KR101580678B1 - 나노형 유산균 - Google Patents

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신와 야쿠힌 가부시키가이샤
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코스모 쇼쿠힝 가부시키가이샤
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Abstract

유산균으로부터, 배양 공정 및 가공 공정에서의 배지의 pH를, 예를 들면, 5∼8 정도의 중성 영역으로 조정하여 얻어진 유산균의 균체는 입도 분포에서의 최빈값(입도)이 1.0㎛ 이하가 된다. 이러한 작은 입도를 갖는 나노형 유산균의 균체는 INF-α의 생산능이 우수함과 아울러, 물에 대한 분산성이 우수하다.
유산균, 배양, 나노형, 인터페론.

Description

나노형 유산균{NANO-SIZED LACTIC ACID BACTERIA}
본 발명은 항원 제시 세포로부터의 인터페론α 생산능을 증강하는 작용을 갖는 나노형 유산균에게 관한 것이다.
최근의 연구에서는, 나이브 T세포(이하, Th0로 약기함)는 기능적으로 I형 T세포(이하, Th1로 약기함)와 II형 T세포(이하, Th2로 약기함)로 분화하는 것이 알려져 있다.
Th1 세포에 의한 면역응답은, 세포성 면역을 유도하여, 매크로파지나 림프구 등 단핵세포 중심의 식균처리가 일어난다. 한편, Th2 세포에 의한 면역응답은, 액성 면역을 유도하여, 항체에 의한 살균처리가 일어난다. Th1형 사이토카인은 Th2를 억제하고, 반대로 Th2형 사이토카인은 Th1을 억제하며, 이 2개는 면역 전체의 밸런스를 유지하기 위하여 서로 관계하고 있다.
인터페론α(IFN-α)는 바이러스나, 결핵균, 살모넬라, 리스테리아균, 나균과 같은 세포내 기생성 세균, 크립토코코스와 같은 세포내 기생성 진균에 의한 감염시에, 수상(樹狀) 세포(항원 제시 세포)로부터 분비되는 사이토카인이다.
또, 인터루킨 12(IL-12)는, 수상 세포 및 매크로파지와 같은 항원 제시 세포로부터 분비되어지는 사이토카인에서, 암세포를 직접 공격하는 내츄럴 킬러 세 포(NK 세포)나, 라크 세포(LAK 세포), 킬러 T세포(CTL 세포)를 활성화하거나, IFN-γ의 생산을 증강하거나 하는 대단히 강력한 면역활성물질로서 알려져 있다.
이들 IFN-α 및 IL-12는，모두 Th1 세포를 유도하는 사이토카인이지만, 항원 제시 세포에 발현되고 있는 수용체(TRL: Toll-like receptor)의 차이(IL-12의 경우: TLRl, TLR3, TLR5, TLR9; IFN-α의 경우: TLR7, TLR9)가 나타난다.
그런데, 항원 제시 세포로부터의 IFN-α 생산을 증강하는 유산균 또는 그 구성물에 대해서는, 락토바실러스 브레비스균 분말(특허문헌 1: 일본 특개 평6-206826호 공보 참조), 엔테로코쿠스 속에게 속하는 유산균 또는 그 처리물(특허문헌 2: 일본 특개 평8-259450호 공보 참조), 락토바실러스 브레비스 균주 FERM BP-4693의 구성 추출물(특허문헌 3: 일본 특개 평9-188627호 공보 참조) 등이 보고되어 있다.
통상이라면, IFN-α 생산능이 높은 균주를 선택하는 것이 자연스러워, 활성이 낮은 균주를 굳이 활성이 높은 균주로 변경할 필요는 없고, 또 그것을 시도해보려고도 생각하지 않는다.
그러나, 오랫동안, 락토바실러스 브레비스균을 시장에 제공해 온 사업자에게 있어서는, 유산균의 IFN-α 생산능을 증강하는 것은 절실한 바램이다.
지금까지 유산균은 발효유 또는 요구르트의 형태로 섭취하는 것이 보통이다. 입으로부터 섭취되는 항원은 페이어판에서 M세포의 탐식에 의해 받아들여진다.
그래서, 어느 정도까지의 크기이면 페이어판으로부터 받아들여지는 것인지와 같은 관심으로, 입자의 크기(입자직경)와 페이어판으로의 받아들임 관계에 대하여 지금까지 많은 연구가 행해져 왔다.
그 결과, 입자의 크기가 10㎛를 초과하면 M세포에 의한 탐식은 현저하게 낮아지고(비특허문헌 1 참조), 페이어판을 통과하는 입자의 최대 직경은, 입자의 재질이 폴리락타이드인 경우에는 10㎛(비특허문헌 2 참조), 폴리스티렌인 경우에는 15㎛(비특허문헌 3 참조), 생분해성 폴리락트산의 경우에는 21㎛(비특허문헌 4 참조)라고 하는 것이 밝혀졌다.
이들 결과로부터, 페이어판을 통과할 수 있는 입자의 크기는 겨우 20㎛ 정도라는 것을 알 수 있다.
또, 항원을 감작시킨 생분해성 폴리락트산 비드를 래트에 경구 투여한 실험에 의하면, Th2 유도에 의해 항원 특이 항체가 생산되는 비율이 가장 높아지는 입자직경은 IgG의 경우 4㎛, IgA의 경우에는 7㎛이며, Th2 유도에 바람직한 입자직경은 3∼7㎛ 정도인 것을 알 수 있다(비특허문헌 4 참조).
그렇지만, Th1 유도에 바람직한 입자직경은 현재까지 밝혀져 있지 않다.
특허문헌 1: 일본 특개 평6-206826호 공보
특허문헌 2: 일본 특개 평8-259450호 공보
특허문헌 3: 일본 특개 평9-188627호 공보
비특허문헌 1: Tabata Y, Ikada Y. Adv Polym Sci 94: 107-141, 1990.
비특허문헌 2: Eldridge JH. et al. J Controlled Rel 11: 205-214, 1990.
비특허문헌 3: Eldridge JH. et al. Molec Immun 28: 287-294, 1991.
비특허문헌 4: Tabata Y. et al. Vaccine 14: 1677-1685, 1996.
(발명이 해결하고자 하는 과제)
본 발명은, 이러한 사정을 고려하여 이루어진 것으로, Th1 유도에 바람직한 입자직경을 갖고, IFN-α의 생산능이 우수함과 아울러, 물에 대한 분산성이 우수한 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명자들은 장수와 관계가 있는 유산균을 쿄토의 스구키즈케(순무로 시큼하게 절인 장아찌), 나가노의 슨키즈케(야채를 절인 발효식품), 그루지야 지방의 마리아미와 마츠오니-라이크, 몽골의 말젖술, 및 각종 발효 유제품으로부터 분리하여, 유산균의 크기와 항원 제시 세포로부터의 IL-12 및 IFN-α의 생산능의 관계를 해석했다.
그 결과, 도 1A에 도시되는 바와 같이, 유산균 자극에 의한 항원 제시 세포로부터의 IL-12 생산능은 유산균의 크기가 1㎛ 이하까지 작아지면 높아졌다(참고예 1 참조).
한편, IFN-α 생산능의 경우에서도, 도 1B에 도시하는 바와 같이, 유산균의 크기가 1㎛ 이하까지 작아지면 높아졌다(참고예 1 참조).
그러나, IL-12 및 IFN-α의 생산능에는 부의 관계를 나타내는 균주도 확인되었다(도 2 참조). 예를 들면, EF, KH1, KH3와 같은 균주에서는 IL-12 생산능이 높고 IFN-α 생산능이 낮고, 반대로 LL12, ML4와 같은 균주에서는 IL-12 생산능이 낮고 IFN-α 생산능이 높다.
한편, SNK는 IL-12 및 IFN-α의 생산능이 상대적으로 모두 높다고 하는 특징이 확인되었다.
이것은 선행기술(일본 특원 2007-30324호 명세서)로부터는 착상할 수 없는 지견이며, 아마, 항원 제시 세포에 발현되는 수용체의 유산균에 대한 인식의 차이에 의한다고 추찰된다.
그 결과, 락토바실러스 브레비스 균주 FERMBP-4693(표 1 및 도 1-2 중, LBR로 표시)과 같이, 입자직경이 9㎛ 근처에 있는 유산균에서는, 그것이 1㎛ 정도인 것에 비해, IFN-α 생산능이 현저하게 뒤떨어진다고 하는 것이 밝혀졌다.
그래서, 또한 본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해, 유산균체의 입도 분포에서의 최빈(最頻)값을 작게 하고, 게다가 균체끼리의 재응집을 방지하기 위한 조건을 예의 검토했다.
그 과정에서, 유산균의 표면이 정(플러스)으로 하전되어 있는 것에 착안하여, 배양 공정 및 가공 공정에서의 pH를 중성 영역으로 조정함으로써 유산균체의 입도 분포에서의 최빈값(이하, 간단히 입도라고 하는 경우도 있음)이 1.0㎛ 이하까지 작아지는 것을 발견했다.
일반적으로, 유산균이 배양시에 있어서의 여러 조건에 의해 그 형태가 변화되는 것은 알려져 있지만, 배양 공정 및 가공 공정에서의 pH를 제어함으로써 그 크기를 1.0㎛ 이하로 조정할 수 있다고 하는 지견은 당업자 사이에서는 지금까지 알려져 있지 않다.
또, 본 발명자는, 당해 균체를 가지고 항원 제시 세포로부터의 IFN-α 생산능을 현저하게 증강시킬 수 있는 것도 발견했다.
이상과 같이, 본 발명자는, 통상의 입도가 1.0㎛보다 큰 유산균에 대해서도, 중성 영역의 pH에서의 배양 및 가공처리를 통하여, 유산균체의 입도를 1.0㎛ 이하까지 조정할 수 있는 것, 및 이 유산균이 항원 제시 세포로부터의 IFN-α 생산능을 증강시켜, 면역 부활 작용을 향상할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
또한, 최근 유산균의 사균체를 농축한 건조분말을 시장에서 볼 수 있게 되었다. 이것은, 소량으로 다수량의 유산균을 섭취 가능하게 하는 것을 목적으로 하는 것이다.
그러나, 이러한 건조분말에서의 유산균 본래의 입도가 1.0㎛ 이하이었다고 해도, 농축한 균체를 건조한 것뿐인 분말로서는 이것을 물에 넣은 경우에 입자끼리 흡착·응집하여, 덩어리(괴)로 되어 버린다(참고예 2 참조).
애당초, 통상의 배양조건에서는 입도가 1.0㎛ 이하의 유산균은 존재할 가능성이 낮다(표 1 참조).
즉, 본 발명은,
1. 입도분포에서의 최빈값이 1.0㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체,
2. 유산균의 배양 공정 및 가공 공정에서의 배지의 pH를 중성 영역으로 조정하여 얻어지는 1의 나노형 유산균의 균체,
3. 상기 배지의 pH를 5∼8로 조정하여 얻어지는 2의 나노형 유산균의 균체,
4. 상기 유산균의 배양 공정에서의 배지에 포도당을 함유시키는 2 또는 3의 나노형 유산균의 균체,
5. pH를 중성 영역으로 조정한 배지와, 균을 포함하는 배양액에 분산제 또는 부형제를 첨가하여 분산한 후, 동결건조 또는 분무건조하여 얻어지는 1의 나노형 유산균의 균체,
6. 락토바실러스속 유산균인 1∼5 중 어느 하나의 나노형 유산균의 균체,
7. 상기 락토바실러스속 유산균이 락토바실러스 브레비스인 6의 나노형 유산균의 균체,
8. 상기 락토바실러스 브레비스의 균주가 FERM BP-4693인 7의 나노형 유산균의 균체,
9. 1∼8 중 어느 하나의 나노형 유산균의 균체를 함유하는 면역 부활(賦活) 작용을 갖는 조성물,
10. 1∼8 중 어느 하나의 나노형 유산균의 균체, 또는 9의 조성물을 함유하는 음식물, 사료, 화장품 또는 의약품,
11. 유산균의 배양 공정 및 가공 공정에서의 배지의 pH를 중성 영역으로 조정하는 것을 특징으로 하는 1의 나노형 유산균의 균체의 제조방법,
12. 상기 배지의 pH를 5∼8로 조정하는 11의 나노형 유산균의 균체의 제조방법,
13. pH를 중성 영역으로 조정한 배지와, 균을 포함하는 배양액에 분산제 또는 부형제를 첨가하여 분산한 후, 동결건조 또는 분무건조하는 11의 나노형 유산균의 균체의 제조방법을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 통상의 입도가 1㎛ 보다 큰 유산균에 대해서도, 중성 영역의 pH에서의 배양 및 가공처리를 통하여, 유산균체의 입도를 1.0㎛ 이하까지 조정할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 나노형 유산균의 균체는, 항원 제시 세포로부터의 IFN-α 생산능을 증강시켜, 면역 부활 작용을 향상할 수 있기 때문에, 대단히 유용한 균체라고 할 수 있다.
도 1은 유산균의 균체 입도와 IL-12 및 IFN-α 생산능의 관계를 나타낸 도면이다.
도 2는 유산균 자극에 의한 IL-12 및 IFN-α 생산능의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 3은 균체 입도를 비교한 도면이다.
도 4는 유산균 분말의 입경 분포(A: 빈도%, B: 적산%)를 나타낸 도면이다.
도 5는 나노형 유산균 라브레의 균체 입도와 IFN-α 생산능을 나타낸 도면이다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세하게 설명한다.
본 발명에 따른 나노형 유산균의 균체는 입도 분포에서의 최빈값(입도)이 1.0㎛ 이하인 것이다.
본 발명에서, 「입도 분포에서의 최빈값」은 균의 크기를 나타내는 지표가 되는 값으로, 균체의 입자직경을 측정했을 때의 입도 분포에서의 상대빈도가 최대가 되는 입자직경을 말한다.
본 발명의 「나노형 유산균의 균체」의 원료가 되는 유산균의 구체적인 예로서는, 락토바실러스 액시드필러스(Lactobacillus acidphilus), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 마리(L. mali), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum), 락토바실러스 부히네리(L. buchneri), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 갈리나럼(L. gallinarum), 락토바실러스 아밀로보러스(L. amylovorus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 케피어(L. kefir), 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 크리스파터스(L. crispatus) 등의 락토바실러스속 세균, 스트렙토코쿠스 서모필러스(Streptcoccus thermophilus) 등의 스트렙토코쿠스속 세균, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 등의 락토코쿠스속 세균, 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패시움(E. faecium) 등의 엔테로코쿠스속 세균, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 론검(B. longum), 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 브레베(B.breve), 비피도박테리움 카테눌라텀(B. catenulatum) 등의 비피도박테리움속 세균 등을 들 수 있다.
본 발명의 나노형 유산균의 균체의 형태는 생균이어도 사균이어도 되지만, 생균의 경우, 제품 제조 이후의 배송시나 진열시에 형태변화를 일으킬 가능성이 있기 때문에, 그 이상형태 변화를 일으키지 않는 사균이 바람직하다.
유산균은 배양시의 생육 환경이 열악해지면, 그 스트레스로 형태가 변화되는 것이 알려져 있다.
그래서 본 발명에서는, 배양 및 가공조건을 제어함으로써 유산균의 형태가 일정하게 되도록 유지하면서 유산균을 증식시켜, 상기한 입도 분포에서의 최빈값을 갖는 나노형 유산균을 제조한다.
구체적으로는, 앞에 기술한 바와 같이, 유산균의 표면이 정(양, 플러스)으로 하전되어 있는 것에 착안하여, 배양 공정 및 가공 공정에서의 pH를 중성 영역으로 조정하여 막을 안정화함으로써, 분열균이 접합한 상태인 쌍균 상태 및 균끼리의 재흡착을 방지하는 것이다.
여기에서, 「pH를 중성 영역으로 조정」하는 방법으로서는, 락트산 등의 산이나 수산화나트륨 등의 알칼리로의 중화를 들 수 있다.
또한, 본 발명에서의 「배양 공정 및 가공 공정에서의 배지의 pH를 중성 영역으로 조정」한다는 것은, 배양 공정의 pH를 중성 영역으로 조정해 두는 것뿐만 아니라, 배양 종료 후의 균체 멸균, 세정, 농축과 같은 공정(가공 공정)에서의 pH도 중성 영역으로 조정하는 것을 의미하고 있다.
배양 공정 및 가공 공정에서의 pH는 5∼8이 바람직하고, 5.5∼7.5가 보다 바람직하다.
또, 배지의 영양조성에서의 에너지원으로서는 에너지 이용성이 가장 높은 포도당이 바람직하고, 그 첨가량은 배지 중에 5∼10질량% 정도로 하는 것이 바람직하다.
또한, 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 함으로써, 영양 고갈로부터 오는 스트레스에 의한 균 형태의 변화를 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 「나노형 유산균의 균체」는 분산 처리된 것이 바람직하다.
분산 처리의 수법으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 균의 배양액을 습식으로 150kgf/cm2(1.5MPa) 정도의 고압 호모지나이저로 분산하는 방법을 들 수 있다.
이 경우, 미리 공지의 분산제 또는 부형제를 배양액에 첨가해 두는 것이 바람직하며, 이것에 의해, 균체의 재응집을 효율적으로 방지할 수 있다.
사용하는 분산제 및 부형제의 첨가량은 균체의 성상에 따라 변화되지만, 질량 환산으로 균체에 대하여 1∼100배량이 바람직하고, 2∼20배량이 보다 바람직하다.
적합한 분산제 및 부형제로서는 트레할로스, 덱스트린, 스킴 밀크 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 「나노형 유산균의 균체」를 최종적으로 분말로서 얻는 경우에는, 공지의 분산제·부형제 등으로 균체가 재응집하지 않는 것과 같은 처리를 시행하고 나서, 동결건조나 분무건조 하는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 물에 대한 분산성이 우수한 균체 분말을 얻을 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 나노형 유산균의 균체는, 입도가 1.0㎛ 이하의 나노미터(nm) 사이즈로까지 미세화된 것이다.
또, 이 균체는 상기 수법에 의해 건조분말로 하고, 당해 분말을 생리적 소화액에 재현탁한 경우의 균체 입도가 역시 1.0㎛ 이하를 유지한다. 생리적 소화액이란 공지의 방법으로 조제된 인공 위액 혹은 장액을 의미한다.
본 발명의 나노형 유산균의 균체는, 그대로 제품으로 할 수도 있지만, 일반적으로는, 풍미를 높이거나, 필요한 형상으로 하는 등을 위해 여러 성분을 첨가, 배합하거나, 플레이버를 더 첨가하거나 하여 최종제품으로 된다.
이 첨가, 혼합되는 성분으로서는 각종 당질이나 유화제, 감미료, 산미료, 과즙 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 벌꿀 등의 당류; 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락티톨, 파라티니트 등의 당 알코올; 수크로스 지방산 에스테르, 글리세린당 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제 등을 들 수 있다. 그 밖에도, 비타민 A, 비타민 B류, 비타민 C, 비타민 E 등의 각종 비타민류나 허브 엑스, 곡물 성분, 야채 성분, 젖 성분 등을 배합해도, 우수한 풍미의 Th1 유도제를 얻을 수 있다.
또, 플레이버로서는 요구르트계, 베리계, 오렌지계, 모과계, 자소계, 시트러스계, 애플계, 민트계, 그레이프계, 페어, 카스타드 크림, 피치, 멜론, 바나나, 트로피컬, 허브계, 홍차, 커피계 등의 플레이버를 들 수 있고, 이것들을 1종 또는 2 종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 플레이버의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 풍미면에서 균체 내에 0.05∼0.5질량%, 특히 0.1∼0.3질량% 정도가 바람직하다.
이상에서 설명한 본 발명의 나노형 유산균의 균체는 고형상, 액상 등 어느 형태의 제품으로 할 수도 있다. 구체적으로는, 의약적으로 수용한 염, 부형제, 보존제, 착색제, 교미제 등과 함께, 의약품 또는 식품의 제조분야에서의 공지의 방법에 의해, 음료, 과립, 정제, 캡슐제 등의 여러 형태로서 제품화 할 수 있다.
또, 본 발명의 나노형 유산균의 균체는 건강식품에 이용할 수 있다. 건강식품이란 통상의 식품보다도 적극적인 의미로, 보건, 건강유지·증진 등을 목적으로 한 식품을 의미한다. 그 형태는 액체, 반고형, 고형의 어떤 것이어도 되고, 구체적으로는, 쿠키, 전병, 젤리, 양갱, 요구르트, 과자빵 등의 과자류; 청량음료, 영양음료, 스프 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 나노형 유산균의 균체는 로션(화장수), 화장용 크림류, 유액, 화장수, 팩제, 스킨 밀크(유제), 젤제, 파우더, 립 크림, 립스틱, 언더 메이크업, 파운데이션, 썬 케어, 목욕용제, 보디 샴푸, 보디 린스, 비누, 클렌징 폼, 연고, 첩부제, 젤리제, 에어로졸제 등 여러 제품 형태로 피부 외용제에 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 나노형 유산균의 균체에는, 하기에 예시되는 것과 같은 화장품, 의약부외품, 의약품에서 통상 사용되는 각종 성분이나, 첨가제를 필요에 따라 적당하게 배합할 수 있다.
즉, 글리세린, 바셀린, 요소, 히알루론산, 헤파린 등의 보습제; PABA 유도 체(파라아미노벤조산, 에스칼롤 507(아이에스비·재팬(주)) 등), 신남산 유도체(네오헬리오판, 파르솔 MCX(DSM 뉴트리션 재팬(주), 썬가드 B((주)시세이도) 등), 살리실산 유도체(옥틸살리실레이트 등), 벤조페논 유도체(ASL-24, ASL-24S((유)쇼난케미칼 서비스) 등), 디벤조일메탄 유도체(파르솔 A, 파르솔 DAM(DSM 뉴트리션 재팬(주) 등), 복소환 유도체(티누빈계 등), 산화티탄 등의 자외선흡수제·산란제; 에데트산 2나트륨, 에데트산 3나트륨, 시트르산, 시트르산 나트륨, 타르타르산, 타르타르산 나트륨, 락트산, 말산, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 봉쇄제; 살리실산, 유황, 카페인, 탄닌 등의 피지 억제제; 염화벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로로헥시딘 등의 살균·소독제; 염산디펜히드라민, 트라넥삼산, 구아이아줄렌, 아줄렌, 알란토인, 히노키티올, 글리시리즈산 및 그 염, 글리시리즈산 유도체, 글리실레틴산 등의 항염증제; 비타민 A, 비타민 B군(B1, B2, B6, B12, B15), 폴산, 니코틴산류, 판토텐산류, 비오틴, 비타민 C, 비타민 D군(D2, D3), 비타민 E, 유비퀴논류, 비타민 K(K1, K2, K3, K4) 등의 비타민류; 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌, 리신, 글리신, 글루타민, 세린, 시스테인, 시스틴, 티로신, 프롤린, 아르기닌, 피롤리돈카르복실산 등의 아미노산 및 그 유도체; 레티놀, 아세트산 토코페롤, 아스코르브산 인산 마그네슘, 아스코르브산 글루코시드, 알부틴, 코지산, 엘라그산, 태반 추출액 등의 미백제; 부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 갈산 프로필 등의 항산화제; 염화아연, 황산아연, 석탄산아연, 산화아연, 황산알루미늄칼륨 등의 수렴제; 글루코스, 프룩토스, 말토스, 수크로스, 트레할로스, 에리트리톨, 만니톨, 크실리톨, 락티톨 등의 당류; 감초, 카밀레, 마로니에, 범의 귀, 작약, 모과나무, 황금, 황벽나무, 황련, 삼백초, 은행잎 등의 각종 식물 엑스 등 이외에, 유성 성분, 계면활성제, 증점제, 알코올류, 분말성분, 색소 등을 적당하게 배합할 수 있다.
이하, 참고예 및 실시예를 들어, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 유산균의 입자직경은 입도분포 측정장치((주)시마즈 세사쿠쇼, SALD-3100)로 측정했다. 또, 매크로파지로부터 유산균 자극에 의해 생산되는 IL-12 및 IFN-α는 시판되고 있는 ELISA 키트로 측정했다.
[참고예 1]
[사균체의 조제]
표 1에 표시되는 바와 같이, 장수와 관계가 있는 유산균을, 쿄토의 스구키즈케, 나가노의 슨키즈케, 그루지야 지방의 마리아미와 마츠오니-라이크, 몽골의 말젖술, 및 각종 발효유 제품으로부터 분리하고, MRS 배지를 사용하여 배양시의 pH를 조정하지 않고 36.5℃에서 48시간 배양했다. 배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분간 가열 멸균 처리하고, 균체를 PBS로 세정하고, 균체 농도로 10mg/ml이 되도록 조제했다.
또한, 표 중의 LBR이란 락토바실러스 브레비스 균주 FERM BP-4693을 의미한다.
[균체 입도와 IL-l2 및 IFN-α 생산능과의 관계]
유산균의 균체 입도와 IL-12 및 IFN-α 생산능의 관계를 도 1A 및 도 1B에 각각 나타낸다.
유산균의 크기(입자직경)가 1㎛ 정도로까지 작아진 쪽이, IL-12 및 IFN-α 모두 사이토카인도 현저하게 생산능이 증강되는 것이 밝혀졌다(표 1과 도 1 참조).
단, 도 2에 나타내어지는 바와 같이, IL-12 및 IFN-α의 생산능에는 부의 상관관계를 나타내는 균주가 확인되었고, 예를 들면, EF, KH1, KH3와 같은 균주에서는 IL-12 생산능이 높고 IFN-α 생산능이 낮으며, 반대로 LL12, ML4와 같은 균주에서는 IL-12 생산능이 낮고 IFN-α 생산능이 높으며, 한편으로 SNK는 IL-12 및 IFN-α의 생산능이 상대적으로 모두 높다고 하는 특징이 확인되었다.
Figure 112009047690313-pct00001
[실시예 1]
[나노형 유산균 EF의 조제]
유산균 엔테로코쿠스 페칼리스 균주 EF를, 5질량% 포도당 첨가의 공지의 영양 배지에서, 20질량% 수산화나트륨 수용액으로 배양시에 있어서의 pH를 6.5로 조정하면서 36.5℃에서 배양하고, 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 했다(배양 공정).
배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분간 가열 멸균 처리한 후, 균체를 PBS로 세정하고, 균체 농도로 10mg/ml가 되도록 조정했다(가공 공정). 또한, 가공 공정시의 pH는 6.5로 유지했다.
[균체 입도의 비교]
참고예 1 및 실시예 1에서 조제한 유산균 EF의 균체 입도를 측정했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타내어지는 바와 같이, 비중화 배양에 의한 균체 입도가 1.215로 1㎛보다 컸던 것에 반해, 중화 배양에 의한 균체 입도는 0.701로 1.0㎛ 이하로 되어 있는 것을 알 수 있다.
[참고예 2]
[사균 건조분말의 조제]
유산균 본래의 크기가 0.6㎛(도 4A)이고, 선택적으로 사이토카인을 유도할 수 있는 2㎛ 이하의 입자의 적산 분포가 99%(도 4B)의 유산균 엔테로코쿠스 페칼리스 균주 EF를 실시예 1의 방법으로 배양하고, 그 배양액으로부터 균체를 농축하고, 부형제를 첨가하지 않고 분무건조하여 분말로 했다.
[균체 입도의 비교]
상기에서 조제한 분말을 다시 물에 분산시켰다. 그 결과, 도 4A에 나타내어지는 바와 같이, 입자직경이 100㎛까지 완만한 입도 분포를 나타냈다. 그 내역은 도 4B의 적산 분포에 나타내어지는 바와 같이, 페이어판을 통과하는 20㎛까지의 입자는 약 50%, Th2 세포를 유도하는 3∼7㎛의 입자는 약 14%, 또한 Th1 세포를 유도하는 2㎛ 이하의 입자는 겨우 1%에 불과했다. 이것으로는 Th1/Th2 응답을 모두 유도하는 입자가 혼재하게 되어, 생리적으로는 결코 바람직한 상황이라고는 할 수 없다.
또한 생체 내에서의 소화작용을 상정하고, 이것을 공지의 방법으로 조제된 인공 위액 또는 장액으로 처리한 경우에도, Th1 세포를 유도하는 2㎛ 이하의 입자의 적산 분포는 겨우 10%까지 밖에 올라가지 않았다(도 4).
이것으로는 모처럼의 유산균 본래의 기능도 충분히 발휘되지 않는(겨우 10% 정도)다고 하는 결과를 초래하는 것이 염려된다.
[실시예 2]
[나노형 유산균 락토바실러스 브레비스의 조제]
유산균 락토바실러스 브레비스 균주 FERM BP-4693을, 5질량% 포도당 첨가의 공지의 영양 배지에서, 20질량% 수산화나트륨 수용액으로 배양시에 있어서의 pH를 6.5로 조정하면서 36.5℃로 배양하고, 글루코스 소비가 완료한 시점을 배양 종점으로 했다(배양 공정).
배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분간 가열 멸균 처리하고, 균체를 PBS에서 세정하고, 균체에 대하여 중량 환산으로 4배량의 덱스트린을 부형제로서 첨가하고, 믹서로 분산하고나서 동결건조하여 시료를 조제하고, 이것을 다시 균체 농도로 10mg/ml이 되도록 PBS에 현탁했다(가공 공정). 또한, 가공공정시의 pH는 6.5로 유지했다.
[균체 입도 및 IFN-α 생산능의 비교]
참고예 1 및 실시예 2에서 조제한 락토바실러스 브레비스 균주 FERM BP-4693의 균체 입도 및 IFN-α 생산능을 측정했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타내어지는 바와 같이, 비중화 배양의 경우(LBR로 표시)는 균체 입도가 8.8㎛, IFN-α 생산능이 16.8pg/ml이었던 것에 반해, 중화 배양의 경우(NANO-LBR로 표시)는 균체 입도가 0.7㎛와 1.0㎛ 이하로 되고, 그리고 IFN-α 생산능은 92.9pg/ml로 비중화 배양의 경우에 비해 5.5배로 증강되어 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 배양 및 가공공정에서의 pH를 중성 영역으로 조정함으로써, 균체 입도를 1.0㎛ 이하로까지 미세화할 수 있고, 또한 균체에 질량환산으로 4배량 정도의 부형제를 첨가하고나서 분산 처리를 시행하고, 동결건조함으로써 분산성이 우수한 균체 분말을 얻을 수 있고, 이 분체를 가지고 매크로파지로부터 효율적으로 인터페론α를 생산시킬 수 있는 것이 확인되었다.

Claims (13)

  1. 입도 분포에서의 최빈값이 1.0㎛ 이하인 나노형 유산균의 균체의 제조방법으로서,
    상기 유산균은 락토바실러스속 유산균이고,
    비중화 배양에서의 균체 입도가 1㎛ 보다 큰 유산균을 배양하는 배양 공정과 얻어진 유산균을 가공하는 가공 공정을 구비하고,
    유산균의 배양 공정 및 가공 공정에서의 배지의 pH를 중성 영역으로 조정하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배지의 pH를 5∼8로 조정하는 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 배양 공정에서의 배지가 에너지원으로서 포도당을 함유하고, 상기 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 하는 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, pH를 중성 영역으로 조정한 배지와, 유산균을 포함하는 배양액에 분산제 또는 부형제를 첨가하여 분산한 후, 동결건조 또는 분무건조하는 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스속 유산균이 락토바실러스 브레비스인 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스의 균주가 FERM BP-4693인 것을 특징으로 하는 나노형 유산균의 균체의 제조방법.
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