FR3108122A1 - Milieu de culture de qualite alimentaire - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire pour la production de bactéries lactiques destinées à une utilisation alimentaire ou pharmaceutique.
Description
La présente invention se rapporte au domaine de l’industrie agroalimentaire et pharmaceutique, et concerne plus particulièrement l’utilisation d’un milieu de culture pour la production de bactéries lactiques destinées à une utilisation alimentaire ou pharmaceutique.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les bactéries lactiques ont de nombreuses applications dans l’industrie agroalimentaire et pharmaceutique. Elles peuvent être utilisées en tant que starters pour les produits fermentés, en tant que bactéries probiotiques mais également pour les métabolites d’intérêts qu’elles produisent (acide lactique, bactériocines, protéines d’intérêt diverses).
La production de biomasse de ces souches d’intérêt est réalisée classiquement dans des milieux de culture comme le milieu MRS (de De Man, Rogosa et Sharpe) utilisé pour la production de Lactobacilles (cf. Tableau 1).
En 1960, de Man, Rogosa et Sharpe ont développé la formulation d’un milieu spécialement adapté aux cultures des lactobacilles provenant de produits laitiers (De Manet al.1960). Cette mise au point a été réalisée afin de remplacer un produit variable (jus de tomate) et de fournir en même temps un milieu propice au bon développement des lactobacilles en général, y compris des souches poussant faiblement sur les milieux existants. Le milieu MRS est supérieur au milieu au jus de tomate de Briggs (Briggs M. (1953)) et au milieu au jus de tomate et à l’extrait de viande de De Man. Il permet une pousse plus abondante de toutes les souches de lactobacilles.
Le milieu MRS est utilisé pour la culture et le dénombrement des bactéries du genreLactobacillus, notamment dans les produits laitiers et les autres produits alimentaires ainsi que dans les produits destinés à l’alimentation animale. Ce milieu est généralement utilisé à un pH faible acide (entre 6 et 6,4) et permet de cultiver des germes à croissance ralentie tels queLactobacillus brevisetLactobacillus fermentum. Acidifié à pH 5,4, il permet également de dénombrerLactobacillus bulgaricusdans les yaourts. D’après la norme NF ISO 15214 pour le dénombrement des bactéries lactiques mésophiles, le milieu MRS est utilisé à un pH de 5,7.
Ce milieu contient cependant des composés d’origine animale (peptones et extrait de viande) et des ingrédients dont l’utilisation est controversée car potentiellement dangereux pour la santé humaine (Tween 80, hydrogènophosphate de potassium, cf. Tableau 1).
Les milieux de culture et leurs composants influencent la survie des bactéries soumises à un procédé de stabilisation (Goldberg and Eschar 1977; Bealet al.2001; Carvalhoet al.2004a; Silvaet al.2005; Corcoranet al.2007; Siaterliset al.2009). Par exemple, le type de peptone (animale ou végétale) présent dans le milieu de culture influence la composition en acides gras de la membrane des bactéries, modifiant ainsi la fluidité membranaire qui joue un rôle dans la résistance cellulaire aux stress des procédés de déshydratation (Carvalhoet al.2003, 2004b).
Il existe des milieux de culture sans ingrédients controversés, développés pour répondre à des critères de production de biomasse. Cependant, les critères de résistance au stress des procédés de déshydratation ont souvent été négligés. Afin de garantir la conservation de la viabilité et des fonctionnalités de la biomasse bactérienne produite sur le long terme et jusqu’à son utilisation, celle-ci doit être stabilisée par déshydratation. L’eau intracellulaire des cellules bactériennes va être retirée ce qui va stopper le métabolisme cellulaire. La lyophilisation est la technique de préservation de la biomasse bactérienne la plus utilisée en industrie. Elle permet de retirer l’eau des cellules bactériennes par sublimation. Un cycle de lyophilisation comprend 3 phases: la congélation qui consiste à former des cristaux de glace, la désorption primaire qui consiste à sublimer la glace par diminution de la pression et la désorption secondaire qui consiste à éliminer l’eau résiduelle en fournissant de l’énergie au système (Blondet al.1997). Cependant, des dommages cellulaires peuvent être causés pendant le procédé de déshydratation, liés généralement à la présence d’espèces réactives de l’oxygène (Francaet al.2007; Iannielloet al.2016) et aux stress thermique et osmotique associés à la congélation (Broeckxet al.2016).
Dans ce contexte, un nouveau milieu de culture de qualité alimentaire ou «Food Grade» a été élaboré afin d’obtenir une biomasse viable après lyophilisation maximale en répondant à des critères de production de biomasse et des critères de résistance aux stress du procédé de déshydratation.
La société Demanderesse a constaté que l'utilisation de perméat de lait dans un procédé de production de bactéries lactiques avait, de façon surprenante, un effet stimulant sur la croissance de ces bactéries et un effet sur la résistance au stress du procédé de déshydratation. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis au point un nouveau milieu de culture de qualité alimentaire, sans ingrédients controversés ou toxiques pour la santé humaine ou animale, élaboré pour l’obtention 1) d’une production de biomasse équivalente à celle obtenue avec le milieu de culture MRS; et 2) d’une résistance aux stress du procédé de déshydratation (lyophilisation) équivalente ou supérieure à celle obtenue avec le milieu de culture MRS.
Ce milieu de culture innovant permet la culture de probiotiques de types lactobactéries, ferments lactiques, avec des titres équivalents ou plus élevés de biomasse avant et après lyophilisation en comparaison des milieux de culture traditionnels.
Ce milieu de culture, destiné à la culture bactérienne, permet la croissance, c’est-à-dire le développement de biomasse des bactéries. Ce milieu de culture permet l’amélioration de la survie à la lyophilisation et l’obtention d’une plus grande biomasse bactérienne après lyophilisation.
L’invention concerne en particulier un milieu de culture de qualité alimentaire comprenant du perméat de lait. Il est facile à mettre en œuvre et peu couteux et convient à un régime végétarien, halal ou casher. Le perméat de lait est un sous-produit de l’industrie de transformation du fromage et du lait, facilement disponible et peu couteux. Le milieu de culture selon l’invention ne contient que des ingrédients autorisés en agroalimentaire en Europe et peut ainsi être utilisé comme substitut aux milieux de culture conventionnels qui contiennent des extraits de viande, des peptones d’origine animale, et/ou des minéraux ou des additifs (tween 80) dont certaines formes d’apports sont controversées pour la santé humaine.
En particulier, la culture de lactobactéries dans le milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention ne nécessite pas de rinçage des bactéries aussi consciencieusement que les procédés de fabrication actuels, ces rinçages étant nécessaires pour retirer les composés néfastes ou potentiellement néfastes pour la santé humaine ou animale. De plus, en raison du faible coût du perméat de lait, le coût de production des compositions pharmaceutiques ou nutraceutiques comprenant des bactéries lactiques en tant que probiotiques cultivées sur le milieu de l’invention ont un coût substantiellement plus faible que celui des produits obtenus à partir des milieux conventionnels.
L’invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire pour cultiver des bactéries lactiques, ledit milieu comprenant: 35 à 70% de perméat de lait en poids sec par rapport au poids sec total du milieu en tant que source carbonée et azotée, une source azotée additionnelle et une source minérale, dans lequel le ratio de l’apport en carbone par rapport à l’apport en azote total dans le milieu est compris entre 4 et 10.
L’invention concerne également une méthode de production de bactéries lactiques comprenant:
a) la mise en culture et la multiplication de bactéries lactiques dans un milieu de culture de qualité alimentaire comprenant 35 à 70% de perméat de lait en poids sec par rapport au poids sec total du milieu en tant que source carbonée et azotée, une source azotée additionnelle et une source minérale; dans lequel le ratio de l’apport en carbone par rapport à l’apport en azote total dans le milieu est compris entre 4 et 10,
b) la récupération des bactéries lactiques multipliées, et
c) facultativement, la lyophilisation ou la congélation des bactéries multipliées.
L’invention concerne aussi un milieu de culture de qualité alimentaire pour bactéries lactiques comprenant 35 à 70 % en poids sec de perméat de lait, 25 à 55 % en poids sec d’extrait de levure par rapport au poids sec total du milieu, et une source minérale, le milieu de culture ayant un ratio carbone par rapport à l’apport en azote total compris entre 4 et de 10.
En particulier, le milieu de culture ne comprend pas de peptone d’origine animale et/ou d’extrait de viande.
De préférence le milieu de culture comprend du magnésium comme source minérale, de préférence du sulfate de magnésium, en particulier 0,01% et 1% en poids sec de sulfate de magnésium par rapport au poids sec total du milieu.
Le milieu de culture peut également comprendre du manganèse comme source minérale, de préférence du sulfate de manganèse, en particulier 0,01% et 1% en poids sec de sulfate de manganèse par rapport au poids sec total du milieu.
Selon un aspect, le milieu de culture a un pH compris entre 5,5 et 7,5, de préférence un pH compris entre 6 et 7.
Selon un autre aspect, le milieu de culture ne comprend pas au moins un composé choisi dans le groupe constitué par du glucose, un antibiotique, de l’hydrogénophosphate de potassium, de l’acétate de sodium trihydraté, du citrate de triammonium et du Tween 80.
L’invention concerne également l’utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention pour la préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique comprenant des bactéries lactiques.
L’invention concerne finalement une méthode de préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique comprenant une étape d’ajout de bactéries lactiques préparées selon la méthode de production de l’invention, aux autres composants de la composition pharmaceutique ou nutraceutique.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Définitions
Par «milieu de culture de qualité alimentaire» ou «milieu de culture Food Grade» ou «milieu FG» est entendu ici une composition, une préparation ou un support permettant la culture ou la multiplication de cellules telles que des microorganismes, de préférence des bactéries telles que des bactéries lactiques. Ce milieu satisfait les exigences nutritives minimales des cellules ou des micro-organismes à cultiver. Pour être définis comme étant de qualité alimentaire, les matériaux utilisés pour la composition de ce milieu doivent être non toxiques et sûrs pour la consommation humaine ou animale. De préférence, un milieu de culture de qualité alimentaire ne comprend pas de composés considérés comme controversés, dangereux ou potentiellement dangereux pour la santé humaine ou animale, notamment par l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES) ou l’Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux (FDA -Food and Drug Administration). De préférence, le milieu de culture selon l’invention est un milieu de culture dont la composition est alimentaire au sens du règlement européen 178/2002 datant du 28 janvier 2002.
Tel qu'utilisé ici, le terme « bactérie » désigne tout micro-organisme procaryote existant sous la forme d'une cellule unique, dans un groupe ou dans un agrégat de cellules individuelles. Le terme « bactérie » englobe toutes les variantes de bactéries (par exemple, les bactéries du microbiote humain ou les bactéries environnementales). Ces bactéries sont de préférence des bactéries lactiques. Ces bactéries sont notamment des bactéries probiotiques, de manière préférée des bactéries lactiques probiotiques.
Tel qu'utilisé ici, le terme «probiotique» se réfère à des bactéries vivantes ou inactivées qui, lorsqu'elles sont administrées en quantités adéquates, ont un effet bénéfique sur l'organisme hôte. Ces bactéries probiotiques sont avantageuses en ce qu'elles sont appropriées pour une administration aux humains et à d'autres sujets mammifères. Les substances probiotiques contiennent un nombre suffisamment élevé de micro-organismes probiotiques vivants et actifs qui peuvent exercer une action équilibrante sur la flore intestinale par colonisation directe. Il est à noter que, aux fins de la présente description, on entend par probiotique toute forme biologiquement active de probiotique. De préférence, les probiotiques selon l’invention sont tels que définis par l’Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) et l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) dans la Consultation mixte d’experts FAO/OMS réalisée en 2001 sur l’évaluation des propriétés sanitaires et nutritionnelles des probiotiques dans les aliments, y compris le lait en poudre contenant des bactéries lactiques vivantes. De préférence, les probiotiques sont des bactéries lactiques (LAB), encore appelées lactobactéries. Ces bactéries sont des microorganismes à Gram positif, à faible contenu en génome GC, anaérobies ou aérotolérantes, généralement non sporulées, qui produisent de l'acide lactique comme principal produit final de la fermentation des glucides.
De préférence, les bactéries lactiques cultivables sur le milieu de la présente invention appartiennent notamment au genreLactobacillus, Pediococcus , Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus , Leuconostoc , OenococcusouBifidobacterium ,préférentiellement du genreLactobacillus.Les bactéries lactiques (LAB) sont généralement reconnues comme sûres pour la santé humaine et animale et certaines espèces ont obtenu le statut de présomption de sécurité (QPS) de l'Agence européenne de sécurité des aliments (EFSA).
Le terme «source carbonée» ou «source de carbone» comprise dans un milieu de culture correspond particulièrement à un nutriment (sucre, acide gras, acide aminé...) ou matière organique fournissant le carbone nécessaire à la constitution de nouvelles molécules organiques (anabolisme), à la culture, survie et/ou multiplication des bactéries. Selon l’invention, cette source carbonée est métabolisable par les LAB, et est préférentiellement du perméat de lait.
Tel qu’utilisé ici le terme «lactosérum» concerne l'aliment obtenu sous forme liquide en séparant le coagulum du lait, de la crème ou du lait écrémé. C'est l'un des principaux sous-produits de la fabrication du fromage. Le «perméat de lactosérum» est une poudre issue de l'ultrafiltration du lactosérum, généralement concentré puis séché par atomisation. En comparaison avec le lactosérum, le perméat de lactosérum est généralement plus pauvre en protéines mais plus riche en lactose et en minéraux.
Le terme «perméat de lait» concerne l’aliment obtenu après élimination des protéines du lait et de la matière grasse laitière contenue dans le lait, le lait partiellement écrémé ou le lait écrémé par ultrafiltration.
Le terme «source azotée» ou «source d’azote» présente dans le milieu de culture, fait référence à l’ensemble de composés pouvant fournir l’azote nécessaire à la culture, la croissance et/ou la survie des bactéries dans le milieu de culture selon l’invention. Ce terme englobe préférentiellement des composés inorganiques (ammoniac, sels d'ammonium, nitrites, nitrates) ou des sources organiques (extrait de levures, groupements amines des composés organiques). Selon l’invention, cette source azotée est assimilable par les LAB, et est préférentiellement apportée par du perméat de lait et/ou par de l’extrait de levure.
Par «extrait de levure» est entendu le terme général utilisé pour désigner les différentes formes de levures transformées en retirant le contenu des cellules.
Le «ratio carbone/azote total» ou «ratio de l’apport en carbone par rapport à l’apport en azote » tel qu’utilisé ici correspond au rapport de l’apport en composés carbonés sur l’apport en composés azotés d’une composition de milieu. En particulier, certains éléments de la composition peuvent être utilisés en tant que source de carbone et/ou d’azote. Typiquement, le perméat de lait apporte à la fois une source de carbone et d’azote. Le calcul du ratio carbone/azote comprend ainsi l’évaluation de la teneur en carbone et en azote de chaque composé, ainsi que la somme des teneurs des différents composés. Seront par exemple pris en considération l’apport en carbone du perméat de lait, et l’apport en azote du perméat de lait et de l’extrait de levure.
La «source minérale», telle qu’utilisée ici, correspond aux éléments minéraux contribuant à la culture, la survie et/ou la croissance de bactérie dans le milieu de culture selon l’invention.
Tel qu'utilisé ici le terme «produit d’origine animale» fait référence à des produits prélevés ou issus d’animaux vivants ou morts tels que la graisse, la chair, le sang, mais ne comprend pas les matières produites par des animaux vivants tels que le lait, le miel et les œufs.
Tel qu'utilisé ici, le terme «comprenant» ou «comprend» est utilisé en référence à des substances, composés ou procédés qui sont essentiels à l'invention, mais qui sont ouverts à l'inclusion d'éléments non spécifiques, essentiels ou non. L'utilisation de «comprenant» indique l'inclusion plutôt que la limitation.
Le terme «et/ou» tel qu'il est utilisé ici doit être considéré comme une description spécifique de chacune des deux caractéristiques ou composants spécifiés, avec ou sans l'autre. Par exemple, « A et/ou B » doit être considéré comme une divulgation spécifique de chacun des éléments suivants : (i) A, (ii) B et (iii) A et B, comme si chacun d'eux était présenté individuellement.
Le terme «environ» tel qu'utilisé ici en relation avec toutes les valeurs (incluant les extrémités inférieures et supérieures de plages numériques) signifie toute valeur ayant une variation acceptable allant jusqu'à +/- 10% (par exemple, +/- 0,5% , +/- 1%, +/- 1,5%, +/- 2%, +/- 2,5%, +/- 3%, +/- 3,5%, +/- 4%, +/- 4,5% , +/- 5%, +/- 5,5%, +/- 6%, +/- 6,5%, +/- 7%, +/- 7,5%, +/- 8%, +/- 8,5%, + / - 9%, +/- 9,5%). L'utilisation du terme «environ» au début d'une liste de valeurs modifie chacune d’entre elles (c'est-à-dire «environ 1, 2 et 3» se réfère à environ 1, environ 2 et environ 3). En outre, lorsqu'une liste de valeurs est décrite (par exemple environ 50%, 60%, 70%, 80%, 85% ou 86%), la liste inclut toutes ses valeurs intermédiaires et fractionnaires (par exemple 54% ou 85,4%).
Milieu de culture
La présente invention concerne un milieu de culture de qualité alimentaire. Ce milieu est particulièrement adapté à la culture de bactéries dites probiotiques, en particulier de bactéries lactiques.
Le milieu de culture selon l’invention est destiné à la fabrication d'une biomasse de bactéries probiotiques, en particulier de bactéries lactiques, de préférence à l’échelle industrielle. Les caractéristiques d’un milieu de culture destiné à la production industrielle de lactobactéries, ferments lactiques, conditionnent très largement l'activité finale d’un produit. Malgré les exigences nutritionnelles des bactéries lactiques, les milieux de culture doivent permettre d'obtenir une biomasse concentrée avec de bons rendements de production. Les besoins en nutriments sont satisfaits en fournissant aux microorganismes une source carbonée, une ou plusieurs sources azotées, et des minéraux, et dans certains cas des vitamines, des acides gras, des bases azotées et/ou des acides organiques.
Le milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention peut être solide, semi-solide ou liquide.
Par « milieu de culture solide » ou « milieu solide », on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie, mais il est également possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. De préférence, l’agent gélifiant est d’origine végétale.
Le milieu de culture selon l’invention peut alternativement être sous forme déshydratée ou sèche, en particulier sous forme de poudre. Ce milieu de culture peut être par la suite humidifié ou dilué dans un liquide tel que de l’eau, en particulier de l’eau stérilisée, pour former un milieu solide, semi-solide ou liquide.
De préférence, le milieu de culture selon l’invention est sous forme liquide. Le milieu de culture liquide peut être particulièrement compris dans un fermenteur ou bioréacteur, pour permettre la culture des bactéries.
Selon un aspect, le milieu de culture de qualité alimentaire comprend une source carbonée qui est le perméat de lactosérum.
De préférence, le perméat de lait est issu du lait de vache, de chèvre ou de brebis.
Le milieu de culture comprend une base se présentant sous la forme d’un perméat de lait en tant que source carbonée et azotée. Ce perméat est préférentiellement issu de l’ultrafiltration de lait écrémé et concentré puis déshydraté par un procédé d’atomisation conférant à la poudre un très bon écoulement et une hygroscopicité réduite.
De préférence, le perméat de lait contient entre 0,05 et 5% en poids de protéines, entre 0,2 % et 1% en poids de matière grasse, de 76 à 95% en poids de lactose, entre 5 et 8 % en poids de matière minérale pour 100% en poids de perméat de lait. Le perméat de lait peut comprendre en outre environ 300 mg de calcium pour 100g de perméat de lait. De préférence, le perméat de lait comprend une quantité limitée ou une absence d’acide lactique et de lactates, en particulier au maximum 0,1 % en poids pour des perméats en poudre et 0,015% en poids pour des perméats de lait sous forme liquide, et une absence de glycomacropeptides. Un exemple de perméat de lait pouvant être utilisé dans le milieu de culture selon l’invention est celui fournit par Eurial Ingredients sous la référence DR 52:127, qui comprend 2% de protéines, 0,5% de matière grasse, 6,9% de matières minérales et 85% de lactose, cette composition de perméat de lait étant à pH 6,3, les pourcentages étant donnés en poids.
Selon un aspect, le milieu de culture de qualité alimentaire pour bactéries lactiques comprend 35 à 70 % en poids sec de perméat de lait par rapport au poids sec total du milieu. Alternativement ou additionnellement, le milieu de culture comprend 2 à 10 % en poids humide de perméat de lait par rapport au poids humide total du milieu.
De préférence, le milieu de culture de qualité alimentaire pour bactéries lactiques comprend 40 à 70 %, 40 à 70%, 50 à 70%, 50 à 65 %, 55 à 65% ou 55 à 65% en poids sec de perméat de lait par rapport au poids sec total du milieu.
Par poids sec on entend particulièrement la composition du milieu en masse sèche ou déshydratée, par exemple sous la forme de poudre. Par poids humide ou poids mouillé, on entend le poids de la composition une fois diluée dans un liquide, par exemple dans de l’eau, en particulier de l’eau stérilisée.
Selon un aspect, le milieu de culture selon l’invention comprend en outre de 25 à 55 % en poids sec d’extrait de levures par rapport au poids sec total du milieu, en tant que source azotée. Alternativement ou additionnement, le milieu de culture comprend de 1% à 10% en poids humide d’extrait de levure par rapport au poids humide total du milieu.
De préférence, le milieu de culture de qualité alimentaire pour bactéries lactiques comprend 25% à 50%, 30% à 50%, 35% à 50%, 40 à 50%, 25% à 45 %, 30 % à 45%, 35% à 45% en poids sec d’extrait de levure par rapport au poids sec total du milieu.
Selon un mode de réalisation particulier, l’extrait de levure utilisé est un extrait de levure inactivée, par exemple telle que fournie par Biospringer.
En particulier, le milieu de culture selon l’invention comprend une source de carbone et une source d’azote, de manière à ce que leur quantité respective dans le milieu respecte un ratio carbone/azote (C/N) total compris entre 4 et 10, De préférence, le ratio C/N est compris entre 4 et 7, préférentiellement entre 4 et 6,5, tout particulièrement entre 4,4 et 6,3.
En particulier, ce ratio est calculé à partir des quantités de carbone et d’azote fournies par le perméat de lait et de la quantité d’azote fournie par l’extrait de levure.
Selon un aspect particulier, le ratio C/N est tel que défini dans les tableaux 2 à 5 et 7.
Selon un aspect, le milieu de culture selon l’invention comprend en outre une source minérale. De préférence, la source minérale est choisie parmi: du phosphore, du souffre, du sodium, du potassium, du magnésium, du manganèse, du calcium, du fer, ou une combinaison de ceux-ci.
Avantageusement, le milieu de culture contient du magnésium, de préférence sous forme de sulfate de magnésium, à une teneur comprise entre 0,01% et 0,5% ou 1 % en poids sec par rapport au poids sec total du milieu de culture, de préférence 0,05 à 0,6%, de préférence 0,1% à 0,5% et particulièrement de 0,2 à 0,5%. Alternativement ou additionnement, le milieu de culture contient du magnésium, de préférence sous forme de sulfate de magnésium, à une teneur comprise entre 0,01% et 0,1% en poids humide par rapport au poids humide total du milieu de culture, de préférence 0,01 à 0,05%, de préférence 0,01% à 0,03% et particulièrement de 0,02 %.
Avantageusement, le milieu de culture contient du manganèse, de préférence sous forme de sulfate de manganèse, à une teneur comprise entre 0,01% et 0,1%, 0,5% ou 1% en poids sec par rapport au poids sec total du milieu de culture, encore de préférence entre 0,01 et 0,2%, et particulièrement 0,01 à 0,015 %. Alternativement ou additionnement, le milieu de culture contient du manganèse, de préférence sous forme de sulfate de manganèse, à une teneur comprise entre 0,001% et 0,01% en poids humide par rapport au poids humide total du milieu de culture, de préférence 0,001 à 0,05%, particulièrement de 0,005 %.
Ainsi, selon un aspect particulier, le milieu selon l’invention comprend du lactosérum, du perméat de lactosérum ou du perméat de lait en tant que source d’azote et de carbone, de l’extrait de levure en tant une source d’azote, du magnésium et/ou du manganèse en tant que source minérale, de préférence dans les proportions décrites ci-dessus.
De préférence, le milieu de culture de qualité alimentaire comprend 40 à 75% en poids sec de perméat de lait en tant que source d’azote et de carbone, 25 à 55% en poids sec d’extrait de levure en tant une source d’azote, 0,01 à 1% en poids sec de magnésium, de préférence sous forme de sulfate de magnésium et 0,01% à 0,5% en poids sec de manganèse, de préférence sous forme de sulfate de manganèse, en tant que source minérale, pour 100% en poids sec de la composition totale du milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, la composition du milieu de culture selon l’invention est telle que définie Tableau 6 ou Tableau 8.
Alternativement, le milieu de culture de qualité alimentaire comprend 2 à 10 % en poids mouillé de perméat de lait en tant que source d’azote et de carbone, 1 à 5% en poids mouillé d’extrait de levure en tant une source d’azote, 0,01 à 1% en poids mouillé de magnésium, de préférence sous forme de sulfate de magnésium et 0,001 à 0,05% en poids mouillé de manganèse, de préférence sous forme de sulfate de manganèse, en tant que source minérale, pour 100% en poids mouillé de la composition totale du milieu de culture, c’est-à-dire après dilution des poudres respectives dans un liquide, par exemple de l’eau, de préférence de l’eau stérilisée.
Le milieu de culture est de préférence faiblement acide, ce qui peut inhiber la croissance et la reproduction de la plupart des bactéries, mais est propice à la croissance et à la reproduction des bactéries lactiques. Selon un aspect particulier, le milieu de culture a un pH légèrement acide, de préférence compris entre 5, 5 et 7, préférentiellement entre 5,5 et 6,5, de manière préférée entre 6 et 6,5.
La présente invention concerne de préférence un milieu de culture dont la composition est alimentaire au sens du règlement européen 178/2002.
Le milieu selon l’invention ne comprend pas de produits toxiques, dangereux ou néfastes, ou dont l’effet est controversé pour la santé humaine ou animale, notamment tel qu’établi par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). En particulier, le milieu selon l’invention ne comprend pas au moins un composé choisi dans le groupe constitué par du glucose, un antibiotique, de l’hydrogénophosphate de potassium, de l’acétate de sodium trihydraté, du citrate de triammonium et du Tween 80. Dans un aspect particulier, le milieu selon l’invention ne comprend pas de l’hydrogénophosphate de potassium, de l’acétate de sodium trihydraté, du citrate de triammonium ou du Tween 80, ou toute combinaison de ceux-ci.
Selon un aspect, le milieu de culture selon l’invention ne comprend pas de produits d’origine animale. En particulier, le milieu de culture selon l’invention ne contient pas de produits ou sous-produits animales autre que le perméat de lait.
De préférence, le milieu de culture ne comprend pas de peptone d’origine animale et/ou d’extrait de viande. En particulier, le milieu de culture ne comprend pas de peptone et/ou d’extrait de viande.
Selon un aspect particulier, le milieu de culture selon l'invention ne contient pas de glucose.
Selon un autre aspect particulier, le milieu de culture selon l'invention ne contient pas d’antibiotique.
Ingrédients supplémentaires
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture comprend en outre des acides aminés, des minéraux, des facteurs de croissance, des bases puriques et pyrimidiques, des sels, des vitamines, des antioxydants, des oligo-éléments, des régulateurs métaboliques ou des régulateurs de pH, ou toute combinaison de ceux-ci. De préférence, ces composés ne sont pas d’origine animale et/ou ne sont pas considérés comme dangereux ou potentiellement dangereux pour la santé humaine ou animale.
Les acides aminés sont naturels ou synthétiques et sont de préférence d’origine végétale. Les acides aminés peuvent notamment être choisis parmi l’asparagine, la proline, la sérine et la L-cystéine, ou un mélange de ceux-ci.
Les vitamines, minéraux et/ou oligo-éléments peuvent par exemple être choisis parmi: une vitamine par exemple la thiamine (B1), la riboflavine (B2), la niacine (B3), l'acide pantothénique (B5), la pyridoxine (B6), l'acide folique (B9) et la cyanocobalamine (B12),et/ou les vitamines C, A, D, E, K1 et K2; le magnésium, le calcium, le fer, l'iode, le cuivre, le zinc, le sélénium, le chrome, le molybdène, le bore ou un de leurs mélanges.
Les anti-oxydants peuvent par exemple être choisis parmi la super oxyde dismutase (SOD), l’ubiquinol/ubiquinone (Coenzyme Q10), le sulfate de zinc, le resvératrol, les catéchines (catéchine, épicatéchine et dérivés gallatés), les flavanols, les flavanones ou encore les anthocyanes.
Selon un aspect, le milieu comprend en sus un tampon avec une capacité de tamponnage de pH, de préférence permettant de tamponner le milieu de culture à un pH compris entre 5 et 7, de préférence entre 5,5 et 6,5, de manière préférée entre 6 et 6,5. En particulier, le milieu peut comprendre un régulateur de pH. De préférence, le régulateur de pH est choisi parmi: l’acide citrique, l’acide acétique, l’acide tartrique et l’acide ascorbique ou toute combinaison de ceux-ci.
Utilisation
L’invention concerne également l’utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention en tant que milieu de culture pour des bactéries lactiques. Les milieux de culture tels que décrits ci-dessus pourront avantageusement être utilisés dans les procédés de fermentations lactiques, notamment pour la préparation d’ingrédients probiotiques destinés à l’industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, de préférence à l’échelle industrielle.
Avantageusement le milieu de culture selon l’invention permet d’obtenir des concentrations de biomasse avant lyophilisation équivalentes ou supérieures à celles obtenues en utilisant un milieu de culture conventionnel, tel que le milieu MRS.
Avantageusement le milieu de culture selon l’invention permet d’obtenir des concentrations de biomasse après lyophilisation équivalentes ou supérieures à celles obtenues en utilisant un milieu de culture conventionnel, tel que le milieu MRS.
Selon un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention pour la préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique à base de bactéries lactiques.
L’invention concerne également l’utilisation de bactéries lactiques cultivées dans le milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention, pour la préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique destinée à un usage humain ou animal. En particulier, la composition pharmaceutique ou nutraceutique peut être préparée selon la méthode décrite ci-dessous.
Le terme «nutraceutique» fait référence à une composition ou produit fabriqué à partir de substances alimentaires, mais rendu disponible sous forme de comprimé, de poudre, de potion ou d'autre formes galéniques habituellement non associées à des aliments, et ayant un effet physiologique bénéfique ou protecteur contre des troubles ou maladies animales ou humaines. On retrouve notamment sous cette définition les compléments alimentaires, certains aliments pour groupe spécifique ou les substituts de repas. En particulier, la composition nutraceutique telle qu’entendue ici est à base de bactéries lactiques, de préférence en tant qu’ingrédient principal.
Telle qu'utilisée ici, une «composition pharmaceutique» désigne une préparation d'un ou plusieurs des agents actifs avec d'autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d'administration ou d'utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l’invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c’est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. En particulier, la composition pharmaceutique telle qu’entendue ici est à base de bactéries lactiques, de préférence en tant que principe actif principal.
En particulier, les bactéries lactiques sont choisies parmi les bactéries du genreLactobacillus, Pediococcus , Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus , Leuconostoc , OenococcusouBifidobacterium ,et toutes combinaisons de celles-ci, de préférenceLactobacillus,Lactococcuset/ouBifidobacteriumet de manière toute particulièreLactobacillus.
De préférence, les bactéries pouvant être cultivées dans le milieu selon l’invention sont des bactéries du genreLactobacillus, de préférence choisies parmi: L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. caucasicus , L. lactis , L. crispatus , L. reuteri , L. brevi , L. thermophilus, L. gasseri , L. helveticus , L. bifermentans , L. hominis, L. acidophilus,L. bulgaricuset toutes combinaisons de celles-ci.
Les compositions de la présente invention trouvent une utilisation dans la fabrication de probiotiques en tant que starters ou ingrédients mais aussi dans la fabrication de tout autre ingrédient, aliment, composition alimentaire, nutraceutique ou pharmaceutique contenant une bactérie lactique.
Ce type de composition nutraceutique ou pharmaceutique présentent l’avantage de ne présenter aucune trace ou résidus de composés d’origine animale autres que ceux issus du lait, de composés sujets à controverse, potentiellement dangereux ou dangereux pour la santé humaine ou animale, et conviennent particulièrement aux sujets suivant un régime végétarien, casher ou halal.
Méthode de culture
La présente invention concerne également une méthode de production ou de préparation de bactéries lactiques dans le milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention.
Selon un aspect, la méthode de culture des bactéries lactiques comprend:
a) la mise en culture et la multiplication de bactéries lactiques dans un milieu de culture de qualité alimentaire tel que défini ci-dessus, notamment comprenant 35 à 70% de perméat de lait en poids sec par rapport au poids sec total du milieu en tant que source carbonée et azotée, une source azotée additionnelle et une source minérale; dans lequel le ratio de l’apport en carbone/azote total dans le milieu est compris entre 4 et 10,
b) la récupération des bactéries lactiques multipliées, et
c) facultativement, la lyophilisation ou la congélation des bactéries multipliées.
En particulier, la méthode de culture des bactéries lactiques comprend:
a) l’humidification d’un milieu de culture de qualité alimentaire selon l’invention, de préférence dans de l’eau stérilisée pour former un milieu de culture de qualité alimentaire,
b) la mise en culture et la multiplication de bactéries lactiques dans ce milieu de culture,
c) la récupération des bactéries lactiques multipliées,
d) facultativement, la concentration des bactéries lactiques multipliées,
e) facultativement, la préservation et/ou la conservation des bactéries multipliées, de préférence par lyophilisation ou congélation.
La méthode de culture peut comprendre de préférence une étape de stérilisation du milieu après l’humidification du milieu (étape a) et avant la mise en culture des bactéries lactiques (étape b).
La multiplication des bactéries lactiques (étape b) peut être réalisée en aérobie ou en anaérobie, selon les conditions requises. De préférence, la culture des bactéries lactiques est réalisée en aérobiose.
La culture des bactéries de l’étape b) peut être réalisée selon un mode d’alimentation de type batch, fed-batch ou continue. De préférence, la culture des bactéries lactiques est réalisée selon un mode d’alimentation de type batch.
L’homme du métier sait déterminer les conditions de culture adéquates selon le type de bactéries à cultiver et le type de rendement envisagé.
Selon un aspect particulier, la multiplication ou la croissance des bactéries ou l’augmentation en biomasse de l’étape b) est réalisée dans un fermenteur ou bioréacteur, de préférence de taille industrielle, par exemple ayant une contenance de 20 litres, 50 litres, 100 litres, 200 litres, 500 litres, 1000 litres ou 2000 litres.
Tel qu’utilisé ici, le terme «bioréacteur» ou «fermenteur» est un appareil dans lequel les micro-organismes (en particulier ici des bactéries lactiques) sont multipliés pour la production de biomasse, ou pour la production d'un métabolite ou encore la bioconversion d'une molécule d'intérêt.
Selon un aspect, la méthode selon l’invention comprend une étape de concentration des bactéries multipliées.
Cette étape peut notamment être suivie d’une étape de rinçage des bactéries. Selon un aspect particulier, la méthode selon l’invention comprend une étape d) dans laquelle les bactéries sont concentrées, le milieu de culture prélevé et les bactéries rincées avec une solution de rinçage. L’homme du métier sait déterminer la solution et les conditions de rinçage selon le type de bactéries cultivées.
Selon un autre aspect, la méthode selon l’invention ne comprend pas d’étape de rinçage, en particulier suite à la récupération des bactéries multipliées ou suite à la concentration des bactéries multipliées. Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre la préservation ou la conservation des bactéries sans nécessité de rinçage préalable des bactéries. La méthode peut ainsi comprendre une étape d) dans laquelle les bactéries sont concentrées et le milieu de culture surnageant prélevé, suivie directement d’une étape e) de préservation et/ou de conservation des bactéries multipliées, de préférence par lyophilisation.
Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention comprend une étape de lyophilisation ou de congélation des bactéries cultivées en vue de leur préservation et/ou de leur conservation ou stockage. De préférence, cette étape comprend la suspension des bactéries dans une solution de conservation. En particulier, la méthode selon l’invention comprend en outre l’ajout d’un ou plusieurs cryo- et/ou lyoprotectant aux bactéries cultivées avant leur mise en congélation ou lyophilisation, par exemple tel que du glycérol, du saccharose, des monosaccharides, des disaccharides ou des polysaccharides.
En particulier, les bactéries pouvant être cultivées selon la méthode de l’invention sont choisies parmi les bactéries du genreLactobacillus, Pediococcus , Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus , Leuconostoc , OenococcusouBifidobacterium ,et toutes combinaisons de celles-ci, de préférenceLactobacillus,Lactococcuset/ouBifidobacterium ,et de manière toute particulièreLactobacillus.
De préférence, les bactéries lactiques pouvant être cultivées selon la méthode de l’invention sont des bactéries du genreLactobacillus, de préférence choisies parmi: L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. caucasicus , L. lactis , L. crispatus , L. reuteri , L. brevi , L. thermophilus, L. gasseri , L. helveticus , L. bifermentans , L. hominis, L. acidophilus,L. bulgaricuset toutes combinaisons de celles-ci.
L’invention concerne également une méthode de préparation de bactéries lactiques comprenant les étapes décrites ci-dessus, en vue de leur utilisation dans une composition pharmaceutique ou nutraceutique.
L’invention concerne également une méthode de préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique comprenant une étape d’ajout de bactéries lactiques préparées selon la méthode ci-dessus. Notamment, cette méthode comprend l’ajout des bactéries lactiques aux autres composants de la composition pharmaceutique ou nutraceutique.
Les compositions pharmaceutiques ou nutraceutiques obtenues par la méthode selon l’invention présentent l’avantage de ne présenter aucun trace ou résidus de composés d’origine animale autres que ceux issus du lait, sujets à controverse, potentiellement dangereux ou dangereux pour la santé humaine ou animale, et conviennent particulièrement aux sujets suivant un régime végétarien, casher ou halal.
EXEMPLES
RESULTATS
Les Tableaux 9 et 10 présentent, pour les trois souches et pour chaque milieu de culture la biomasse produite, le taux de survie à la lyophilisation et la biomasse après lyophilisation (UFC/mL et UFC/g de lyophilisat). Les lettres différentes indiquent une différence significative (test HSD, p<0,05).
Pour toutes les souches, le milieu à base de lait écrémé avec le ratio équilibré avec celui du milieu MRS n’a pas pu être considéré comme un milieu de culture efficace. En effet, la forte quantité de protéines de lait dans ce milieu et la forte production d’acide lactique par les bactéries ont provoqué la coagulation du lait. Ce milieu n’a donc pas été comparé avec le MRS et le reste des milieux dans le cas où les ratios C/N ont été équilibrés avec celui du MRS (c’est-à-dire un rapport C/N de 4,4).
Biomasse produite
En fonction des trois espèces de lactobacilles (plantarum,caseietrhamnosus), la biomasse produite avec le milieu de culture contenant du perméat de lait est équivalente ou supérieure à celle produite sur le milieu MRS (p<0,05, ANOVA).
PourL. rhamnosus, la biomasse produite dans le milieu à base de perméat de lait (concentration 2) est significativement supérieure aux milieux MRS et perméat de lait (concentration 1) (p<0,05, ANOVA). Pour les deux autres espèces (L. caseietL. plantarum), la biomasse produite dans le milieu à base de perméat de lait est équivalente à celle produite avec le milieu MRS.
En comparaison, la biomasse produite dans un milieu à base de guar, de lait écrémé ou de lactosérum a été significativement inférieure ou équivalente à celle produite sur le milieu MRS. Notamment, une biomasse significativement inférieure a été observée:
- avec un milieu contenant de la guar pourL. caseietL. rhamnosus,
- avec un milieu contenant du lait écrémé pourL. plantarumetL. rhamnosus, et
- avec un milieu contenant du lactosérum pourL. rhamnosus.
Taux de survie au procédé de lyophilisation
En fonction des trois espèces de lactobacilles (plantarum, caseietrhamnosus), le taux de survie au procédé de lyophilisation avec le milieu de culture contenant du perméat de lait est équivalent à celui des bactéries produites sur le milieu MRS (p<0,05, ANOVA).
PourL. plantarum, le taux de survie au procédé de lyophilisation après culture dans le milieu MRS est inférieur à celui après culture dans les milieux à base de perméat de lait (p<0,05, ANOVA). Pour les deux autres espèces (L. caseietL. rhamnosus), le taux de survie au procédé de lyophilisation après culture dans les milieux à base de perméat de lait est équivalent (non significativement différent) au taux de survie obtenu après culture dans le milieu MRS.
En comparaison, le taux de survie dans un milieu à base de guar, de lait écrémé ou de perméat de lactosérum a été significativement inférieur ou équivalent à celui produit sur le milieu MRS. Notamment, un taux de survie significativement inférieur a été observé:
- avec un milieu contenant de la guar pourL. plantarum,
- avec un milieu contenant du lait écrémé pourL. plantarum, et
- avec un milieu contenant du perméat de lactosérum pourL. plantarum.
Biomasse présente après lyophilisation
La biomasse présente après lyophilisation résulte de la biomasse produite et de la survie des cellules bactériennes au procédé de lyophilisation.
Ainsi, pour toutes les espèces de lactobacilles, les biomasses après lyophilisation sont équivalentes ou supérieures à celles obtenues après culture dans le MRS lorsque les cultures ont été réalisées dans les milieux à base de perméat de lait.
De plus, pourL. rhamnosus, la biomasse présente après lyophilisation lorsque la culture a été réalisée dans le milieu à base de perméat de lait (concentration 2) est significativement supérieure à la biomasse présente après lyophilisation lorsque la culture a été réalisée dans le milieu à base de perméat de lait (concentration 1).
Lorsque les ratio C/N ne sont pas équilibrés avec celui du MRS, pour la soucheL. plantarum, la biomasse après lyophilisation est ainsi de 4.1011UFC/g de lyophilisat, pourL. caseielle est de 2,2.1011UFC/g de lyophilisat et pourL. rhamnosuselle est de 2,4.1011UFC/g de lyophilisat.
En comparaison, les biomasses après lyophilisation dans un milieu à base de guar, de lait écrémé ou de perméat de lactosérum ont été significativement inférieures, équivalentes ou supérieures à celles produites sur le milieu MRS. Notamment, des biomasses après lyophilisation significativement inférieures ont été observées:
- avec un milieu contenant de la guar pourL. rhamnosus,
- avec un milieu contenant du lait écrémé pourL. rhamnosusetL. plantarum, et
- avec un milieu contenant du perméat de lactosérum pourL. plantarum.
Conclusions
Les milieux de qualité alimentaire élaborés à base de perméat de lait permettent d’obtenir une biomasse après lyophilisation équivalente au milieu MRS (ratios C/N équilibrés) pour toutes les souches (Tableau 9). Lorsque les ratios C/N des milieux de qualité alimentaire sont augmentés par rapport au MRS, le milieu de qualité alimentaire élaboré à base de perméat de lait permet d’obtenir une biomasse après lyophilisation équivalente ou supérieure au MRS pour toutes les souches (Tableau 10). Le perméat de lait est un sous-produit de l’industrie de transformation du fromage et du lait, facilement disponible et moins couteux que le lactosérum. Le perméat de lait est ainsi choisi comme source d’azote et de carbone de qualité alimentaire pour la production de biomasse de souches de lactobacilles. De plus, il convient dans le cadre d’un régime végétarien, casher ou halal.
MATERIELS ET METHODES
Souches
Pour évaluer le milieu de culture développé, trois souches de Lactobacilles ont été utilisées:Lactobacillus plantarum(Lp1),Lactobacillus casei(Lc03) etLactobacillus rhamnosus(Lr04). Les souches ont été stockées à -80°C sous forme d’aliquotes contenant 1 mL de culture en phase stationnaire de croissance en suspension dans du milieu MRS supplémenté avec 20% de glycérol (v/v) (G7893, Honeywell, USA).
Milieux de culture
Milieu MRS (Tableau 1)
Le milieu MRS (Lactobacillus Broth acc. to De Man, Rogosa and Sharpe, 69966, Sigma-Aldrich) a été préparé selon les consignes du fabricant et stérilisé à 120°C pendant 20 minutes après l’ajout de 0,1% (v/v) de Tween 80 (P4780, Sigma-Aldrich, CAS: 9005-65-6). Sa composition finale est donc: peptone 10 g/L, extrait de viande 8 g/L, extrait de levure 4 g/L, D (+)-Glucose (CAS: 50-99-7) 20 g/L, hydrogénophosphate de potassium (CAS: 7758-11-4) 2 g/L, acétate de sodium trihydraté (CAS: 6131-90-4) 5.0 g/L, citrate de triammonium (CAS: 3458-72) 2 g/L, sulfate de magnésium heptahydraté (CAS: 10034-99-8) 0,2 g/L, sulfate de manganèse tétrahydraté (CAS: 10101-68-5) 0,05 g/L et tween 80 1mL/L. Le pH final est de 6.2 +/- 0,2 à 25°C.
Milieux de culture de qualité alimentaire
Quatre sources d’azote et de carbone ont été évaluées pour la production de biomasse et la survie au procédé de lyophilisation des souches de Lactobacilles: du lait écrémé, du lactosérum, du perméat de lait, du perméat de lactosérum et de la peptone de guar. La peptone de guar est obtenue à partir de la légumineuseCyamoposis tetragonolobusqui a été purifiée par traitement mécanique (élimination de la gomme de guar attachée au germe). Les tableaux 2 à 8 montrent particulièrement les compositions et les ratios C/N utilisés.
Les composants d’origine animale et/ou controversés présents dans le milieu MRS ont été remplacés par des matières premières alimentaires, c’est-à-dire autorisés au sens réglementaire européen. Les composants considérés comme des substances toxiques ont été éliminés de la composition.
La composition des milieux de culture de qualité alimentaires est basée sur celle du milieu MRS simplifié : une source d’azote (ou une source d’azote et de carbone) alimentaire, de l’extrait de levure (NuCel 582 MG, Procelys Lesaffre Fermentation Nutrients, France), une source de carbone (glucose, D9434, Sigma-Aldrich), du magnésium (sulfate de magnésium heptahydraté, CL00,1324.0250, Chem-Lab NV, Belgique) et du manganèse (sulfate de manganèse (II) monohydraté, 221287, Honeywell, USA).
Les sources d’azote et de carbone laitières ont été fournies par Eurial Ingrédients & Nutrition (France) et la source d’azote végétale a été fournie par Organotechnie (France).
Le lait écrémé, le lactosérum, le perméat de lait et le perméat de lactosérum fournissent de l’azote et du carbone (lactose) alors que la peptone de guar ne fournit que de l’azote.
Les poudres de lait écrémé, de lactosérum, de perméat de lait et de perméat de lactosérum ont été ajoutées après stérilisation du milieu (120°C - 20 minutes) à une température comprise entre 65°C et 75°C (température de pasteurisation du lait). La peptone de guar a été ajoutée en même temps que les autres composants du milieu de culture puis celui-ci a été stérilisé comme décrit précédemment. Le pH des milieux a ensuite été ajusté à 6.2 ± 0,2.
Production de biomasse et lyophilisation de la biomasse produite
A partir des cryotubes, des souchiers ont été préparés par ensemencement de 100µL de culture sur boîtes de Petri contenant du milieu MRS gélosé: MRS supplémenté avec 15g/L d’agar (84609, VWR, Belgique). Après 24h de croissance dans une étuve à 37°C, les souchiers ont été conservés au réfrigérateur à 4°C et peuvent être utilisés jusqu’à 3 semaines après leur culture. Des pré-cultures ont été réalisées en inoculant 10 mL de milieu MRS avec des colonies prélevées sur ces souchiers. Pour finir, après 24h de culture à 37°C, les milieux de culture FG ou le milieu de culture témoin (MRS) ont été inoculés à 1% (v/v) avec les pré-cultures puis incubés à 37°C.
Dénombrement de la biomasse produite et détermination du taux de survie à la lyophilisation
Le nombre de cellules présentes a été estimé par la méthode des Unités Formant Colonies (UFC). La biomasse produite (UFC/mL avant lyophilisation) a été récoltée en début de phase stationnaire de croissance. Après centrifugation (4000g - 10 minutes, Eppendorf 5810 R), les culots ont été resuspendus dans du saccharose (59378, Sigma) à 5% (m/v) dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, P4417, Sigma). Le saccharose est ajouté de façon à concentrer par 10 le nombre de cellules produites par mL.
Un millilitre de ce mélange est introduit dans des flacons en verre ambré de 5 ml adapté pour des applications en lyophilisation puis congelé à -80°C pendant 2h avant d’être lyophilisé pendant 24h.
A la fin du procédé de lyophilisation, les échantillons sont réhydratés dans 1 mL de milieu MRS à 37°C afin d’effectuer un dénombrement de la biomasse (UFC/mL après lyophilisation).
La survie au procédé de lyophilisation (%) est déterminée en faisant le rapport entre la biomasse présente après lyophilisation et réhydratation (UFC/mL avant lyophilisation) sur la biomasse présente avant lyophilisation (UFC/mL après lyophilisation et réhydration).
Pour estimer le nombre de cellules présentes par gramme de lyophilisat, le nombre de cellules présentes dans 1L de lyophilisat réhydraté a été rapporté à 50 g de matière sèche, c’est-à-dire divisé par 20 (matière sèche dans le lyophilisat, c’est-à-dire matière sèche de 5% de saccharose dans du PBS soit 50g/L).
Analyse statistique
Une analyse de variance (ANOVA) et un test post-hoc HSD de Tukey (si p < 0,05) ont été réalisés pour déterminer si des différences significatives de production de biomasse, de survie à la lyophilisation ou de biomasse présente après lyophilisation existaient entre les milieux de culture. Les analyses ont été effectuées en utilisant le logiciel R (version 3.5.1).
Les expériences ont été réalisées en triplicats biologiques (3 cultures indépendantes). Les résultats présentés sont les moyennes et les écarts types pour n=3.
Références bibliographiques
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Tableau 1: Composition du milieu MRS. En gris foncé : composants d’origine animale; En gris clair: ingrédients listés parmi les substances toxiques pour la santé humaine ou dont l’utilisation est controversée.
Tableau 2: Taux d'azote et de carbone des cinq sources d'azote et de carbone de qualité alimentaire (pour 100 grammes de matière sèche).
Tableau 3 : Taux d’azote et de carbone pour 1 litre de milieu de culture MRS.
Tableau 4 : Taux d'azote et de carbone pour 1 litre de milieu à base de protéines laitières avec les ratios C/N équilibrés avec le MRS et le pourcentage de carbone fixé à celui du MRS.
Tableau 5 : Taux d'azote et de carbone pour 1 litre de milieu FG à base de peptone de guar avec le ratio C/N équilibré avec celui du MRS.
Tableau 6 : Exemple de composition des milieux de culture Food Grade (ratios C/N équilibrés).
Tableau 7 : Taux d'azote et de carbone pour 1 litre de milieu à base de protéines laitières avec les ratios C/N supérieurs à celui du MRS.
Tableau 8 : Exemple de composition des milieux de culture Food Grade (ratios C/N non équilibrés avec le MRS).
Tableau 9 : Biomasse produite, taux de survie à la lyophilisation et biomasse après lyophilisation en fonction du milieu de culture (ratio C/N des milieux de culture équilibrés avec celui du MRS). Les lettres représentent une différence significative entre les milieux de culture avec le test HSD (p < 0,05). Ce tableau indique également l’efficacité des milieux testés en comparaison avec le milieu MRS: Significativement inférieur au MRS: <; Equivalent au MRS: =; Significativement supérieur au MRS: >.
Tableau 10: Biomasse produite, taux de survie à la lyophilisation et biomasse présente après lyophilisation en fonction du milieu de culture (ratios C/N des milieux de culture FG non équilibrés avec celui du MRS). Les lettres représentent une différence significative entre les milieux de culture avec le test HSD (p < 0,05). Ce tableau indique également l’efficacité des milieux testés en comparaison avec le milieu MRS: Significativement inférieur au MRS: <; Equivalent au MRS: =; Significativement supérieur au MRS: >.
Claims (10)
- Utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire pour cultiver des bactéries lactiques, ledit milieu comprenant: 35 à 70% de perméat de lait en poids sec par rapport au poids sec total du milieu en tant que source carbonée et azotée, une source azotée additionnelle et une source minérale, dans lequel le ratio de l’apport en carbone par rapport à l’apport en azote total dans le milieu est compris entre 4 et 10.
- Méthode de production de bactéries lactiques comprenant:
a) la mise en culture et la multiplication de bactéries lactiques dans un milieu de culture de qualité alimentaire comprenant 35 à 70% de perméat de lait en poids sec par rapport au poids sec total du milieu en tant que source carbonée et azotée, une source azotée additionnelle et une source minérale; dans lequel le ratio de l’apport en carbone par rapport à l’apport en azote total dans le milieu est compris entre 4 et 10,
b) la récupération des bactéries lactiques multipliées, et
c) facultativement, la lyophilisation ou la congélation des bactéries multipliées. - Milieu de culture de qualité alimentaire pour bactéries lactiques comprenant 35 à 70 % en poids sec de perméat de lait, 25 à 55 % en poids sec d’extrait de levure par rapport au poids sec total du milieu, et une source minérale, le milieu de culture ayant un ratio carbone par rapport à l’apport en azote total compris entre 4 et de 10.
- Utilisation selon la revendication 1, méthode selon la revendication 2 ou milieu de culture selon la revendication 3, dans lequel le milieu de culture ne comprend pas de peptone d’origine animale et/ou d’extrait de viande.
- Utilisation selon la revendication 1 ou 4, méthode selon la revendication 2 ou 4, ou milieu de culture selon la revendication 3 ou 4, dans lequel le milieu de culture comprend du magnésium comme source minérale, de préférence du sulfate de magnésium, en particulier 0,01% et 1% en poids sec de sulfate de magnésium par rapport au poids sec total du milieu.
- Utilisation selon la revendication 1, 4 ou 5, méthode selon la revendication 2, 4 ou 5 ou milieu de culture selon la revendication 3, 4 ou 5, dans lequel le milieu de culture comprend du manganèse comme source minérale, de préférence du sulfate de manganèse, en particulier 0,01% et 1% en poids sec de sulfate de manganèse par rapport au poids sec total du milieu.
- Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 et 4-6, méthode selon l’une quelconque des revendications 2 et 4-6, ou milieu de culture selon l’une quelconque des revendications 3-6, dans lequel le milieu de culture a un pH compris entre 5,5 et 7,5, de préférence un pH compris entre 6 et 7.
- Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 et 4-7, méthode selon l’une quelconque des revendications 2 et 4-7 ou milieu de culture selon l’une quelconque des revendications 3-7, dans lequel le milieu de culture ne comprend pas au moins un composé choisi dans le groupe constitué par du glucose, un antibiotique, de l’hydrogénophosphate de potassium, de l’acétate de sodium trihydraté, du citrate de triammonium et du Tween 80.
- Utilisation d’un milieu de culture de qualité alimentaire selon l’une quelconque des revendications 3-8 pour la préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique comprenant des bactéries lactiques.
- Méthode de préparation d’une composition pharmaceutique ou nutraceutique comprenant une étape d’ajout de bactéries lactiques préparées selon la méthode de l’une quelconque des revendications 2 et 4-8 aux autres composants de la composition pharmaceutique ou nutraceutique.
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