JPWO2007080962A1

JPWO2007080962A1 - 抗炎症組成物および抗炎症組成物の製造法

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Publication number: JPWO2007080962A1
Application number: JP2007553944A
Authority: JP
Inventors: 秀和殿内; 佐々木　一; 一佐々木; 粂　久枝; 久枝粂; 義信土屋
Original assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Current assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2009-06-11
Anticipated expiration: 2027-01-12
Also published as: JP5025491B2; WO2007080962A1

Abstract

【課題】本発明の課題は、カゼインの分解物等の、より高い活性を有する抗炎症組成物を見出す事である。【解決手段】本発明の抗炎症組成物はチーズまたはカゼイン等の原料を乳酸菌発酵および／または酵素処理して得られる。すなわち、チーズまたはカゼイン等の原料をLactococcus属の乳酸菌で発酵させ、さらにプロテアーゼまたはペプチダーゼからなる複数の酵素で処理するのが好ましい。

Description

本発明は抗炎症組成物およびその製造法、具体的にはTNF-α産生抑制、IL-6産生抑制等の抗炎症効果を高めた抗炎症組成物および本抗炎症組成物の製造法に関する。

Enzyme Modified Cheese（EMC）はチーズをプロテアーゼやリパーゼ等の酵素で分解して改変したものをいう。チーズフレーバーが増強されるため、チーズやその他食品に少量添加して風味の増強・改良を行うことを目的として使用される。これまでに報告されているEMCの機能として、チェダーチーズをニュートラーゼ（Bacillus amyloliquefaciens由来：Novozyme Corp.製）、Lactobacillus casei由来酵素、デビトラーゼの組み合わせによって分解したEMCから既知のACE阻害活性ペプチドを部分配列に含むペプチドが数種報告されているが、それら個々のペプチドについて活性の検討までは行われていない（非特許文献１）。

TNF-αは腫瘍に出血性壊死を誘導する因子として発見されたが、免疫系の調節にとっても重要な因子である。T細胞の増殖や分化を刺激するのみならず、B細胞の増殖や抗体産生の促進、マクロファージの組織適合性抗原発現や走化性の増強、好中球の走化性や貪食能の増強など多くの役割を持つ。また、TNF-αは炎症を誘起する。炎症はまさに生体防御反応であり、同時に病態形成の過程である。TNF-αが関与する病態としては、全身性炎症反応症候群（SIRS）、Helicobacter pylori感染、アレルギー性炎症、慢性関節リウマチ、びまん性肺疾患、肝疾患、胆道疾患、心臓障害、流産、妊娠中毒、血球貪食症候群、肥満、動脈硬化、神経疾患、腸管感染症、エイズ、老化などがある（非特許文献２）。

これまでに食品由来生理活性ペプチドが数多く報告されており、例えば、オピオイドペプチド（非特許文献３）、ミネラル吸収促進ペプチド（非特許文献４）、抗菌ペプチド（非特許文献５）、ACE阻害ペプチド（非特許文献６）等が挙げられ、抗炎症活性を有する食品由来タンパク分解物としては、乳清タンパク質のトリプシン分解物（特許文献１）およびラクトフェリンの分子量10,000以下のペプチド（特許文献２）が報告済みである。しかしながら、カゼイン分解物で抗炎症活性を有するものは報告されていない。

特開２００４−１５５７５１号公報特開平８−１６５２４８号公報 Haileselassie SS, Lee BH, Gibbs BF、Purification and Identification of Potentially Bioactive Peptides from Enzyme-Modified Cheese. 、J. Dairy Sci.、82、pp.1612-1617(1999) 今西二郎編著、「別冊・医学のあゆみ−サイトカインと疾患」、医歯薬出版、pp.3-116（2000年7月10日） Zioudrou C, Streaty RA, Klee WA、Opioid peptides derived from food proteins.、J. Biol. Chem.、254(7)、pp.2446-2449(1979) Kitts DD、Bioactive substances in food: identification and potential uses.、Can J Physiol Pharmacol、72(4)、pp.423-434(1994) Pellegrini A, Dettling C, Thomas U, Hunziker P、Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine beta-lactoglobulin.、Biochim. Biophys. Acta、1526(2)、pp.131-140(2001) Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K, Okubo A, Yamazaki S, Takano T.、Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from sour milk.、J. Dairy Sci.、78(4)、pp.777-783(1995)

本発明の課題は、カゼインの分解物等からなる、より高い活性を有する抗炎症組成物を見出す事である。

本発明者らは、EMCが、培養細胞を用いたin vitroの系およびマウスを用いたin vivoの系で抗炎症効果を有することを見出した。さらに、EMCがエタノールとリポポリサッカライド（以降、LPSともいう）で惹起されるアルコール性肝障害を緩和することも、ラットにおいて確かめられている。

本発明の抗炎症組成物は、チーズまたはカゼイン等を乳酸菌発酵および／または１または２種以上のプロテアーゼにより処理されたものであることを特徴としている。

すなわち、本発明は、
[１] カゼインを乳酸菌発酵および／または酵素処理して得られる抗炎症組成物、
[２] 酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼのうち１つあるいは複数の組み合わせである、[１]に記載の抗炎症組成物、
[３] 酵素がAspergillus oryzae 由来またはBacillus subtilis 由来のうち１つあるいは複数の組み合わせである、[１]〜[２]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[４] 乳酸菌がLactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus cremoris、Lactococcus diacetylactisのうち１つあるいは複数の組み合わせである、[１]〜[３]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[５] 肝炎の抑制用である、[１]〜[４]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[６] 抗炎症作用がグラム陰性菌またはLPSに起因するTNF-α産生の抑制である、[１]〜[５]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[７] 抗炎症作用が自己免疫疾患またはコンカナバリンA（Con A）に起因する肝炎の抑制である、[１]〜[５]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[８] 抗炎症作用がアルコール性肝障害の抑制である、[１]〜[５]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物、
[９] [１]〜[８]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物を有効成分として含有する炎症予防および／叉は治療用医薬品、
[１０] [１]〜[８]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物を含有する炎症予防および／叉は治療用飲食品、
[１１] [１]〜[８]のいずれか１つに記載の抗炎症組成物の製造方法、
からなる。

本発明の抗炎症組成物は、炎症、特にグラム陰性菌、自己免疫疾患、アルコール障害に起因する炎症の予防および／叉は治療に有効な組成物として有用である。また、少ない工程で効率よく抗炎症組成物を調製することが可能である。すなわち、飲食品、医薬品への添加が可能で安全性にすぐれた抗炎症組成物を簡便に提供できる利点がある。

実施例１実験３において、各濃度のEMCサンプルの示すTNF-α産生抑制効果を示す図である。平均値（n=2）を表す。実施例１実験４において、各群の示す血中GOT活性を示す図である。平均値±標準誤差（n=10）を表す。*：p<0.05（Mann-Whitney U-test）。実施例１実験４において、各群の示す血中GPT活性を示す図である。平均値±標準誤差（n=10）を表す。*：p<0.05（Mann-Whitney U-test）。実施例１実験４において、各群の示す血中IL-6濃度を示す図である。平均値±標準誤差（n=10）を表す。*：p<0.05（Unpaired t-test）。実施例１実験５において、各群の呼気中¹³CO₂濃度の変化（Δ¹³CO₂）を示すグラフである。平均値±標準偏差（n=5）を表す。*, **：陽性 vs. 陰性、* p<0.05, ** p<0.01 (Student's t-test)。#：陽性 vs. EMC、# p<0.05 (Student's t-test)。実施例２において、各濃度のチーズ酵素処理サンプルの示すTNF-α産生抑制効果を示す図である。平均値（n=2）を表す。実施例３において、各濃度のカゼイン酵素処理サンプルの示すTNF-α産生抑制効果を示す図である。平均値（n=2）を表す。

以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。

本発明の抗炎症組成物はカゼインを乳酸菌発酵および／または酵素処理して得られる。カゼインとしては、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、酸カゼイン、レンネットカゼイン等を用いることができる。入手容易な食品素材もカゼインの代わりに用いることができ、カゼインを多く含む食品素材としては、チーズ、脱脂乳、脱脂粉乳が例示できるが、チーズが特に好ましい。チーズは含有されるタンパク質の９５％がカゼインであるとされており（例えば、「乳の科学」、上野川修一編、朝倉書店）、ナチュラルチーズ、プロセスチーズのいずれもが好適に用いられる。また、脱脂チーズ、部分脱脂チーズ、スキムチーズであってもよい。カゼインは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ウマ、ブタ、ヒト等の哺乳類の乳から得る事ができる。また、本発明品が得られるのであれば、上記の方法のみならず、他の動物性、植物性、微生物由来等の原料を用いて製造してもよく、有機合成等の手法を用いて合成して製造してもよい。実施において、上記原料は単独あるいは複数を組み合わせて使用することができる。

乳酸菌発酵は、カゼイン等の原料を水又は温湯に分散、溶解し、脱脂乳培地で培養した乳酸菌スターターを添加して行う。さらに後述のプロテアーゼ等の酵素と併用してもよい。原料の濃度は別段制限はないが、あえて挙げるなら５〜７０重量％の濃度範囲とするのが好ましく、より好ましくは２５〜６５重量％、さらに好ましくは４０〜６０重量％の濃度範囲とすることができる。発酵開始時のpH、発酵時間、発酵温度は本発明品が得られるのであれば特に限定しないが、発酵開始時のpHは3.0〜7.5、好ましくは3.5〜6.5で行うことができる。発酵時間は0.5〜300時間、好ましくは100〜200時間で、発酵温度は20〜45℃、好ましくは30〜43℃で行うことができる。

乳酸菌スターターとして用いる菌は、乳酸菌であれば特に限定はない。あえて例を挙げるとすれば、Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、 Lactobacillus amylovorus、 Lactobacillus gallinarum、 Lactobacillus gasseri、 Lactobacillus johnsonii、 Lactobacillus casei、 Lactobacillus rhamnosus、 Lactobacillus zeae、 Lactobacillus reuteri、 Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus、 Lactobacillus delbruekii subsp. lactis、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus murinus、 Bifidobacterium animalis、 Bifidobacterium bifidum、 Bifidobacterium breve、 Bifidobacterium infantis、 Bifidobacterium longum、 Bifidobacterium pseudolongum、 Enterococcus faecium、 Enterococcus fecalis、 Streptococcus thermophilusについて好適に用いることができる。より好ましくは、Lactococcus属を用いることができる。本発明の実施において、乳酸菌は１種もしくは２種以上を組み合わせてもよい。組み合わせる場合には、それぞれの発酵は、同時でもよく、別々に行ってもよい。乳酸菌の組み合わせとして好適な例としてMM Culture（MM100：Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactisの３種類の菌を含む、Dairy Connection Inc (Wisconsin, USA)）をあげる事ができるが、この例に限定されない。また、スターターの調製に用いる培地は脱脂粉乳培地に限定されない。

酵素処理は、カゼイン等の原料や、上記発酵物の溶液に、酵素を添加して行う。酵素処理は乳酸菌発酵の前でも、乳酸菌発酵と同時でも、乳酸菌発酵の後いずれの時期に行ってもよい。また、本発明においては、乳酸菌発酵を行わず、酵素処理だけを行ってもよい。乳酸菌発酵と同様にチーズまたはカゼイン等の原料や、上記発酵物の濃度は別段制限はないが、あえて挙げるなら５〜７０重量％の濃度範囲とするのが好ましく、より好ましくは２５〜６５重量％、さらに好ましくは４０〜６０重量％の濃度範囲とすることができる。酵素処理開始時のpH、酵素処理時間、酵素処理温度は本発明品が得られるのであれば特に限定しないが、酵素処理時のpHは3.0〜7.5、好ましくは3.5〜6.5で行うことができる。酵素処理時間は0.5〜300時間、好ましくは100〜200時間で行う事ができる。酵素処理温度は20〜45℃、好ましくは30〜43℃で行うことができる。

乳酸菌発酵と併用する酵素および酵素処理に用いる酵素は、プロテアーゼまたはペプチダーゼのうち１つあるいは複数の組み合わせである。使用するプロテアーゼまたはペプチダーゼは特に限定されないが、例えば、食品グレードプロテアーゼは、エンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼ、エキソ型ペプチダーゼ／エンド型プロテアーゼ複合酵素、プロテアーゼ／ペプチダーゼ複合酵素を含む。エンド型プロテアーゼは、例えば、キモシン（EC 3.4.23.4、Maxiren、modified yeast Kluyveromyces lactis 由来、GIST-BROCADES N.V.）、AlcalaseR （Bacillus licheniformis 由来、ノボ社）、エスペラーゼ（B. lentus 由来、ノボ社）、NeutraseR （B. subtilis由来、ノボ社）、プロタメックス（バクテリア由来、ノボ社）、PTN6.0S（ブタ膵臓トリプシン、ノボ社）など、エキソ型ペプチダーゼ／エンド型プロテアーゼ複合酵素としては、例えばフレーバーザイム（Aspergillus oryzae 由来、ノボ社）などがあげられる。他に、エンド型プロテアーゼとして、例えば、トリプシン（CAS No.9002-07-7、EC 3.4.21.4、ウシ膵臓由来、Product No.T8802、SIGMA）、ペプシン（CAS No.9001-75-6、EC 3.4.4.1、ブタ胃粘膜由来、SIGMA）、キモトリプシン（ノボ社、ベーリンガー社）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（Bacillus subtilis 由来；天野エンザイム）、ビオプラーゼ（Bacillus subtilis 由来；ナガセ産業）、パパインＷ−40 （天野エンザイム）、エキソ型プロテアーゼとして、膵カルボキシペプチダーゼ、小腸刷子縁のアミノペプチダーゼなどがあげられる。また、プロテアーゼ／ペプチダーゼ複合酵素としては、例えばウマミザイムＧ（ペプチダーゼおよびプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム）を用いることができる。

酵素の由来は上記の記載に限定されず、動物、植物、微生物のいずれであってもよいが、Aspergillus oryzae 由来またはBacillus subtilis 由来のものが好適である。これらの酵素は商品名・由来・製造元など限定的なものを意味しない。本発明の実施において、酵素は１種もしくは２種以上を組み合わせてもよい。酵素の組み合わせとして、好適な例として、フレーバーザイム（Aspergillus oryzae 由来、ノボ社）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（Bacillus subtilis 由来；天野エンザイム）、ウマミザイムＧ（ペプチダーゼおよびプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム）を挙げることができるが、この例に限定されない。組み合わせる場合には、それぞれの酵素反応は、同時でもよく、別々に行ってもよい。

これらの乳酸菌および／または酵素は、単独あるいは複数種類の組み合わせで用いることができるが、酵素については複数種類を組み合わせて用いるのがより好ましい。乳酸菌発酵や酵素反応の停止は、殺菌や酵素失活、すなわち化学的処理、加熱処理などにより行うことが出来る。本発明の好適な例として、粉砕したチーズにMM Cultureから調製したスターター培養液およびプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇおよび塩化ナトリウムを添加して２日間分解し（発酵開始時のpHは5.5、発酵温度は34℃）、pHを4.1に調整した後に、さらにウマミザイムＧおよびフレーバーザイム添加して5日間撹拌分解し（温度は34℃）、分解終了後、pHを5.0に調整し、110℃にて15分間加熱して酵素を失活させる方法を挙げる事ができるが、この方法に限定されない。

さらに、本発明品は上記乳酸菌発酵および／または酵素処理物をそのまま、あるいは溶媒で希釈した可溶画分または不溶画分として得ることもできる。溶媒としては、水や通常用いられる溶媒、例えば、アルコール類、炭化水素類、有機酸、有機塩基、無機酸、無機塩基、超臨界流体等を単独あるいは複数を組み合わせて用いることができる。

このようにして得られた本発明品は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮または希釈した溶液として使用することもできる。さらには、この濃縮液を公知の方法により乾燥物として使用することもできる。また、単一の原料に由来するものを使用してもよく、異なる原料に由来するものを複数組み合わせて使用することもできる。

本発明の抗炎症組成物は炎症の予防および／叉は治療に有効な組成物として有用である。特に、グラム陰性菌、自己免疫疾患、アルコール障害に起因する炎症に対する効果が、LPS、Con A、アルコールで誘発させた炎症モデルにおいて確認されている。

LPSはグラム陰性菌の膜成分であり、細菌感染時等において哺乳動物等に強い発熱作用を惹起することが知られている。RAW 264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞株）をLPSで刺激するアッセイ系において、本発明の抗炎症組成物を予め添加して培養したところ、培養上清中のTNF-α量の上昇を濃度依存的に抑制する事ができた。抗炎症の指標として上記アッセイ系におけるTNF-α量を用いる場合、その産生阻害率は１３％以上であることが好ましく、さらに３０％以上がより好ましく、さらに５０％以上が特に好ましい。これまでに培養細胞を用いた検討で報告されているTNF-α産生抑制ペプチドについては、（１）ペプチドが直接LPSに吸着し、LPSのToll like receptorへの吸着を阻害する、（２）細胞内に取り込まれたペプチドがNF-κBの活性化を抑制し、サイトカインの転写レベルを下げる、等の事が確認されており、本発明品についても同様のメカニズムが考えられ、本発明品はグラム陰性菌感染症やエンドトキシン血症へ適用が可能であると実証された。

Con Aは、T細胞マイトジェンとして知られている。T細胞等の免疫担当細胞を過剰に刺激する作用があるため、自己免疫性肝炎のモデル作成に用いられる。Con Aによる肝障害の発症メカニズムは、Con AがT細胞やマクロファージといった免疫担当細胞表面の糖鎖に結合し、それら細胞を活性化させることによって種々のサイトカイン産生が起こることによる。マウスにCon Aを前投与するアッセイ系において、本発明の抗炎症組成物は血中IL-6、GOT、GPTの有意な上昇抑制効果を示した。このことから、本発明品がT細胞やマクロファージに作用して抗炎症効果を発揮した可能性が考えられ、本発明品は慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患へ適用が可能であると実証された。

過剰のアルコール摂取は肝障害を惹起することが知られている。そのメカニズムは、エタノール代謝（NADHの増加、アセトアルデヒドの産生等）、微少循環（Microcirculation）における酸素濃度低下、自己免疫反応等が報告されている。アルコール性肝硬変においてはエンドトキシン血症も出現しており、エンドトキシンによって活性化されたマクロファージや好中球から放出される各種サイトカイン（TNF、血小板活性化因子等）が臓器障害に重要な役割を果たすとされている（山村雄一、吉利和監修、「最新内科学大系５１」、中山書店、pp.78-84（1992年4月30日発行））。また、榎本らは、エタノールの経口投与後に肝臓のKupper細胞のLPSに対する感受性が増大する事を報告している。その機構としてはCD14（LPS受容体）蛋白およびLPS結合蛋白（LPB）の増大が関与する。さらに、エタノールによって腸管の透過性が高まるため、腸内のグラム陰性細菌に由来するエンドトキシン（LPSを含む）が血中に移行しやすくなる。このようにして活性化されたKupper細胞からはより多くのTNF-αが産生され、肝障害の誘発や進行を促進する。この現象に基づき、エタノールの経口投与とLPSの静脈内投与からなるアルコール性肝障害モデル動物の作成が試みられている（榎本信行他７名、アルコールと医学生物学、Vol.20、pp.121-126(2000)、および、Enomoto N et al、Hepatology、29(6)、pp.1680-1689(1999)、および、橋爪恵理香他５名、日本農芸化学会大会講演要旨集、Vol.2002、pp.155(2002)）。ラットにエタノールの経口投与とLPSの静脈内投与を施すアッセイ系において、本発明の抗炎症組成物は肝機能の低下を抑制する効果を示した。このことから、本発明品に存在するペプチドが肝障害に伴う肝機能低下に有用であることが実証された。

肝機能は、アミノピリンの代謝能を指標とした。動物にアミノピリンを投与すると、吸収された後、肝臓において代謝を受ける。このとき、肝臓のシトクロムP450 2D1で代謝され4-メチルアミノアンチピリンになり、これがさらに同酵素で代謝され、4-アミノアンチピリンとなる。この2段階の代謝に伴って生成するホルムアルデヒドが更に代謝を受けてCO₂が生成する。肝臓が障害を受けると、アミノピリン〜4-メチルアミノアンチピリン〜4-アミノアンチピリンの代謝が停滞するため、アミノピリンに由来するCO₂の排泄が減少する事になる。そこで、¹³C標識したアミノピリンを投与し、呼気中の¹³CO₂排泄を測定すると、肝臓が障害を受けたときの残存代謝能力を測定することが出来る。

本発明の抗炎症組成物は炎症の予防および／叉は治療に有効な組成物として炎症性疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節炎、リウマチ様脊髄炎、通風性関節炎、骨膜炎等の関節炎、腰痛、手術・外傷後の炎症、腫張の緩解、神経痛、口内炎、咽頭炎、膀胱炎、肝炎（ウイルス性、アルコール性等）、肝硬変、胃炎、膵炎、鼻炎、アトピー性皮膚炎、クローン病、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、悪性貧血、1型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーヴス病、不妊症等）、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患（IBD）、髄膜炎、炎症性眼疾患、炎症性肺疾患、糖尿病合併症など）、循環器系疾患（狭心症、心筋梗塞、うっ血性心不全、汎発性血管内凝固症候群など）、喘息アレルギー疾患、全身性エリトマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、乾せん、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、エイズ脳症等）、中枢神経障害（脳血管障害、頭部外傷、脊椎損傷、脳浮腫、多発性硬化症等）、毒血症（敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性菌敗血症、トキシンショック症候群など）、アジソン病、クロイツフェルトーヤコブ病、ウィルス感染症、移植時の拒絶反応、透析低血圧、骨粗鬆症等への応用が可能である。また、少ない工程で効率よく抗炎症組成物を調製することが可能である。すなわち、飲食品、医薬品への添加が可能で安全性にすぐれた抗炎症組成物を簡便に提供できる利点がある。

本発明の抗炎症組成物は医薬品又は飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、又は特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種の炎症の治療及び／又は予防することが期待される。また、液状、ペースト状、固形、粉末等の形態を問わず、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品等）に添加し、これを摂取してもよい。摂取量は対象とする症状や年齢、体重等によっても異なり、その有効性（効果）によって適宜定めることができる。

本発明の抗炎症組成物を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。

本発明の抗炎症組成物を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、適当量のカルシウムを含んでいてもよい。さらに適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、アミノ酸、ペプチド類などを添加してもよい。

以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。

[実験１]（EMCの調製）
（スターター培養液の調製）
20ｇのスキムミルク粉末（生化学用、和光純薬工業）を200mlの蒸留水に溶解し、滅菌して、10w/v%脱脂粉乳培地を調製した。ここに約0.1ｇのMM Culture（MM100：Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactisの３種類の菌を含む、Dairy Connection Inc (Wisconsin, USA)）を接種し、37℃で16時間培養した。

(調製方法)
ミートチョッパーにて粉砕したデンマークスキムチーズ（熟成期間6ヶ月）に蒸留水を加え、上記の方法で調製したスターター培養液、塩化ナトリウムおよびプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（プロテアーゼ、Bacillus subtilis由来、天野エンザイム）を添加した。発酵開始時のpHは5.5であった。発酵温度34℃で2日間撹拌分解した。クエン酸でpHを4.1に調整し、ウマミザイムＧ（ペプチダーゼおよびプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム）およびフレーバーザイム（エンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼ、Aspergillus oryzae由来、Novozymes A/S）添加した。34℃で5日間、撹拌して分解した。分解終了後、水酸化ナトリウムにてpHを5.0に調整し、110℃にて15分間加熱して酵素を失活させ、EMCを得た。表１に配合表を示す。

[実験２]（EMC中に含まれる遊離ペプチドの調製）
実験１にて製造したEMCに等量の水を添加して、10,000gで40分間遠心分離し、水溶性画分を回収した。本水溶性画分を凍結乾燥して遊離ペプチド画分とした。

[実験３]（培養細胞を用いたEMCのTNF-α産生抑制効果）
（方法）
RAW 264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞株）を37℃で培養し（培養液はRPMI1640（Sigma）にウシ胎児血清（三菱化学）10%および硫酸カナマイシン（GIBCO）1%添加して調製する）、1×10⁵ cells/mlで400μlずつ24穴プレートに播種した。続いて実験２で調製した遊離ペプチド（以降、EMC由来ペプチドともいう）を最終濃度100、500、1000μg/mlになるように添加した後、一晩培養した。ついで、LPSを0.1ng/mlの終濃度で添加して刺激し、LPS添加4時間後に培養上清を回収し、ELISA法で培養上清中のTNF-α量を測定した。

（結果）
結果を図１に示す。EMC由来ペプチドが、炎症性サイトカインであるTNF-αの産生を濃度依存的に抑制した。これまでに培養細胞を用いた検討で報告されているTNF-α産生抑制ペプチドは、（１）ペプチドが直接LPSに吸着し、LPSのToll like receptorへの吸着を阻害する、（２）細胞内に取り込まれたペプチドがNF-κBの活性化を抑制し、サイトカインの転写レベルを下げる、等の事が確認されており、EMCについても同様のメカニズムが考えられる。

[実験４]（Con A誘発肝障害モデルマウスを用いた肝炎抑制効果）
Con Aは、Ｔ細胞等の免疫担当細胞を過剰に刺激する作用があるため、自己免疫性肝炎のモデル作成に用いられる。
（方法）
実験動物は雄性6週齢C57BL/6マウスを日本SLC（株）より購入し、7日間馴化後、1群10匹でカゼイン群とEMC群に体重で群分けした。EMC由来ペプチドは実験２に従って調製した遊離ペプチドを用いた。群分け後、カゼイン群を表２の対照飼料で飼育し、EMC群を表２のEMC飼料で飼育した。飼育14日目にCon Aを12mg/kg静脈投与した。2, 4, 8および24時間後に採血を行い、血中GOT、GPT（8および24時間後）およびIL-6量（2, 4, 8および24時間後）を測定した。

表２に示す飼料は、AIN-93M精製飼料（オリエンタル酵母工業）を基礎に調製した。対照飼料は、タンパク質をカゼイン（ARACID 720、NZMP社）、コーンスターチをβコーンスターチ（オリエンタル酵母工業）で調製した。EMC飼料は、対照飼料のカゼインの半量を実験２で作製したEMC由来ペプチドに置換して調製した。

結果を図２、図３、図４に示す。EMC由来ペプチドを投与することによって、対照群と比較して血中IL-6、GOT、GPTの有意な上昇抑制効果が見られた。Con Aによる肝障害の発症メカニズムは、Con AがT細胞やマクロファージといった免疫担当細胞表面の糖鎖に結合し、それら細胞を活性化させることによって種々のサイトカイン産生が起こることによる。培養細胞と同様、EMC中に存在するペプチドがT細胞やマクロファージに作用して抗炎症効果を発揮した可能性が考えられる。

[実験５]（エタノールとLPSの併用投与によって誘導されるアルコール性肝障害に対するEMCの効果）
動物にアミノピリンを投与すると、吸収された後、肝臓において代謝を受ける。このとき、肝臓のシトクロムP450 2D1で代謝され4-メチルアミノアンチピリンになり、これがさらに同酵素で代謝され、4-アミノアンチピリンとなる。この2段階の代謝に伴って生成するホルムアルデヒドが更に代謝を受けてCO₂が生成する。肝臓が障害を受けると、アミノピリン〜4-メチルアミノアンチピリン〜4-アミノアンチピリンの代謝が停滞するため、アミノピリンに由来するCO₂の排泄が減少する事になる。そこで、¹³C標識したアミノピリンを投与し、呼気中の¹³CO₂排泄を測定すると、肝臓が障害を受けたときの残存代謝能力を測定することが出来る。本実施例１では、この系を用いてアルコール性肝障害に対するEMCの効果を示した。

（１）材料および方法
[動物実験]
実験動物は雌性4週齢SDラットを日本SLC（株）より購入し、7日間馴化後、1群5匹で陰性対照群、陽性対照群およびEMC群に体重で群分けした。群分け後、陰性対照群および陽性対照群は表２の対照試料、EMC群は表２のEMC試料を自由摂取させて２週間飼育した。EMC由来ペプチドは実験２に従って調製した遊離ペプチドを用いた。１５日目に各群にエタノール4g/kgを経口投与した（50v/v%エタノールとして投与した）。その6時間後に陽性対照群およびEMC群にLPS（E.coli055:B5由来、Sigma-Aldrich Co.）を1.66mg/kg尾静脈投与し（投与容量は2ml/kg）、陰性対照群には同容量の生理食塩水を尾静脈投与した。LPSまたは生理食塩水投与から20時間後、各群に¹³C標識したアミノピリン（以降、¹³C-アミノピリンともいう）を20mg/kg経口投与して（投与容量は10ml/kg）、その直後、個体毎にラットをデシケーターに入れ、以降、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、180、210、240分後の呼気を経時的に採取した。デシケーター内に排泄された呼気を速度150ml/minで吸引してUBiT・POCone専用呼気採取バッグ20（大塚製薬株式会社）に呼気を採取した。具体的には以下に示す方法で呼気採取を行い、各時点で1.5分間の呼気を採取した。

[呼気採取装置]
容積2Lのデシケーター内に数ミリメートルの小孔を多数有する板状の中敷きを敷き、その上にラットを乗せ、ふたを閉め、呼気採取口または空気採り入れ口以外の部分から呼気が漏れないようにふたを固定した。デシケーターの側面開口部（空気採り入れ口）よりシリコンチューブを通し、チューブ開口部の一端をデシケーター底面に固定して呼気採取口とした。シリコンチューブは空気採り入れ口より径の小さいものを用いる。呼気は中敷きの下に設けた呼気採取口から移送することになる。チューブ開口部の他端はUBiT・POCone専用呼気採取バッグ20に接続し、デシケーターとUBiT・POCone専用呼気採取バッグ20の間にペリスタポンプ（Master Flex L/S; Cole-Parmer Instrument Company）を接続し、デシケーター内に排泄された呼気を一定速度150ml/minでそれぞれ継続的に吸引してUBiT・POCone専用呼気採取バッグ20に採取した。

（２）評価
呼気を採取したUBiT・POCone専用呼気採取バッグ20をUBiT-IR300に接続したUBiT-IR300専用オートサンプラー UBiT-AS10（大塚製薬株式会社）へ接続し、混合ガス(O₂:95%、CO₂:5%)を対照として呼気中のΔ¹³CO₂を測定した。評価は個体毎に経時的なΔ¹³CO₂測定値、Cmax（最高Δ¹³CO₂測定値）、Tmax（最高Δ¹³CO₂測定値発現時間）を表示する。さらに¹³C-アミノピリン投与から0〜240分のAUC（Δ¹³CO₂測定値-時間曲線下面積）を台形面積法にて算出した。

（３）結果および考察
経時的なΔ¹³CO₂測定値を図５、Cmax、Tmax、AUCを表３に示す。陰性群と比較して陽性群では、アミノピリン投与後20-210分で有意に¹³CO₂排出量が減少しており、エタノールとLPS併用投与によって肝代謝能力の低下が見られた。
それに対して、EMC群はアミノピリン投与後30-80分において陽性群と比較して有意に¹³CO₂排出量が増加しており、エタノールとLPS併用投与によって低下した肝代謝能力を有意に抑制する効果を示した。
また、Cmaxについては、陽性群は陰性群に比べて有意に低下しているが、EMC群は陽性群に対して有意に高い値を示した。Tmaxはいずれの群間に有意な差が認められなかった。AUCについても、陽性群は陰性群に比べて有意に減少した。しかし、EMC群と陽性群に有意差はみられなかった。

上記表３は、各群の呼気中¹³CO₂濃度の変化（Δ¹³CO₂）におけるCmax、Tmax、AUCを示す。平均値±標準偏差（n=5）を表す。*：陽性 vs. 陰性、* p<0.05 (Student's t-test)。#：陽性 vs. EMC、# p<0.05 (Student's t-test)。

次に、チーズのプロテアーゼ処理物について、TNF-α産生抑制効果を確認した。
[実験１]（チーズのプロテアーゼ処理物の調製）
(調製方法)
ミートチョッパーにて粉砕したデンマークスキムチーズ（熟成期間6ヶ月）に蒸留水を加え、塩化ナトリウムおよびプロテアーゼN「アマノ」G（プロテアーゼ、Bacillus subtilis由来、天野エンザイム）を添加した。34℃で2日間撹拌分解後、クエン酸でpHを4.1に調整し、ウマミザイムG（ペプチダーゼおよびプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム）およびフレーバーザイム（エンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼ、Aspergillus oryzae由来、Novozymes A/S）を添加した。34℃で5日間撹拌分解した。分解終了後、水酸化ナトリウムにてpHを5.0に調整し、110℃にて15分間加熱して酵素を失活させた。配合は表1からスターター培養液を除いたものである。
[実験２]（プロテアーゼ処理物に含まれる遊離ペプチドの調製）
実験１にて製造したプロテアーゼ処理物に等量の水を添加して、10,000gで40分間遠心分離し、水溶性画分を回収した。本水溶性画分を凍結乾燥して遊離ペプチド画分とした。

[実験３]（培養細胞を用いたEMCのTNF-α産生抑制効果）
この調製物について、実施例１の実験３と同様の方法にて、TNF-α産生抑制効果を調べた。なお、実験２で調製した遊離ペプチドを最終濃度500、1000μg/mlになるように添加した。その結果を図６に示す。チーズの酵素処理物由来のペプチドが、炎症性サイトカインであるTNF-αの産生を濃度依存的に抑制し、EMCと同様に抗炎症作用があると考えられる。

次に、カゼインのプロテアーゼ処理物について、TNF-α産生抑制効果を確認した。
[実験１]（カゼインのプロテアーゼ処理物の調製）
(調製方法)
Na Casein（NZMP社製）に蒸留水を加え、塩化ナトリウムおよびプロテアーゼN「アマノ」G（プロテアーゼ、Bacillus subtilis由来、天野エンザイム）を添加した。34℃で2日間撹拌分解後、クエン酸でpHを4.1に調整し、ウマミザイムG（ペプチダーゼおよびプロテアーゼ、Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム）およびフレーバーザイム（エンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼ、Aspergillus oryzae由来、Novozymes A/S）を添加した。34℃で5日間撹拌分解した。分解終了後、水酸化ナトリウムにてpHを5.0に調整し、110℃にて15分間加熱して酵素を失活させた。配合表は表４に示すとおりである。

[実験２]（プロテアーゼ処理物に含まれる遊離ペプチドの調製）
実験１にて製造したプロテアーゼ処理物に等量の水を添加して、10,000gで40分間遠心分離し、水溶性画分を回収した。本水溶性画分を凍結乾燥して遊離ペプチド画分とした。

この調製物について、実施例２の実験２、３と同様の方法にて、カゼインのプロテアーゼ処理物中に存在するペプチドのTNF-α産生抑制効果を調べた。その結果を図７に示す。カゼインの酵素処理物由来のペプチドが、炎症性サイトカインであるTNF-αの産生を濃度依存的に抑制し、EMCと同様に抗炎症作用があると考えられる。

以上実施例１〜３の結果から、EMCに限らず、カゼインやカゼインが含有タンパク質のほとんどを占めるチーズを酵素処理することによって、優れた抗炎症作用を有する組成物が得られることが示された。

抗炎症作用を有するため、同機能を有する医薬品または飲食品として応用が可能である。

Claims

カゼインを乳酸菌発酵および／または酵素処理して得られる抗炎症組成物。
酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼのうち１つあるいは複数の組み合わせである、請求項１に記載の抗炎症組成物。
酵素がAspergillus oryzae 由来またはBacillus subtilis 由来のうち１つあるいは複数の組み合わせである、請求項１または２のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
乳酸菌がLactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus cremoris、Lactococcus diacetylactisのうち１つあるいは複数の組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
肝炎の抑制用である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
抗炎症作用がグラム陰性菌またはリポポリサッカライド(LPS)に起因するTNF-α産生の抑制である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
抗炎症作用が自己免疫疾患またはコンカナバリンA（Con A）に起因する肝炎の抑制である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
抗炎症作用がアルコール性肝障害の抑制である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗炎症組成物。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗炎症組成物を有効成分として含有する炎症予防および／叉は治療用医薬品。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗炎症組成物を含有する炎症予防および／叉は治療用飲食品。
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗炎症組成物の製造方法。