CN107794232B - 拮抗痤疮丙酸杆菌和革兰氏阳性菌生长的链球菌及其代谢产物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株缓症链球菌(Streptococcus mitis,CGMCC No.12916),可用于调节哺乳动物皮肤的寄居菌群,并可预防、治疗、缓解、减轻、和治愈痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)的感染症状,包括矫形外科的痤疮丙酸杆菌和院内金黄色葡萄球菌感染。该链球菌的多肽成分与痤疮丙酸杆菌噬菌体可协同作用于痤疮丙酸杆菌。相关的制剂可用于皮肤美容、皮肤感染、外科感染等领域。
Description
技术领域
本发明涉及利用缓症链球菌(Streptococcus mitis)及其代谢产物,拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革兰氏阳性细菌的生长,用于皮肤和整形外科的痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌感染的干预。
背景技术
痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)是皮肤常驻菌之一,革兰氏阳性,厌氧生长,具有生成细菌生态膜(biofilm)的特性;参与了寻常痤疮(acne vulgaris)的形成,也是整形外科感染造成手术失败的重要致病菌之一;相关的感染常与多重细菌耐药性相关联。金黄色葡萄球菌亦是皮肤常驻菌,也参与痤疮的形成,并造成院内感染,同样具有多重耐药性。
通常寻常痤疮的患者习惯于长期用抗生素治疗,虽然治疗有效,但抗生素会有副作用。抗生素的使用会导致痤疮丙酸杆菌耐药性发育,结果治疗无效和将耐药性转移到皮肤的其他细菌和密切接触的胃肠道菌群。
缓症链球菌也是体表和粘膜的常驻菌之一,革兰氏阳性,兼性生长;与某些其他链球菌相仿,其代谢产物具有调节皮肤常驻菌生长的作用,如细菌素(bacteriocin)类产物,更具有拮抗痤疮丙酸杆菌生长的作用。
本发明分离出的缓症链球菌株及其无细胞产物具有强烈拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力,具有对皮肤和整形外科感染痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的干预潜力。是抗生素之外的抗菌物。
发明内容
本发明中分离到的缓症链球菌,能有效拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。特别是本发明确定该细菌的无细胞产物能强烈拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。
本发明涉及分离到的缓症链球菌,用作活性物能显著地拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的感染,尤其是能破坏并杀灭具有细菌生态膜生长方式的痤疮丙酸杆菌。
本发明涉及缓症链球菌的无细胞代谢产物,用作活性物能显著地拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的感染。
本发明涉及提取并纯化缓症链球菌代谢产物。
进而,本发明提供了抗生素之外的干预细菌感染的方法,尤其是针对痤疮丙酸杆菌的细菌生态膜生长方式及其抗生素耐药性,以及针对金黄色葡萄球菌耐药株的干预方法;以一种组合给药方式,针对皮肤分离到的痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌,有效减少并杀灭痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌;尤其是缓症链球菌的无细胞代谢产物,以有效的剂量杀灭痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。
本发明也提供组合给药方式杀灭或抑制痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。使用该方法的媒介可以是食品、制造食品的物质、化妆品介质、医学设备、皮肤、外科灌输、或金属、塑料、瓷器、或玻璃表面。该媒介可以是惰性载体,也可以按常规的杀菌方式使用,如外敷或涂抹等。
本发明也提供一种新的、由一种或多种提取的缓症链球菌代谢产物的杀菌剂,用于消毒或杀灭痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌,以保护任何需要的,包括但不限于食品、制造食品的物质、食品制备区域、化妆品介质、外科灌输、金属、塑料、搪瓷器、瓷器、或玻璃表面、医学设备和仪器,皮肤。
本发明所涉及的缓症链球菌CGMCC No.12916,能有效杀灭皮肤上分离的痤疮丙酸杆菌、以及ATCC29399、ATCC6919、ATCC11827等痤疮丙酸杆菌菌株,以及金黄色葡萄球菌。但对大肠埃希氏菌则无此拮抗效应。
在本说明书和具体实施方法中,使用了常规微生物培养法(含厌氧培养)和操作,以及同步拮抗试验和延迟拮抗试验检测无细胞代谢产物拮抗活性,以及使用透析试验、或硫酸铵沉淀试验、或真空干燥法提取无细胞代谢产物。
本发明中涉及的缓症链球菌代谢产物提取物可与痤疮丙酸杆菌的特异性噬菌体、或适当抗菌剂联合使用,来干预痤疮丙酸杆菌的感染,这些抗菌剂包括(但不限于)抗生素和化学疗法的制剂。
本发明中提取的无细胞代谢物可用除菌滤膜除菌,该活性物可密封包装于安瓿或其它包装形式用于给药。并按检测活性物的连续稀释液与痤疮丙酸杆菌接种物共同培养(同步试验),确定制剂的近似效价,即按完全抑制痤疮丙酸杆菌生长的最低浓度确定为有效抑菌浓度(生物单位/毫升,BE/ml)。该活性物制剂可用于注射(含皮下注射),亦可对其进行浓缩(如冻干),随后再悬浮于诸如生理盐水的缓冲液中。该活性物制剂还应用诸如豚鼠的实验动物测定毒性,以确保不具有致敏作用。
据此,该活性物制剂可以确立基组成或原则,以一种活体给药的生物学相容形式给药,是指活性物的给药形式,其疗效效应超过其毒性效应。
该活性物制剂可以用便利的方式给药,诸如注射(皮下注射、静脉注射,等),口服、肺部气雾剂、鼻腔喷雾、肌肉注射、腹腔注射、阴道灌注、直肠灌注、局部注射、脊柱穿刺、和直接敷用。依据给药途径,该活性物可被以保护层(如肠衣剂或丸剂),避免酶、酸碱和其它天然条件下的灭活作用。
在此所描述的给药形式可配制成药物学允许的可用于人体或动物的制剂形式,诸如有效量的活性物与药物学许可的载体混合组成。
技术成熟的赋形剂可用作传输载体。
该活性物可冻干,于注射前再溶解。该活性物可溶解于适当的媒介,如水溶液、或缓冲液、或悬浮于任何适当的液体、胶体、或多聚混合物,制成抗菌剂。抗菌剂可组合成化妆品、药膏、或敷料,诸如外科感染的敷料、或外科插管、或制成广谱消毒剂用于皮肤和口腔清洁液、消毒擦洗剂、洗剂。该活性物也可用于清洁医疗器械、外科手术前擦洗,等等。
本发明涉及的菌株及其活性物和方法,适合于拮抗痤疮丙酸杆菌,包含多重抗生素耐药性的痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。在针对抗生素耐药性的痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌感染,这种形式和方法尤其有用。具体在本发明中,缓症链球菌活性物的组合物和方法用于干预痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的感染。
附图说明
具体实施方式
以下用非限制性实例说明本发明:
用于干预痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌感染的缓症链球菌活性物,能杀灭皮肤上分离的痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。
方法和材料:
菌株分离:
被分离鉴定的缓症链球菌CGMCC No.12916,来自厌氧操作痤疮丙酸杆菌培养物的偶然污染,表现为厌氧生长的痤疮丙酸杆菌菌苔上有环状缺失,缺失区中央有微小白色菌落,挑取该菌落,连续分离数次,以单菌落接种平板,按常规微生物操作冻干保藏,并对该菌株做生化学和16S rDNA测序。经检索,该菌株符合缓症链球菌(Streptococcus mitis)特征,并由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,保藏编号为CGMCC No.12916。
菌株鉴定:
缓症链球菌于轻型唾液链球菌琼脂(mitis-salivarius agar)培养基上,于35.5℃培养24小时。革兰氏阳性,兼性生长,α-溶血,dGAL-,LeuA+,ELLM-,PheA+,ProA+,PyrA-,dCEL-,TyrA+,APPA+,dGLU-,dMNE-,dMAL-,SAC-,ARB-,NAG-,BGLUi-,URE-,BGURi-,BGALi(-),AARA-,AGALi+,BMHN-,ARG-,PVATE-,MTE-,ESC-,BdFUC-,BNAG-,AMANi-,AIFUC-,PHOS+,IARA-,dRIB2-,OPS-,AARAF-,dXYL-。检索提示为缓症链球菌(Streptococcus mitis)。
16S rDNA测序比对,27F和1492R的结果如下:
27F序列:
GGGAGGCGGGTACTATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTGGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAATAGTAGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTACCAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTATCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTAGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTTAACCATAGTACGCTTTGGAAACTGTTTAACTTGAGTGCAAGAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCTTGTAACTGACGCTGAGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTGCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGACCCTTTCCGGGGTTTAGTGCCGCAGCGAACGCATTAAGCACTCGCCTGGGAGTACGGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGGTGGTTTAATTGAACACCCGAAGAAGCCTTACAAGGACTTGACATGCGCTGTGGACCCCCTTAAGAGAAATTA
1492R序列:
CAAAATCTATCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGACTGGCTTTAAGAGATTAGCTTGCCGTCACCGGCTTGCGACTCGTTGTACCAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGAAGGAAAACTCTATCTCTAGAGCGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTAAACCCCGGAAAGGGTCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAAGCCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTCTTGCACTCAAGTTAAACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTAAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCTAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGGTAGCCGTCCCTTTCCTGTAAAGATAACGG
与NCBI数据库比对,提示与Streptococcusmitis(ATCC49456)有99%的同一性。
缓症链球菌CGMCC No.12916对痤疮丙酸杆菌的拮抗试验(同步/延迟试验):
痤疮丙酸杆菌生长,培养基1490(ATCC medium),生长条件,37℃,10%CO2,10%H2,80%N2,培养72小时,观察同步缓症链球菌及其代谢产物的拮抗作用。结果如下:
PA1-6为本实验室分离的痤疮丙酸杆菌株,29399、6919、11827为ATCC的痤疮丙酸杆菌参考株,+为拮抗阳性,-为拮抗阴性,金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌为本实验室的菌株。同步试验是指同时接种2个相互作用的菌株,延迟试验是指链球菌株(产生株)先行培养(24-36小时)后,除去表面菌苔,并于氯仿蒸汽下30分钟后,再通气30分钟去除残留的氯仿,来杀灭残留的链球菌,随后接种指示菌株,厌氧下培养,观察结果。
缓症链球菌代谢产物制备:
缓症链球菌在mitis-salivarius agar培养基上,于37℃,厌氧下培养34-36小时;培养结束后用氯仿蒸汽灭菌30分钟,移去氯仿后通气30分钟;向平板的菌苔上加入7M尿素液,于37℃浸泡4-6小时,洗脱下菌苔液,收集上清部分;向该上清部分加入硫酸铵,至饱和度达到50%,收集沉淀部分,重新溶于原有容积一半量的三蒸水中,备用于活性标定。
缓症链球菌代谢物活性标定:
将上述制备物按连续倍倍稀释,对指示株2ATCC29399做活性标定,将能够抑制痤疮丙酸杆菌生长的最低浓度,标定为该制备物的有效抑菌浓度,例如8倍稀释为最低抑菌浓度,则该活性物具有8BE/ml。
缓症链球菌代谢物制剂:
纯化的代谢物可冷冻干燥备用。临用前可用适量生理盐水或适当缓冲液溶解,或添加于面膜成分内,或直接用于外敷,或借助导管或仪器导入到患处,或喷涂于器具表面。
缓症链球菌代谢物与痤疮丙酸杆菌噬菌体φPA6的协同应用:
应用于寻常痤疮时,先行φPA6干预,待24-36小时后,再使用缓症链球菌代谢物。寻常痤疮既有痤疮丙酸杆菌的存在,亦会有金黄色葡萄球菌感染,二者先后使用可较好地干预痤疮的发展。前者作用于痤疮丙酸杆菌,后者拮抗痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。
生物材料的保藏:
本发明涉及的缓症链球菌株,已于2016年08月30日按照布达佩斯条约在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏。保藏号CGMCC No.12916。
Claims (2)
1.一株分离的链球菌,其保藏编号为:CGMCC No.12916。
2.权利要求1所述的链球菌,其特征在于,所述链球菌具有拮抗致病性痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力。
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