サイトカイン(IL-1α、IL-1ra、IL-8、TNF-α)を測定した。特にIL-1ra/IL-1αは露光部、UV照射部位やアトピー性皮膚炎病変部等で増加しているとの報告がある。そのため、これらのサイトカインを皮膚の炎症状態の指標として評価した。IL-8やTNF-αはニキビやシミとの関連が知られている。
採取したテープ(PPSテープ2.5×4cm、3枚)を小さく切り、0.1%のTween 20を含むPBS 1.5mLが入ったエッペンチューブ(2mL容)に入れ、超音波処理(on ice)を行った。超音波処理(15分)によりテープから可溶性タンパクがPBS中に溶出される。抽出後、テープを取り出し、遠心(15000xg、1分、4℃)し、上清1mLを得た。上清中のタンパク濃度をMicro BCA protein assayで測定し、サイトカイン(IL-1α、IL-1ra、IL-8、TNF-α)を測定した。IL-1αとIL-1raは比率をとり、IL-8とTNF-αはタンパク量で補正した。
IL-1ra/IL-1α比率は、試験食に関わらず、摂取前後で差が認められなかった(図4)。摂取前に対する摂取後の増加率(摂取後/摂取前)は、試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料:Profec+Yo)摂取群で最も小さかった。角層中のIL-8は試験食A(プラセボ)摂取群において、摂取前後で有意に増加した(図5、p<0.05, ウィルコクソン符号付順位和検定)。試験食A(プラセボ)摂取群以外の群では、摂取前後でIL-8濃度に変化はなかった。IL-8の増加率(摂取後/摂取前)について3群間で群間比較を行ったが、統計学的に有意な差は認められなかった。TNF-αは検出されない人が多く、摂取前後の産生量、増加率のいずれについても、群間比較の結果有意差は認められなかった(データ非掲載)。試験期間中、季節の変化により紫外線が多くなったことが、試験食A(プラセボ)摂取群の角層IL-8の増加に影響した可能性が考えられた。一方、試験食B(Profec含有酸性飲料)摂取群および試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料)摂取群では有意なIL-8の変化は認められなかった。このことから、季節性の変化による炎症を抑制した可能性が示唆された。
測定の目的
試験期間の前後に被験者に提出してもらった糞便サンプル中のBifidobacterium属およびBacteroides属菌の菌数の変動を解析した。より具体的には、Bifidobacterium属菌の菌数の増加、またはBacteroides属菌の菌数の相対的な減少が見られるか否かについて検討した。
糞便を常温で溶解して全体を均一に混合した後、20mg分をチューブに分取し、ASL試薬700μLと混合して暫く静置した。これをtissue lyser(QIAGEN)を用いて2500rpmの条件下15分間激しく振とうした。引き続き、70℃湯浴に10分間浸けた後、15000rpm、10分間遠心した。上清を別のチューブに回収してInhibit EXを入れて即座に1分間ボルテックスし、15000rpm、3分間遠心した。その後、上清を回収してさらに15000rpm、3分間遠心して核酸粗精製液を得た。
この溶液をQIA cube(QIAGEN)にセットし、機械による自動操作によってDNA精製液を抽出し、この液を10倍希釈したものをPCRテンプレートとして使用した。
16S rDNA量の解析にはABI 7300 real-time PCR Systemを用いた。Bifidobacterium属標準試料にはB.longum 基準株(OLB6125)、Bacteroides属標準試料にはB.vulgatus基準株(OLB7086)から抽出したDNA溶液を用い、105cells/gを検出限界として菌数を算出した。
全88名の被験者の試験期間前後の糞便計176サンプルについてBifidobacterium属およびBacteroides属菌の菌数(cfu/g)を解析し、各群に分けて比較した。0週および4週時でのプラセボと各群との差、各群の0週と4週との差について有意差検定を実施した。その結果、Bifidobacterium属およびBacteroides属のいずれにおいても、菌数に有意な差は見られなかった。なお、試験食A(プラセボ)群はn=29、試験食B(Profec含有酸性飲料:profec)群はn=29、試験食C(Profec含有ヨーグルト飲料:profec+yogurt)群はn=30である。
さらに、0週時のBifidobacterium属菌の菌数の多寡によって被験者を層別に分けて解析した。その結果を以下に示した。
(i)試験開始時の菌数が10 10 cfu/g以下の被験者のみを抽出した場合
Profec摂取群ではBifidobacterium属菌の菌数が増加する傾向が見られた(p=0.058)。
プラセボ摂取群では有意にBifidobacterium属菌の菌数が減少した(p=0.013)。一方、Profec摂取群では菌数に有意な差は見られなかった。
以上の解析結果より、Profecが、初発ビフィズス菌数が多い人においてはその減少を抑え、初発ビフィズス菌数が比較的少なめの人においてはそれを増加させる効果を有する可能性があることが示唆された。また、初発菌数によって被験者を層別に分けたうえで、それぞれの層について、Bacteroides属の菌数に対するBifidobacterium属菌の菌数の比を解析した。しかしいずれの群においても、それぞれの層の間に有意な差は見られなかった。
1. Profecによる整腸作用
整腸作用の評価において、摂取前後の排便回数を比較すると、プラセボ群では有意な変化は見られなかった。しかしProfec摂取群においては、排便回数の有意な増加が観察され、整腸作用の改善が認められた。また、摂取前に便中のビフィズス菌数が少なかった被験者において、Profec摂取によってビフィズス菌数の増加傾向が認められた。このようにProfec摂取によって、一定の整腸効果が認められた。
本実施例は、2月から4月にかけて実施され、試験期間中に季節は冬から春に移行した。冬から春にかけて、季節が大きく変化(気温・湿度の上昇、紫外線量の増加)するため、角層細胞のターンオーバーに変調をきたすことが多い。一般に女性の間では、春は肌トラブルが多い季節であると認識されている。そのため、本実施例において季節変動が試験結果に与えた影響を、プラセボ摂取群の変化から言及する。
プラセボ飲料の摂取前後の変化で最も顕著な変化が、経表皮水分蒸散量(TEWL)の改善であった。TEWLは体内から蒸発する水分の量を測定することによって、皮膚のバリア機能を評価する指標である。TEWLが高いとはバリアが壊れて水分がたくさん逃げている状態を表し、一般に好ましくない。そのため、この値が減少するとバリア機能が改善したと評価することができる。ただし、この指標のみにより皮膚状態を判断すると、大きな誤りに陥ることがある。
たとえば、加齢によりターンオーバーが低下して角層が厚く貯留すると、見かけ上TEWLが改善する(値が小さくなる)ことがある。このような状態は高齢者に多く見られる。しかし、高齢者の皮膚では角層水分量が低く乾燥状態であることが多い。
また、必ずしもTEWLが高いことが悪い状態と言えない場合もある。赤ちゃんの肌は、TEWLが高い。しかし赤ちゃんの肌では角層水分量が高く非常にうるおっており、美容上ベストな状態と認識されている。このように、TEWLのみにより皮膚状態を一概に判断することはできない。角層水分量等、他のパラメータも含めて、総合的に判断することが重要である(現場レベルでの皮膚測定・評価〜トラブル事例・対策〜サイエンス&テクノロジー株式会社(2007)第24章)。
このような点を考慮した上で、本実施例の結果を検討すると、プラセボ摂取群のTEWL測定値は摂取前の20.5±6.6g/m2・hから、摂取後の18.7±5.9g/m2・hと変化し、統計学的に有意な差が見られた。しかし、プラセボ摂取群では角層水分量は摂取前後で有意に改善しておらず、キメについては悪化傾向を示した(p<0.1)。この結果を総合的に判断すると、プラセボ摂取群において季節変化の影響を受けた可能性、つまり、季節の変化に伴ってターンオーバーの遅延が起こった可能性が推測される。
TEWLの改善の次にプラセボ摂取群で認められた顕著な変化としては、色素沈着の悪化(画像解析)がある。シミは、紫外線によって活性化したメラノサイトがメラニンを作ることによって生じる。画像解析の結果から、プラセボ摂取群では大きくて濃いシミ(大II、III)がさらに大きくなり、その数も増えると言う結果が得られた。さらに、紫外線によってケラチノサイトでの産生量が上がることが知られている炎症性サイトカイン(IL-8)が、プラセボ摂取群の角層中で有意に増加した。これは本実施例を実施した2月〜4月にかけて紫外線量が増加した影響を受けた結果を裏付けるデータと言える。
さらに、プラセボ摂取群でターンオーバーが遅延したことにより、メラニンの排出遅延(排出抑制)が起こった可能性も考えられる。通常メラノサイトによって作られたメラニンはケラチノサイトに蓄積されるため、シミと認識される。プラセボ摂取群ではターンオーバーが遅延したため、ケラチノサイトが剥離する前にメラニンが増殖し、シミが成長した可能性も考えられる。
肌解析(機器測定・画像解析)において、角層水分量とキメスコアが、プラセボ摂取群と比較して、Profec摂取群で有意に改善した。被験者の実感を表すアンケート調査においては、毛穴の目立ち、キメ、シワ、透明感が改善された。これら4項目は女性が最も気にする肌トラブルであり、表現は異なるものの、いずれも角層の正常なターンオーバーの維持と角層水分量の改善によって実感が導かれる項目である。前述の通り、本実施例を実施した期間中の季節変動により、ターンオーバーの遅延が起こった可能性がある。本実施例ではターンオーバーを表す指標を測定していないが、角層水分量とキメスコアの値が改善されていることに加え、それら測定値と密接に関係しているアンケート指標(毛穴の目立ち、キメ、シワ、透明感)においても改善効果が認められていることから、Profecにはターンオーバーの正常化作用がある可能性が示唆される。
以下に、各アンケート項目と角層水分量、キメスコアおよびターンオーバーとの関係について述べる。
毛穴の目立ちとは、「毛穴出口の周囲がすり鉢状にくぼんでおり、そこが影となり毛穴として認識されること」である。毛穴の窪んだ部分の角層はターンオーバーが異常な状態(不全角化状態)であることが知られている(Fragrance J. 35(1):p19, 2007)。このような不全角化状態は皮脂中の不飽和脂肪酸によって誘発される。本実施例では角層のターンオーバーを測定した結果はなく、皮脂量にも変化はなかった。しかし、Profec摂取群で皮膚pHが摂取前のpH6.0から摂取後にpH5.5へと変化したことから、皮脂の組成が変化したことが示唆される。Profecの摂取により、皮脂組成が改善し、毛穴部分の角層のターンオーバーが改善され、その結果毛穴が目立たなくなった可能性が考えられる。
皮膚の表面形態を表す指標として、キメがある。皮膚を観察すると、網目状に細かい溝が走っており、溝に囲まれた部分は三角、菱形あるいは四角形になっている。この溝のことを皮溝と言い、皮溝に囲まれた部分を皮丘と言う。一般にキメの細かい肌と言った場合には、皮溝は狭く浅くなっており、皮丘は規則正しい形状となっている。逆に、皮溝が広く深いほど、皮丘が目立つ。さらに、皮丘が不揃いの形状になると、皮膚表面の触感はざらついたものとなり、キメの粗い肌となる。正常なターンオーバーが維持され、角質細胞が正常に終末分化(角化)を迎えることにより、角化細胞の形状は均一になり、保水力の高い健康な角層が形成される。これを、キメが整うと言う。
本実施例においては、キメを表す指標が改善していることに加え、角層水分量が有意に増加している。今回の試験で認められたProfec摂取群におけるキメスコア(画像解析)の改善結果は実感を伴った改善作用といえる。
皮膚が乾燥し、角層が厚くなり、角層の剥離が正常に進行しないと浅いシワの原因となる。角層のターンオーバーを調節し、十分に保湿すれば、浅い、細かいシワは消失すると言われている(アンチ・エイジングシリーズ No.2 皮膚の抗老化最前線、株式会社 エヌ・ティー・エス (2006))。そのため、シワは、角層水分量が改善されることに伴い改善された可能性がある。
透明感の高い皮膚はキメが深くかつ細かく整っており、角層水分量が多く、メラニン量、ヘモグロビン量が少ないことが示されている(Fragrance J. 35(2):p18, 2007)。本実施例においては、Profec摂取群で角層水分量とキメスコアの有意な改善効果が認められた。これが透明感の向上へとつながったと考えられる。
先述の通り、季節性の変化により、紫外線量が増加した結果、プラセボ摂取群でシミが増加・拡大したと考えられる。一方Profec摂取群ではシミの積極的な改善効果は認められていない。しかし、Profec摂取群では、プラセボ摂取群で認められた顕著なシミの増加・拡大も認められなかった。アンケートのシミの項目においても、Profec摂取による有意なシミの改善効果が示されている。このようなProfecによるシミの成長抑制効果の作用機作として、皮膚の炎症抑制作用とチロシナーゼ活性抑制作用、ターンオーバーの改善(遅延抑制)が考えられる。
本実施例で測定した角層の炎症性サイトカインの測定結果によると、プラセボ摂取群ではIL-8が有意に増加したが、Profec摂取群ではIL-8の産生量は変化しなかった。この結果は先の画像解析結果と良く一致する。Profecは、IL-8の産生を抑制することによってシミの成長(増加・拡大)を抑制したと考えられる。このようなProfecによる炎症抑制効果は、動物実験でも確認されている。また、Profecに含まれるDHNAの作用により、in vitroにおいてチロシナーゼ活性の抑制効果が確認されている。経口摂取したProfec中に含まれるDHNAが血中に移行し、直接メラノサイトに作用した可能性も考えられる。さらにProfec摂取群におけるターンオーバー遅延抑制によって、メラニンが増殖する前にケラチノサイトが剥離し、シミの成長が抑制されたことも一因と考えられる。
本実施例は、人の皮膚のターンオーバーの1回にあたる4週間を摂取期間として設定した。食品による皮膚の評価は通常8週間から12週間の摂取期間を設定することから、効果を十分に評価するには摂取期間が短かった可能性も考えられる。それにもかかわらず、以上に述べた効果が見られたことから、Profecの皮膚への改善効果は非常に高いと考えられる。
目的
一般的にメラニンは、シミのもとになるため、美肌の観点からは疎まれている。そのため、メラニン合成阻害能を有する美白素材を含む化粧品が多数開発されている。ベンゼン環に2個の-OH基がついているハイドロキノンは現在最も強力な美白剤として知られており、「肌の漂白剤」とも言われている。しかし、あまりに強力すぎるために肌が白く脱色されてしまう等の理由から、使用には医師の処方が必要となる。一方アルブチンはハイドロキノン配糖体で、ハイドロキノンほどの効果がないため市販の美白剤に配合されている。株式会社明治製Profecに含まれるDHNAおよびACNQのメラニン産生抑制効果を、チロシナーゼ活性阻害効果とメラノーマ細胞によるメラニン産生抑制効果の観点から調べた。
サンプルとしてDMSOに溶解したDHNAとACNQ、また陽性対照としてDMSOに溶解したPTU(フェニルチオ尿素)、0.1M リン酸バッファー(pH6.8)に溶解したコウジ酸(Kojic acid)とアルブチン(Arubutin)を、それぞれ添加前の濃度で2μM〜200mM調製し(ACNQのみ2μM〜20mM)、実験に供した。反応液中の濃度すなわち最終濃度はそれぞれ0.1〜10000μM(ACNQのみ0.1〜1000μM)であり、反応液中のDMSO濃度は5%である。
基礎培地として、10%のFCS-EMEM(抗生物質含有)を用いた。サンプル(DHNA、ACNQ)および陽性対照(PTU、Arubutin、Kojic acid)、陰性対照(PBS、DMSO)を含む培地は、それぞれ、最終濃度がDHNAは1nM〜100μM、ACNQは1nM〜10μM、陽性対照は100μM、陰性対照は0.1%になるよう、基礎培地で希釈して調製した。
(方法)
測定方法はYoshikawaらの方法(Yoshikawa M, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(12): 2368-73, 2005)に若干の変更を加えて行った。また、反応は全て96well plateにてtriplicateで行った。
まず、基質として、2mM L-DOPA 50μLに90μLの0.1M Phosphate buffer(pH6.8)とサンプル10μLをwell内で混合し、37℃で5分間プレインキュベートした。次に0.1M Phosphate buffer(pH6.8)で100 unit/mLに調製したTyrosinase(mushroom由来、Sigma)を50μL加え、37℃で15分間インキュベートした後、吸光度(405nm)を測定した。
リン酸バッファーを100としたときの各濃度の活性を評価した。溶媒のDMSO(最終濃度5%)によって活性が2〜3割低下するが、DHNAによって濃度依存的に活性が阻害されることがわかった。DMSOと比較した場合、DHNA の濃度が10μM以上において顕著な効果があると言えた。一方、ACNQは濃度依存的な阻害活性はみられず、DMSOと比較し、チロシナーゼ活性をほとんど阻害していないことがわかった。
チロシナーゼ阻害能を有することが知られている陽性対照のPTU、コウジ酸、アルブチンの結果について述べる。PTUについては、1μM以上の濃度において活性が急激に落ちた。そこで、0.1〜1μMの間で濃度を振りなおし、再測定したところ、この濃度範囲では濃度依存的な阻害活性がみられた。
コウジ酸は、0.1〜100μMの範囲では、陰性対象であるリン酸バッファーと有意差はなかった。DHNAと比較すると、濃度10000μMではコウジ酸の方が高い阻害活性を有するが、濃度100〜1000μMでは、DHNAの方が高いことがわかった。一方、ハイドロキノン配糖体であるアルブチンは、濃度依存的なチロシナーゼ活性の顕著な阻害活性はみられなかった。この結果から、アルブチンよりもDHNAの方が強いチロシナーゼ活性の阻害効果があると言えた。
(アッセイ方法)
B16株を1.9×105cfu/wellで12well plateに接種し、一晩で培養した。翌日に試料を含む培地(10%のFCS-EMEM)に交換し、3日間培養した。培養の終了日に、PBSで細胞を洗浄し、1N NaOH を500μL/well添加することにより細胞を溶解した。溶解した細胞液を96well plateに1サンプルにつき100μL/well×3wellずつ移し、吸光度(405nm)でメラニン量を測定した(Curto EV, Biochem. Pharmacol., 57: 663-672, 1999, Dooley TP, Skin Pharmacol., 7: 188-200, 1994, Virador VM, Anal. Biochem., 270: 207-219, 1999)。
アッセイ結果を図6に示した。DHNAやACNQ等を溶解している溶媒(DMSO)は最終濃度を0.1%に調整しているため、DMSOによるメラニンの産生阻害は見られなかった。DHNAおよびACNQはいずれも、1nMでDMSO(溶媒対象)の6割程度のメラニン量しか産生されておらず、陽性対照の100μMのアルブチンやコウジ酸およびPTUよりもメラニン生成抑制効果が強いことが示唆された。
上記のメラニンの産生抑制効果は、DHNAまたはACNQによる細胞毒性によるものであることが疑われた。そのため、同時に細胞増殖能を測定した。しかしいずれのサンプルについても、基礎培地(Medium)のみの増殖と同等あるいはそれ以上の増殖活性が認められた(データ非掲載)。そのため、DHNAおよびACNQのメラニン産生抑制効果は細胞毒性効果によるものではないことが確認された。
(考察)
DHNAおよびACNQにはメラニンの産生抑制効果が認められた。しかしチロシナーゼ活性に対する作用は両者では異なることがわかった。すなわち、DHNAはチロシナーゼ活性阻害を介する作用機序で、メラニンの産生を抑制するのに対して、ACNQはチロシナーゼ活性阻害を介する以外の作用機序でメラニンの産生を抑制することが、本実施例によって明らかとなった。
魚鱗コラーゲンペプチドを721重量部、醗酵グルコサミンを8.1重量部、アルギニンを4.1重量部、還元麦芽糖を32.9重量部、および粉末状のプロピオン酸菌培養物(DHNA:81μg/g)を200重量部として、流動層造粒機(フロイント産業社製)に入れて混合・加熱したところへ、プルランの3.0重量部を温水100重量部に溶解したプルラン水溶液を用意して、そのプルラン水溶液を造粒機内で噴霧して造粒した。その噴霧・造粒が終了した後に、水分が3%になるまで乾燥してから冷却し、14メッシュの篩を通過させ、大きな顆粒を除いた。そして、そこへHLB値が2.1のグリセリン脂肪酸エステルを20重量部、L-アスコルビン酸ナトリウムを10.9重量部で添加して、均一に混合した。その得られた混合粉体を打錠機(畑鐵工所社製)により、硬度が3kgfになるよう圧縮成型し、一粒の重量が0.25g、直径が8mmの円形状の錠剤(タブレット)を製造した。製造した錠剤を23℃で、6ヶ月の経過観察をした結果、98%(確率)以上のDHNAが残存することから、錠剤でも有効成分は安定に存在することを確認した。また、錠剤の水分がゼロの状態での配合表は、下記の通りである。
配合表1
--------------------------------------------------
成分名 配合率(%)
--------------------------------------------------
魚鱗コラーゲンペプチド 72.1
醗酵グルコサミン 0.8
アルギニン 0.4
プロピオン酸菌培養物粉末 20.0
還元麦芽糖 3.3
プルラン 0.3
L−アスコルビン酸ナトリウム 1.1
グリセリン脂肪酸エステル 2.0
--------------------------------------------------
合計 100.0
魚鱗コラーゲンペプチドを706重量部、醗酵グルコサミンを8.1重量部、アルギニンを4.1重量部、還元麦芽糖を21.9重量部、および粉末状のプロピオン酸菌培養物(DHNA:81μg/g)を200重量部として、流動層造粒機(フロイント産業社製)に入れて混合・加熱したところへ、プルラン3.0重量部、オレンジ果汁10.9重量部とカロチン色素5.0重量部を温水100重量部に溶解したプルラン溶液を用意して、そのプルラン溶液を造粒機内で噴霧し、造粒した。その噴霧・造粒が終了した後に、水分が3%になるまで乾燥してから冷却し、14メッシュの篩を通過させ、大きな顆粒を除いた。そして、そこへHLB値が2.1のグリセリン脂肪酸エステル20重量部、L-アスコルビン酸ナトリウム10.9重量部と、粉末オレンジ香料10重量部を添加して、均一に混合した。その得られた混合粉体を打錠機(畑鐵工所社製)により、硬度が10kgfになるよう圧縮成型し、一粒の重量が1.0g、直径が15mmの円形状の錠剤(タブレット)を製造した。製造した錠剤を23℃で、6ヶ月の経過観察をした結果、プロピオン酸菌培養物中の98%(確率)以上のDHNAが残存することから、錠剤でも有効成分は安定に存在することを確認した。また、錠剤の水分がゼロの状態での配合表は下記の通りである。
配合表2
--------------------------------------------------
成分名 配合率(%)
--------------------------------------------------
魚鱗コラーゲンペプチド 70.6
醗酵グルコサミン 0.8
アルギニン 0.4
プロピオン酸菌培養物粉末 20.0
還元麦芽糖 2.2
オレンジ果汁 1.1
カロチン色素 0.5
粉末オレンジ香料 1.0
プルラン 0.3
L−アスコルビン酸ナトリウム 1.1
グリセリン脂肪酸エステル 2.0
--------------------------------------------------
合計 100.0
魚鱗コラーゲンペプチドを721重量部、醗酵グルコサミンを8.1重量部、アルギニンを4.1重量部、還元麦芽糖を51.0重量部、粉末状のプロピオン酸菌培養物(DHNA:81μg/g)を200重量部、二酸化ケイ素16.0重量部を加えて、V字混合機で均一に混合した。その得られた混合粉体を打錠機(畑鐵工所社製)により、硬度が8.0kgfになるよう圧縮成型し、一粒の重量が0.25g、直径が8mmの円形状の錠剤(タブレット)を製造した。製造した錠剤を23℃で、6ヶ月の経過観察をした結果、プロピオン酸菌培養物中の98%(確率)以上のDHNAが残存することから、錠剤でも有効成分は安定に存在することを確認した。また、錠剤の水分がゼロの状態での配合表は下記の通りである。
配合表3
--------------------------------------------------
成分名 配合率(%)
--------------------------------------------------
魚鱗コラーゲンペプチド 72.1
醗酵グルコサミン 0.8
アルギニン 0.4
プロピオン酸菌培養物粉末 20.0
還元麦芽糖 5.1
二酸化ケイ素 1.6
--------------------------------------------------
合計 100.0
Claims (12)
- 以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、皮膚の色素沈着の減少用の組成物であって、DHNAまたはACNQの類似体が、1,4−ナフトキノン、2−メチル−1,4−ナフトキノン、4−アミノ−2−メチル−1−ナフトール、および2−アミノ−3−クロロ−1,4−ナフトキノンからなる群より選択される、経口摂取用の組成物;
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。 - プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)である請求項1に記載の組成物。
- 乳発酵成分を付加的に配合する、請求項1または2に記載の組成物。
- 乳発酵成分が、乳をLactobacillus属に属する乳酸菌およびStreptococcus属に属する乳酸菌のいずれか、または両方で発酵させた乳、またはその混合物である、請求項3に記載の組成物。
- Lactobacillus属に属する乳酸菌が
Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus JCM 1002T、
Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1(FERM BP-10741)、および
Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1255(NITE BP-76)
よりなる群より選択される少なくとも1 つであり、
Streptococcus 属に属する乳酸菌が、
Streptococcus thermophilus ATCC 19258、
Streptococcus thermophilus OLS3059(FERM BP-10740)、および
Streptococcus thermophilus OLS3294(NITE P-77)
よりなる群より選択される少なくとも1 つである、
請求項4に記載の組成物。 - プロピオン酸菌の培養物が殺菌されている請求項1〜請求項5のいずれかに記載の組成物。
- 乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、乳製品または発酵乳である請求項1〜請求項6のいずれかに記載の組成物。
- 抗酸化剤が組成物100gに対して1g以上添加されている、請求項1〜7のいずれかに記載の組成物。
- 錠剤(タブレット)に成型された、請求項1〜8のいずれかに記載の組成物。
- 以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、皮膚における色素形成阻害剤であって、DHNAまたはACNQの類似体が、1,4−ナフトキノン、2−メチル−1,4−ナフトキノン、4−アミノ−2−メチル−1−ナフトール、および2−アミノ−3−クロロ−1,4−ナフトキノンからなる群より選択される、経口摂取用の色素形成阻害剤;
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。 - 皮膚における色素沈着の減少用の組成物であって経口摂取用の組成物の製造における以下(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分の使用であり、DHNAまたはACNQの類似体が、1,4−ナフトキノン、2−メチル−1,4−ナフトキノン、4−アミノ−2−メチル−1−ナフトール、および2−アミノ−3−クロロ−1,4−ナフトキノンからなる群より選択される、使用
(a)プロピオン酸菌の培養物、
(b)DHNAまたはその類似体、および
(c)ACNQまたはその類似体。 - 組成物の全体に対して、前記(a)〜(c)よりなる群より選択される少なくとも1つの成分を0.001%〜20%の割合で配合する、請求項11に記載の使用。
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