CN102488716B - 丙酸杆菌发酵物在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用 - Google Patents

Abstract

提供一种抗过敏剂。抗过敏剂以丙酸杆菌发酵物为有效成分。

Description

丙酸杆菌发酵物在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用

本申请是申请日为2009年2月26日、申请号为200980106607.5、发明名称为“抗过敏剂”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及抗过敏剂。

背景技术

近几年，由食物、日本柳杉等的特定的花粉、屋尘、化学物质等激发的鼻炎、结膜炎、支气管哮喘、特应性皮炎等过敏症状已成为社会问题。尤其，伴随住宅的高密封化，因施工时的甲醛、甲苯等的挥发性有机化合物的使用、宠物的室内饲养以及冷气暖气的连续使用等而螨、其尸体、粉、霉、花粉、宠物的毛等屋尘和挥发性有机化合物等化学物质等将长期间存在于室内，引起过敏症状已成为问题。

通常，关于减轻过敏症状方面更多是依赖于抗组胺、类固醇等的药剂，在费用、副作用等方面患者所承受的负担大，因此期待通过较简便地摄取安全性高的食品来源物而能减轻过敏症状。

例如，在柿子叶提取物中，确认到被动皮肤过敏(PCA)反应和特应性皮炎模型中的有效性(专利文献1)。并且，微生物中也有确认了这样的有效性的例子，但是该微生物为基因重组大肠杆菌，需要充分验证安全性(专利文献2)。仍然需要能减轻过敏症状的食品和安全性高的天然微生物等的探索。

另一方面，丙酸杆菌(Propionibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)乳酸菌、明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌一直以来被使用于饮料食品的制造中，且已报道它们的培养液中含有1,4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)(专利文献3，非专利文献1)。

专利文献1:日本特开2000-139406号公报

专利文献2:日本特开2002-154976号公报小册子

专利文献3:国际公开2003/016544号

非专利文献1:K．Fruichi et al.,Applied and EnvironmentalMicrobiology,May 2007,p.3137-3143.

发明内容

本发明的目的在于提供安全性高的抗过敏剂。

本发明人等对能降低过敏症状的物质进行研讨的结果，发现丙酸杆菌发酵物具有减轻由螨来源抗原引起的特异反应性皮炎及被动皮肤过敏(PCA)反应的作用，该发酵物作为抗过敏剂有用。

因此，本发明提供一种以丙酸杆菌发酵物作为有效成分的抗过敏剂。

另外，本发明提供丙酸杆菌发酵物在制造抗过敏剂中的应用。

另外，本发明提供一种过敏症状的预防、改善方法，给药或摄取有效量的丙酸杆菌发酵物。

本发明由于是来自一直以来使用于食品制造中的天然微生物的发酵物，所以作为安全性高的抗过敏剂有用。而且，因使用微生物，能够大量生产该发酵物。

附图说明

图1表示蒸馏水给药组[蒸馏水]、丙酸杆菌发酵物给药组[丙酸杆菌发酵物]、培养基(未发酵物)给药组[培养基]、以及皮炎未激发组[未激发]的、试验期间中的皮炎症状记分（score）的变化(以平均±标准误差表示。＊＊P<0.01,*P<0.05,Dunnett的多重比较，与蒸馏水给药组的比较)。

图2表示蒸馏水给药组[蒸馏水]、丙酸杆菌发酵物给药组[丙酸杆菌发酵物]、培养基(未发酵物)给药组[培养基]以及皮炎未激发组[未激发]的、14天、21天和28天的血清中总IgE浓度(以平均±标准误差表示。*P<0.05，Dunnett的多重比较，与蒸馏水给药组的比较)。

图3表示蒸馏水给药组[蒸馏水]、丙酸杆菌发酵物给药组[丙酸杆菌发酵物]、培养基(未发酵物)给药组[培养基]及皮炎未激发组[未激发]的、14天、21天和28天的SAA浓度(以平均±标准误差表示。*P<0.05，Dunnett的多重比较，与蒸馏水给药组的比较)。

图4表示蒸馏水给药组的PCA反应激发部位[蒸馏水]、丙酸杆菌发酵物给药组的PCA反应激发部位[丙酸杆菌发酵物]、培养基给药组的PCA反应激发部位[培养基]、富马酸酮替芬给药组的PCA反应激发部位[富马酸酮替芬]、以及各组的PCA反应未激发部位[PCA(-)]的伊凡斯蓝(Evans blue)漏出量。(以平均±标准误差表示。＊＊P<0.01，Dunnett的多重比较，与蒸馏水给药组的PCA反应激发部位[蒸馏水]比较。)

图5表示试验食物A:酸性饮料(安慰剂)、试验食物B:含有丙酸杆菌乳清发酵物的酸性饮料(活性物1)、C:含有丙酸杆菌乳清发酵物的酸奶饮料(活性物2)的角质层水分量(AU)(以平均±标准差表示。*P<0.05(paired t-test)，#P<0.05(基于Tukey-Kramer法的3组间的多重比较鉴定))。

图6表示试验食物A:酸性饮料(安慰剂)、试验食物B:含有丙酸杆菌乳清发酵物的酸性饮料(活性物1)、C:含有丙酸杆菌乳清发酵物的酸奶饮料(活性物2)的肌理记分(以平均±标准差表示。*P<0.05(pairedt-test)，#P<0.05(基于Tukey-Kramer法的3组间的多重比较检验))。

具体实施方式

本发明所使用的丙酸杆菌有丙酸杆菌属（Propionibacterium）、Propionicimonas菌属、丙酸产生菌属（Propioniferax）、Propionimicrobium菌属、Propionivibrio菌属等，没有特别限制，但优选丙酸杆菌属的菌。丙酸杆菌属的菌例如可举出费氏丙酸杆菌(P．freudenreichii或Propionibacterium freudenreichii)、特氏丙酸杆菌(P．thoenii或Propionibacterium thoenii)、产丙酸丙酸杆菌(P．acidipropionici或Propionibacterium acidipropionici)、詹氏丙酸杆菌(P．jensenii或Propionibacterium jensenii)等的奶酪用丙酸杆菌；卵白丙酸杆菌(P．avidum)、痤疮丙酸杆菌(P．acnes)、嗜淋巴丙酸杆菌(P．lymphophilum)，颗粒丙酸杆菌(P．granulosam)、阿拉伯糖丙酸杆菌(P．arabinosum)、环乙烷丙酸杆菌(P．cyclohexanicum)、无害丙酸杆菌（Propionibacterium innocuum）、中间丙酸杆菌（Propionibacteriumintermediu）、戊糖丙酸杆菌（Propionibacterium pentosaceum）、贝氏丙酸杆菌（Propionibacterium peterssonii）、丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium propionicum）、玉米丙酸杆菌（Propionibacteriumzeae）等，优选奶酪用丙酸杆菌。其中更优选费氏丙酸杆菌，特优选费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)ET-3株(2001年8月9日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))，保藏编号为FERM BP-8115。用于识别的标记为ET-3，基于布达佩斯条约的保藏移交日为2002年7月11日)。

本发明的丙酸杆菌发酵物的制造过程中的培养工序所使用的培养基的营养源为，只要能用于丙酸杆菌的培养即可(例如，专利文献3及非专利文献1)，能使用乳制品、酵母提取物、大豆提取物、胰酶解酪蛋白等的蛋白胨、以及大量含有这些的食品。或者还可以使用它们的酶处理物。其中优选含有乳制品的蛋白质分解酶处理物的培养基。该培养基更优选以该蛋白质分解酶处理物作为主要成分，该蛋白质分解酶分解物的含量在液体培养基中更优选0.1~40质量%，进一步优选1~20质量%。

作为上述蛋白质分解酶分解物所用的乳制品可举出鲜奶、浓缩奶、全脂乳粉、脱脂乳，脱脂乳粉、乳蛋白(MPC(milk protein concentrate))、酪蛋白、乳清、浓缩乳清、浓缩乳清蛋白(WPC)、分离乳清蛋白(WPI)以及乳清粉等，这些可以单独或2种以上使用。其中，优选脱脂乳、脱脂乳粉、乳清浓缩物、乳清粉、乳蛋白。这些可以使用市售的产品。该乳制品的使用量在液体培养基中优选0.1~40质量%，更优选1~20质量%。

另外，上述蛋白质分解酶可以采用市售产品，但优选蛋白酶，其中优选中性蛋白酶，该蛋白质分解酶除了蛋白酶以外还可以含有肽酶。所使用的蛋白酶或肽酶不被特别限定，例如，食品等级的蛋白酶包括内切型蛋白酶、外切型蛋白酶、外切型肽酶/内切型蛋白酶复合酶、蛋白酶/肽酶复合酶。内切型蛋白酶例如可举出凝乳酶(EC 3.4.23.4，Maxiren，modified yeast Kluyveromyces lactis来源，GIST-BROCADES N．V.)、水解蛋白酶（Alcalase）R(Bacillus licheniformis来源，Novo Nordisk公司)、益瑞蛋白酶（esperase）(B．lentus来源，Novo Nordisk公司)、中性蛋白酶（Neutrase）R(B．subtilis来源，Novo Nordisk公司)、复合蛋白酶(Protamex)(细菌来源，Novo Nordisk公司)、PTN6.0S(猪胰脏胰蛋白酶，Novo Nordisk公司)等，作为外切型肽酶/内切型蛋白酶复合酶例如可举出风味蛋白酶（Flavourzyme）(米曲霉（Aspergillus oryzae）来源，Novo Nordisk公司)等。另外，作为内切型蛋白酶例如可举出胰蛋白酶(CAS No.9002-07-7，EC 3.4.21.4，牛胰脏来源，ProductNo.T8802，SIGMA)、胃蛋白酶(CAS No.9001-75-6，EC 3.4.4.1，猪胃粘膜来源，SIGMA)、糜蛋白酶（Chymotrypsin）(Novo Nordisk公司，BEHRINGER公司)、蛋白酶N“Amano”G(枯草杆菌（Bacillus subtilis）来源；天野酶公司)、Bioplase(枯草杆菌来源；Nagase Biochemicals公司)、PapainW-40(天野酶公司)，作为外切型蛋白酶可举出胰羧肽酶、小肠黏膜纹状缘的氨肽酶等。并且，作为蛋白酶/肽酶复合酶例如可使用蛋白酶A“Amano”G(米曲霉来源；天野酶公司)、鲜味强化酶（Umamizyme）G(肽酶及蛋白酶，米曲霉来源；天野酶公司)。酶的来源并不限定于上述的记载，可来源于动物、植物、微生物的任一种，优选米曲霉来源酶。这些酶并不意味着限定于商品名、来源、制造厂家等。在本发明的实施中，酶可以是1种或组合2种以上。作为优选例可举出蛋白酶A“Amano”G(米曲霉来源；天野酶公司)，但并不被该例所限定。另外，组合使用上述的酶时，各自的酶反应可以是同时进行，也可以分别进行。该酶的使用量只要使用能将乳制品中的蛋白质分解的量即可，优选相对于乳制品100质量份，为0.01~10质量份，更优选为0.1~10质量份。

上述乳制品的蛋白质分解酶处理物的制造方法为，向乳制品添加蛋白质分解酶，进行加温处理，分解乳制品中的蛋白质。酶解开始时的pH、酶解时间、酶反应温度无特别限定，只要能得到本发明产品即可

加温温度为只要是蛋白质分解酶活化的温度即可，优选20~60℃，更优选40~60℃，进一步优选为40~50℃。

加温时间无特别限定，优选1~10小时，更优选3~8小时。

对于此时的pH(25℃)没有特别限定，优选2~8，更优选5~8。作为调整pH的缓冲剂可举出碳酸、醋酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、乳酸、葡萄糖酸、酒石酸等的有机酸盐，磷酸、盐酸、硫酸等的无机盐，氢氧化钠等氢氧化物，氨或氨水等。这些可以单独使用或组合2种以上使用。

作为上述乳制品的蛋白质分解酶分解物的制造方法，下面举一个例子。

将脱脂乳粉以成为3~6％(w/w)以及乳蛋白3~6％(w/w)的浓度用水进行溶解或悬浮而调制溶液，相对于乳制品100质量份，向该溶液添加0.25~5质量份的蛋白酶，调制混合液。在40~50℃、5~7小时、pH6~8的条件下对该混合溶液进行乳制品的蛋白质的分解，可获得乳制品的蛋白酶处理物(蛋白质分解酶分解物)。

另外，将乳清粉(10w/w%)及蛋白酶Amano A“Amano”G(0.07w/w%、天野酶公司)溶解于水，在47℃(pH6.6)下进行2小时的酶分解，其后，通过85℃下加热10分钟而使酶失活，可获得乳制品的蛋白质分解酶分解物。但并不局限于该例。

本发明所使用的培养基中，除了上述乳制品的蛋白质分解酶处理物以外，还可以适当添加胰酶解酪蛋白、植物蛋白胨、酵母提取物、糖类等的任意成分，其中优选至少添加酵母提取物，该酵母的使用量为，相对于乳制品100质量份，优选0.1~10质量份，更优选0.5~10质量份。

作为糖类可使用乳糖或其乳糖酶处理物、葡萄糖、果糖、蔗糖、或者糖废液，其中优选乳糖。可以含有乳清矿物质等的矿物质类等。

作为这些任意成分可以使用市售产品，或者还可以使用大量含有它们的食品。

作为本发明所使用的培养基的例子，可举出将培养基量的3％(w/w)的脱脂乳粉(明治乳业)、3.4％(w/w)的Milk Protein Concent大鼠e(MPC:Murray Goulburn)、0.25％(w/w)的蛋白酶(蛋白酶A“Amano”G，天野酶公司)溶解于适量的离子交换水中，对脱脂乳粉及MPC中的蛋白质进行47℃、6小时的酶分解，分解后添加0.5％(w/w)的啤酒酵母提取物(P2G，朝日食品与健康株式会社)，调整为pH6.8~6.9之后，进行121℃、15分钟的杀菌而获取的培养基。其中，酶分解时的pH是用碳酸钾溶液调整为6.6~7.0。

另外，还可以举出将乳清粉(10w/w%)及蛋白酶Amano A“Amano”G(0.07w/w%、天野酶公司)溶解于水，进行47℃(pH6.6)、2小时的酶分解，其后，通过进行85℃、10分钟的加热使酶失活，然后添加啤酒酵母提取物(0.10w/w%、朝日食品与健康株式会社)和硫酸铵(0.27w/w%)，pH调整为6.7后，进行121℃、7分钟的杀菌而获取的培养基。但是并不局限于该例。

本发明中，以后将以鲜奶、浓缩奶、全乳粉、脱脂乳、脱脂乳粉、乳蛋白(MPC(milk protein concentrate))、酪蛋白、浓缩乳清及乳清粉等来源于乳蛋白的物质作为营养源使用的丙酸杆菌发酵物称为丙酸杆菌乳蛋白质发酵物。并且，以后将以乳清、WPC或WPI等乳清来源的物质作为营养源的丙酸杆菌发酵物称为丙酸杆菌乳清发酵物。

作为本发明的培养方法可使用公知的各种需氧或厌氧性培养方法，但是，从大量生产的观点出发，优选利用液体培养基的需氧或厌氧培养法。

并且，从提高丙酸杆菌发酵物的生产效率的观点出发，优选通过厌氧条件下进行的预培养先增加丙酸杆菌的菌体数之后，进行厌氧或需氧条件下的主培养（main culture）。

从丙酸杆菌为厌氧性的观点出发，优选使用厌氧性培养法，更优选为使用厌氧培养法之后继续采用需氧培养法。

在厌氧培养法中，培养过程的培养温度优选为20~40℃，更优选30~40℃。并且，此时的培养基pH优选中性~微酸性，具体为优选调整成5.0~8.0，更优选为6.0~7.0，进一步优选为6.2~6.8。该培养的时间优选为1~12天，更优选为5~12天。

在需氧培养法中，培养过程的培养温度优选为20~40℃，更优选为30~40℃。并且，此时的培养基pH优选为中性~微酸性，具体为优选调整成5.0~8.0，更优选为6.0~7.0，进一步优选为6.2~6.8。该培养的时间优选为1~10天，更优选为3~7天。

作为本发明的有效成分的丙酸杆菌发酵物，是使用上述培养基通过上述培养方法培养丙酸杆菌而获得的，包含丙酸杆菌和培养物两者。

可以直接使用所得的丙酸杆菌发酵物，也可以适当进行浓缩、稀释、干燥等。

此时，可通过添加抗氧化剂而防止所生成的DHNA变成2-氨基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))。

在此，作为抗氧化剂可使用抗坏血酸或其盐，抗坏血酸酯，异抗坏血酸等，特别优选抗坏血酸或其盐。作为该盐可举出钠、钾等的碱金属盐；钙、镁等的碱土金属盐；氨盐等。

抗氧化剂的含量优选在丙酸杆菌发酵物中为0.001~10质量%，更优选0.01~5质量%，特别优选0.04~3质量%。

另外，该发酵物中的丙酸杆菌，可以是活菌、死菌或其粉碎物的任一个。

此时，在该发酵物1mL中，优选含有1~9×10¹⁰cfu的丙酸杆菌，更优选含有2~6×10¹⁰cfu。或者，在该发酵物1mL中，以干燥质量换算，优选含有50~500mg的丙酸杆菌，更优选含有100~300mg。

下面，举例本发明的丙酸杆菌发酵物制造法的一个例子。

将经预培养的含丙酸杆菌培养液接种到培养液(1~3L)之后，进行主培养。

在30~40℃的培养中，以0.1~1L/min向培养液通氮气，搅拌速度50~200rpm下进行了140~160小时的厌氧培养。此时，也可以在丙酸杆菌接种后培养1~2天之后，以0.5~20mL/h连续添加作为任意培养基组分的糖类。

并且，优选继上述厌氧培养进行需氧培养，此时，将氮气换成氧气同样通气，进行110~130小时的需氧培养。

如此培养丙酸杆菌得到丙酸杆菌的培养液，并向该培养液中添加抗氧化剂，就可以作为丙酸杆菌发酵物使用。

另外，作为本发明有效成分的丙酸杆菌发酵物，也可以通过如国际公开第03/016544号小册子等中记载的公知制造法来制造。本说明书中，“丙酸杆菌发酵物”包括，通过丙酸杆菌的发酵而得的培养物自身、向培养物添加了抗氧化剂而得的物质、以及它们的处理物，例如，将培养物进行过滤或除菌而得的培养滤液、培养上清液、对该培养滤液等通过蒸发器等进行浓缩而得的浓缩物、糊化物、稀释物或(冻结)干燥物。

并且，为了去除丙酸杆菌发酵物的杂质或浓缩有效成分，可对如上所得的丙酸杆菌发酵物，用活性炭、离子交换树脂等吸附层析等进行纯化。还可以将丙酸杆菌发酵物制成用溶剂稀释的可溶部分或不溶部分。作为溶剂可使用水、通常用的溶剂，例如将醇类、烃类、有机酸、有机碱、无机酸、无机碱、超临界流体等单独或多种组合使用。

本发明的丙酸杆菌发酵物，如后述试验例1所示，可以减轻因螨、化学物质引起的过敏症状等，所以可作为抑制鼻炎、结膜炎、支气管哮喘或特应性皮炎的抗过敏剂使用。特应性皮炎是免疫介导的皮肤炎症，指伴随慢性瘙痒的皮肤表层性炎症。特应性皮炎有IgE介导型(外因型)还有无IgE介导型(内因型)。作为特应性皮炎的环境因素有食物(牛奶、蛋、小麦、花生、鱼等)、空气中的变应原(螨、霉、头皮屑等)等。另外，特应性皮炎的发病也提示有遗传因素(福岛雅典总监修，メルクマニユアル第18版日语版、日经BP社发行，pp.999(2006))。

另外，如后述试验例3所示，本发明的丙酸杆菌发酵物，提高角质层水分量、肌理记分，所以作为干燥皮肤状态的改善剂，即作为皮肤粗糙预防、改善剂也有用。并且，作为特应性皮炎的治疗方法之一，有对干燥的皮肤进行保湿，改善皮肤状态的方法，所以该皮肤粗糙预防、改善剂也对特应性皮炎的治疗有用，因而也可作为抗过敏剂使用。在此，所谓“皮肤粗糙”是指角质层水分量减少而皮肤表面干燥的情况、肌理变粗糙的情况。

并且，本发明的丙酸杆菌发酵物也可作为各种制剂使用，也可以在抗过敏剂、皮肤粗糙预防、改善剂等的制造中使用。

该抗过敏剂等可以通过饮料食品或医药品的任一形态利用。例如，通过作为医药直接给药，或者作为特定保健用食品等的特用食品、营养功能食品、补给品直接经口摄取，或添加于各种食品(牛奶、发酵奶、酸奶、奶酪、面包、饼干、薄脆饼干、比萨饼外壳、配制乳粉、流质食品、病人用食品、营养食品、冷冻食品、加工食品及其他的市售食品及其他)将其摄取从而进行利用。也可以通过管饲营养、肠内营养等其他方式摄取。

含有本发明丙酸杆菌发酵物的食品，可以使用水、蛋白质、糖类、脂质、维生素类、矿物质类、有机酸、有机碱、果汁、调味料类等作为主要成分。

作为蛋白质例如可举出全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳分、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、肉蛋白等的动植物性蛋白质、它们的分解物；黄油、乳清矿物质、奶油、乳清、非蛋白氮、唾液酸、磷脂、乳糖等的各种乳来源成分等。也可以包含酪蛋白磷酸肽、精氨酸、赖氨酸等的肽、氨基酸。

作为糖类，例如糖类、加工淀粉(除了糊精以外、可溶性淀粉、英国淀粉（British starch）、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。作为脂质例如可举出猪油、鱼油等，它们的分离油、加氢油、酯交换油等的动物性油脂；棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分离油、加氢油、酯交换油等的植物性油脂等。

作为维生素类例如可举出维生素A、胡萝卜素类、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K族、维生素P、维生素Q、尼亚新（niacin）、尼克酸、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等。作为矿物质类例如可举出钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。作为有机酸例如可举出苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、异抗坏血酸等。这些成分可以组合2种以上使用，也可以使用合成品及/或大量含有它们的食品。作为食品的形态，固体和液体均可。也可以是凝胶状。

另外，使用本发明的丙酸杆菌发酵物作为医药品时，能以各种形态给药。例如可举出通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆等的经口给药，也可以加工成注射剂、液剂等的制剂，通过经管、经肠等其他的给药方式给药。这些各种制剂可通过一般方法，主剂中采用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味·矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、成膜剂等的通常可使用的已知辅料进行制剂化。进而可以添加适量的维生素、矿物质、有机酸、糖类、氨基酸、肽类等。

使用该丙酸杆菌发酵物时，将丙酸杆菌发酵物换算成干燥质量，优选人体重的每1kg的1天的摄取量为10~500mg，更优选为50~200mg。另外，换算成菌体数，优选人体重的每1kg的1天的摄取量为108~10¹²cfu，更优选为10⁹~10¹¹cfu。另外，也可以与以前已知的具有抗过敏作用或预防、改善皮肤粗糙作用的医药品、食品并用。

实施例

制造例1:丙酸杆菌发酵物的制造方法

1.材料

<菌株>

费氏丙酸杆菌ET-3株(FERM BP-8115株)

<预培养用培养基>

将培养基量的10％(w/w)的乳清粉(明治乳业)和0.07％(w/w)的蛋白酶(蛋白酶A“Amano”G：米曲霉来源:天野酶公司)溶解于适量的离子交换水，对乳清粉中的蛋白质进行47℃、3小时的酶分解，分解后添加0.1％(w/w)的酵母提取物(P2G:朝日食物与健康株式会社)，pH调整为6.8~6.9之后，进行了121℃、15分钟的杀菌。其中，酶分解时的pH是用碳酸钾溶液调整为6.6~7.0。

<主培养用培养基>

将培养基量的3％(w/w)的脱脂乳粉(明治乳业)、3.4％(w/w)的MilkProtein Concent大鼠e(MPC:Murray Goulburn)和0.25％的蛋白酶(蛋白酶A“Amano”G)，溶解于适量的离子交换水，对脱脂乳粉及MPC的蛋白质进行47℃、6小时的酶分解，分解后添加0.5％的酵母提取物(P2G)，pH调整为6.8~6.9之后，进行了121℃、15分钟的杀菌。其中，酶分解时的pH为6.6~7.0，用碳酸钾溶液调整。

2.制造法

<预培养>

向预培养用培养基100mL接种ET-3株冻结菌(-80℃保存)1mL，实施37℃、48小时的厌氧下的静置培养，以该培养液作为主培养的起子（starter）。

<主培养>

向主培养用培养基2000mL接种20mL的预培养液，开始主培养。将培养温度调整为33℃，pH用碳酸钾水溶液调整为6.5。通气是以0.4L/min通氮，搅拌速度为150rpm。从培养开始72小时后，以0.90mL/h，经192小时流入添加1.5M的乳糖溶液(已进行121℃、15分钟的杀菌)，流入添加结束后将通气从氮换成氧，改为需氧培养，将需氧培养继续120小时结束培养，得到含有丙酸杆菌的培养液。

培养结束后，为了防止因丙酸杆菌生成的DHNA变成ACNQ，向培养液每1000mL当中添加抗坏血酸钠5g，以使抗坏血酸共存于发酵物中，得到丙酸杆菌发酵物。

上述发酵物的制造法是根据古市等的方法(Furuichi et al,Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production byPropionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture.Appl EnvironMicrobiol.2007；73(10):3137-43.)进行的。

在上述操作之后，丙酸杆菌发酵物0.5mL中所含的丙酸杆菌为2.43×10¹⁰cfu。

上述操作之后，通过下述HPLC分析，作为培养液所含物质确定了1,4-二羟基-2-萘甲酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))，培养液每1L中为0.34mM(68mg/L)，几乎未发现2-氨基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))。

<HPLC分析>

柱:Capcell pak C18SG120、填充剂粒径5μm、内径4.6mm、长度250mm(资生堂公司)

流动相:乙腈:甲醇:水:醋酸=250:100:900:0.6(用5％氨水调整为pH5.6)

流速:1mL/min

注入量:10μL

检测器:UV270nm

<HPLC样品的调制法>

培养液1mL中分别添加2.5mL的丙酮和乙酸乙酯混合后，以2000xg进行5分钟的离心分离，将其上清液用膜过滤器过滤。

试验例1:特应性皮炎的抑制试验(特应性皮炎的动物实验模型)

(1)概要

购买4周龄的NC/Nga雌小鼠(日本SLC公司)，分成以下4组。即，群分成皮炎激发组(蒸馏水给药组(n=7)[蒸馏水]、作为比较例的液体培养基(以下，也称为培养基)给药组(n=7)[培养基]和丙酸杆菌发酵物(液体)给药组(n=7)[丙酸杆菌发酵物])、以及皮炎未激发组(n=7)[未激发]之后，将各种试料在试验期间中(7天到27天)连日经经口给药(1日0.5mL/小鼠)。

在各种试料中，丙酸杆菌发酵物是用上述制造例1中所得物(含有68mg/L的DHNA、以及4.86×1010cfu/ml的丙酸杆菌)，液体培养基使用上述制造例1中制造的未接种丙酸杆菌的、已进行杀菌的主培养用培养基。

从经口给药开始后第7天(day0)起，通过后述方法对皮炎激发组激发皮炎，症状的变化进行记分化。并且，皮炎激发开始后的14、21、28天(14、21、28天)采血清，通过ELISA法测定了血清淀粉样蛋白A(serumamyloid A:SAA)和IgE浓度。SAA浓度是用Bio Source公司的ELISA kit测定的。测定遵从所附使用说明书。IgE浓度的测定是用Pharmingen公司制的抗体，部分改变Pharmingen公司推荐的规程测定的。

(2)螨破碎物溶液的制作

将屋尘螨的螨体(Mite-Dp，LSL公司制)用无水醚脱脂后，添加蒸馏水进行了超声波破碎。接着离心分离水溶性部分，冻干后，用蒸馏水调制成蛋白质浓度4.5mg/ml(BSA换算，以BioRAD公司的DC proteinassay测定)后使用。

(3)皮炎的激发

对海野等的方法(海野哲史等，アレルギー50:1152-1162、2001)进行了改变。将皮炎激发部位(头部、耳廓部及颈部)用理发推剪剃毛后，用对全小鼠的皮炎激发部位涂布20次的4%SDS水溶液(涂布量大约相当于60μL)。SDS水溶液干燥后，分别向皮炎未激发组涂布蒸馏水，向皮炎激发组涂布螨破碎物溶液，同样进行20次。通过1日1套每天反复上述操作而激发皮炎。

(4)IgE的测定

向96孔板以2μg/mL添加一抗用抗IgE抗体(Pharmingen公司制)，37℃下静置1小时。以0.05％的Tween20/PBS(PBS-Tween)清洗后，添加1％BSA/PBS，室温下静置30分钟。PBS-Tween清洗后，添加血清样品和标准曲线制作用IgE(Pharmingen公司制)，室温下静置30分钟。PBS-Tween清洗后，以0.5μg/mL添加二抗用的生物素-抗IgE抗体(Pharmingen公司制)，室温下静置1小时。用PBS-Tween清洗后，添加链霉亲和素-HRP(Pharmingen公司制)，室温下静置30分钟。用PBS-Tween清洗后，添加TMB+Substrate Chromogen(DAKO公司制)，开始显色反应。显色反应后，添加1N硫酸，用酶标仪测定在450nm的吸光度，计算了血清中的IgE浓度。

(5)结果

图1中表示皮炎症状记分的变化。记分化是对于1)形成乾皮·痂皮，2)皮肤发红·出血，3)组织脱落·擦伤，4)浮肿，5)搔痒动作的5项，以0(无症状)、1(轻度)、2(中间度)、3(重度)四等级进行评价，算出各小鼠的各记分的总和。其结果，关于症状记分，在丙酸杆菌发酵物给药组中，与蒸馏水给药组相比显著地变为低值(图1)。另一方面，在培养基给药组中虽然也变为低值，但与丙酸杆菌发酵物给药组相比仍为高值。

关于血清中的总IgE，发现在14天上，与蒸馏水给药组相比，丙酸杆菌发酵物给药组中的IgE浓度显著低(图2)。另一方面，与蒸馏水给药组相比，培养基给药组中也较低，但未能确定显著差异。

关于SAA，发现在14天上，与蒸馏水给药组相比，丙酸杆菌发酵物(上述制造例1的制取物)给药组中显著低(图3)。另一方面，在培养基给药组中虽然低于蒸馏水给药组，但未能确定显著差异。反之，在21天上，丙酸杆菌发酵物给药组中虽然低于蒸馏水给药组，但未能确定显著差异，而在培养基给药组中显著低于蒸馏水给药组。在28天上，丙酸杆菌发酵物给药组和培养基给药组的两者均比蒸馏水给药组显著低。

由上可知，本发明的丙酸杆菌发酵物，对特应性皮炎的发病抑制效果高。

试验例2:被动皮肤过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis:PCA反应)的抑制试验(急性过敏反应的动物实验模型)

(1)概要

将7周龄、雄性SD大鼠预备饲养后，以体重没有差别的方式分成以下4组。例数为7或8。1组:蒸馏水给药组，2组:丙酸杆菌发酵物给药组，3组:培养基给药组，4组:富马酸酮替芬(PCA反应的抑制试剂，和光纯药公司制)给药组。各大鼠的背部用理发推剪剃毛后，在此设置了PCA反应激发部位和PCA反应未激发部位。分别在上述PCA反应激发部位经皮内给药抗DNP-IgE抗体液(25ng/site，ICN公司制)，在上述PCA反应未激发部位经皮内给药生理食盐水。

各组所使用的各种试样，与试验例1相同。

IgE抗体或生理食盐水给药24小时后，为各组静脉给药作为抗原的结合了DNP的BSA(DNP-BSA:2,4-dinitrophenylated Bovine SerumAlbumin)(1mg/大鼠，LSL公司制)和埃文斯蓝(5mg/大鼠，和光纯药公司制)，激发PCA反应。丙酸杆菌发酵物、培养基或蒸馏水分别在PCA反应激发前的1、3、5小时经口给药10mL/kg(以固态成分换算1.7g/kg)，另外，富马酸酮替芬是在PCA反应激发前的1小时经口给药10mg/kg(3、5小时前给药蒸馏水)。PCA反应激发30分钟后从大鼠取背部皮肤，用1N氢氧化钾处理后，以丙酮和0.6N磷酸混液萃取埃文斯蓝，从620nm的吸光度计算向皮肤漏出的埃文斯蓝的量。

(2)结果

图4表示埃文斯蓝的漏出量。可知与蒸馏水给药组的PCA反应激发部位[蒸馏水]相比，丙酸杆菌发酵物给药组的PCA反应激发部位[丙酸杆菌发酵物]中显著降低(图4)。另一方面，在培养基给药组的PCA反应激发部位[培养基]中虽然也降低，但未能确定显著差异。

由上可知本发明的丙酸杆菌发酵物，对PCA反应的抑制此效果高。

制造例2:丙酸杆菌乳清发酵物的制造方法

1.材料

<菌株>

费氏丙酸杆菌ET-3株(FERM BP-8115株)

<预培养用培养基及主培养用培养基>

与制造例1的<预培养用培养基>的制作方法同样，调制了预培养用培养基和主培养用培养基。

2.制造方法

<预培养>

向预培养用培养基100mL接种ET-3株冻结菌(-80℃保存)1mL，实施37℃、48小时的厌氧下的静置培养，以该培养液作为主培养的起子。

<主培养>

向主培养用培养基接种2％预培养液，开始主培养。在氮气环境培养温度33~37℃下，继续培养66~96小时，得到含丙酸杆菌的培养液(丙酸杆菌乳清发酵物)。在试验例3的试验食物调制中，作为丙酸杆菌乳清发酵物使用该培养液本身。

试验例3:以干燥皮肤的人为对象的临床试验

(1)试验的概要

<试验对象>

具有干燥皮肤的20~39岁女性作为被试验者，实施了双盲安慰剂对照试验。试验开始前，根据医生观察作出的皮肤状况(干燥、脱屑、丘疹、粉刺、脓疱)，无偏差地将被试验者分组为3组。并且，本试验是遵守赫尔辛基宣言(2000年，爱丁堡大会修改)，基于伦理学原则实施的。

<试验食物>

设置了以下的3种类(试验食物A~C)。使用了上述制造例2中所得的丙酸杆菌乳清发酵物。

试验食物A:酸性饮料(安慰剂)[n=30]

水中添加了各种成分(果胶、乳酸、酸奶香精、维生素C、阿斯巴甜)而得到的物质。

不含乳成分及乳酸菌。

试验食物B:含丙酸杆菌乳清发酵物的酸性饮料(活性物1)[n=28]

向上述酸性饮料添加上述丙酸杆菌乳清发酵物1v/v%而得到的物质。

不含非来源于丙酸杆菌乳清发酵物的乳成分及乳酸菌。

试验食物C:含有丙酸杆菌乳清发酵物的酸奶饮料(活性物2)[n=28]

将市售的酸奶设为60v/v%，添加水、与添加于上述酸性饮料(安慰剂)相同浓度的各种成分、蔗糖及1v/v%的上述丙酸杆菌乳清发酵物而得到的物质。

其中，试验食物B和试验食物C的120ml中包含的DHNA含量为13.2μg。

<试验食物的摄取时间及摄取方法>

开始摄取试验食物的天~4周后为止的试验食物摄取期间，经口摄取1天120ml的试验食物。试验食物摄取期间，禁止了含试验食物以外的乳酸菌的食品(酸奶、发酵奶等)以及含低聚糖的食品的摄取、开始摄取新的补给品、开始新的美容目的治疗药的摄取与外用药的使用、以及美容目的手术(化学换肤等)。

(3)检查项目

在试验食物的摄取开始日的试验食物摄取前、和试验食物摄取开始4周后，实施了以下的检查。

角质层水分量:使用水分计Corneometer CM825(Courage+Khazaka electronic GmbH(德国)公司制)，对被试验者脸皮肤的角质层水分量，以静电容量值各测定2次，算出了平均值。

肌理:采用皮肤图像分析仪（Robo Skin Analyzer）RSA-100(Inforward公司制)，对被试验者脸皮肤纹理进行记分化。

在本发明中，将该记分值称为肌理记分，肌理记分越高表示皮肤纹理越整齐的状态。

并且，关于试验食物的摄取前后的测定值，对组内的配对检验(paired t-test)、和试验食物的摄取前后的测定值的变化量，通过3组间的多重比较检验(Tukey-Kramer法)进行了显著差别鉴定。

(4)结果

结果如图5及图6所示。角质层水分量、肌理记分的测定值均未能在试验食物A:酸性饮料(安慰剂)的摄取前后中确定显著差别。与此相对，在试验食物B:含丙酸杆菌乳清发酵物的酸性饮料(活性物1)、C:含丙酸杆菌乳清发酵物的酸奶饮料(活性物2)的摄取后，观察到了显著的角质层水分量、肌理记分的测定值的上升。并且，关于试验食物的摄取前后的测定值的变化量，无论角质层水分量还是肌理记分，试验食物B、试验食物C的摄取组均显著大于试验食物A摄取组。

由以上的结果可知，本发明的丙酸杆菌发酵物具有改善干燥皮肤的状态的效果。并且，可知与本发明的丙酸杆菌发酵物并用酸奶也能得到同样的效果。

Claims (10)

1.丙酸杆菌发酵物在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用。

2.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，所述发酵物是使用含乳制品的蛋白质分解酶处理物的培养基而培养了丙酸杆菌的培养液。

3.如权利要求2所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，乳制品是选自脱脂乳粉、乳清粉以及乳蛋白中的一种以上。

4.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，皮肤粗糙是角质层水分量减少而皮肤表面干燥的情况或者肌理变粗糙的情况。

5.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，对象者是干燥皮肤的人。

6.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，增加角质层水分量或者改善肌理。

7.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，丙酸杆菌是奶酪用丙酸杆菌。

8.如权利要求7所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，奶酪用丙酸杆菌选自费氏丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌、产丙酸丙酸杆菌。

9.如权利要求8所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其中，奶酪用丙酸杆菌是费氏丙酸杆菌。

10.如权利要求1所述的在制造皮肤粗糙预防、改善剂中的应用，其特征在于，所述皮肤粗糙预防、改善剂为经口给药用或经口摄取。

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