JP5114200B2 - 抗アレルギー剤 - Google Patents

Description

本発明は、β−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）遊離阻害活性を有し、アレルギー症状を緩和する抗アレルギー剤に関する。

近年、特定の花粉や食物等によってアレルギー症状を発症するヒトの増加が社会問題となっており、発症したアレルギー症状を緩和する抗アレルギー剤や食品の開発が進められている。
アレルギー症状の治療法としては、ステロイドホルモンの投与等のステロイド療法や抗ヒスタミン剤等の非ステロイド系療法に大別される。ステロイド療法は非常にアレルギー症状の緩和に効果的であるが長期間投与すると、骨粗鬆症、白内障、血栓症等の副作用がみられることがある。

アレルギー症状のメカニズムとしては、好塩基球やマスト細胞等の顆粒中にヒスタミン等各種のケミカルメディエーターが存在し、それらの細胞表面上にある特定部位が抗原によって刺激を受け、脱顆粒化現象を起こすことでケミカルメディエーターが細胞外へ放出される。ケミカルメディエーターが放出されることによって、くしゃみ、鼻水、涙、皮膚炎、喘息等のアレルギー症状を誘発することが明らかにされている。

このアレルギー症状のメカニズムが解明され、ＩｇＥ量を減らす他に、肥満細胞や好塩基球の細胞表面上に発現している高親和性のＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）にＩｇＥが結合した後、更に抗原で架橋されると起こる肥満細胞や好塩基球の脱顆粒を抑制する非ステロイド系療法の薬剤が天然抽出物等から探索、研究が行われている。
例えば、マンゴスチンの果皮抽出物のα−又はγ−マンゴスチン（特許文献１参照。）、茶抽出物のエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート類（非特許文献１参照。）、カビの一種であるオオスポラ属菌株が生産するベンゾフェノン誘導体であるスロクリン（特許文献２参照。）、シソ科植物より抽出されたジテルペンの一種のフォルスコリン（特許文献３参照。）、タイ産Ａ．ｇａｌａｎｇａの乾燥根茎より抽出されたフェニルプロパノイド類等が挙げられる（非特許文献２参照。）。
特開２０００−１１６３５６号公報 特開平８−９２０８２号公報 特開２００３−２５２７８６号公報 マエダ（Ｍａｅｄａ）等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４年，１７２巻，ｐ．４４８６−４４９２ 吉川等，文部科学省ハイテク・リサーチ・センター整備事業；平成１４・１５年度研究成果報告書，−生薬学−，「タイ天然薬物Ｋｈａａの抗アレルギー作用成分」，［ｏｎｌｉｎｅ］，平成１６年４月，京都薬科大学、［平成１７年８月２日検索］，インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｙｏｔｏ−ｐｈｕ．ａｃ．ｊｐ／ｈｉｔｅｃｈ／ａ５．ｐｄｆ＞

しかしながら、従来の抗アレルギー剤は有効性が十分でなかったり、副作用がある等の問題がある。従って、本発明の目的は、新たな抗アレルギー剤を提供することにある。

抗体ＩｇＥがＦｃεＲＩに結合した後においても肥満細胞や好塩基球の脱顆粒を抑制することができれば、アレルギー症状の緩和に直接繋がる。細胞株の脱顆粒抑制の指標として、β−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）を用いることができる（ＬＢ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ＫＦ Ａｕｓｔｅｎ，ａｎｄ ＳＩ Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒａｔ ｓｅｒｏｓａｌ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９７９）１２３：ｐ．１４４５−１４５０，その他非特許文献２。）ため、本発明者は、ナフトキノン類を被験物とし、好塩基球細胞株の脱顆粒抑制を指標にβ−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）放出抑制活性及び５０％β−ヘキソサミニダーゼ遊離阻害濃度（ＩＣ_５０）を検討した結果、特定のナフトキノン類が強い脱顆粒抑制作用を有し、抗アレルギー剤として有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，４−ナフトキノン、４−アミノ−２−メチル−１−ナフトール、２−メチル−１，４−ナフトキノン、及び２−アミノ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン及びその塩から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする抗アレルギー剤を提供するものである。

本発明におけるナフトキノン類は、強い脱顆粒抑制作用を有するため、抗アレルギー剤として有用である。

ＡＣＮＱにおけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出率を示す。 ＤＨＮＡにおけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出率を示す。 ＰＣＡ反応における、ＡＣＮＱ投与群（実施例７）、ＣＭＣナトリウム投与群（比較例４）及びＰＣＡ非惹起群（比較例５）の耳介漏出エバンスブルー量を示す。 ＊Ｐ＜０．０５，ｔ−ｔｅｓｔ，対照群（ＣＭＣナトリウム投与群（比較例４））と比較。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の抗アレルギー剤の有効成分は、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃａｒｂｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＡＣＮＱ）、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ ａｃｉｄ、ＤＨＮＡ）、１，４−ナフトキノン（１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（２−ｍｅｔｈｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ３）、４−アミノ−２−メチル−１−ナフトール（４−ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ５）、２−アミノ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）及びそれらの塩から選ばれる１種又は２種以上である。より好ましくは、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）である。

これらの成分の塩としては、医薬品上又は食品上許容しうる塩であることが好ましい。例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム、マンガン等のアルカリ土類金属の塩、塩酸、硫酸等の酸付加塩等が挙げられる。

これらの成分は、いずれも既知の化合物であり、例えばビタミンＫ３及びビタミンＫ５は医薬品や食品に使用されることもある。またＡＣＮＱ及びＤＨＮＡは、有用なビフィズス菌を増殖せしめる物質であることが知られており、安全性が高いものである（特開平７−２８９２７３、特開平１０−３６３２８、特開２００３−８９６８３及び特開２００４−２１０６７６）。

前記ナフトキノン類は、強い脱顆粒抑制作用を有し、かつ安全性も高いことから、抗アレルギー剤として有用である。本発明で対象となるアレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、喘息、くしゃみ、鼻水、涙、かゆみ（掻痒）等が挙げられる。

本発明の抗アレルギー剤は、単独、又は他の医薬、任意の製剤用担体や希釈剤と混合した任意の剤形にして医薬品とすることができる。また、本発明の抗アレルギー剤は、各食品に配合することができ、抗アレルギー食品、特にアレルギー症状を緩和する旨を表示した食品として利用することができる。
前記成分の医薬品又は食品への含有量には特に制限はないが、通常は０．０１〜１００重量％であることが好ましく、０．１〜５０重量％であることが好ましい。

本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、前記成分の医薬品又は食品上におけるそれぞれ一般的な製造方法により、直接混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。これらを製造する際に、それぞれ医薬品又は食品として許容される担体或いは希釈剤等を添加することができる。具体的には、それぞれ医薬品又は食品として許容される公知の溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤及び安定剤等が添加される。

抗アレルギー剤としては、例えば、経口投与形態又は筋肉内、皮下、静脈内、下部体腔、皮膚等の非経口投与等投与形態により、経口剤、点眼剤、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、座剤等が挙げられる。経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、トローチ剤、経口用液体製剤等が挙げられる。
また、抗アレルギー食品としては、例えば、キャンディー、ドロップ、チューンガム、カプセル錠、錠剤、清涼飲料、菓子、冷菓、乳製品、パン類、米飯類、穀物類及び肉類等が挙げられる。

本発明の抗アレルギー剤の投与量又は摂取量は特に制限されないが、前記成分として成人１日に当たり０．００５〜５００ｍｇが好ましい。

＜細胞株による脱顆粒の誘導＞
本実施例では、β−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の活性を測定することにより細胞の脱顆粒を評価した。方法は次の通りである。好塩基球様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を１０％ウシ胎児血清入りのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）で懸濁し、２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで０．１μｇ／ｍＬの抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−ＩｇＥ抗体（ＳＩＧＭＡ）存在下、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで３７℃、一晩インキュベートした。

調製した好塩基球様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、各濃度の被験物（実施例１〜６及び比較例１〜３）存在下で３７℃、３０分間インキュベートした。このときの各濃度は、それぞれ、ＡＣＮＱが０．１，０．２，０．３，０．４，０．５μＭ、ＤＨＮＡが２０，３０，４０，６０，８０μＭ、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ３）が６０，７０，８０，９０，１００μＭ、４−アミノ−２−メチル−１−ナフトール（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ５）が１０，２０，３０，４０，５０μＭ、１，４−ナフトキノン（１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）が１０，２０，３０，４０，５０μＭ、２−アミノ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）が３，４，５，６，７μＭ、ビタミンＫ１（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ１）が５０，１００μＭ、ビタミンＫ２（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ２）が２５，５０，１００μＭ、１，３−ナフタレンジオール（１，３−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｏｌ）が５０，１００μＭである。
インキュベートした好塩基球様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３をＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＢＳＡ（エル・エス・エル）の存在下でさらに３７℃、１時間インキュベートした。インキュベート後、上清を回収し、上清に含有するβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を測定した。また、細胞内に残ったβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの活性については、残った細胞を０．１％ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ／ＤＭＥＭで可溶化し、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を同様に測定した。

＜β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの活性測定＞
得られた上清及び細胞の可溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加後、基質として２ｍＭのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。３７℃で２時間インキュベート後、停止液（１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．０）を１５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４１５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。次式によりβ−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）放出率（％）を算出し、脱顆粒を評価した。
β−ヘキソサミニダーゼ放出率（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ）（％）
＝１００×（上清のＯＤ_４１５）／（上清のＯＤ_４１５＋可溶化細胞のＯＤ_４１５）

＜β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ 遊離阻害試験＞
被験物無添加以外上記β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの活性測定と同様に上清のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を測定し、各実施例１〜６及び比較例１〜３の被験物の好塩基球様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３の上清のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を測定し、５０％β−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）遊離阻害濃度（ＩＣ_５０）を求めた。

＜実施例１〜２＞
実施例１〜２は、被験物をそれぞれ、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃａｒｂｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＡＣＮＱ）、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｓａｉｓｙｕｏｉｃ ａｃｉｄ、ＤＨＮＡ、和光純薬工業）とし、上記の方法でβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの活性測定及びβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害試験を行った。
＜実施例３〜６、比較例１〜３＞
実施例３〜６は、被験物をそれぞれ、ビタミンＫ３（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ３、２−メチル−１，４−ナフトキノン、和光純薬工業）、ビタミンＫ５（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ５、４−アミノ−２−メチル−１−ナフトール、和光純薬工業）、１，４−ナフトキノン（１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、和光純薬工業）、２−アミノ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、和光純薬工業）とし、上記の方法でβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離阻害試験を行った。
比較例１〜３は、被験物をそれぞれ、ビタミンＫ１（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ１、フィロキノン、和光純薬工業）、ビタミンＫ２（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ２、メナキナン、ＳＩＧＭＡ）及び１，３−ナフタレンジオール（１，３−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｏｌ、和光純薬工業）とし、上記の方法でβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ 遊離阻害試験を行った。

図１及び２に示すように、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４ナフトキノン（ＡＣＮＱ）（実施例１）では０．４μＭ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）（実施例２）では６０μＭ以上で、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出率を被験物無添加（０μＭ）の約２０％に抑制することができることが判明した。
下記表１に各被験物（実施例１〜６及び比較例１〜３）の５０％β−ヘキソサミニダーゼ遊離阻害濃度（ＩＣ_５０）を記す。
被験物の中で、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４ナフトキノン（ＡＣＮＱ）が特に強い活性を示し、ＩＣ_５０は０．２５μＭ（０．０５４５μｇ／ｍＬ）であった。また、２−アミノ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン（２−ａｍｉｎｏ−３−ｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）ではＩＣ_５０が６．８μＭ（１．４μｇ／ｍＬに相当）、４−アミノ−２−メチル−１−ナフトール（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ５）、１，４−ナフトキノン（１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）ではＩＣ_５０が約３０μＭ（各々６．１，４．７μｇ／ｍＬに相当）、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ３）では、ＩＣ_５０が５０μＭ（各々８．２，１１．５μｇ／ｍＬに相当）前後であった。

非特許文献１によると、茶の成分であるＯ−メチル基を有するエピガロカテキンガレートでも脱顆粒抑制能が報告されている。当該文献ではヒスタミンの放出で脱顆粒抑制能を評価しているが、１０５．８μＭ（５０μｇ／ｍＬ）で約５０％の阻害率であった。また、非特許文献２によると、好塩基球様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３において、合成医薬品の抗アレルギー薬であるトラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ，Ｎ−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）及びフマル酸ケトチフェン（ｋｅｔｏｔｉｆｅｎ ｆｕｍａｒａｔｅ，４（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｉｐｅｒｉｄｙｌｉｄｅｎｅ−４Ｈ−ｂｅｎｚｏ［４，５］−ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａ［１，２−ｂ］−ｔｈｉｏｐｈｅｎ−１０（９Ｈ）−ｏｎｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｕｍａｒａｔｅ）のＩＣ_５０が各々４９２μＭ（１６１μｇ／ｍＬ）、２１４μＭ（９１μｇ／ｍＬ）と報告されている。
以上のことにより、本発明の有効成分の脱顆粒抑制能は非常に強いことが判明した。

＜ＰＣＡ反応＞
ＩＣＲマウス（雌、６週齢）を予備飼育後、体重に差がないように次の３群に分けた。１群；０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウム投与群（比較例４）、２群；ＡＣＮＱ（１００μｇ／ｋｇ）投与群（実施例７）、３群；ＰＣＡ非惹起群（比較例５）とした。それぞれの例数は、１，２群が８匹、３群が４匹とした。１群（ＣＭＣナトリウム投与群）を２群（ＡＣＮＱ投与群）の対照群とした。
１，２群のＩＣＲマウスには抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（１００ｎｇ／ｂｏｄｙ）をマウスの耳介に皮内投与した。３群のＩＣＲマウスには抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体に代えて生理食塩水を同様に投与した。耳介への抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体投与２３時間後、被験物として１群と３群のＩＣＲマウスには０．５％ＣＭＣナトリウム水溶液を、２群のＩＣＲマウスには０．５％ＣＭＣナトリウム水溶液で懸濁したＡＣＮＱ液をそれぞれ経口投与した。
さらに、被験物の投与１時間後、１〜３群のそれぞれのＩＣＲマウスに抗原としてＤＮＰの結合したＢＳＡ（０．２５ｍｇ／ｂｏｄｙ）をエバンスブルーと共に静脈投与し、ＰＣＡ反応を惹起させた。ＰＣＡ反応惹起３０分後、１〜３群のＩＣＲマウスを殺処分し、耳介を切除した。切除した耳介を１Ｎ水酸化カリウム存在下で３７℃、一晩インキュベート後、アセトンと０．５Ｎリン酸（１３：５）混液でエバンスブルーを抽出し、６２０ｎｍにおける吸光度から耳介に漏出したエバンスブルー量を算出した。

図３に、ＡＣＮＱ投与群（実施例７）、ＣＭＣナトリウム投与群（対照群、比較例４）及びＰＣＡ非惹起群（比較例５）の結果を示す。
ＡＣＮＱ投与群（実施例７）では、ＣＭＣナトリウム投与群（比較例４）と比較してエバンスブルー量が有意に低下し、ＡＣＮＱによりＰＣＡ反応が抑制されることが判明した。

Claims (2)

1. ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン及びその塩から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする抗アレルギー剤。
2. 有効成分が、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン及びその塩から選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載の抗アレルギー剤。