CN107794247A - 一株痤疮丙酸杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

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    • C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Abstract

本发明提供一株痤疮丙酸杆菌噬菌体(Propionibacterium acnes phage，φPA6)，可用于调节人体皮肤的寄居菌群，并可预防、治疗、缓解、减轻、和治愈痤疮丙酸杆菌的感染症状，如寻常痤疮(acne vulgaris)，并包括矫形外科的痤疮丙酸杆菌感染。尤其是针对痤疮丙酸杆菌的多重耐药菌株。相关的噬菌体制剂可用于皮肤美容、皮肤感染、外科感染等领域。

Description

一株痤疮丙酸杆菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及利用痤疮丙酸杆菌噬菌体(Propionibacterium acnes phage)，φPA6，拮抗痤疮丙酸杆菌的生长，尤其是多重耐药性菌株。应用于皮肤感染，如寻常痤疮，和应用于整形外科的痤疮丙酸杆菌感染的干预。保藏号：CGMCC No.12669。
背景技术
痤疮丙酸杆菌是皮肤常驻菌之一，革兰氏阳性，厌氧生长，具有生成细菌生态膜(biofilm)的特性，并造成局部生态位(ecological niche)的酸性环境；参与了寻常痤疮(acne vulgaris)的形成，也是整形外科感染造成手术失败的重要致病菌之一；相关的感染常与细菌多重耐药性相关联。
通常寻常痤疮的患者习惯于长期用抗生素治疗，虽然治疗有效，但抗生素会有副作用。抗生素的使用会导致痤疮丙酸杆菌耐药性发育，结果治疗无效和将耐药性转移到皮肤的其他细菌和密切接触的胃肠道菌群。
痤疮丙酸杆菌噬菌体也是体表和粘膜的常驻生物，调节着皮肤痤疮丙酸杆菌的生长，影响皮肤局部的生态位。
本发明分离出的痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6，具有强烈拮抗痤疮丙酸杆菌生长的能力，具有对皮肤和整形外科感染痤疮丙酸杆菌的干预潜力。是抗生素之外的抗菌物。
发明内容
本发明中分离到的痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6，能有效拮抗痤疮丙酸杆菌的生长，并杀灭之。
本发明涉及提取并纯化痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6。
进而，本发明提供了抗生素之外的干预细菌感染的方法，尤其是针对痤疮丙酸杆菌的细菌生态膜生长方式及其抗生素耐药性；以一种组合给药方式，针对皮肤分离到的痤疮丙酸杆菌，有效减少并杀灭痤疮丙酸杆菌。
本发明也提供组合给药方式杀灭或抑制痤疮丙酸杆菌。使用该方法的媒介可以是食品、制造食品的物质、化妆品介质、医学设备、皮肤、外科灌输、或金属、塑料、瓷器、或玻璃表面。该媒介可以是惰性载体，也可以按常规的杀菌方式使用。
本发明也提供一种新的、由一种或多种宿主修饰的痤疮丙酸杆菌噬菌体构成的鸡尾酒，用于消毒或杀灭痤疮丙酸杆菌，以保护任何需要的，包括但不限于食品、制造食品的物质、食品制备区域、化妆品介质、外科灌输、金属、塑料、搪瓷器、瓷器、或玻璃表面、医学设备和仪器，皮肤。
本发明所涉及的痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6，CGMCC No.12669，能有效杀灭皮肤上分离的痤疮丙酸杆菌、以及ATCC39399、ATCC6919、ATCC11827等痤疮丙酸杆菌菌株。但对颗粒丙酸杆菌(ATCC11829)和金黄色葡萄球菌无拮抗作用。
在本说明书和具体实施方法中，使用了常规微生物培养法(含厌氧培养)和操作和噬菌体操作。
本发明中涉及的痤疮丙酸杆菌的特异性噬菌体、与轻型链球菌及其代谢产物、或适当抗菌剂联合使用，来干预痤疮丙酸杆菌的感染，这些抗菌剂包括(但不限于)抗生素和化学疗法的制剂。
本发明中提取和纯化的噬菌体，可密封包装于安瓿或其它包装形式。并按噬菌体连续稀释液与痤疮丙酸杆菌共同培养(双层琼脂法)，确定制剂的滴度(效价)，以PFU/ml表示。
据此，该活性物制剂可以确立其组成或原则，以一种活体给药的生物学相容形式给药，是指活性物的给药形式，其疗效效应超过其毒性效应。
该活性物制剂可以用便利的方式给药，诸如注射(皮下注射、静脉注射，等)，口服、肺部气雾剂、鼻腔喷雾、肌肉注射、腹腔注射、阴道灌注、直肠灌注、局部注射、脊柱穿刺、和直接敷用。依据给药途径，该活性物可被以保护层(如肠衣剂或丸剂)，避免酶、酸碱和其它天然条件下的灭活作用。
在此所描述的给药形式可配制成药物学允许的可用于人体或动物的制剂形式，诸如有效量的活性物与药物学许可的载体混合组成。
技术成熟的赋形剂可用作传输载体。
该活性物可冻干，于注射前再溶解。该活性物可溶解于适当的媒介，如水溶液、或缓冲液、或悬浮于任何适当的液体、胶体、或多聚混合物，制成抗菌剂。抗菌剂可组合成化妆品、药膏、或敷料，诸如外科感染的敷料、或外科插管、或制成广谱消毒剂用于皮肤和口腔清洁液、消毒擦洗剂、洗剂。该活性物也可用于清洁医疗器械、外科手术前擦洗，等等。
本发明涉及的噬菌体及其制剂，适合于拮抗痤疮丙酸杆菌，包含多重抗生素耐药性的痤疮丙酸杆菌。在针对抗生素耐药性的痤疮丙酸杆菌感染，这些形式和方法尤其有用。具体在本发明中，痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6的组合物和方法用于干预痤疮丙酸杆菌感染。
具体实施方式
以下用非限制性实例说明本发明：
用于干预痤疮丙酸杆菌感染的φPA6，能杀灭皮肤上分离的痤疮丙酸杆菌。
方法和材料：
菌株与噬菌体分离鉴定：
被分离鉴定的φPA6，CGMCC No.12669，分离自本实验室于皮肤上分离的痤疮丙酸杆菌PA6株。PA6株经生化鉴定为痤疮丙酸杆菌：dGAL-、LeuA+、ELLM+、PheA+、ProA+、PyrA+、dCEL-、TyrA+、APPA(-)、dGLU+、dMNE+、dMAL-、SAC-、ARB-、NAG-、BGLUi-、URE-、BGURi-、BGALi+、AARA-、AGALi-、BMAN-、ARG+、PVATE+、MTE-、ESC-、BdFUC-、BNAGi-、AMANi+、AIFUC-、PHOS-、IARA-、dRIB2+、OPS-、AARAF-、dXYL-、GRAM+、MORPH-、AERO-。PA6株于厌氧操作中，向1490厌氧培养基中加入丝裂霉素C(2μg/ml)，经48-72小时厌氧培养(80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳，37℃)诱导得到能裂解原细菌PA株的噬菌体，φPA6。该噬菌体能裂解全部本实验室分离到的痤疮丙酸杆菌PA1-PA6，并能裂解痤疮丙酸杆菌的参考株ATCC29399、6919、11827株，但不裂解颗粒丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。
φPA6，CGMCC No.12669对痤疮丙酸杆菌的裂解试验结果：
痤疮丙酸杆菌生长，培养基1490(ATCC medium)，生长条件，37℃，10％CO2，10％H2，80％N2，培养72小时，观察裂解作用。结果如下：
PA1-6为本实验室分离的痤疮丙酸杆菌株，29399、6919、11827为ATCC的痤疮丙酸杆菌参考株，颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)(ATCC11829)为阴性对照，+为拮抗阳性，-为拮抗阴性，金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌为本实验室菌株。
φPA6的制备与纯化：
对φPA6做连续10倍稀释，如10-2至10-7，分别加入0.1ml于53℃保温的半固体(3ml)中，并立即加入0.1ml菌株PA6(约106)，倾倒于1490琼脂板上，370C厌氧培养48-72小时。取融合裂解的平板的噬菌体溶度为制备溶度(如10-4或10-5)，留有痕迹的菌苔。按此噬菌体溶度大量制备高滴度噬菌体裂解液(双层琼脂法)，滴度可达109至1010PFU/ml。经72小时培养后，于平板上加入5ml/板1490肉汤，连同半固体层一道洗脱下，于5000rpm，4℃离心20分钟。取上清液，并除菌过滤得到裂解物粗制噬菌体液。粗制液经氯化铯梯度离心后可得纯化噬菌体。噬菌体粗制液或纯化液均可用脱脂牛乳赋型行冷冻干燥备用。
φPA6的滴度测定：
制备所得的噬菌体行连续10倍稀释，按上法(双层琼脂法)，计数平板的噬斑数，而测定其噬菌体滴 度，如粗制液滴度可达1010PFU/ml。
φPA6噬菌体制剂的配制：
冷冻干燥制剂，可用适量生理盐水或适当缓冲液溶解，或添加于面膜成分内，或直接用于外敷，或借助导管或仪器导入到患处，或喷涂于器具表面。
φPA6与链球菌代谢产物的协同应用：
应用于寻常痤疮时，先行φPA6干预，待24-36小时后，再使用轻型链球菌代谢物。寻常痤疮既有痤疮丙酸杆菌的存在，亦会有金黄色葡萄球菌感染，二者先后使用可较好地干预痤疮的发展。前者作用于痤疮丙酸杆菌，后者作用于痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。
生物材料的保藏：
本发明涉及的φPA6，已于2016年08月30日按照布达佩斯条约在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏。保藏号CGMCC No.12669。

Claims (8)

1.一株分离的痤疮丙酸杆菌噬菌体(Propionibacterium acnes phage)，φPA6，该噬菌体可用于拮抗痤疮丙酸杆菌生长，尤其是多重抗生素耐药性的菌株。包括不同宿主痤疮丙酸杆菌株适应的宿主修饰的噬菌体株。可用于寻常痤疮的预防和治疗，以及矫形外科的继发性痤疮丙酸杆菌感染。该噬菌体保藏号：CGMCC No.12669。
2.权利要求1的噬菌体，制备成一种或多种含痤疮丙酸杆菌噬菌体的制剂。
3.权利要求1的噬菌体，和权利要求2的噬菌体制剂，对痤疮丙酸杆菌的生长具有强烈抑制作用和杀菌作用。
4.权利要求2的噬菌体制剂，包括但不限于：可以是裂解液粗提物和纯化物，或经冷冻干燥的、或添加于适当溶媒的、或添加于美容面膜的、皮肤美容用液的、或直接借助仪器导入皮肤的、或添加于医学外用敷料的、或借助导管引入感染灶和关节腔的、或直接外敷的、或喷洒于医学器械表面的、或添加于食品原料的、或添加于动物饲料的。
5.权利要求1、2、4的噬菌体及其制剂，对于皮肤寄居的痤疮丙酸杆菌有拮抗生长的作用，可用于寻常痤疮的干预或治疗。
6.权利要求1、2、4的噬菌体及其制剂，对矫形外科的继发性痤疮丙酸杆菌感染具有潜在的应用价值，尤其是针对多重耐药性的痤疮丙酸杆菌株引起的感染。
7.权利要求1、2、4的噬菌体及其制剂，可对皮肤常驻菌群产生调控作用，进而影响皮肤微生态，让皮肤痤疮丙酸杆菌噬菌体不足的个体，有恢复正常的可能，降低皮肤的产酸性，或降低皮肤细菌膜的生成可能，降低局部厌氧环境。
8.权利要求1、2、4的噬菌体及其制剂，可与轻型链球菌及其代谢产物形成协同作用，调整皮肤痤疮丙酸杆菌的生长状态，而实现干预痤疮丙酸杆菌生长的可能，并对寻常痤疮中可能存在的金黄色葡萄球菌有拮抗作用。该协调干预作用包括应用于寻常痤疮和外科的继发性痤疮丙酸杆菌感染。
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