JP4689060B2 - 免疫賦活組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫賦活組成物、より詳しくは、免疫賦活作用に優れている低分子免疫賦活物質BT−1を含有することを特徴とする免疫賦活組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
乳酸菌を有効成分として含有する免疫賦活剤は、従来から知られている(特開平6−80575号、特開平1−242532号など)。また、乳酸菌に含まれる免疫賦活成分についても研究されており、乳酸菌の細胞壁画分や乳酸菌の生産する多糖体が免疫活性を有することが報告されている(C.I.Parkら,Milchwissenschaft,46,87(1991);H.Yasuiら、J.Dairy Sci.,74,1187(1991);M.Nagaokaら,J.Biochem.,108,568(1990);北澤春樹ら,酪農化学・食品の研究,40,A−261,(1991))。また、乳酸菌菌体の細胞質画分を含有する免疫賦活剤も知られている(特開平5−252900号)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安定性が高く、かつ体内に吸収されやすい免疫賦活成分を含有する免疫賦活組成物を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、乳酸菌およびその代謝産物に含まれる免疫賦活成分についてさらに検討を加えたところ、下記実証から明らかなように、例えば乳酸菌の破砕液、そこから得られる細胞質画分もしくは細胞壁、または培養上清などに含まれる低分子量の免疫賦活物質(以下「BT−1」という)は、免疫賦活作用を発揮しない状態(不活性状態)にあり、かかる乳酸菌処理物に対し例えばゲルろ過クロマトクラフィーを用いて分子量の相違により分離するなどの本発明において行う活性化処理を施すと、BT−1は免疫賦活作用を発揮する状態(活性状態)に誘導されるという思いがけない知見を得た。
なお、上述の乳酸菌を用いた従来の免疫賦活剤においては、上記のような活性化処理を施していないので、たとえBT−1が含まれていたとしても、それそのものは不活性BT−1であって、免疫賦活作用に貢献していない。
【0005】
上記の記載を裏付ける実証として、より詳しくは、本発明者らによる下記実験結果が挙げられる。すなわち、免疫賦活活性を示すことが確認された乳酸菌の培養上清をイオン交換クロマトグラフィーで分離すると、免疫賦活活性を示す画分と示さない画分が存在した。免疫賦活活性を示さない画分について、ゲルろ過クロマトクラフィーを用いて分子量の相違により分離すると、思いがけないことに分子量約10kDa程度以下の低分子量画分で免疫賦活活性が見られた。
また、免疫賦活活性を示すことが確認された乳酸菌の培養上清をゲルろ過クロマトクラフィーを用いて分子量の相違により分離したところ、分子量100kDa以上の高分子量の画分と、分子量約10kDa程度以下の低分子量画分のそれぞれで免疫賦活活性が見られた。ゲルろ過クロマトクラフィーによる分離前の培養上清が示す免疫賦活活性の強さは、上記高分子量画分と低分子量画分とが示す免疫賦活活性の強さの和になるはずであるのに、実際は上記高分子量の画分が示す免疫賦活作用の強さしか示さなかった。従って、ゲルろ過クロマトクラフィーによる分離前の培養上清に含まれるBT−1は免疫賦活作用を示さない不活性状態にあるといえる。
【0006】
また、免疫活性を示すことが確認された乳酸菌の培養上清をゲルろ過クロマトクラフィーを用いて分子量の相違により分離した際に、免疫賦活作用を示した高分子量画分においては、免疫活性の強さが経時的に減少した。すなわち、かかる高分子量の免疫賦活成分は安定性に劣ったものであることが示唆された。これに対し、前述の低分子量の画分においては、免疫活性の強さが経時的に減少することはなかった。従って、活性BT−1は安定性に優れているといえる。さらに、低分子量であるがゆえに活性BT−1は体内で吸収されやすい。かかる知見に基づき、さらに検討を重ね、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、
(1)活性BT−1を含有することを特徴とする免疫賦活組成物、
(2)活性BT−1を含有する細胞またはBT−1を含有する細胞の処理物を含むことを特徴とする前記(1)に記載の免疫賦活組成物、
(3)細胞が、BT−1産生を誘導する条件下で培養して得られる細胞であることを特徴とする前記(2)に記載の免疫賦活組成物、
(4)細胞が、AMC培地で培養して得られる細胞であることを特徴とする前記(3)に記載の免疫賦活組成物、
(5)細胞が、菌体であることを特徴とする前記(2)〜(4)に記載の免疫賦活組成物、
(6)AMC培地で培養して得られる菌体の処理物であって、分子量10kDa以下の低分子量画分を含むことを特徴とする前記(2)に記載の免疫賦活組成物、
(7)菌体が、Bifidobacterium bifidumまたはBifidobacterium longumであることを特徴とする前記(5)または(6)に記載の免疫賦活組成物、
(8)不活性BT−1を含有し、該不活性BT−1を細胞外に放出する細胞を含み、細胞外で不活性BT−1が活性化状態になることを特徴とする免疫賦活組成物、
(9)パイエル板細胞賦活組成物である前記(1)〜(8)に記載の免疫賦活組成物、
(10)不活性BT−1を含有する細胞またはその細胞の処理物を、分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離し、分子量10kDa以下の低分子量画分を含む画分を採取することを特徴とする前記(1)に記載の免疫賦活組成物の製造方法、
(11)不活性BT−1を含有する細胞またはその細胞の処理物に含まれる不活性BT−1を活性BT−1に変換し、該変換された活性BT−1を生体に作用させることを特徴とする生体の免疫賦活方法、
に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明において「活性BT−1」とは、細胞に含まれる分子量が約10kDa程度以下の免疫賦活成分をいう。ここで、免疫賦活成分とは、免疫賦活作用を発揮する成分のことであり、具体的には、実施例に記載した方法で免疫活性を測定した場合、その値(刺激率IS)が3以上である成分が好ましい。また、「不活性BT−1」とは、上記活性BT−1が阻害物質の存在などにより免疫賦活作用を発揮し得ない状態、つまり不活性な状態にある場合の該BT−1を差す。
【0009】
本発明は、上記活性BT−1を含有する免疫賦活組成物を提供する。該免疫賦活組成物に含まれる活性BT−1は、安定性に優れ、かつ低分子であるがゆえに体内に吸収されやすいという利点がある。
本発明に係る該免疫賦活組成物の一態様としては、例えば、活性BT−1を含有する細胞またはBT−1を含有する細胞の処理物を含む免疫賦活組成物が挙げられる。
【0010】
本発明に係るBT−1を含有する細胞の処理物としては、例えば、(a)活性BT−1を含有する細胞(以下、「活性BT−1含有細胞」と略称することもある)の処理物、または(b)不活性BT−1を含有する細胞(以下、「不活性BT−1含有細胞」と略称することもある)を処理し、または該細胞の処理物に対しさらに処理を加えて、BT−1阻害物質を除くなどして、BT−1を活性状態、すなわち免疫賦活作用が発揮できる状態にした不活性BT−1含有細胞の処理物が挙げられる。
【0011】
上記(a)活性BT−1含有細胞の処理物とは、活性BT−1含有細胞に処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該細胞の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液もしくは培養上清、それらを濾過ないし遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素もしくは機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理もしくは塩析処理などして得られるタンパク質複合体(タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など)やペプチド複合体(ペプチド、糖ペプチド等)なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物またはこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。また、該細胞の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液もしくは培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーにより分離した画分などのようにさらに処理を加えたものも本発明における該処理物に含まれる。
【0012】
上記(b)において、不活性BT−1含有細胞の処理物としては、不活性BT−1含有細胞に対し、上述のような処理を施した処理物が挙げられる。
また、不活性BT−1含有細胞または該処理物に含まれる不活性BT−1を活性状態にするための処理としては、不活性BT−1を含有する細胞または当該細胞の処理物を分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離し、分子量10kDa以下の低分子量画分を含む画分を採取するという処理が好ましい。より具体的には、不活性BT−1含有細胞の処理物、例えば超音波などによる破砕液、該細胞の培養液または培養上清などから、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、低分子量画分、好ましくは約10kDa程度以下の画分もしくは当該画分含有物を採取するという処理がより好ましい。
【0013】
本発明の「活性BT−1含有細胞」または「不活性BT−1含有細胞」における細胞としては、例えば微生物、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞などが挙げられる。微生物としては、例えば乳酸菌などの原核生物であってもよいし、例えば酵母などの真核生物であってもよい。
中でも、該細胞としては、菌体が好ましく、腸内細菌がより好ましい。腸内細菌とは、腸内に住みついている細菌類の総称であり、具体的には、例えば、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. plantalum、L. delbrueckii subsp bulgaricus、L. delbrueckii subsp lactis等のラクトバチルス属(乳酸桿菌ともいう);例えば、Leuconostoc mecenteroides、Streptococcus(Enterococcus) faecalis、Streptococcus(Enterococcus) faecium、 Streptococcus(Enterococcus) hirae、Lactococcus lactis、Streptococcus thermophilus等の乳酸球菌;Bifidobacterium bifidum、B. longum、 B. breve、B. adrecentis、B. infantis、B.pseudolongum、B.thermophirum等のビフィドバクテリウム属(ビフィズス菌ともいう);例えば、フラジリス菌またはメラニノジェニカス菌などのバクテロイデス(Bacteroides)属;例えば、エアロファシエンス菌などのユウバクテリウム(Eubacterium)属;例えば、アネロビウス菌などのペプトストレプトコッカス(Peptstreptcoccus)属;例えば、フェカーリス菌などのエンテロコッカス(Enterococcus)属;例えば、エアロジェネス菌などのエンテロバクター(Enterobacter)属;例えば、アクネス菌などプロピオニバクテリム(Propionibacterium)属;例えば、ミュータンス菌などのストレプトコッカス(Streptococcus)属;例えば、マルチアシダ菌などのミツオケラ(Mitsuokella)属;例えば、ブェントリキューリ菌などのサルシナ(Sarcina)属;例えば、ブローミ菌などのルミノコッカス(Ruminococcus)属;例えば、パルブラ菌などのベーヨネラ(Veillonella)属;例えば、エルスデニ菌などのメガスフェラ(Megasphaera)属に属する微生物などが挙げられる。
【0014】
さらに、該細胞として、Bifidobacterium bifidum、B. longum、 B. breve、B. infantis等のビフィドバクテリウム属、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. bulgaricus等のラクトバチルス属、またはEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、 Streptococcus lactis、Streptococcus thermophilus等の乳酸球菌を用いるのがより好ましく、中でも、Bifidobacterium bifidumまたはB. longumを用いるのが最も好ましい。さらに、Bifidobacterium bifidumの菌株のうち、E−139を用いるのがさらに好ましい。
なお、上記細胞は、例えばATCCもしくはIFOなどの機関や財団法人 日本ビフィズス菌センターなどから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
【0015】
本発明において、上述のような細胞は、精製したものであっても良いし、粗精製した程度の純度のものを用いてもよい。また、該細胞の状態は問わず、生きていても死んでいてもよく、また凍結乾燥されたものであってもよい。さらに、上記細胞を単独で用いてもよいし、2種以上を混合して用いてもよい。
【0016】
本発明に係る活性BT−1含有細胞としては、上記細胞のうち活性BT−1を含有している細胞であればよいが、中でも活性BT−1を細胞外に放出できる細胞が好ましい。該活性BT−1を細胞外に放出できる細胞としては、BT−1を常に細胞外に放出するものであってもよいし、ある特定の条件(環境)下で細胞外に放出するものであってもよい。
このように活性BT−1が細胞外に放出されることにより、本発明に係る免疫賦活組成物の製造において、所望の免疫賦活作用を得るため、活性BT−1含有細胞またはその処理物から活性BT−1を抽出するという工程が必要なくなるので、安価な製品が供給できる。さらに、上記細胞を生きたままの状態で摂取または投与し、該摂取または投与した生体内で上記細胞を培養増殖させることにより、活性BT−1を持続的に摂取または投与することも可能となる。
【0017】
また、本発明に係る不活性BT−1含有細胞としては、上記細胞のうち不活性BT−1を含有している細胞であればよいが、中でもBT−1を細胞外に放出できるものが好ましい。さらに、放出されたBT−1が該細胞を投与または摂取した生体内などの細胞外において活性化状態となれば、上記のような理由から、より好ましい。しかし、放出されたBT−1は不活性状態であってもよい。なぜなら、例えば培養液などの細胞外液を、例えばゲルろ過クロマトグラフィーにかけ低分子量画分のみを取り出すなど、不活性BT−1を活性な状態にすることは可能だからである。このようなBT−1を不活性な状態で放出する不活性BT−1含有細胞としては、具体的には、例えば、Bifidobacterium bifidumもしくはB. longumなどの上記ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス属菌または乳酸球菌等が挙げられる。
【0018】
本発明に係る活性BT−1含有細胞としては、常にBT−1を活性な状態で含有している細胞に限らず、BT−1産生を誘導する条件下においた場合またはBT−1産生を誘導する条件下で培養した場合にのみ、BT−1を産生し、該BT−1を活性状態で含有することとなる細胞であってもよい。
また、不活性BT−1含有細胞としては、常にBT−1を不活性な状態で含有している細胞に限らず、BT−1産生を誘導する条件下においた場合またはBT−1産生を誘導する条件下で培養した場合にのみ、BT−1を産生し、該BT−1を不活性状態で含有することとなる細胞であってもよい。より具体的には、AMC培地で菌体、好ましくは腸内細菌、より好ましくはBifidobacterium bifidumまたはB. longumなどの上記ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス属菌または乳酸球菌等を培養すると、BT−1を不活性状態で含有し、かつBT−1を不活性な状態で菌体外に放出できる細胞が得られる。ここで、AMC培地としては、カサミノ酸(Casamino acid)0.5重量%、バクティトリプトン(Bactitryptone)0.5重量%、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸、Tween80を含有し、pH6.8の培地が挙げられる。より好ましくは、実施例に記載のAMC培地が挙げられる。
培養条件は、培地や培養細胞によって異なるので一概には言えない。例えば、BT−1産生の誘導条件として上記AMC培地を用いてBifidobacterium bifidumを培養する場合は、約37℃程度で、約2日間程度静置培養するのが好ましい。
【0019】
本発明のより好ましい態様としては、Bifidobacterium bifidum、B. longum、 B. breve、B. infantis等のビフィドバクテリウム属、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. bulgaricus等のラクトバチルス属、またはEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、 Streptococcus lactis、Streptococcus thermophilus等の乳酸球菌、好ましくはBifidobacterium bifidumまたはB. longumを、AMC培地、好ましくは実施例に記載のAMC培地で培養する。その培養上清または超音波による菌体粉砕物を、ゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、低分子画分、好ましくは約10kDa以下の画分を採取し、本発明に係る免疫賦活組成物とするという態様が挙げられる。ゲルろ過クロマトグラフィーの分離条件は、実施例に記載の条件が好ましい。
【0020】
本発明に係る免疫組成物は、(a)活性BT−1含有細胞またはその細胞の処理物に含まれる活性BT−1、または(b)不活性BT−1含有細胞もしくはその細胞の処理物に含まれる不活性BT−1を活性BT−1に変換し該変換された活性BT−1を、生体に作用させることを特徴とする。
ここで、不活性BT−1を活性BT−1に変換する方法としては、不活性BT−1を含有する細胞またはその細胞の処理物を分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離し、分子量10kDa以下の低分子量画分を含む画分を採取するという方法が好ましい。より具体的には、不活性BT−1含有細胞の処理物、例えば超音波などによる破砕液、該細胞の培養液または培養上清などから、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、低分子量画分、好ましくは約10kDa程度以下の画分もしくは当該画分含有物を採取するという方法がより好ましい。
【0021】
本発明に係る組成物が有する免疫賦活作用としては、免疫機能に作用しこれを増強するものであれば、その作用および機序は限定されない。具体的に免疫賦活作用としては、例えばリンパ節細胞の免疫応答の向上、脾臓細胞または/および胸腺細胞の活性化、骨髄由来のB細胞の活性化、パイエル板細胞の賦活化(例えば、IgA抗体などの腸管内分泌抗体の産生増強など)等が挙げられる。中でも、本発明に係る免疫賦活組成物は、腸管免疫の要であるパイエル板細胞の賦活作用を有するものが好ましい。
【0022】
本発明にかかる免疫賦活組成物は、医薬として用いることができる。本発明の医薬としての免疫賦活組成物は、上記(a)活性BT−1、(b)活性BT−1を含有する細胞またはBT−1を含有する細胞の処理物、または(c)不活性BT−1を含有し、不活性BT−1を細胞外に放出する細胞(以下、これらをまとめて「本発明に係る免疫賦活成分」という)をそのまま投与してもよい。しかし、一般的には、有効成分である本発明に係る免疫賦活成分と1または2以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。
このような医薬組成物は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。
【0023】
経口投与に適する液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類;ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類;ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類;p−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。
また、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤;澱粉、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤;ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤;脂肪酸エステルなどの界面活性剤;グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。
【0024】
非経口投与に適する製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくは体液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。
腸内投与のための坐剤は、例えばカカオ脂、水素化脂肪または水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができる。
噴霧剤は、口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である本発明に係る免疫賦活成分を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。本発明に係る免疫賦活成分および用いる担体の性質により、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。
非経口用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1または2以上の製剤用添加物を用いることができる。
なお、本発明の医薬の形態およびその製造方法は、上記に具体的に説明したものに限定されることはない。
【0025】
本発明の医薬としての免疫賦活組成物の投与経路、投与量および投与頻度は特に限定されず、本発明に係る免疫賦活成分の種類、治療すべき病態の種類、患者の年齢および体重、症状、および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。
投与経路としては経口投与が好ましい。また、例えば、Bifidobacterium bifidumまたはB. longumが本発明に係る免疫賦活成分として含有されている免疫賦活組成物を経口投与で全身投与する場合は、その投与量は成人一日あたり約0.1〜1500mg/kg/day程度であることが好ましい。また、該組成物を静脈投与および筋肉投与する場合は、その投与量は約0.01〜1200mg/kg/day程度であることが好ましい。しかし、投与量はこの特定の例に限定されることはない。
【0026】
本発明に係る免疫賦活組成物は、医薬のみならず、例えば、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、育児用粉乳またはドリンク剤などの飲食品として使用してもよい。食品として用いられる場合には、顆粒、錠菓、ガム、キャンディ、ゼリー、飲料等の形で提供されうる。食品として本発明に係る免疫賦活組成物を用いる場合、本発明に係る免疫賦活成分の含有量は、該成分の種類などに応じて適宜選択することが可能である。例えば、Bifidobacterium bifidumまたはB. longumを本発明に係る免疫賦活成分として含有する場合は、約1.0×105個/g以上、好ましくは約1.0×106〜1.0×1012個/g程度の該菌体が食品としての本発明に係る免疫賦活組成物に含有されていることが好ましい。
【0027】
本発明に係る免疫賦活組成物は、例えば、食物アレルギーや常在細菌フローラなどの抗原性物質、またはウィルスもしくは病原菌等の感染性微生物に対する生体防御能を生体に付与するのに利用することができる。また、本発明に係る免疫賦活組成物を育児用粉乳に配合した場合は、上記抗原性物質もしくは感染性微生物によって引き起こされる人工栄養児等の各種疾患を予防することもできる。ただし、該免疫賦活組成物の利用は、これに限定されない。また、本発明に係る免疫賦活組成物は、ヒトのみならず哺乳動物(例、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル、ヒト等)に対しても適用できる。
【0028】
【実施例】
〔実施例1〕
〔培養上清の取得〕
Bifidobacterium bifidumの保存菌株(E−139)を37℃で嫌気培養したものを種菌とした。この種菌を30mLの下記組成のVF培地に1/100量接種し、37℃で嫌気培養した。培養後、3600回転/分で10分間遠心分離を行い上清を除去し、得られた菌体を3Lの下記組成のAMC培地に 懸濁し37℃で48時間嫌気培養した。得られた培養液を3600回転/分で10分間遠心分離を行い上清を分取し、これを培養上清すなわち試料検体とした。
【0029】
VF培養液の組成
牛肉・肝臓浸出液 1000mL
カゼイン製ペプトン 10g
ブドウ糖 10g
ポリソルベート80 1g
L−システイン 0.5g
これらを混合し、pH6.9±0.1に調製した後、高圧蒸気滅菌(121℃で15分間)を行い使用した。
【0030】
【表1】
以上の成分を蒸留水に溶解させてpH6.8に調整し、高圧蒸気滅菌(115℃で20分間)を行う。
【0031】
〔ゲルろ過カラムクロマトグラフィー〕
上記のようにして得られた培養上清(試料検体)1mLにつき、次の条件で液体クロマトグラフ法による分離を行った。
【0032】
〔免疫賦活活性測定方法〕
液体クロマトグラフ法により分離された10KDa以下の画分(Fraction)(以下、BT−1という)について、以下のようにして免疫賦活活性をしらべた。
C57BL/6マウス(雄 6週齢)またはBALB/cマウス(雄 6週齢)から無菌的に脾臓、胸腺およびパイエル板組織を摘出し、スライドガラスで押し潰し細胞浮遊液を調製した。培養液5%FCS-RPMI1640(日水株式会社製)を用いてそれぞれ4.4×106cells/mLに調製し、96wellマイクロプレートに1wellあたりそれぞれ90μlづつ添加し、BT−1を10μl加えて全量100μlとした。37℃で5%CO2下68時間培養後、MTT試薬(5mg/mL sigma社製)を各wellに10μl加えさらに4時間培養後、遠心分離により上清を除去した。残渣にジメチルスルホキシド(DMSO) 200μlを加えて攪拌しマイクロプレートリーダにより570nmの吸光度を測定した。なお、コントロールはBT−1の代わりにPBS、陽性対照にはConA(1μg/mL)およびLPS(5mg/mL)を10μl加えた。
【0033】
その結果を下記表に示す(コントロールの吸光度を1として刺激率SIで示した)。
【表2】
【0034】
〔実施例2〕
Bifidobacterium bifidumの保存菌株(E−139)を3LのAMC培地で37℃、2日間嫌気培養を行い、遠心分離(3600回転/分で10分間)により上清を分取した。培養上清3mLについて陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(DEAE−Tyopa1650 1.0×30.5cm 東ソー製、移動相溶液;PBS、溶出液;1MNaCl加PBS、測定波長;210nm、流速;1ml/分)を行い、非吸着および吸着に分画し、実施例1と全く同様にしてそれぞれの免疫賦活活性を測定した。活性は吸着画分に存在しており非吸着画分には認められなかった。それぞれの画分をゲルろ過カラムクロマトグラフィー(条件は実施例1と全く同様)で分離すると、吸着画分においては高分子量(100kDa以上)画分に、また非吸着画分においては低分子量(10kDa以下)画分に免疫賦活活性を認めた。以下に、その免疫賦活活性(コントロールの吸光度を1とした刺激率SI)を示す。
【0035】
【表3】
【0036】
〔実施例3〕
実施例2と全く同様に得られたBifidobacterium bifidum培養上清1mLをゲルろ過カラムクロマトグラフィーで高分子量免疫賦活活性画分(100Da以上)および低分子量免疫賦活活性画分(BT−1)に分離し、経時的変化(4℃±1で保存)による活性の影響を検討した。以下にその活性(残存活性%)を示す。なお、残存活性は下記式から算出され、各刺激率は実施例1と全く同様にして免疫賦活活性を測定しコントロールの吸光度を1として得られた値である。
【数1】
残存活性(%)=(所定期間経過時の刺激率/開始時の刺激率)×100
【0037】
【表4】
【0038】
【発明の効果】
本発明に係る活性BT−1は、安定性に優れ、かつ低分子量であるがゆえに体内に吸収されやすいので、本発明に係る組成物を投与または摂取したときの免疫賦活作用の効果が大きい。
Claims (6)
- カサミノ酸0.5重量%、バクティトリプトン0.5重量%、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸およびTween80を含有するpH6.8の培地で培養したBifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの破砕液、または該Bifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの培養上澄もしくは培養液を、分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離して得られる、分子量10kDa以下の低分子量画分を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
- 分離が、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行われる請求項1に記載の免疫不活組成物。
- パイエル板細胞賦活組成物である請求項1または2に記載の免疫賦活組成物。
- カサミノ酸0.5重量%、バクティトリプトン0.5重量%、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸およびTween80を含有するpH6.8の培地で培養したBifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの破砕液、または該Bifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの培養上澄もしくは培養液を、分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離し、分子量10kDa以下の低分子量画分を含む画分を採取することを特徴とする請求項1に記載の免疫賦活組成物の製造方法。
- 分離が、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行われる請求項4に記載の製造方法。
- カサミノ酸0.5重量%、バクティトリプトン0.5重量%、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸およびTween80を含有するpH6.8の培地で培養したBifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの破砕液、または該Bifidobacterium bifidumもしくはBifidobacterium longumの培養上澄もしくは培養液を、分子量10kDa以下の低分子量画分と分子量10kDa以上の高分子量画分とに分離して得られる、分子量10kDa以下の低分子量画分の、免疫賦活組成物を製造するための使用。
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