WO2009107380A1 - 抗アレルギー剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an antiallergic agent.
- Propionibacterium, Lactococcus lactic acid bacteria and Leuconostoc lactic acid bacteria have been conventionally used for the production of food and drink, and 1,4-dihydroxy is contained in these cultures. It has been reported that -2-naphthoic acid (DHNA) is contained (Patent Document 3, Non-Patent Document 1). JP 2000-139406 A JP 2002-154976 A International Publication No. 2003/016544 K. Fruichi et al., Applied and Environmental Microbiology, May 2007, p.3137-3143.
- DHNA -2-naphthoic acid
- An object of the present invention is to provide a highly safe antiallergic agent.
- the present invention is a fermented product of natural microorganisms conventionally used for food production, it is useful as a highly safe antiallergic agent. Moreover, since the microorganism is used, the fermented product can be produced in large quantities.
- Test meal A Acidic beverage (placebo)
- Test food B Propionic acid bacteria whey fermented acidic beverage (active 1)
- C Propionic acid bacteria whey fermented yogurt drink (active 2) (AU) (expressed as mean ⁇ standard deviation.
- * P ⁇ 0.05 paired t-test
- #P ⁇ 0.05 multiple comparison test between 3 groups by Tukey-Kramer method).
- Test meal A Acidic drink (placebo)
- Test meal B Propionic acid bacteria whey fermented acid-containing beverage (active 1)
- C Propionic acid bacteria whey fermented yogurt drink (active 2)
- the propionic acid bacteria used in the present invention include the genus Propionibacterium, the genus Propionicimonas, the genus Propioniferax, the genus Propionimicrobium, and the Propionivibrio. ) And the like, and is not particularly limited, but bacteria belonging to the genus Propionibacterium are preferred.
- the genus Propionibacterium include, for example, Propionibacterium fluedenreich (P. freudenheimii or Propionibacterium freudenreichii), Propionibacterium toeni (P. thoenii or Propionibacterium thoenii), Propionibacterium thoenii Propionic acid bacteria for cheese such as P.
- Endo-type proteases include, for example, chymosin (from EC 3.4.23.4, Maxiren, modified yeast Kluyveromyces lactis, GIST-BROCADES NV), AlcalaseR (from Bacillus licheniformis, Novo), esperase (from B. lentus, Novo), NeutraseR (B. subtilis origin, Novo), Protamex (bacterial origin, Novo), PTN6.0S (porcine pancreatic trypsin, Novo), etc., for example, flavorzyme ( Aspergillus oryzae, Novo).
- Other endo-type proteases include, for example, trypsin (CAS No.
- protease N “Amano” G derived from Bacillus subtilis; Amano Enzyme
- biolase derived from Bacillus subtilis; Nagase Sangyo
- papain W-40 Amano Enzyme
- exo-type protease include pancreatic carboxypeptidase, small intestinal brush border aminopeptidase, and the like.
- protease / peptidase complex enzyme for example, protease A “Amano” G (derived from Aspergillus oryzae; Amano Enzyme), equine enzyme G (peptidase and protease, derived from Aspergillus oryzae; Amano Enzyme) can be used.
- the origin of the enzyme is not limited to the above description, and it may be derived from any of animals, plants, and microorganisms, but those derived from Aspergillus oryzae are preferred. These enzymes do not mean a limited product name, origin, or manufacturer. In the practice of the present invention, the enzymes may be used alone or in combination of two or more.
- Suitable examples include protease A “Amano” G (derived from Aspergillus oryzae; Amano enzyme), but are not limited to this example. Moreover, when using combining the above-mentioned enzyme, each enzyme reaction may be simultaneous or may be performed separately.
- the amount of the enzyme used may be an amount capable of degrading the protein in the dairy product, but is preferably 0.01 to 10 parts by mass, more preferably 0.1 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the dairy product. preferable.
- a proteolytic enzyme is added to the dairy product, and the protein is decomposed by heating treatment.
- the pH at the start of enzymatic degradation, the enzymatic degradation time, and the enzymatic reaction temperature are not particularly limited as long as the product of the present invention can be obtained.
- the heating temperature may be any temperature at which the proteolytic enzyme is activated, and is preferably 20 to 60 ° C, more preferably 40 to 60 ° C, and further preferably 40 to 50 ° C.
- the heating time is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 hours, and more preferably 3 to 8 hours.
- the pH (25 ° C.) at this time is not particularly limited, but is preferably 2 to 8, and more preferably 5 to 8.
- Buffers for adjusting the pH include organic acid salts such as carbonic acid, acetic acid, citric acid, fumaric acid, malic acid, lactic acid, gluconic acid and tartaric acid, inorganic salts such as phosphoric acid, hydrochloric acid and sulfuric acid, sodium hydroxide, etc.
- a hydroxide, ammonia, aqueous ammonia, etc. are mentioned, These may be used alone or in combination of two or more.
- whey powder (10 w / w%) and protease Amano A “Amano” G (0.07 w / w%, Amano Enzyme) were dissolved in water and enzymatically degraded at 47 ° C. (pH 6.6) for 2 hours.
- the enzyme can be deactivated by heating at 85 ° C. for 10 minutes to obtain a proteolytic enzyme degradation product of the dairy product, but is not limited to this example.
- the acid-bacteria fermented product is hereinafter referred to as propionic acid bacterium milk protein fermented product.
- a propionic acid bacteria fermented product using whey, WPC or WPI-derived whey-derived nutrients as a nutrient source is hereinafter referred to as a propionic acid bacterial whey fermented product.
- an aerobic or anaerobic culture method using a liquid medium is preferable from the viewpoint of mass production.
- the number of propionic acid bacteria is increased in advance in the preculture under anaerobic conditions, and then the main culture is performed under anaerobic or aerobic conditions. It is preferable. It is more preferable to use an anaerobic culture method because propionic acid bacteria are anaerobic, and it is more preferable to use an aerobic culture method after using the anaerobic culture method.
- the culture temperature during culture in the anaerobic culture method is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C.
- the medium pH at this time is preferably adjusted to neutral to slightly acidic, specifically 5.0 to 8.0, more preferably 6.0 to 7.0, still more preferably 6.2 to 6.8.
- the culture period is preferably 1 to 12 days, more preferably 5 to 12 days.
- the culture temperature during the culture in the aerobic culture method is preferably 20 to 40 ° C., more preferably 30 to 40 ° C.
- the medium pH at this time is preferably adjusted to neutral to slightly acidic, specifically 5.0 to 8.0, more preferably 6.0 to 7.0, still more preferably 6.2 to 6.8.
- the culture period is preferably 1 to 10 days, more preferably 3 to 7 days.
- the salt examples include alkali metal salts such as sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium; ammonia salts and the like.
- the content of the antioxidant is preferably 0.001 to 10% by mass, more preferably 0.01 to 5% by mass, and particularly preferably 0.04 to 3% by mass in the propionic acid bacteria fermented product.
- the propionic acid bacteria in the fermented product may be live bacteria, dead sterilized, or pulverized products thereof.
- 1 to 9 ⁇ 10 10 cfu of propionic acid bacteria are preferably contained in 1 mL of the fermented product, and more preferably 2 to 6 ⁇ 10 10 cfu are contained.
- 1 mL of the fermented product preferably contains 50 to 500 mg of propionic acid bacteria in terms of dry mass, and more preferably contains 100 to 300 mg.
- aerobic culture following the above-mentioned anaerobic culture.
- aerobic culture is performed for 110 to 130 hours by aeration similarly in place of nitrogen gas instead of oxygen gas.
- Propionic acid bacteria can be cultured in this way to obtain a culture solution of propionic acid bacteria, and an antioxidant can be further added to the culture medium, which can be used as a fermentation product of propionic acid bacteria.
- the propionic acid bacteria fermented product which is an active ingredient of the present invention can also be produced according to a known production method described in International Publication No. 03/016544 pamphlet or the like.
- the “propionic acid bacteria fermented product” includes a culture itself obtained by fermentation with propionic acid bacteria, a product obtained by adding an antioxidant to the culture, and a processed product thereof such as a cultured product.
- a culture filtrate or culture supernatant obtained by filtration or sterilization, a concentrate obtained by concentrating the culture filtrate or the like with an evaporator, a paste, a diluted product, or a (freeze) dried product are included.
- the propionic acid bacteria fermented product of the present invention can reduce allergic symptoms and the like caused by mites and chemical substances as shown in Test Example 1 below, and therefore suppresses rhinitis, conjunctivitis, bronchial asthma or atopic dermatitis Can be used as an antiallergic agent.
- Atopic dermatitis refers to inflammation of the skin mediated by immunity, which is a surface inflammation of the skin with chronic itching. There are two types of atopic dermatitis: IgE-mediated type (exogenous type) and IgE-free type (endogenous type).
- atopic dermatitis include food (milk, eggs, wheat, peanuts, fish, etc.), air allergens (ticks, mold, dandruff, etc.).
- food milk, eggs, wheat, peanuts, fish, etc.
- air allergens ticks, mold, dandruff, etc.
- genetic factors are also suggested for the onset of atopic dermatitis (General supervision by Fukushima Masanori, Merck Manual 18th Japanese edition, Nikkei BP, pp. 999 (2006)).
- the fermented propionic acid bacterium of the present invention increases the stratum corneum moisture content and skin texture score, so that it improves the dry skin condition, that is, as a rough skin prevention / improving agent. Is also useful.
- the rough skin prevention / amelioration agent is used for the treatment of atopic dermatitis. Since it is useful, it can also be used as an antiallergic agent.
- “rough skin” means that the amount of water in the stratum corneum decreases and the skin surface is dried, and the skin texture becomes rough.
- the propionic acid bacteria fermented material of this invention can be used also as various preparations, it can also be used in order to manufacture an antiallergic agent, a rough skin prevention and improvement agent, etc.
- the antiallergic agent and the like can be used in any form of food and drink or medicine.
- a medicine or by direct oral intake as a special food such as food for specified health use, nutritional functional food or supplement, or various foods (milk, fermented milk, yogurt, cheese, bread, biscuits , Crackers, pizza crusts, formula milk, liquid foods, foods for the sick, nutritional foods, frozen foods, processed foods and other commercially available foods) and can be used by ingesting them.
- Water, protein, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, fruit juices, flavors, and the like can be used as a main ingredient in foods containing the propionic acid bacteria fermented product of the present invention.
- the protein include whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, whey powder, whey protein, whey protein concentrate, whey protein isolate, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactoglobulin , ⁇ -lactalbumin, lactoferrin, soy protein, egg protein, meat protein and other animal and vegetable proteins, and their degradation products; butter, whey minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phospholipid, lactose, etc.
- various milk-derived components may contain peptides and amino acids such as casein phosphopeptide, arginine and lysine.
- saccharide include saccharides, processed starch (in addition to text phosphorus, soluble starch, British starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like.
- lipid include animal oils such as lard, fish oil, etc., fractionated oils, hydrogenated oil, transesterified oil, etc .; palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated oils thereof, Examples include vegetable oils such as hydrogenated oils and transesterified oils.
- vitamins include vitamin A, carotene, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline.
- minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, and selenium.
- organic acid include malic acid, citric acid, lactic acid, tartaric acid, erythorbic acid, and the like. These components can be used in combination of two or more, and synthetic products and / or foods containing a large amount thereof may be used.
- the form of food may be solid or liquid. It may be in the form of a gel.
- the fermented propionic acid bacterium of the present invention when used as a medicine, it can be administered in various forms.
- oral administration by tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc. can be mentioned, but they are processed into preparations such as injections and liquids and administered in other administration forms such as tube, enteral, etc. May be.
- auxiliary agents such as excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, flavoring / flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents, etc. It can be formulated using an agent. Further, an appropriate amount of vitamins, minerals, organic acids, sugars, amino acids, peptides, etc. may be added.
- the fermented propionic acid bacterium is preferably ingested in an amount of 10 to 500 mg per kg of human body weight per day in terms of dry mass, and more preferably 50 to 200 mg. In terms of the number of cells, it is preferable to take 10 8 to 10 12 cfu per day per kg of human body weight, more preferably 10 9 to 10 11 cfu. Moreover, you may use together with the pharmaceutical and foodstuff which have a conventionally known antiallergic action and rough skin prevention and improvement action.
- DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
- biotin-anti-IgE antibody for secondary antibody (Pharmingen) was added at 0.5 ⁇ g / mL and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
- streptavidin-HRP (Pharmingen) was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
- TMB + Substrate Chromogen (DAKO) was added to start the color reaction. After the color development reaction, 1N sulfuric acid was added, the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader, and the IgE concentration in the serum was calculated.
- FIG. 1 shows the transition of the skin inflammation score. Scoring: 0 (no symptoms), 1 (mild), 5 items of 1) dry skin / scab formation, 2) redness / bleeding, 3) tissue loss / abrasion, 4) edema, 5) pruritus behavior, Evaluation was made in 4 grades, 2 (medium) and 3 (severe), and the total of each score in each mouse was calculated. As a result, it was found that the symptom score was significantly lower in the propionic acid bacteria fermented product administration group than in the distilled water administration group (FIG. 1).
- An anti-DNP-IgE antibody solution (25 ng / site, manufactured by ICN) was intradermally administered to the PCA reaction inducing site, and physiological saline was intradermally administered to the PCA reaction non-inducing site.
- Various samples used in each group were the same as those in Test Example 1. 24 hours after administration of IgE antibody or physiological saline, DNP-bound BSA (DNP-BSA: 2,4-dinitrophenylated Bovine Serum Albumin) (1 mg / rat, manufactured by LSL) was used for each group.
- Intravenous administration with Evans Blue (5 mg / rat, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) induced a PCA reaction.
- Production Example 2 Method for Producing Propionic Acid Whey Fermented Product 1.
- Test Example 3 Clinical trial for humans with dry skin (1) Outline of the test A double blind placebo control study was performed on subjects 20-39 years old with dry skin. Prior to the start of the test, the subjects were divided into 3 groups so that there was no bias based on the skin findings (dry, scales, papules, face blisters, pustules) observed by the doctor. This test was conducted in compliance with the Declaration of Helsinki (modified at the 2000 Edinburgh General Assembly) and with ethical considerations. ⁇ Test meal> The following three types (test meals A to C) were provided. The propionic acid bacteria whey fermentation product obtained in Production Example 2 was used.
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Abstract
Description
例えば、柿の葉エキスでは、受け身皮膚アナフィラキシー(PCA)反応とアトピー性皮膚炎モデルでの有効性が確認されている(特許文献1)。また微生物でもこのような有効性が確認された例はあるが、この微生物は遺伝子組換え大腸菌であり、十分に安全性を検証する必要がある(特許文献2)。更に、アレルギー症状を軽減できる食品や安全性の高い天然微生物等の検索が望まれる。
また、本発明は、プロピオン酸菌発酵物の、抗アレルギー剤の製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、プロピオン酸菌発酵物を有効量投与又は摂取するアレルギー症状の予防・改善方法を提供するものである。
また、上記タンパク質分解酵素は、市販品のものを用いればよいが、プロテアーゼが好ましく、このうち中性プロテアーゼが好ましく、当該タンパク質分解酵素にはプロテアーゼの他にペプチダーゼを含んでいてもよい。使用するプロテアーゼまたはペプチダーゼは特に限定されないが、例えば、食品グレードプロテアーゼは、エンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼ、エキソ型ペプチダーゼ/エンド型プロテアーゼ複合酵素、プロテアーゼ/ペプチダーゼ複合酵素を含む。エンド型プロテアーゼは、例えば、キモシン(EC 3.4.23.4、Maxiren、modified yeast Kluyveromyces lactis由来、GIST-BROCADES N.V.)、AlcalaseR(Bacillus licheniformis由来、ノボ社)、エスペラーゼ(B. lentus由来、ノボ社)、NeutraseR(B. subtilis由来、ノボ社)、プロタメックス(バクテリア由来、ノボ社)、PTN6.0S(ブタ膵臓トリプシン、ノボ社)など、エキソ型ペプチダーゼ/エンド型プロテアーゼ複合酵素としては、例えばフレーバーザイム(Aspergillus oryzae由来、ノボ社)などが挙げられる。他に、エンド型プロテアーゼとして、例えば、トリプシン(CAS No.9002-07-7、EC 3.4.21.4、ウシ膵臓由来、Product No.T8802、SIGMA)、ペプシン(CAS No.9001-75-6、EC 3.4.4.1、ブタ胃粘膜由来、SIGMA)、キモトリプシン(ノボ社、ベーリンガー社)、プロテアーゼN「アマノ」G(Bacillus subtilis由来;天野エンザイム)、ビオプラーゼ(Bacillus subtilis由来;ナガセ産業)、パパインW-40(天野エンザイム)、エキソ型プロテアーゼとして、膵カルボキシペプチダーゼ、小腸刷子縁のアミノペプチダーゼなどが挙げられる。また、プロテアーゼ/ペプチダーゼ複合酵素としては、例えばプロテアーゼA「アマノ」G(Aspergillus oryzae由来;天野エンザイム)、ウマミザイムG(ペプチダーゼ及びプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来;天野エンザイム)を用いることができる。酵素の由来は上記の記載に限定されず、動物、植物、微生物のいずれに由来するものであってもよいが、Aspergillus oryzae由来のものが好適である。これらの酵素は商品名・由来・製造元など限定的なものを意味しない。本発明の実施において、酵素は1種もしくは2種以上を組み合わせてもよい。好適な例として、プロテアーゼA「アマノ」G(Aspergillus oryzae由来;天野エンザイム)を挙げることができるが、この例に限定されない。また、前述の酵素を組み合わせて用いる場合には、それぞれの酵素反応は、同時でもよく、別々に行ってもよい。この酵素の使用量は、乳製品中のタンパク質が分解できる量を用いればよいが、乳製品100質量部に対して、0.01~10質量部が好ましく、0.1~10質量部がより好ましい。
加温温度は、タンパク質分解酵素が活性化する温度であればよく、20~60℃が好ましく、40~60℃がより好ましく、40~50℃がさらに好ましい。
加温時間は、特に限定されないが、1~10時間が好ましく、3~8時間がより好ましい。
このときのpH(25℃)は、特に限定されないが、2~8が好ましく、5~8がより好ましい。pHを調整する緩衝剤としては、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は2種以上組み合わせて用いてもよい。
脱脂粉乳を3~6%(w/w)及びミルクプロテイン3~6%(w/w)の濃度になるように水で溶解又は懸濁した溶液を作製し、当該溶液にプロテアーゼを乳製品100質量部に対して0.25~5質量部添加し、混合液を調製する。当該混合溶液を40~50℃、5~7時間、pH6~8で乳製品中のタンパク質の分解を行い、乳製品のプロテアーゼ処理物(タンパク質分解酵素分解物)を得ることができる。
糖質としては、乳糖又はこのラクターゼ処理物、グルコース、果糖、ショ糖又は糖廃液も使用することができ、このうち乳糖が好ましい。乳清ミネラル等のミネラル類などを含有してもよい。
これら任意成分は、市販品のものを使用すればよく、またはこれらを多く含有する食品を用いてもよい。
また、プロピオン酸菌発酵物の生産効率を高める点から、嫌気的条件下における前培養で予めプロピオン酸菌の菌体数を増加させた後に、嫌気的又は好気的条件下における本培養を行うことが好ましい。
プロピオン酸菌は嫌気性である点から嫌気的培養法を用いることがより好ましく、嫌気的培養法を用いた後引き続き好気的培養法を用いることが更に好ましい。
また、好気的培養法における培養中の培養温度は20~40℃が好ましく、30~40℃がより好ましい。また、このときの培地pHは中性~微酸性、具体的には5.0~8.0に調整することが好ましく、6.0~7.0がより好ましく、さらに好ましくは6.2~6.8である。当該培養期間は1~10日間が好ましく、3~7日間がより好ましい。
得られたプロピオン酸菌発酵物をそのまま使用してもよいが、適宜濃縮や希釈、乾燥等を行ってもよい。
このとき、抗酸化剤を添加することにより、生成されたDHNAが2-アミノ-3-カルボキシ-1,4-ナフトキノン(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))に変化することを防ぐことができる。
ここで、抗酸化剤としては、アスコルビン酸若しくはその塩、アスコルビン酸エステル、エリソルビン酸等が用いられるが、アスコルビン酸又はその塩が特に好ましい。当該塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩;アンモニア塩等が挙げられる。
抗酸化剤の含有量は、プロピオン酸菌発酵物中に0.001~10質量%、更に0.01~5質量%、特に0.04~3質量%が好ましい。
なお、当該発酵物中のプロピオン酸菌は、生菌、死滅菌又はその粉砕物の何れでもよい。
このとき、当該発酵物1mL中にプロピオン酸菌が1~9×1010cfu含まれていることが好ましく、2~6×1010cfu含まれていることがより好ましい。又は、当該発酵物1mL中に乾燥質量換算でプロピオン酸菌が50~500mg含まれていることが好ましく、100~300mg含まれていることがより好ましい。
前培養したプロピオン酸菌含有培養液を培養液(1~3L)に接種後、本培養を行う。
30~40℃の培養中、培養液を窒素ガス0.1~1L/minでスパージングし、攪拌速度50~200rpmで140~160時間嫌気的培養を行う。このとき、プロピオン酸菌接種後1~2日培養した後、任意の培地組成成分である糖質を0.5~20mL/hで連続的に添加してもよい。
更に、上記嫌気的培養に引き続き好気的培養を行うことが好ましく、このとき、窒素ガスを酸素ガスに代えて同様に通気し、110~130時間好気的培養を行う。
このようにしてプロピオン酸菌を培養してプロピオン酸菌の培養液を得、更に当該培養液中に抗酸化剤を添加し、プロピオン酸菌発酵物として使用することができる。
また、本発明のプロピオン酸菌発酵物は、各種製剤としても使用することができるが、抗アレルギー剤や肌荒れ予防・改善剤等を製造するために使用することも可能である。
タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ-カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物;バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。
糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉(テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等)、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂;パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。
ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、エリソルビン酸などが挙げられる。これらの成分は、2種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び/又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。
1.材料
<菌株>
Propionibacterium freudenreichii ET-3株(FERM BP-8115株)
<前培養培地>
培地量の10%(w/w)のホエイ粉(明治乳業)及び 0.07%(w/w)のプロテアーゼ(プロテアーゼA「アマノ」G:Aspergillus oryzae 由来:天野エンザイム)を適当量のイオン交換水に溶解し、47℃で3時間、ホエイ粉中のタンパク質を酵素分解し、分解後に0.1%(w/w)の酵母エキス(P2G:アサヒフードアンドヘルスケア)を添加し、pHを6.8~6.9に調整した後、121℃で15分の滅菌をした。なお、酵素分解時のpHは炭酸カリウム溶液を用いて6.6~7.0に調整した。
<本培養培地>
培地量の3%(w/w)の脱脂粉乳(明治乳業)、3.4%(w/w)のMilk Protein Concentrate(MPC:Murray Goulburn)、0.25%のプロテアーゼ(プロテアーゼA「アマノ」G)を適当量のイオン交換水に溶解し、47℃で6時間、脱脂粉乳及びMPC中のタンパク質を酵素分解し、分解後に0.5%の酵母エキス(P2G)を添加し、pHを6.8~6.9に調整した後、121℃で15分の滅菌をした。なお、酵素分解時のpHは炭酸カリウム溶液を用いて6.6~7.0に調整した。
<前培養>
前培養培地100mLにET-3株の凍結菌(-80℃保存)を1mL接種し、37℃で48時間、嫌気下での静置培養を実施し、この培養液を本培養のスターターとした。
<本培養>
本培養培地2000mLに前培養液を20mL接種して本培養を開始した。培養温度を33℃、pHは炭酸カリウム水溶液で6.5に調整した。通気は窒素を0.4L/minでスパージングし、撹拌速度は150rpmとした。培養開始72時間後から1.5Mの乳糖溶液(121℃,15分で滅菌済み)を0.90mL/hで192時間に渡って流加し、流加終了後に通気を窒素から酸素へと切り替え好気培養にし、好気培養を120時間継続して培養を終了し、プロピオン酸菌を含む培養液を得た。
培養終了後、プロピオン酸菌によって生成されたDHNAがACNQに変化することを防ぐため発酵物中にアスコルビン酸を共存させるように、培養液1,000mL当たり、アスコルビン酸ナトリウム5gを添加し、プロピオン酸菌発酵物を得た。
上記発酵物の製造法は、古市らの方法(Furuichi et al, Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production by Propionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture. Appl Environ Microbiol. 2007;73(10):3137-43.)に準じて行った。
上記操作後のプロピオン酸菌発酵物0.5mL中に、プロピオン酸菌は2.43×1010cfu含まれていた。
上記操作後、下記HPLC分析により、培養液に含まれる物質として、1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))が認められ、培養液1L当り0.34mM(68mg/L)であったが、2-アミノ-3-カルボキシ-1,4-ナフトキノン(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))はほとんど認められなかった。
カラム:Capcell pak C18 SG120、充填剤粒径5μm、内径4.6mm、長さ250mm(資生堂社)
溶離液:アセトニトリル:メタノール:水:酢酸=250:100:900:0.6(5%アンモニア水でpH5.6に調整)
流速:1mL/min
注入量:10μL
検出器:UV270nm
<HPLCサンプル調製法>
培養液1mLにアセトンと酢酸エチルを各々2.5mL添加して混合後、2000xgで5分間遠心分離し、その上清液をメンブランフィルターでろ過した。
(1)概略
NC/Ngaマウス雌、4週齢(日本エスエルシー社)を購入し、次の4群に分けた。すなわち、皮膚炎惹起群(蒸留水投与群(n=7)[蒸留水]、比較例として液体培地(以下、培地とも称す)投与群(n=7)[培地]およびプロピオン酸菌発酵物(液体)投与群(n=7)[プロピオン酸菌発酵物])ならびに皮膚炎非惹起群(n=7)[非惹起]に群分け後、各種試料を試験期間中(day-7からday27)に亘って連日経口投与(1日につき0.5mL/mouse)した。
各種試料において、プロピオン酸菌発酵物は上記製造例1にて得られたもの(DHNA 68mg/L、およびプロピオン酸菌 4.86×1010cfu/mlを含有する)を用い、液体培地は上記製造例1にて製造したプロピオン酸菌を接種していない殺菌済みの本培養培地を用いた。
経口投与開始後7日目(day0)より皮膚炎惹起群に対し後述の方法にて皮膚炎を惹起し、症状の推移をスコア化した。また、皮膚炎惹起開始後14、21、28日(day14、21、28)に血清を採取し、血清アミロイドA(serum amyloid A:SAA)及びIgE濃度をELISA法により測定した。SAA濃度については、Bio Source社のELISA kitを用いて測定した。測定は、付属の取扱説明書に従った。IgE濃度の測定については、Pharmingen社製の抗体を用いてPharmingen社推奨のプロトコールを一部改変して測定した。
ヤケヒョウヒダニの全虫体(Mite-Dp、エル・エス・エル社製)を無水エーテルで脱脂後、蒸留水を添加して超音波破砕した。ついで水溶性画分を遠心分離し、凍結乾燥後、蒸留水を用い、タンパク質濃度で4.5mg/ml(BSA換算、BioRAD 社のDC protein assayで測定)に調製して使用した。
海野らの方法を改変した(海野哲史 他、アレルギー50:1152-1162、2001)。皮膚炎惹起部位(頭部、耳介部及び頸部)をバリカンで剃毛後、4% SDS水溶液を全マウスの皮膚炎惹起部位にはけで20回塗布した(塗布量は約60μLに相当)。SDS水溶液の乾燥後、皮膚炎惹起群にはダニ破砕物液を、皮膚炎非惹起群には蒸留水を各々20回同様にして塗布した。上記操作を1日1セット毎日繰り返すことにより皮膚炎を惹起した。
96ウェルプレートに1次抗体用の抗IgE抗体(Pharmingen社製)を2μg/mLで添加し、37℃1時間静置した。0.05%Tween20/PBS(PBS-Tween)で洗浄後、1%BSA/PBSを添加し、室温で30分間静置した。PBS-Tweenで洗浄後、血清サンプル及び標準曲線作成用のIgE(Pharmingen社製)を添加し、室温で30分間静置した。PBS-Tweenで洗浄後、2次抗体用のビオチン-抗IgE抗体(Pharmingen社製)を0.5μg/mLで添加し、室温で1時間静置した。PBS-Tweenで洗浄後、ストレプトアビジン-HRP(Pharmingen社製)を添加し、室温で30分間静置した。PBS-Tweenで洗浄後、TMB+Substrate Chromogen(DAKO社製)を添加して発色反応を開始した。発色反応後、1N硫酸を添加し、450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、血清中のIgE濃度を算出した。
図1に、皮膚炎症状スコアの推移を示す。スコア化は、1)乾皮・痂皮形成、2)発赤・出血、3)組織脱落・擦り傷、4)浮腫、5)掻痒行動の5項目について、0(無症状)、1(軽度)、2(中程度)、3(重度)の4段階で評価し、各マウスにおける各スコアの合計を算出した。その結果、症状スコアについて、プロピオン酸菌発酵物投与群では、蒸留水投与群と比較して有意に低値で推移することがわかった(図1)。一方、培地投与群でも低値で推移したが、プロピオン酸菌発酵物投与群と比較すると高値だった。
血清中総IgEについて、Day14において、プロピオン酸菌発酵物投与群では、蒸留水投与群と比較してIgE濃度が有意に低いことがわかった(図2)。一方、培地投与群では、蒸留水投与群と比較して低かったが、有意差は認められなかった。
SAAについて、Day14において、プロピオン酸菌発酵物(上記製造例1のもの)投与群では、蒸留水投与群と比較して有意に低いことがわかった(図3)。一方、培地投与群では蒸留水投与群より低かったが、有意差は認められなかった。逆に、Day21においては、プロピオン酸菌発酵物投与群では、蒸留水投与群より低かったが有意差が認められなかった一方、培地投与群では蒸留水投与群より有意に低かった。Day28においては、プロピオン酸菌発酵物投与群と培地投与群の両者とも、蒸留水投与群より有意に低かった。
以上より、本発明に係わるプロピオン酸菌発酵物は、アトピー性皮膚炎の発症抑制に効果が高いことがわかった。
(1)概要
SDラット、雄、7週齢を予備飼育後、体重に差がないように次の4群に分けた。例数は7又は8である。1群:蒸留水投与群、2群:プロピオン酸菌発酵物投与群、3群:培地投与群、4群:ケトチフェンフマル酸塩(PCA反応の抑制試薬、和光純薬社製)投与群。各ラットの背部をバリカンで剃毛後、ここにPCA反応惹起部位およびPCA反応非惹起部位を設けた。前記PCA反応惹起部位に抗DNP-IgE抗体液(25ng/site、ICN社製)、前記PCA反応非惹起部位に生理食塩水を各々皮内投与した。
各群に用いる各種試料は、試験例1と同様なものを用いた。
IgE抗体または生理食塩水の投与24時間後に、各群に抗原としてDNPの結合したBSA(DNP-BSA:2,4-dinitrophenylated Bovine Serum Albumin)(1mg/rat、エル・エス・エル社製)をエバンスブルー(5mg/rat、和光純薬社製)と共に静脈投与し、PCA反応を惹起した。プロピオン酸菌発酵物、培地又は蒸留水は、PCA反応惹起の1, 3, 5時間前に各々10mL/kg(固形分換算で1.7g/kg)で経口投与し、また、ケトチフェンフマル酸塩はPCA反応惹起の1時間前に10mg/kgで経口投与した(3,5時間前は蒸留水を投与した)。PCA反応惹起30分後にラットから背部皮膚を得て1N水酸化カリウムで処理後、アセトンと0.6Nリン酸混液でエバンスブルーを抽出し、620nmにおける吸光度から皮膚に漏出したエバンスブルー量を算出した。
図4に、エバンスブルー漏出量を示す。プロピオン酸菌発酵物投与群のPCA反応惹起部位[プロピオン酸菌発酵物]では、蒸留水投与群のPCA反応惹起部位[蒸留水]と比較して有意に低下することがわかった(図4)。一方、培地投与群のPCA 反応惹起部位[培地]でも低下したが、有意差は認められなかった。
以上より、本発明に係わるプロピオン酸菌発酵物は、PCA反応の抑制に効果が高いことがわかった。
1.材料
<菌株>
Propionibacterium freudenreichii ET-3株(FERM BP-8115株)
<前培養培地および本培養培地>
製造例1の<前培養培地>の調製方法と同様にして、前培養培地および本培養培地を調製した。
2.製造方法
<前培養>
前培養培地100mLにET-3株の凍結菌(-80℃保存)を1mL接種し、37℃で48時間、嫌気下での静置培養を実施し、この培養液を本培養のスターターとした。
<本培養>
本培養培地に前培養液を2%接種して本培養を開始した。窒素雰囲気下で培養温度33~37℃、66~96時間継続して培養し、プロピオン酸菌を含む培養液(プロピオン酸菌乳清発酵物)を得た。試験例3の試験食調製においては、この培養液自体をプロピオン酸菌乳清発酵物として用いた。
(1)試験の概要
<試験対象>
乾燥皮膚を有する20~39歳の女性を被験者に、二重盲検プラセボコントロール試験を実施した。試験開始前に、医師が観察した皮膚所見(乾燥、鱗屑、丘疹、面疱、膿疱)に基づいて、偏りがないように、被験者を3群に群分けした。なお、本試験は、ヘルシンキ宣言(2000年エジンバラ総会で修正)を遵守し、倫理的配慮のもとに実施した。
<試験食>
以下の3種類(試験食A~C)を設けた。上記製造例2にて得られたプロピオン酸菌乳清発酵物を使用した。
試験食A:酸性飲料(プラセボ)[n=30]
水に各種成分(ペクチン、乳酸、ヨーグルトフレーバー、ビタミンC、アスパルテーム)を添加したもの。
乳成分および乳酸菌を含有しない。
試験食B:プロピオン酸菌乳清発酵物含有酸性飲料(アクティブ1)[n=28]
上記酸性飲料に前記プロピオン酸菌乳清発酵物を1v/v%添加したもの。
プロピオン酸菌乳清発酵物に由来しない乳成分および乳酸菌を含有しない。
試験食C:プロピオン酸菌乳清発酵物含有ヨーグルト飲料(アクティブ2)[n=28]
市販のヨーグルトを60v/v%とし、水、上記酸性飲料(プラセボ)に添加したのと同濃度の各種成分、スクロースおよび前記プロピオン酸菌乳清発酵物を1v/v%添加したもの。
なお、試験食Bおよび試験食Cの120mlに含まれるDHNA含量は13.2μgである。
試験食の摂取開始日~4週間後までの試験食摂取期間、試験食を1日120ml経口摂取する。試験食摂取期間は、試験食以外の乳酸菌を含む食品(ヨーグルト、発酵乳等)およびオリゴ糖を含む食品の摂取、新たなサプリメント摂取の開始、新たな美容目的の治療薬摂取や外用薬使用の開始、美容目的の施術(ケミカルピーリング等)を禁止した。
試験食の摂取開始日における試験食摂取前、および試験食摂取開始から4週間後に、以下の検査を実施した。
角層水分量:水分計 コルネオメーター CM825(Courage+Khazaka electronic GmbH (Germany)社製)を用い、被験者の顔面肌の角層水分量を静電容量値として2回ずつ測定し、平均値を算出した。
肌のきめ:肌画像解析装置ロボスキンアナライザー RSA-100(インフォワード社製)を用いて、被験者の顔面肌のきめをスコア化した。
本発明においてこのスコア値をキメスコアといい、キメスコアが高いほど、肌のきめが整っている状態であることを示す。
さらに、試験食の摂取前後の測定値については群内の比較検定(paired t-test)、および試験食の摂取前後の測定値の変化量については3群間の多重比較検定(Tukey-Kramer法)にて有意差検定を行った。
結果を図5および図6に示す。角層水分量、キメスコアの測定値はいずれも、試験食A:酸性飲料(プラセボ)の摂取前後で有意な差は認められなかった。それに対し、試験食B:プロピオン酸菌乳清発酵物含有酸性飲料(アクティブ1)、C:プロピオン酸菌乳清発酵物含有ヨーグルト飲料(アクティブ2)の摂取後では、角層水分量、キメスコアの測定値上昇が有意に観察された。また、試験食の摂取前後の測定値の変化量に関しても、角層水分量、キメスコアのいずれにおいても、試験食A摂取群に対し、試験食B、試験食Cの摂取群は有意に大きかった。
以上の結果から、本発明のプロピオン酸菌発酵物は、乾燥した肌の状態を改善する効果を有することがわかった。また、本発明のプロピオン酸菌発酵物にヨーグルトを併用しても同様の効果が得られることもわかった。
Claims (21)
- プロピオン酸菌発酵物を有効成分とする抗アレルギー剤。
- 前記発酵物が、乳製品のタンパク質分解酵素処理物を含有する培地を用いてプロピオン酸菌を培養した培養液である請求項1記載の抗アレルギー剤。
- 乳製品が、脱脂粉乳、ホエイ粉及びミルクプロテインから選ばれる1種以上のものである請求項2記載の抗アレルギー剤。
- プロピオン酸菌が、チーズ用プロピオン酸菌である請求項1~3の何れか1項記載の抗アレルギー剤。
- チーズ用プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである請求項4記載の抗アレルギー剤。
- アレルギーの症状が、鼻炎、結膜炎、気管支喘息又はアトピー性皮膚炎である請求項1~5の何れか1項記載の抗アレルギー剤。
- 前記抗アレルギー剤が経口投与用又は経口摂取用であることを特徴とする、請求項1~6の何れか1項記載の抗アレルギー剤。
- プロピオン酸菌発酵物の、抗アレルギー剤の製造のための使用。
- 前記発酵物が、乳製品のタンパク質分解酵素処理物を含有する培地を用いてプロピオン酸菌を培養した培養液である請求項8記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- 乳製品が、脱脂粉乳、ホエイ粉及びミルクプロテインから選ばれる1種以上のものである請求項9記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- プロピオン酸菌が、チーズ用プロピオン酸菌である請求項8~10の何れか1項記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- チーズ用プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである請求項11記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- 前記抗アレルギー剤が経口投与用又は経口摂取であることを特徴とする、請求項8~12の何れか1項記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- アレルギーの症状が、鼻炎、結膜炎、気管支喘息又はアトピー性皮膚炎である請求項8~13の何れか1項記載の抗アレルギー剤の製造のための使用。
- プロピオン酸菌発酵物を有効量投与又は摂取するアレルギー症状の予防・改善方法。
- 前記発酵物が、乳製品のタンパク質分解酵素処理物を含有する培地を用いてプロピオン酸菌を培養した培養液である請求項15記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
- 乳製品が、脱脂粉乳、ホエイ粉及びミルクプロテインから選ばれる1種以上のものである請求項16記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
- プロピオン酸菌が、チーズ用プロピオン酸菌である請求項15~17の何れか1項記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
- チーズ用プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである請求項18記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
- 前記プロピオン酸菌発酵物の投与又は摂取が経口投与又は経口摂取であることを特徴とする、請求項15~19の何れか1項記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
- アレルギーの症状が、鼻炎、結膜炎、気管支喘息又はアトピー性皮膚炎である請求項15~20の何れか1項記載のアレルギー症状の予防・改善方法。
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