CN113308405A - 一种新型的双益生菌协同复合菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的双益生菌协同复合菌剂和应用。所述双益生菌协同复合菌剂是由发酵乳杆菌菌液和乳酸片球菌菌液以1:1‑3的体积比制备而成的，其中所述发酵乳杆菌菌液的活菌含量不低于5×10¹⁰ CFU/mL，乳酸片球菌菌液的活菌含量不低于4×10¹⁰ CFU/mL。本发明经过实验验证，发酵乳杆菌、乳酸片球菌及其共同制备的双益生菌协同复合菌剂均具有显著的抑制体内外白色念球菌的作用，进而可以将其制备成多种形式的药物来达到防治念珠菌性阴道炎的作用。

Description

一种新型的双益生菌协同复合菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新型的双益生菌协同复合菌剂及其应用。

背景技术

念珠菌性阴道炎是由念珠菌感染引起的阴道炎症性疾病。念珠菌通常是一种腐败物寄生菌，可生活在正常人体的皮肤、黏膜、消化道或其他脏器中，在阴道中存在而经常无症状。当阴道糖原增加、酸度升高时，或在机体抵抗力降低的情况下，便可成为致病的原因，长期应用广谱抗生素和肾上腺皮质激素，可使霉菌感染大为增加。由于这种疾病会给患者带来瘙痒，甚至导致坐卧不宁、痛苦异常等症状，对患者的身心健康造成严重的影响。而目前的治疗药物多采用氟康唑、咪康唑等，但这些药物会使细菌产生抗药性，且症状易反复，因此需要研究更持续稳定且效果更好的药物。

而益生菌是可以通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物，其能够产生有利于机体健康的作用。目前发现，益生菌在增强免疫功能、抗肿瘤等方面均具有重要的作用，且益生菌在许多胃肠道疾病的治疗中也能发挥有益的作用。因此，通过益生菌来达到防治念珠菌性阴道炎，对患者的身心健康非常有利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的双益生菌协同复合菌剂及其应用。所述双益生菌协同复合菌剂由发酵乳杆菌菌液和乳酸片球菌菌液混合制成，其能够显著地抑制白色念珠菌。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种新型的双益生菌协同复合菌剂，所述双益生菌协同复合菌剂包括发酵乳杆菌菌液和乳酸片球菌菌液。

进一步的，所述发酵乳杆菌菌液和所述乳酸片球菌菌液的体积比为1:1-3。

优选的，所述发酵乳杆菌菌液和所述乳酸片球菌菌液的体积比为1:1。

进一步的，所述发酵乳杆菌菌液的活菌含量不低于5×10¹⁰ CFU/mL。

进一步的，所述乳酸片球菌菌液的活菌含量不低于4×10¹⁰ CFU/mL。

进一步的，所述发酵乳杆菌菌液或乳酸片球菌菌液的制备方法为：将所述发酵乳杆菌或乳酸片球菌于改良MRS固体培养基上活化后，挑取单菌落接种于改良MRS液体培养基中，37℃培养14-18 h，菌液再以2-3%的体积比接种至改良MRS液体培养基中，培养至对数期，菌液于低温离心后，得到的菌泥与10-14%的脱脂乳溶液重悬，即可得到所述发酵乳杆菌菌液或乳酸片球菌菌液。

进一步的，所述双益生菌协同复合菌剂能够显著地抑制白色念珠菌。

本发明还提供了所述的双益生菌协同复合菌剂在用于制备白色念珠菌抑制剂中的应用。

进一步的，在应用时，所述双益生菌协同复合菌剂的使用量为抑制剂总体积的10-15%。

本发明还提供了所述的双益生菌协同复合菌剂在用于制备防治念珠菌性阴道炎的药物中的应用。

进一步的，所述药物包括洗剂、栓剂、口服药、外用乳膏。

进一步的，由动物使用剂量经过换算，所述双益生菌协同复合菌剂的使用剂量为12 mL/kg/人/天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明利用发酵乳杆菌与乳酸片球菌共同复配制得了一种双益生菌协同复合菌剂，两种菌相互协同，能够明显增加单菌对白色念球菌的抑制作用，产生了更加优异的技术效果。并且经过本发明的动物实验验证，发酵乳杆菌与乳酸片球菌及其协同复合菌剂均能够对念珠菌性阴道炎小鼠模型阴道内白色念珠菌起到抑制灭除作用，从而达到防治念珠菌性阴道炎的作用，且作用效果优于现有的药物咪康唑和克霉唑。另外，双益生菌协同复合菌剂不会产生副作用以及耐药性，安全可靠，具有很好的应用价值。

附图说明

图1为发酵乳杆菌NSL1601的平板培养照片。

图2为发酵乳杆菌NSL1601的菌体镜检照片。

图3为乳酸片球菌NSS0301的平板培养照片。

图4为乳酸片球菌NSS0301的菌体镜检照片。

图5为抑制白色念球菌的试验结果图，其中左上为乳酸片球菌NSS0301，左中为发酵乳杆菌NSL1601，左下为协同复合菌剂，右上为咪康唑，右中为克霉唑。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1：双益生菌协同复合菌剂的制备和抑菌作用

1、菌株的获取

本发明通过从生物公司购买得到两株菌株，分别为发酵乳杆菌Limosilactobacillus fermentum和乳酸片球菌Pediococcus acidilactici，经活化培养后，分别编号：NSL1601和NSS0301，即发酵乳杆菌NSL1601和乳酸片球菌NSS0301。

经形态学检测，参见图1和图2，发酵乳杆菌NSL160呈革兰氏阳性，菌落为乳白色，圆形，不透明，表面微凸，具有奶皮状褶皱，边缘不规则；菌体为长杆状，两端钝圆，呈不规则单独或少量聚集状排列，表面光滑，无芽孢。参见图3和图4，乳酸片球菌NSS0301呈革兰氏阳性，菌落为白色至乳白色，圆形，不透明，表面微凸，具有奶皮状褶皱，周围弥散；菌体为圆形，聚集式非成链状排列，表面和边缘光滑，无芽孢。

2、菌粉的制备

分别取冻存的乳酸片球菌NSS0301和发酵乳杆菌NSL1601于改良MRS固体平板上划线，37℃培养48h，然后挑取单菌落接种于改良MRS液体培养基中，37℃培养16 h；菌液再以3%的接种量接种至2 L的改良MRS液体培养基中，37℃培养16 h，培养至对数期；菌悬液在4℃下，12000r/min，离心10 min，弃去上清液，收集菌体；菌体用超纯水洗涤3次，离心后得到菌泥；菌泥用12%的脱脂乳溶液重悬，经真空冷冻干燥冻干后，得到菌粉，并于-20℃保存。

3、双益生菌协同复合菌剂的制备

分别将乳酸片球菌NSS0301菌粉和发酵乳杆菌NSL1601菌粉使用0.9%生理盐水稀释，并利用倾注法对活菌数进行计数，此时乳酸片球菌NSS0301菌液的活菌数为5×10¹⁰CFU/mL，发酵乳杆菌NSL1601菌液的活菌数为4×10¹⁰ CFU/mL；将两种菌液以1:1的比例混合均匀后，得到双益生菌协同复合菌剂（简称协同复合菌剂）。

4、抑菌活性的检测

（1）测定采用牛津杯法。取100μL活菌数为1×10⁷ CFU/mL的白色念珠菌于平板内，倒入适量加热熔化的改良MRS固体培养基，摇晃均匀，待其冷却凝固后，在平板内适当的间隔依次放入牛津杯，然后分别取乳酸片球菌NSS0301菌液、发酵乳杆菌NSL1601菌液、协同复合菌剂100μL添加至牛津杯孔内；质量浓度为20 mg/mL的抗真菌药物咪康唑和克霉唑做对照。37℃静置培养 24 h后测定抑菌圈直径。

结果见表1和图5，乳酸片球菌NSS0301和发酵乳杆菌NSL1601单菌对白色念珠菌具有很好的抑制效果，且协同复合菌剂增强了单菌的抑制效果，抑菌圈直径大于25 mm，并且单菌和协同复合菌剂的抑菌效果均优于对照药物咪康唑和克霉唑。

表1：抑菌活性结果

	NSS0301	NSL1601	协同复合菌剂	咪康唑	克霉唑
						直径	24.98	23.69	25.12	14.33	22.45

（2）对白色念珠菌活菌数的抑制影响

白色念珠菌活菌数的测定分为4组。取活菌数为1× 10⁷ CFU/mL的白色念珠菌100μL接种于50 mL改良MRS液体培养基中，震荡均匀。试验组添加乳酸片球菌NSS0301菌液、发酵乳杆菌NSL1601菌液、协同复合菌剂5 mL，对照组不添加菌液加入等量的改良MRS液体培养基。震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到培养液。平板计数，获得各组培养液中白色念珠菌的菌落。

结果见表6显示，加入协同复合菌剂中的白色念珠菌数量最少，5.94×10⁵；其次是乳酸片球菌NSS0301，空白对照组的白色念珠菌在培养条件下增加至7.16×10⁷。说明乳酸片球菌NSS0301、发酵乳杆菌NSL1601和协同复合菌剂均能够有效抑制白色念珠菌的存活。

表6：白色念珠菌活菌数抑制结果

组别	活菌数
		NSS0301	8.51×10<sup>5</sup>
NSL1601	1.07×10<sup>6</sup>
		协同复合菌剂	5.94×10<sup>5</sup>
对照组	7.16×10<sup>7</sup>

（3）菌株上清液对白色念珠菌活菌数的影响

实验分为4组，分别为乳酸片球菌NSS0301组、发酵乳杆菌NSL1601组、协同复合菌剂组以及空白对照组。其中，各实验组各取100μL无细胞上清液(CFS)和100μL白色念珠菌菌液接种于96孔板中，将96孔板在37℃培养箱培养24h，得到培养液；空白对照组取100μL 改良MRS液体培养基和100μL白色念珠菌菌液接种于96孔板中，将96孔板在37℃培养箱培养24h，得到培养液；使用酶标仪在OD_600nm下测量96孔板的每个孔的吸光度值并计算抑菌率。抑菌率的计算公式如下：抑菌率=实验组OD_600nm/空白对照组的OD_600nm/×100%。

结果如表7显示，与加入乳酸片球菌NSS0301、发酵乳杆菌NSL1601相比加入协同复合菌剂的抑菌率最高。说明协同复合菌剂的抑菌效果优于其中组成的单菌效果。

表7：白色念珠菌活菌数抑制结果

组别	抑菌率（%）
		NSS0301	59.12±5.33
NSL1601	43.06±4.98
		协同复合菌剂	62.58±5.99

实施例3：菌株和协同复合菌剂对念珠菌性阴道炎小鼠模型阴道内白色念珠菌浓度的影响

取40只雌性、8周龄、体重20-25g的BALB/c小鼠，随机分成5组，每组8只，5组分别为空白对照组、模型组以及乳酸片球菌NSS0301组、发酵乳杆菌NSL1601组和协同复合菌剂组。

实验分为造模和治疗两部分，实验开始前3天，除空白对照组小鼠外，其余组小鼠均皮下注射100μL戊酸雌二醇，诱导小鼠发情，实验开始后，除空白对照组小鼠外，其余组小鼠仍需平均每周皮下注射1次100μL戊酸雌二醇。

造模第1天，除空白对照组小鼠外，其余组小鼠均阴道内接种20μL菌浓度为3.0×10⁷ CFU/mL的白色念珠菌菌液，第一次接种完毕后，每2天接种1次，共接种3次，直至造模结束。

治疗第1天，模型组小鼠阴道内注射20μL生理盐水，治疗组分别注射20μL的乳酸片球菌NSS0301菌液、发酵乳杆菌NSL1601菌液、协同复合菌剂，每天治疗1次，共治疗14天，空白对照组小鼠不作处理。

分别在治疗的第1天、4天、7天、14天用50 μL无菌PBS缓冲液灌洗各组小鼠阴道3次，收集灌洗液置于洁净无菌管中，将3次取得的灌洗液充分混匀，用0.9%的生理盐水进行梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于BIGGY琼脂培养基上，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度（CFU/mL）。

结果见表8，与模型组相比，NSS0301组、NSL1601组和协同复合菌剂组的白色念珠菌浓度均显著下降，且随着使用时间的延长，白色念珠菌浓度仍在不断的下降，说明乳酸片球菌NSS0301、发酵乳杆菌NSL1601和协同复合菌剂均对念珠菌性阴道炎小鼠模型阴道内白色念珠菌具有有效的抑制灭除作用。并且，协同复合菌剂的抑制效果明显优于两种单菌的。

表8：念珠菌性阴道炎小鼠模型阴道内白色念珠菌浓度的检测结果

	NSS0301	NSL1601	协同复合菌剂	空白对照	模型
						1d	5.55× 10<sup>5</sup>	6.84× 10<sup>5</sup>	2.41× 10<sup>5</sup>	0	5.62× 10<sup>6</sup>
4d	1.68× 10<sup>5</sup>	2.41× 10<sup>5</sup>	8.56× 10<sup>4</sup>	0	7.67× 10<sup>6</sup>
						7d	4.97× 10<sup>4</sup>	5.62× 10<sup>6</sup>	3.66× 10<sup>4</sup>	0	5.39× 10<sup>6</sup>
14d	3.25× 10<sup>3 </sup>	4.37× 10<sup>3 </sup>	1.39× 10<sup>3 </sup>	0	4.64× 10<sup>5</sup>

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种新型的双益生菌协同复合菌剂，其特征在于，所述双益生菌协同复合菌剂包括发酵乳杆菌菌液和乳酸片球菌菌液。

2.根据权利要求1所述的双益生菌协同复合菌剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌菌液和所述乳酸片球菌菌液的体积比为1:1-3。

3.根据权利要求2所述的双益生菌协同复合菌剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌菌液的活菌含量不低于5×10¹⁰ CFU/mL。

4.根据权利要求2所述的双益生菌协同复合菌剂，其特征在于，所述乳酸片球菌菌液的活菌含量不低于4×10¹⁰ CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的双益生菌协同复合菌剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌菌液或乳酸片球菌菌液的制备方法为：将所述发酵乳杆菌或乳酸片球菌于固体培养基上活化后，挑取单菌落接种于液体培养基中，37℃培养14-18 h，菌液再以2-3%的体积比接种至液体培养基中，培养至对数期，菌液于低温离心后，得到的菌泥与10-14%的脱脂乳溶液重悬，即可得到所述发酵乳杆菌菌液或乳酸片球菌菌液。

6.权利要求1所述的双益生菌协同复合菌剂在用于制备白色念珠菌抑制剂中的应用。

7.根据要求6所述的应用，其特征在于，在应用时，所述双益生菌协同复合菌剂的使用量为抑制剂总体积的10-15%。

8.权利要求1所述的双益生菌协同复合菌剂在用于制备防治念珠菌性阴道炎的药物中的应用。

9.根据要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括洗剂、栓剂、口服药、外用乳膏。

10.根据要求8所述的应用，其特征在于，所述双益生菌协同复合菌剂的使用剂量为12mL/kg/人/天。

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