KR101885403B1 - 신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락트산 박테리아 목의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 관한 것이다. 상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 적어도 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 슈도모나스 아에루기노사와 상호-응집될 수 있다.

Description

신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물 {NOVEL LACTIC ACID BACTERIA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM}
본 발명은 특히 프로바이오틱스(probiotics)로서 사용하고/하거나 신체 위생 및 요법에서 사용하기 위한 신규 락트산 박테리아, 그의 유사체 또는 단편은 물론 그를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 야기될 수 있는 모든 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 신규 락트산 박테리아 및/또는 그를 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본원에서 기술되는 진전으로써, 피부 감염의 예방 및 국소적 치료에, 그리고 만성 상처의 치료를 촉진하는 데에 특별한 작용을 가지는 항미생물 첨가제로서 사용될 수 있는 락트산 박테리아인, GRAS 미생물 형태의 혁신적인 생물학적 생성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 조성물 또는 제약 생성물 또는 화장품 또는 의약품은 물론 피부 또는 표면 소독제에서의 본 발명에 따른 미생물 또는 그의 유사체 또는 단편의 용도에 관한 것이다.
피부의 주 기능은 그 아래의 조직을 외부 환경으로부터 보호하는 것이다. 예컨대 그것은 특히 병원성 미생물이 신체로 침투하는 것을 방지한다. 물론, 피부 및 점막에는 매우 다양한 미생물이 군집을 이루어 종종 표면상에서 비교적 안정한 조성의 공생체로 살아가면서 피부의 보호 기능을 지원한다. 이상적인 경우라면, 긍정적인 건강 효과를 가지는 박테리아는 동시에 발생하는 유해 미생물에 비해 우세할 것이다. 이와 같은 시스템이 균형에서 벗어날 경우, 사실상 사람의 건강 및 웰-빙에 대한 부정적인 효과가 예단된다.
병원성 미생물은 결합 단백질을 통하여 표피 구조에 특이적으로 부착하는 능력을 가지고 있다. 예를 들면, 미생물이 피브로넥틴 구조에 부착할 수 있게 해주는 접착성의 존재가 병원성 균주 스타필로코쿠스 아우레우스에서 발견되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Bingham, R.J. et al. 2008], [O'Neill, E. et al., 2008]).
병원성 미생물은 보통 숙주에 대한 더 높은 부착 가능성을 가지고 있어서, 발병력 증가의 원인이 된다. 피부 상층에서의 극히 소형인 병변 또는 기타 손상의 존재는 병원성 미생물 침입의 위험성을 증가시킨다.
또한, 특히 상처 치유중인 상처 표면의 박테리아 감염은 합병증으로 이어질 수 있다. 무엇보다도, 급성의 상처가 치유되지 않고 만성의 상처로 이어지게 될 위험성이 존재한다. 이러한 만성 상처의 미생물총(microflora)은 매우 복잡해서, 다양한 미생물이 상처 치유 과정에 대하여 유해한 효과를 가질 수 있는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Davies et al. 2004], [Kirketerp-Moller et al. 2008]).
상처에서는, 호기성 박테리아, 예를 들면 슈도모나스 아에루기노사 및 스타필로코쿠스 아우레우스가 주 병원체인 것으로 확인되어 있다. 상처 치유의 염증 단계는 보통 잠재적으로 병원성인 미생물을 퇴치하고 세포 재생을 위한 작용을 한다. 그러나, 이미 면역억제되어 있어서 감소된 염증 반응을 가지는 환자에서는, 종종 저조한 치유 또는 불응성인 상처가 발생한다. 이와 같이 약화된 면역 반응은 일차적인 상처 박테리아에 대하여 더 이상 효과적인 방어를 제공할 수 없어서, 박테리아가 상처로 침투하여 콜로니를 형성하게 되고, 그것은 바이오필름(biofilm)으로 조직화된다 (문헌 [James et al. 2008]).
바이오필름은 숙주의 방어 시스템은 물론 플랑크톤성 세포 또는 미세콜로니에 대하여 내성이다 (문헌 [Fux et al. 2005], [Sheldon 2005]). 손상된 면역계로 인하여, 바이오필름은 상처 치유 과정을 염증 단계로 유지함으로써, 예를 들면 엘라스타제, 플라스민 및 트롬빈과 같은 기질 금속단백질의 농도가 상승하고, 그것은 다시 치유에 필수적인 성장 인자 및 그의 수용체를 분해하는 결과를 가져오게 된다 (문헌 [Mast and Schultz 1996]).
또한, 유리 산소 라디칼 및 염증성 시토카인의 농도 상승은 숙주 세포의 심각한 손상으로 이어진다 (문헌 [James et al. 2003, Moseley et al. 2004]).
바이오필름을 제거함으로써 만성 및 불응성 상처의 원인을 퇴치할 수 있는 치료제가 선행 기술에서 기술된 바 있다.
현행 기술
상처 감염 역시 현행 기술에 따라 복잡한 항생제 요법에 의해 치료되고 있는 바, 그것이 항상 치료로 이어지는 것은 아닌데, 바이오필름을 형성하는 그의 능력을 포함한 해당 적응성 및 내성 기작으로 인하여 상기 언급된 상처 생물체가 치료에 대하여 반응하지 않기 때문이다. pH-최적화된 샤워 겔, 세척 로션, 샤워 오일 및 바디 로션과 같은 피부 관리 제품이 특히 면역억제된 환자, 예컨대 아토피 피부염, 습진, 지루성 피부염에 걸린 환자에서 예방적으로 피부 손상을 방지하는 데에 가용하다.
주 병원체인 에스. 아우레우스는 영양소 없이도 7개월까지 생존할 수 있는 질환 병원체이다. 그것은 세탁실 및 문 손잡이, 조명 스위치, 바닥재 및 침상 부근에서 생존한다 (문헌 [Julia Bidder 2010]). 그것은 건강한 사람에서는 증상을 야기하지 않지만, 상처 감염의 경우에서와 같이 그의 면역계가 약화될 경우, 미생물이 증식하여 잘 치유되지 않는 염증, 피부 궤양, 종기, 폐 감염, 요로 감염 및 치명적인 혈액 독성, 안구 감염, 중이 감염을 야기하게 된다. 감염은 실질적으로는 어떠한 기관으로도 전이될 수 있다. 소정의 인자, 예를 들면 약화된 면역계, 당뇨병, 기존의 피부 손상 (박리 또는 신경피부염), 피부 상해 (예컨대 사고, 수술, 카테터로 인한 것), 욕창성 궤양에 걸린 노인 및 누워만 있는 환자, 자체 피부가 미생물 감염의 발생을 위한 수분 저장고를 제공하는 비만 환자는 스타필로코쿠스 아우레우스에 의한 감염을 촉진할 수 있다.
항생제인 메티실린은 에스. 아우레우스의 메티실린-내성 균주 (MRSA)에 대하여 더 이상 효과적이지 않다. 이것이 의미하는 것은 실제로는 이들 균주가 3종 이상의 항생제에 대하여 다중내성이라는 것이다. 지금은 소위 보류 항생제(reserve antibiotics)만이 이들 균주에 대항하여 도움이 된다. 독일의 클리닉은 MRSA 환자의 증가되는 치료 비용을 일 당 1600 내지 4300 유로로 추정하고 있다 (문헌 [Julia Bidder 2010]).
슈도모나스 아에루기노사 역시 병원내 감염에서 자주 만나게 되며 그의 대사 및 그의 세포 막 구조로 인하여 다중 항생제 내성을 가지는 또 다른 주 병원체이다. 피. 아에루기노사는 모든 병원 감염의 거의 10%를 차지하며, 독일에서 가장 흔한 병원감염 미생물 중 하나이다. 이 박테리아에 의해 야기되는 질환의 범위는 광범위하다. 이의 일차적인 촉발 인자 중 하나는 외독소 A (ADP 리보실 트랜스퍼라제), 및 세포독소인 외효소 S 및 외효소 U와 같은 병원성 인자에서와 마찬가지로, 박테리아를 생산하는 용혈 능력이다. 가장 일반적인 소견은 낭성 섬유증을 동반한 폐렴으로써, 면역억제된 환자 및 AIDS 환자에서 특히 심각할 수 있다. 요로 감염, 소장결장염, 수막염, 외이도염 ("수영인 귀(swimmer's ear)"), 화상의 감염, 또는 콘택트 렌즈 사용자에서의 각막염이 촉발될 수도 있다.
락트산 박테리아는 일반적으로 질환 병원체 의해 야기되는 위장관 질환에 대항하여 보호하는 프로바이오틱 박테리아로 사용되고 있는데, 그것이 종종 락트산 이외에도 항박테리아 물질을 생성하기 때문이다. 이러한 락트산 박테리아 (락토바실라에( Lactobacillales ), 락토바실루스 또는 락트산 박테리아)는 항상 혐기성이거나 거의 내기성이며 당을 락트산으로 분해하는 것 (락트산 발효)을 특징으로 하는 그람-양성 박테리아의 목을 형성한다. 락토바실라에 목에는 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 아에로코카세아에(Aerococcaceae), 카르노박테리아세아에(Carnobacteriaceae), 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae) 및 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과가 포함된다. 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 종은 이전에는 락토바실루스로 분류되었었으나 (락토바실루스 비피둠(Lactobacillus bifidum)), 오늘날 가용한 정보에 따라, 계통발생학적으로는 그것이 이 목과 밀접하게 관련되지 않고 있다. 그러나, 대사와 관련하여서는, 그것이 여전히 락트산 박테리아로 취급되고 있다. 락트산 박테리아는 또한 식품 산업에서 매우 중요한데, 유제품을 생산하는 데에 그것이 사용되기도 하지만, 페스트(pest)로서 (예컨대 맥주 양조장에서) 발생할 수도 있다. 락트산 박테리아는 비병원성(apathogenic)으로 분류된다.
피부에 대한 식기세척의 부정적인 효과가 감소될 수 있도록 하는, 식기세척제용 프로바이오틱 박테리아의 사용 역시 선행 기술에 알려져 있다 (예컨대 WO 2010/130563호). 그것 역시 피부 관리 효과를 가지고 있다.
화장용 피부 처리제에서의 미생물의 용도에 대해서는 이미 알려져 있다. 예컨대, US 6,790,434호를 예로 들면, 화장용 피부 처리제에서 UV-유도 피부 손상에 대항하기 위한 세포외 기질로부터의 식물 추출물과의 조합으로 상기 미생물의 용도가 기술되어 있다. 그러나, 이 자료는 세제 및 세정제에서의 상기 미생물의 용도는 개시하지 않고 있다.
더하여, 위생 세정제에서의 특정 바실루스 종의 용도가 알려져 있다. 예컨대 WO　97/25865호가 위생 세정제에서의 바실루스 종의 용도에 대해 기술하고 있는데, 그것이 병원체가 복제되는 것을 방지하며 유기 오염물을 분해할 수 있기 때문이다. 그러나, 여기에는 피부에 대하여 유익한 효과를 가지는 미생물의 용도에 대해서는 기술되어 있지 않다.
한편, 프로바이오틱 박테리아의 경구 투여 형태가 WO　2005/117921호에 개시되어 있는데, 여기서 상기 투여 형태는 1종 이상의 프로바이오틱 미생물 속을 함유하며, 상기 투여 형태 및/또는 박테리아에는 셀룰로스 에테르를 함유하는 코팅이 제공되어 있다.
본 발명의 목적은 선행 기술의 단점 또는 결점을 가지지 않는 상처 감염 및 피부 질환 및/또는 피부 자극의 급성 및 예방적 치료를 위한 작용제 또는 조성물을 제공하는 것이다.
이와 같은 목적은 독립 청구항에 의해 달성된다. 바람직한 실시양태는 종속 청구항으로부터 유래한다.
본 발명은 락트산 박테리아 목에 속하는 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 관한 것으로써, 여기서 상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 1종 이상의 병원성 미생물과 상호응집될 수 있으며, 상기 병원성 미생물은 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 슈도모나스 아에루기노사를 포함하는 군에서 선택된다. 특히 그와 상호응집되는 것에 의해 특히 감염성 박테리아 균주와 응집됨으로써 미생물의 국부 농도를 감소시켜 그의 성장을 억제하거나 심지어는 그를 사멸시키거나 또는 바이오필름의 형성을 방지하는 락트산 박테리아가 제공될 수 있다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 이는 선행 기술의 통상적인 치료 선택사항과 비교할 때, 소정의 중요한 장점으로 선행 기술과의 차별성을 구성하는데, 항생제 치료가 필요 없으며, 대신 병원성인 락트산 박테리아가 사용될 수 있기 때문이다. 또한, 특이적 락트산 박테리아의 생산은 항생제의 생산 및 이어지는 처리 비용과 비교할 때, 저렴한 대안을 구성한다. 해당 미생물에 대항하여 특이적으로 유도되며 미생물의 어떠한 추가적인 내성도 야기하지 않는 락트산 박테리아를 사용한 치료는 병원성 미생물에 대항한 싸움에 있어서 독특한 접근법이다.
본 발명에 있어서, 상호응집(coaggregation)은 유전적으로 상이한 박테리아 종의 서로에 대한 특정 부착 또는 결합을 말하는 반면, 상호부착(coadhesion)은 특히 유전적으로 동일한 박테리아 종의 부착 또는 결합을 지칭한다. 따라서, 이와 같은 점에서, 락트산 박테리아가 병원성 박테리아에 결합함으로써 특히 특이적인 결합을 통한 상호응집을 초래할 수 있다는 것은 한층 더 놀라운 것이었다.
본 발명은 구체적으로 1종 이상의 병원성 미생물의 상호응집 능력이 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리 후에도 존재하는 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 관한 것이다. 바람직한 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물의 경우, 1종 이상의 병원성 미생물의 상호응집 능력은 바람직하게는 대략 3 내지 대략 8의 pH에서도 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 특히 1종 이상의 병원성 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는 능력을 가진다.
구체적으로, 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 락토바실루스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실루스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실루스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 프룩티보란스(Lactobacillus fructivorans), 락토바실루스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii), 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 비리데센스(Lactobacillus viridescens), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 또는 이들의 유사체, 유도체, 단편 또는 돌연변이체를 포함하는 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
청구범위 청구항 중 어느 하나 이상에 따른 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물이 사용될 수 있으며, 여기서 상기 미생물은 독일 미생물 및 세포 배양 협회(German Collection for Microorganisms and Cell Cultures)에 하기의 해당 번호로 기탁되어 있는 해당 미생물을 포함하는 군에서 선택된다: DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908, DSMZ 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 25912, DSM 25913, DSM 25914 및 DSMZ 25915.
또 다른 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 조성물이라는 용어는 제제라는 용어와 동의어로 사용될 수 있다. 바람직한 조성물은 화장품용으로 허용되는 비히클 또는 부형제, 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제, 또는 피부과용으로 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는 군에서 선택되는 비히클 또는 부형제도 함유할 수 있다.
상기 조성물은 바람직하게는 분말, 스틱, 에어로졸 스프레이, 펌프 스프레이, 크림, 분산액, 에멀젼, 폼, 연고, 스프레이, 에어로졸, 분말, 스틱, 천, 로션, 현탁액, 용액, 겔의 형태 또는 기재상의 것 일 수 있다. 조성물은 피부 크림, 피부 세척 로션 또는 피부 연고의 형태인 것이 특히 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 고체, 액체, 점성 형태 또는 에어로졸로 존재할 수 있다. 또한, 바람직한 상기 피부 크림, 피부 세척 로션 또는 피부 연고는 특히 고체, 액체, 점성 형태 또는 에어로졸로 존재할 수 있다.
바람직한 조성물은 또한 바람직하게는 프로바이오틱스, 방부제 또는 기타 항박테리아 물질을 포함할 수 있으며, 그에 따라 바람직한 조성물에서, 그것은 제약 조성물, 수의학적 조성물, 화장품 조성물 또는 식품 조성물이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물은 바람직하게는 빌더(builder) 물질, 표면-활성 계면활성제, 효소, 유기 및/또는 무기 과산소(peroxygen) 화합물, 과산소 활성화제, 수-혼화성 유기 용매, 격리제(sequestering agent), 전해질, pH 조절제, 증점제, 방오제(soil release agent), 광학 증백제, 노화 억제제, 염료 전달 억제제, 폼 조절제, 및/또는 기타 착색제도 포함한다.
또한, 조성물은 하기의 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 것이 바람직할 수 있다:
a. 특히 바이오퀴논, 특히 유비퀴논 Q10, 크레아틴, 크레아티닌, 카르니틴, 비오틴, 이소플라본, 카르디올리핀, 리포산, 동결방지 단백질, 아르크티인(arctiin), 홉 및 홉-맥아 추출물과 조합된, 피부의 상태에 대하여 긍정적인 영향을 가지는 활성 성분, 특히 나이든 피부에 대하여 긍정적인 영향을 가지는 활성 성분,
b. 결합 조직을 재구성하기 위한 촉진제, 특히 이소플라보노이드,
c. 건성 피부상에서 피부 기능을 지원하기 위한 활성 성분, 특히 비타민 C, 비오틴, 카르니틴, 크레아틴, 프로피온산, 녹차 추출물, 유칼립투스 오일, 우레아 및 무기 염, 특히 NaCl, 해양 무기질 및 삼투질,
d. 자극성 피부 상태를 완화하고/하거나 그에 대하여 긍정적인 영향을 주기 위한 활성 성분, 특히 세리코시드, 감초의 다양한 추출물, 리코찰콘(licochalcone), 특히 리코찰콘 A, 실리마린, 실리포스 및/또는 덱스판테놀.
미생물은 불활성화, 생존 또는 비생존 형태로 조성물 중에 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 미생물은 바람직하게는 캡슐화, 분무-건조 및/또는 동결건조 형태로 조성물 중에 존재할 수 있다. 미생물이 특히 세포 용해물의 형태로 조성물 중에 존재하는 것 역시 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 미생물은 특히 0.001 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.005 중량% 내지 5 중량%, 특히 바람직하게는 0.01 중량% 내지 3 중량%의 중량 기준 양으로 조성물 중에 존재한다.
본 발명은 또한 적어도 하기의 단계를 포함하는, 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 슈도모나스 아에루기노사를 포함하는 군에서 선택되는 병원성 미생물과의 상호응집 특성을 가지는 락트산 박테리아의 확인 및/또는 선별 방법에 관한 것이다:
a. 병원성 미생물을 인큐베이션하여 바이오필름을 형성시키는 단계,
b. 조사될 락트산 박테리아를 첨가하고 인큐베이션하여 혼합물을 형성시킴으로써, 병원성 미생물과 조사될 락트산 박테리아 사이에 상호응집을 형성시키는 단계,
c. 상청액을 제거함으로써 비결합 락트산 박테리아를 분리하는 단계, 및
d. 상호응집된 락트산 박테리아의 관점에서 바이오필름을 측정하는 단계.
이와 같은 방법은 바람직하게는 하기의 추가적인 단계를 포함할 수도 있다:
- 바이오필름-형성 병원성 미생물의 인큐베이션 동안 조사될 락트산 박테리아를 첨가하는 것인, 병원성 미생물에 의한 바이오필름의 억제를 조사하는 단계.
또한, 바람직한 실시양태에서, 이와 같은 방법에는 하기의 방법 단계가 보충될 수 있다:
- 시험될 락트산 박테리아의 첨가가 없는 대조군과 비교하였을 때의 광학 밀도 측정치를 이용한, 비결합 세포의 제거에 의한 바이오필름 형성의 정량 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피부 질환, 특히 스타필로코쿠스-열상 피부 증후군, 접촉전염 농가진, 표재성 모낭염, 농가진화, 피부 농양, 종기, 큰종기, 농양, 연조직염, 건성 피부, 소양성 피부, 적색화 피부, 자극성 피부, 극지성 피부, 여드름, 당뇨족, 욕창성 궤양, 신경피부염, 급성 림프절염, 모소낭, 모소 누공, 모소동, 모소 누공, 모소낭, 피부 및 피하 조직의 국부 감염, 농피증, 화농성 피부염, 패혈성 피부염, 화농 피부염, 피부염 및 습진, 아토피성 습진, 지루성 습진, 기저귀 발진, 알레르기성 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈성 피부염, 독성 접촉성 피부염, 만성 단순 태선, 양진, 소양증 및 기타 형태의 피부염, 구진비늘 피부 질환, 건선, 유사건선, 외피 부속기의 질환, 반흔성 탈모증, 탈모성 모낭염은 물론, 기타 피부 및 피하 조직의 질환, 다리 궤양, 피부 손상, 찰과상 및 딱지, 사고 또는 수술 후 상처의 치료 또는 예방을 위한, 바람직하게는 제약 약물, 의약품 또는 화장품의 제조에서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 표면의 처리를 위한 세정제 또는 소독제를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 유리하게는 신체 위생, 의약품 및 예방 분야에 사용되는 제품을 제조하는 데에 사용될 수도 있다.
조성물은 바람직하게는 피부 표면에의 적용을 위한 로션, 진탕 혼합물, 분말, 히드로겔, 크림, 크레사(cresa), 연고, 지방 연고 또는 페이스트를 제조하는 데에 사용된다.
유리하게도, 조성물이 바람직하게는 피부 감염의 국소 치료 및 만성 상처의 치유 촉진에 특이적인 효과를 가지는 항미생물 첨가제를 제조하는 데에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 조성물은 바람직하게는 예방적으로 또는 치유적으로 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 바람직하게는 국소적으로 적용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미생물 또는 조성물, 및 신체 위생 장치 또는 장비, 린스 및/또는 페이스트를 포함하는 위생 처리용 키트에 관한 것이다.
바람직한 적용 형태에서, 본 발명은 피부, 모피 및 깃털에서의 미생물 존재량을 상당히 감소시키기 위하여, 동물, 특히 개, 말, 고양이 및 설치류 (집토끼, 산토끼, 햄스터, 기니 피그) 및 상업용 동물 예컨대 닭, 돼지 및 소를 위한 분무 또는 세척 용액용의 항미생물 첨가제로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 구체적으로 유아 [역시 sic], 소아, 어린이, 건강한 사람, 노인, 면역억제된 사람, 병리학적 피부 변화 (특히 스타필로코쿠스-열상 피부 증후군), 접촉전염 농가진, 표재성 모낭염, 농가진화, 피부 농양, 종기 (종기증), 큰종기 (농양), 연조직염, 건성 피부, 소양성 피부, 적색화 피부, 자극성 피부, 극지성 피부, 여드름, 당뇨족, 욕창성 궤양, 신경피부염, 급성 림프절염, 모소낭 (모소 누공, 모소동, 꼬리뼈 누공, 꼬리뼈낭 포함), 피부 및 피하 조직의 기타 국부 감염 (예컨대 농피증, 화농성 피부염, 패혈성 피부염, 화농 피부염); 또한 다양한 형태의 피부염 및 습진 (예컨대 아토피성 습진, 지루성 습진, 기저귀 발진, 알레르기성 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈성 피부염, 독성 접촉성 피부염, 만성 단순 태선, 양진, 소양증 및 기타 형태의 피부염)에 걸린 사람의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 미생물, 특히 락트산 박테리아, 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 물론, 이들을 함유하는 조성물에 관한 것으로써; 그것은 구진비늘 피부 질환 (건선, 유사건선), 외피 부속기의 질환 (예컨대 탈모성 모낭염을 포함한 반흔성 탈모증), 더하기 기타 피부 및 피하 조직의 질환 (예컨대 다리 궤양), 기존의 피부 손상 (예컨대 건성 피부), 피부 상해 (예컨대 딱지, 상처, 사고 또는 수술 후의 것 포함)에 걸린 사람, 또는 상업용 동물 및 가정용 애완동물을 치료하는 데에 사용될 수도 있다.
다시 말하자면, 바람직한 미생물은 락트산 박테리아 목에 속하는 미생물 또는 그의 유사체, 유도체, 돌연변이체 또는 단편이며, 상호응집 능력, 특히 바람직하게는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적 결합의 능력을 가지고 있다. 바람직한 락트산 박테리아가 공생 피부 박테리아 또는 미생물 예컨대 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 또는 특히 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 소정의 상호응집 또는 결합을 야기하지 않는다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 예를 들면, 스타필로코쿠스 에피데르미디스는 크게 주의를 끌지 않는 피부 균총의 공생 생물체이다. 피부 내 또는 피부 상에서 발견되는 다양한 미생물의 상호작용에 있어서, 종은 많은 포유동물에서 건강한 피부 균총으로 존재하며, - 적어도 건강한 피부상에서는 - 서로 미생물 평형 상태에 있다. 따라서, 예를 들면 응집으로 인한 이와 같은 박테리아에 대한 영향, 그리고 그에 따른 신체 위생에 표적화된 방식으로 사용되는 다른 미생물에 대한 영향은 본 발명의 영역 내에서는 바람직하지 않게 된다.
다른 말로 하면, 바람직한 락트산 박테리아는 병원성 박테리아인 스타필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루기노사와 특이적으로 상호응집된다. 선행 기술에서는 이러한 유형이 유래된 바 없다. 선행 기술은 공생 미생물에 대한 결합도 나타냄으로써 역효과를 야기하지 않고는 그것이 사용될 수 없는 락트산 박테리아만을 기술하고 있다. 그것들과 달리, 바람직한 락트산 박테리아는 피부 균총에 서식하는 공생 피부 박테리아 또는 다른 병원성 미생물에 대한 어떠한 결합 또는 상호응집도 나타내지 않는다. 또 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 따른 락트산 박테리아는 피부상 공생 미생물에 결합하는 능력을 가지고 있지 않다.
건강한 피부가 공생체 또는 상리공생체 형태의 박테리아 또는 진균과 같은 미생물에 의해 조밀하게 점령되어 있다는 것은 업계 숙련자에게 알려져 있다. 이들 미생물은 피부 표면의 자연 구성요소로써, 피부 균총이라는 용어로 요약된다. 피부 균총이라는 용어로 포괄되는 상기 미생물은 병원성 생물체로부터 피부 자체 및 전체 신체를 보호하는 데에 중요한 필수구성요소로써, 바이오돔(biodome)의 일부이다. 이와 같은 점에서, 바람직한 락트산 박테리아는 피부 균총이 평형을 벗어나도록 하지 않고, 그 대신 단순히 병원성 박테리아인 스타필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루기노사에 결합하고/하거나 그와 상호응집되는 것이 특히 유리하다.
본 미생물은 특히 병원성 미생물인 스타필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루기노사와의 특이적인 부착 특성을 가지며, 그와 상호응집체를 형성한다. 그러나, 락트산 박테리아는 또한 미생물 스타필로코쿠스 또는 슈도모나스의 다른 병원성 종과도 특이적으로 상호응집되거나, 또는 적어도 그들과 상호작용하는 것이 바람직하다.
다른 무엇보다도, 본 발명에 따른 미생물은 바이오필름의 형성을 방지하는 특성을 가지고 있다. 바람직한 락트산 박테리아가 병원성 박테리아와 상호응집되고/되거나 그들과 관련한 부착 특성을 가지고 있다는 사실로 인하여, 병원성 미생물이 차단될 수 있는데, 그것은 예를 들면 병원성 박테리아의 상응하는 표면 부착을 차단하고/하거나 그에 결합하는 것에 의해, 많은 병원성 인자의 잠복 및 그에 따른 박테리아 존재량의 감소 및/또는 바이오필름 형성의 억제로 이어진다.
본 발명이 특히 일군의 락트산 박테리아에 관한 것이기는 하지만, 본 출원에 따른 교시의 일관성은 여전히 존재한다. 청구되는 미생물은 공통적인 특성 또는 효과를 가진다. 구조 또는 기능적 공통성의 총합은 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 상호응집, 피부의 공생 미생물에 대한 비결합, 및 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름 형성의 방지 및/또는 확립된 바이오필름의 파괴 사이의 기능적 관계로 이어진다. 따라서, 이러한 공통적인 특징은 임의의 특징 총합을 구성하는 것이 아니라, 그 대신, 해당 목적에 대한 이들 미생물의 적합성을 유리하게 가능케 하고 특징화하는, 말하자면 청구되는 미생물의 공통 지문을 형성하는 것이다.
바람직한 미생물, 구체적으로 락트산 박테리아는 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스, 비피도박테리움 비피둠 또는 이들의 유사체, 유도체, 단편 또는 돌연변이체를 포함하는 군에서 선택되며; 이들 미생물은 서로와의 기능적 관계를 통하여 연합되어 본 발명의 일관된 개념을 형성함으로써 특성 및/또는 효과를 공유하는데, 다시 말하자면, 이들은 병원성 박테리아인 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사와 특이적으로 상호응집되며, 피부 및/또는 점막의 어떠한 공생 미생물에도 결합하지 않고, 또한 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름의 형성을 방지한다. 이러한 락트산 박테리아에는 특히 코드 번호 DSM 25906, DSM 25907, DSM　25908, DMZ 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 25912, DSM 25913, DSM 25914 및 DSMZ 25915로 독일 미생물 및 세포 배양 협회에 기탁되어 있는 해당 미생물을 포함하는 군에서 선택되는 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물이 포함된다. 동일한 유리한 특성을 가지고 있는 락트산 박테리아 군이 확인될 수 있었다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 비병원성이기도 하면서 피부의 자연 균총에 대해서는 어떠한 손상 또는 영향도 야기하지 않는 이러한 모든 특성을 조합한 박테리아, 특히 락트산 박테리아에 대해서는 기술된 바가 없다. 조성물로서인지 또는 다른 것으로서인지에 관계없이, 바람직한 락트산 박테리아의 적용은 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 숙주 세포의 결합 및 침입을 방지한다는 것 역시 밝혀졌다. 이의 원인은 지금까지 알려지지 않고 있어서, 추가적인 실험에 의해 확인되어야 한다.
바람직한 미생물, 특히 락트산 박테리아의 또 다른 놀라운 장점은 그것이 예방적으로도 사용될 수 있다는 것이다. 바람직한 미생물, 특히 락트산 박테리아의 또 다른 놀라운 장점은 그것이 예방적으로도 사용될 수 있다는 것이다. 다른 말로 하면, 락트산 박테리아 및/또는 그를 함유하는 조성물은 피부 또는 피부 균총에 대한 어떠한 손상도 초래하지 않으면서 위험성이 있는 피부 영역 및/또는 위험성이 있는 사람 또는 동물의 군에 예방적으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 장기간의 시간 동안 누워만 있어야 하는 사람에서는 압점에서 개방된 상처가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 최초의 실험은 이러한 영역의 예방적 치료가 개방된 상처의 발생을 방지할 수 있거나, 또는 적어도 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의해 야기되는 추가적인 감염으로부터 보호할 수 있음을 나타내었다.
본 발명에 있어서, 바람직한 실시양태에서의 피부는 특히 외부로부터 내부를 구별하는 작용을 하는 인간 또는 동물 신체의 외부 기관인 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 있어서의 피부 영역에는 피부 상층, 코리움(corium) 또는 진피(true skin), 또는 피하 조직의 구성요소가 포함된다. 본 발명에 있어서, 피부 상층 (표피)은 또한 하기의 층으로 구성된다: 각질 층 (스트라툼 코르네움(stratum corneum)), 투명 층 (스트라툼 루시둠(stratum lucidum)), 과립 층 (스트라툼 그라뉼로숨(stratum granulosum)), 가시 세포 층 (스트라툼 스피노숨(stratum spinosum)) 및/또는 기저 층 (스트라툼 바살레(stratum basale)). 이와 같은 영역에서의 각 세포 변형은 본 발명에 있어서의 피부 영역에서의 세포 변형을 구성한다.
본 발명에 따른 피부 영역의 구성요소일 수도 있는 진피 또는 코리움은 바람직하게는 결합 조직 섬유로 구성되며, 표피를 위한 자양분 및 고착력(anchoring)을 제공하는 역할을 한다. 본 발명에 있어서, 표피와의 경계선 구역의 모세관화된 혈관 시스템 역시 피지선 및 한선 또는 땀샘과 마찬가지로 피부 영역에 속한다. 본 발명에 있어서, 진피는 스트라툼 파필라레(stratum papillare) 및 스트라툼 레티큘라레(stratum reticulare)로 하위분할될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 피부 영역은 피하 조직 (피부밑조직) 또는 신체 또는 임의의 기관 또는 기관 구성요소 내부 조직의 또는 조직상의 임의의 영역, 즉 임의의 위치일 수 있다. 본 발명에 있어서, 주변 구조로부터 기관을 구별하는 조직 장벽은 피부일 수 있다. 또한, 본 발명의 피부 영역 개념에는 모발, 피지선, 입모근, 손톱, 뿔 및 한선, 특히 외분비 및 부분분비 한선은 물론, 유선과 같은 외피 부속기도 포함되는 것으로 이해될 수 있다. 바람직하게는 피부의 외부 영역으로 제한되지 않고, 어떠한 세포 변형, 특히 정상에서 벗어나는 세포 성장도 본 발명에 따른 작용제를 사용하여 치료될 수 있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 피부 영역에는 손가락 또는 발바닥, 또는 그와 관련된 외피 및 피부 부속기상의 것과 같은 서혜 피부가 포함될 수도 있다.
스타필로코쿠스 또는 슈도모나스 군에 속하는 미생물이 발생하는 상처 또는 기타 질환 또는 증상에서의 피부 감염 및 박테리아 감염의 성공적인 치료에는, 피부에 대한 락트산 박테리아의 허용성(tolerability)이 필수적이다.
바람직한 조성물은 특히 비누, 로션, 분말, 합성세제, 폼, 스틱, 에멀젼, 스프레이, 크림, 겔, 샴푸, 액체 비누 또는 탈취제에 함유될 수 있다. 조성물은 특히 세제, 린스제, 세정제 또는 소독제 (예컨대 비누, 분말, 페이스트, 용액, 에멀젼, 로션), 세정 및/또는 살균 타월, 샴푸, 피부, 모발 및/또는 두피용 린스 또는 외용약, 크림, 연고, 피부 세정 로션 및/또는 피부 관리 로션, 안구, 귀, 입, 코 또는 인후에 사용하기 위한 용액 (예컨대 점적제, 스프레이, 린스)으로 첨가될 수 있는 프로바이오틱으로 사용되는 것 역시 바람직하거나, 및/또는 병원성 미생물의 형성을 억제하거나, 거기에 결합하고, 응집물로서 그것을 제거하거나, 및/또는 그것을 억제하거나 그것을 사멸시킴으로써 그 수를 감소시키기 위하여 붕대 또는 상처 드레싱에 도입될 수도 있다.
상기 언급된 제약 형태에의 도입에 의해 본 발명에 따른 조성물의 장점이 아직 더 향상될 수 있다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 업계 숙련자라면, 예컨대 피부 적용을 위한 에멀젼 또는 기타 생성물, 예를 들면 바람직하게는 무수 또는 함수의 것일 수 있는 액체 형태 (본 발명에 있어서 수성 형태는 단일상 시스템 및 다중상 시스템으로 분할될 수 있음)와 같은 비히클 물질에 본 발명에 따른 조성물을 도입하기 위한 기타 제제 개념에 익숙하다. 또한, 무수 또는 함수인 반고체 형태가 사용될 수 있는데, 이것 역시 단일상 시스템 및 다중상 시스템으로 분할되는 것이 가능하며, 물을 함유하는 반고체 형태도 가능하다. 친지질성 또는 친수성인 고체 형태가 바람직하게 사용될 수도 있다. 그와 같은 형태의 예에는 상기에서 이미 언급된 형태 이외에도, 예를 들면 지방-기재 연고, 폼, 분말, 스틱, 겔 크림, 수분산성 겔, 함수 에멀젼, 로션, 연고, 스프레이 및 크림이 포함된다. 여기에서, 업계 숙련자라면, 그와 같은 비히클 물질이 먼저 풍부하고/가치있는 것들 및 피부에 대한 감촉을 기준으로 신선하고 가벼운 것들로 구별될 수 있으며, 두 번째로는 점도 면에서 낮은 점도를 가지는 것들 및 기타 높은 점도를 가지는 것들 (히드로겔 또는 수화크림 및/또는 O/W 에멀젼 또는 W/O 에멀젼은 높은 점도를 가짐)로 구별될 수 있다는 것을 알고 있다. 액체 적용 형태가 사용되는 경우, 그것은 - 상기에서 설명한 바와 같이 - 함수 및 무수 시스템으로 분할될 수 있다. 무수 시스템 중에서는, 비극성 시스템, 에멀젼화제가 없는 극성 시스템 및 에멀젼화제가 있는 극성 시스템이 특히 바람직하다. 함수 시스템 중에서는, 용액 및 미세에멀젼과 같은 단일상 시스템이 바람직하며; 다중상 시스템 중에서는, 다중 에멀젼 W/O 에멀젼 또는 O/W 에멀젼이 바람직하다. 고체/액체 시스템 중, 바람직한 형태에는 현탁액 또는 액체/고체/액체 시스템 예컨대 현탁액 시스템/에멀젼 시스템이 포함된다. 업계 숙련자라면, 그와 같은 비히클을 공급함에 있어서의 다양한 가능성에 대해 알고 있다. O/W 에멀젼의 경우, 바람직한 제약 선도 물질에는 O/W 에멀젼화제, W/O 에멀젼화제, 액체 친수성 성분 및 액체 친지질성 성분이 포함된다. W/O 에멀젼의 경우, 바람직한 제약 선도 물질에는 W/O 에멀젼화제, O/W 에멀젼화제, 액체 및 반고체 친지질성 성분, 겔-형성제, 액체 친수성 성분 및/또는 염이 포함된다.
반고체의 바람직한 비히클 물질 중에는, 무수 시스템은 물론 함수 시스템이 다양한 적용분야에 바람직하다. 무수 시스템은 에멀젼화제가 없는 비극성 시스템 또는 극성 시스템, 예컨대 리포겔, 올레오겔 또는 폴리에틸렌 글리콜 겔로 구성될 수 있거나, 및/또는 O/W 흡수 기제 또는 W/O 흡수 기제상의 에멀젼화제가 있는 비극성 시스템으로 구성될 수 있다. 함수 시스템은 바람직하게는 단일상 시스템 예컨대 히드로겔 또는 미세에멀젼 겔, 또는 다중상 시스템 예컨대 O/W 크림, W/O 크림 또는 친양쪽성 시스템으로 구성될 수 있다. 바람직한 반고체 제제는 실온과 피부 온도 사이의 온도 범위에서 피부 적용시 또는 점막 적용시 퍼짐성이며, 거기에서 국소적 효과를 가지고, 거기에서 활성 성분을 수송하거나, 또는 피부에 대한 연화 또는 보호 효과를 가지는 제제이다. 바람직한 제제에는 좁은 의미에서의 연고, 크림, 겔 및/또는 페이스트가 포함된다. 연고, 크림, 겔 및 페이스트 이외에, 올레오겔이 반고체의 투명한 단일상 시스템으로 사용될 수도 있다. 업계 숙련자라면, 예를 들면 본 발명에 따른 비겔(bigel)로 지칭될 수 있는 올레오겔 및 히드로겔의 화합물을 포함하여, US 특허 6,187,323호 또는 문헌 [Aiache et al. 2001]에 나와 있는 반고체 시스템을 제제화하기 위한 다양한 무수 화합물에 대해 알고 있다. 또한, 수화분산액 겔 또는 다양한 지질이 본 발명에 따른 비히클 물질을 제공하는 데에 사용될 수 있다. 지질을 사용할 경우, 유기규소 화합물 및 유기탄소 화합물이 분산 시스템 중 지질 상을 공급하는 데에 사용될 수 있으며, 여기서 유기탄소 화합물은 예를 들면 비가수분해성 지질 또는 가수분해성 지질 (글리세롤) 또는 왁스 에스테르의 도움으로 공급될 수 있다. 그와 같은 시스템의 장점에는 향상된 피부의 유연성 및 탄성의 증가는 물론, 지질 조성에 따라 물질 방출 및 그의 침투를 증가시키는 효과를 가지는 능력이 포함된다. 업계 숙련자라면, 예를 들면 시간 파라미터 내에서 침투를 증가시키거나 감소시키기 위하여 어떤 지질을 사용해야 하는지에 대해 알고 있을 것이다.
추가적인 바람직한 비히클 물질에는 예를 들면 수화분산액 겔 및/또는 미세캡슐, 미세소구체 또는 펠렛 (거대비드)이 포함된다. 언급된 비히클은 안정성을 증가시키는 작용을 하고 피부에 대한 최소한의 적용 기간을 보장한다. 바람직한 반고체 단일상 시스템은 하기의 제약 선도 물질의 도움으로 제조될 수 있다: 액체 친수성 성분, 특히 물 및 (폴리)알콜, 친수성 겔-형성 물질, 염-형성 물질 및 W/O 에멀젼화제, O/W 에멀젼화제, 액체, 반고체 및 고체 친지질성 성분은 물론, 친지질성 겔-형성 물질 및 증량제. 업계 숙련자라면, 이들 물질을 어떻게 조합하여 소정의 효과를 달성해야 하는지를 알고 있을 것이다.
업계 숙련자라면, 피부 제품용의 다른 제약 제제에 대해서도 알고 있을 것이다. 예를 들면 본 특허 출원에 따른 모든 제약 화합물은 문헌 [Daniels and Knie in JDDG; 2007, 5:367-383]의 인용문에 개시되어 있다. 업계 숙련자라면, 상이한 제약 제제가 피부에서 상이한 효과를 가진다는 것을 알고 있어서, 상이한 양으로 생약학적 조성물을 피부에 적용하게 될 것이다. 문헌 [JDDG; 2007, 5:367-383]의 내용은 의거 본 특허 출원에 따른 교시의 개시 내용에 개재된다. 본 발명에 따른 바람직한 생성물에는 예를 들면 친지질성 또는 친수성 용액, 친지질성 또는 친수성 에멀젼, 친지질성 또는 친수성 현탁액, 특별 액체 제제, 소수성 또는 친수성 연고, 수-에멀젼화 연고, 친지질성, 친수성 또는 친양쪽성 크림, 히드로겔, 소수성 또는 친수성 페이스트 및/또는 분말이 포함된다.
실험은 바람직한 락트산 박테리아, 특히 락토바실루스 세포가 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포와의 접촉시 상호응집체를 형성한다는 것을 보여주었다. 상호응집체의 형성으로 인하여, 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사가 특히 피부 상처로 침투하는 것, 또는 피부상에 정착하여 콜로니를 형성하고, 확립되고, 부착하고, 바이오필름을 형성하는 것이 방지된다. 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포, 특히 이들 세포의 표면이 락트산 박테리아, 특히 락토바실루스 세포에 의해 차단됨으로써, 바람직하게는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포가 피부 상피 세포에 더 이상 결합할 수 없게 된다. 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사가 피부 상피 세포에 결합하는 것이 방지되기 때문에, 염증 반응이 발생하는 것이 실패되거나, 및/또는 피부 자극이 감소 또는 방지된다. 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포, 특히 이들 세포의 표면은 락트산 박테리아, 특히 락토바실루스 세포에 의해 결합된다. 다음에, 락토바실루스 세포 및/또는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포로 구성되며, 개별적으로 또는 소형 응집체로 존재하는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포와 비교하였을 때 피부, 상처 및 일반적인 표면 (모피, 깃털, 강철, 플라스틱 및 금속 표면)으로부터 더욱 용이하게, 더욱 효율적으로, 그리고 효과적으로 제거 (세척 제거)될 수 있는 세포 응집체가 형성된다.
본 발명에 있어서, 프로바이오틱 미생물은 인간 및/또는 동물 신체에서 유리한 효과를 가지는 세포로 구성된다. 바람직한 조성물은 프로바이오틱 조성물로 사용되며, 인간 또는 동물 신체에 대하여 유리한 효과를 가지는 락트산 박테리아를 함유한다. 유리한 효과는 특히 피부 균총을 개선하는 것에 있을 수 있다. 구체적으로, 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포와 같은 원치 않는 미생물이 프로바이오틱 미생물과 원치 않는 미생물의 직접적인 상호작용에 의해, 특히 프로바이오틱 미생물의 발현 생성물로 인한 원치 않는 미생물의 대사 억제를 바탕으로 하는 직접적인 상호작용에 의해 피부 균총에서 억제될 수 있다. 실험은 바람직한 락트산 박테리아에 의한 상호응집 후, 병원성 미생물인 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사가 어떠한 성장, 즉 세포괴(cell mass)의 더 이상의 증식도 나타내지 못하며, 대신 세포가 차단되거나, 응집체에 결합되거나, 및/또는 사멸된다는 것을 보여주었다.
본원에서 기술되는 락트산 박테리아의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 특히 락트산 박테리아의 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리에 의해 제조되며, 놀랍게도 처리 후에도 유리한 특성을 나타낸다. 락트산 박테리아는 유리하게는 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스, 비피도박테리움 비피둠을 포함하는 군에서 선택되며, 바람직하게는 독일 미생물 및 세포 배양 협회에 기탁되어 있으며 DSM　25906, DSM 25907, DSM 25908, DSMZ 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 25912, DSM 25913, DSM 25914 및 DSMZ 25915로 번호가 매겨져 있는 해당 미생물을 포함하는 군에서 선택된다.
또한, 락트산 박테리아, 그의 단편, 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 조합물이 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 사멸 후에도 여전히 유리한 특성을 가지게 된다는 것은 놀라운 것이었다. 예를 들면, 바람직한 균주, 즉 DSM 25906, DSM 25907, DSM 2598, DSMZ 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 25912, DSM 25913, DSM 25914 및 DSMZ 25915는 70℃에서의 20분 동안의 열처리 또는 초음파를 사용한 처리 후에도 병원체의 상호응집체를 생성하며, 바이오필름의 형성을 방지하고, 또한 공생 미생물의 어떠한 결합도 나타내지 않는다. 따라서, 조성물의 바람직한 실시양태에서는, 상기 락트산 박테리아, 그의 단편, 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 조합물이 유리하게도 사멸된 형태로 존재할 수도 있다. 조성물의 안정성 및 유용성은 이와 같은 방식으로 실질적으로 연장될 수 있다. 또한, 살아있는 미생물의 사용을 허용하지 않는 다른 적용분야에서 조성물이 사용될 수도 있다. 조성물 중 락트산 박테리아가 불활성화된 것이거나, 생존성이거나 또는 비생존성인 것일 수 있으며, 그럼에도 불구하고 여전히 병원성 미생물과 특이적인 결합 및/또는 상호응집을 할 수 있다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 조성물은 유리하게도 식품, 식품 첨가제 또는 제약 작용제, 의약품, 화장품, 세정제 첨가제 및 동물 사료 또는 음료로 사용될 수 있다.
바람직한 조성물은 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물과 상호응집하는 능력을 가지는 본 발명에 따른 락트산 박테리아, 또는 그의 유사체, 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 함유하는 것으로써, 신체위생, 신체 치료 및/또는 예방에 사용된다.
바람직한 미생물은 락트산 박테리아 속 또는 목, 즉 글루코스의 발효에 의해 락트산을 생성하는 그람-양성 박테리아를 나타낸다. 본 발명에 따른 미생물은 한편으로는 그것이 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적인 상호응집 능력을 가진다는 사실을 특징으로 한다. 이와 같은 결합은 본 발명에 따른 미생물과 특이적으로 결합된 병원성 미생물의 응집체 형성으로 이어진다. 상호응집체의 형성으로 인하여, 후자, 즉 병원성 미생물은 예를 들면 과거에 알려져 있던 수단으로는 불가능했던 헹굼 제거에 의해 기계적으로 그리고 표적화된 방식으로 용이하게 제거될 수 있다. 락토바실루스 세포 및/또는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포로 구성되는 세포 상호응집체는 개별적으로 또는 소형 응집체로 존재하는 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사 세포와 비교하였을 때, 피부, 상처 및 일반적인 표면으로부터 더욱 용이하게, 더욱 효율적으로, 그리고 더욱 효과적으로 (모피, 깃털, 강철, 플라스틱 및 금속 표면) 제거 (세척)될 수 있다.
본 발명은 물론 일반적인 미생물학 및 위생, 특히 인간 미생물학 및 신체 위생 분야에 있어서, "특이적인 결합" 또는 "상호응집"이라는 용어는 유전적으로 상이한 유형의 세포에 속하는 세포의 상호 인식 및 부착을 지칭하는 것으로 이해된다. 여기서 박테리아는 해당 세포 표면상에서, 세포 사이의 부착에 사용되는 다른 세포 유형에의 부착을 위한 수용체 및 구조를 발현한다. 이와 같은 부착은 병원성 미생물은 물론 공생 미생물과의 콜로니화에서 뛰어난 역할을 하기 때문에, 부착시의 개재는 광범위한 결과를 초래할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물이 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에 속하는 1종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 능력, 특히 상호응집의 능력을 가지고 있다는 사실로 인하여, 본 발명에 따른 미생물과 병원성 미생물은 응집한다. 생성되는 상호응집체는 예를 들면 표면, 피부, 조직 및/또는 기타 다른 콜로니화 부위 또는 저장소를 헹구는 것에 의해 용이하게 제거될 수 있기 때문에, 병원성 미생물의 수가 확실하게 감소된다. 또한, 병원성 미생물의 표면 구조를 차단함으로써, 표면, 피부, 조직 및/또는 기타 콜로니화 부위 또는 저장소에 대한 최초 및/또는 보충되는 부착이 방지 및/또는 감소된다. 세포가 서로 결합하여 응집체를 형성하는 경우, 이와 같은 과정은 구체적으로 응집으로 지칭된다. 이와 같은 응집체의 형성에 1종의 세포 종만이 관련되는 경우, 그 과정은 자가응집 또는 자체응집으로 지칭된다. 2종 이상의 상이한 세포 종이 응집체의 형성에 관련되는 경우, 그 과정은 특히 상호응집으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적인 결합"은 구체적으로 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에 속하는 1종 이상 박테리아에 결합하는 본 발명에 따른 미생물의 특성을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 미생물의 바람직한 실시양태에서 있어서, 그것은 또한 1종 이상의 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력이 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리, 예를 들면 최소 70℃에서의 열처리 후에도 존재한다는 것을 특징으로 한다. 다른 말로 하면, 병원성 박테리아, 특히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사와 특이적으로 상호작용하거나 그에 결합하는 능력이 영향을 받지 않으며, 그에 따라 결합 또는 상호작용이 확립될 수 있기 때문에, 바람직한 락트산 박테리아는 바람직하게도 바람직한 조성물 중에 존재할 수 있다.
불활성이거나 비생존성인 락트산 박테리아 세포는 특히 유리할 수 있는데, 이러한 락트산 박테리아 세포로부터는 대사 활성이 발휘될 수 없기 때문이다.
상기한 특성 이외에도, 락트산 박테리아의 또 다른 바람직한 특성에 따라, 본 발명에 따른 미생물은 열적 안정성, 즉 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 할 수도 있는데, 바람직하게는 대략 60℃ 이상, 더욱 바람직하게는 65℃ 이상, 더욱 더 바람직하게는 70℃ 이상의 고온에서 20분 이상, 바람직하게는 25분, 더욱 바람직하게는 대략 30분 이상의 기간 동안의 처리를 생존하면서도 상기 병원성 미생물에 대한 그의 상호응집 능력과 관련하여 변화되지 않고 유지될 수 있다.
조성물의 바람직한 실시양태에서는, 그것이 상호응집 및/또는 바이오필름 형성 방지 능력을 여전히 가지고 있다는 전제하에, 락트산 박테리아가 불활성화된 것, 살아있는 것 또는 사멸된 것이거나, 또는 그의 일부 및 단편, 예를 들면 해당 박테리아의 효소 또는 기계적 절단 생성물 (예컨대 프렌치 프레스(French press) 등) 또는 대사 생성물이다. 락트산 박테리아가 캡슐화되거나, 분무-건조되고/되거나 동결건조된 형태, 즉 바람직한 조성물 중의 캡슐화되거나, 분무-건조되고/되거나 동결건조된 형태로 사용되는 것 역시 바람직하다. 또한, 락트산 박테리아는 소화된 세포의 형태로 사용될 경우 유리할 수 있다.
또한, 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 능력은 대략 3 내지 8의 pH에서도 지속될 경우 바람직하다. 이는 락트산 박테리아가 3 내지 8의 pH를 가지는 배지 중에 존재하면서도 여전히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 결합하는 그의 능력을 가지고 있을 수 있다는 것을 의미한다. 업계 숙련자라면, 피부가 약간 산성인 pH를 가지고 있다는 사실을 알고 있다. 이러한 점에서, 바람직한 락트산 박테리아는 넓은 pH 범위에서도 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 그의 상호응집 능력을 나타내는 것이 특히 유리하다. 피부의 pH는 예를 들면 화장품으로 인하여, 또는 상이한 신체 영역에서 달라질 수 있다. 바람직한 락트산 박테리아는 유리하게도 pH 범위가 넓을 수 있거나, 및/또는 바람직한 범위에서 바람직한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 바람직한 락트산 박테리아는 유리하게는 상이한 신체 영역에서 범용으로 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 기술되는 발명은 프로테아제 처리 (예컨대 트립신, 트립신 TPCK-처리, 리소자임, 프로테이나제 K, 프로나제, 트롬빈, PNGase, 펩신, 키모트립신, 파페인) 후에도 상호응집 특성을 가지는 조성물, 특히 혁신적인 프로바이오틱이다.
본 발명에 따른 락트산 박테리아는 놀랍게도 대략 25℃-42℃의 넓은 온도 범위에서 특히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사와의 상호응집 특성을 나타낸다.
따라서, "약" 또는 "대략"과 같은 용어를 특징으로 하는 여기에서는 물론 본 발명에서 주어지는 범위에 대한 모든 언급에서, "약" 또는 "대략"이라는 표현과 함께 정확한 숫자 범위가 표시되어야 할 필요는 없으며, 그 대신 표시되는 숫자와 관련한 약간의 상향 또는 하향 편차도 역시 본 발명의 영역에 속한다는 것이 업계 숙련자에게는 명백할 것이다.
열거되어 있는 병원성 미생물에 대한 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 결합은 바람직하게는 해당 병원성 미생물의 성장 억제를 초래한다.
병원성 미생물과 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 결합으로 인하여 특히 교반 없이 실온에서 5 내지 100분 후에 침강물로서 존재하는 응집체가 형성된다는 것은 놀라운 것이었다.
상처에서 호기성이며 주로 병원성인 박테리아는 특히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사이다. 상처 치유의 염증 단계는 보통 잠재적인 병원성 미생물을 퇴치하고 세포 재생을 위한 작용을 한다. 그러나, 이미 면역학적으로 억제되어 있어서 감소된 염증 반응을 가지는 환자에서는, 종종 불응성인 상처가 발생한다. 이와 같이 감소된 면역 반응은 일차적인 상처 박테리아를 더 이상 효과적으로 퇴치할 수 없으며, 그에 따라 박테리아가 상처로 침투하여 콜로니를 형성하게 되고, 그것은 바이오필름으로 조직화된다. 이러한 바이오필름은 숙주의 방어 시스템에 대하여 내성일 뿐만 아니라, 플랑크톤성 세포 또는 미세콜로니를 포함하기도 한다.
바람직한 실시양태에서, 바람직한 락트산 박테리아, 그의 유사체, 단편, 돌연변이체, 유도체 또는 조합물은 바람직하게는 하기의 특징 중 하나 이상을 가진다: a) 열적 안정성, 또는 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리 후의 안정성, 또는 b) 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는 능력. 본 발명에 따른 락트산 박테리아가 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리 후에도 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하게 된다는 것은 완전히 놀라운 것이었다.
본 발명에 따른 락트산 박테리아의 또 다른 특성은 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는 능력이다. 초음파, 세제, 프로테아제 또는 열에 대하여 내성인 극히 강한 바이오필름을 형성하는 이들 박테리아는 항미생물 물질에 대하여 내성이기도 하다. 본 발명에 따른 미생물은 특히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는 특성을 가지고 있다. 바이오필름 형성의 억제로 인하여, 이들 병원성 박테리아는 더 이상 생물학적 표면 또는 무기 표면을 콜로니화할 수 없으며, 결과적으로 더 이상 질환을 야기할 수 없다.
따라서 본 발명에 있어서, "스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름 형성의 억제"라는 구는 특히 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사와 상호작용하는, 즉 그에 결합하거나, 또는 그것이 더 이상 바이오필름을 형성할 수 없도록 하는 방식으로 그것에 다르게 영향을 주는 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 특성을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서 바람직한 실시양태에서 있어서, 본 발명에 따른 미생물은 언급된 특성, 즉 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 특이적인 결합의 능력, 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 상호응집 중 하나 이상을 가질 수 있다. 바람직한 특성 조합에는 예를 들면 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 그리고 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 결합하는 능력, 또는 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 그리고 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름 형성의 억제가 포함된다.
이미 언급된 바와 같이, 본 건에서 "락트산 박테리아 속 또는 목에 속하는 미생물"이라는 표현에는 본원에서 기술되는 본 발명에 따른 미생물의 특색 및/또는 특징 또는 특성을 여전히 가지고 있는 그의 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 단편이 포함되는 것으로도 이해된다. 본 발명에 따른 락트산 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 크리스파투스 및 락토바실루스 인글루비에이(Lactobacillus ingluviei) 종의 박테리아이다.
따라서, 락트산 박테리아 속에 속하는 상기 언급된 미생물의 "돌연변이체 또는 유도체", 특히 락토바실루스 종의 돌연변이체 또는 유도체로써, 특히 본 건의 발명에 따른 락트산 박테리아에 대하여 청구되는 것과 동일한 특징을 가지는 동일한 균주가 청구된다. 이는 적어도 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적인 상호응집 능력을 지칭하게 된다. 또한, 하기의 특징 중 하나 이상을 가지는 것이 바람직하다: (i) 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리, 특히 70℃ 초과에서의 30분 이상 동안의 열처리에 대한 특이적 결합 능력의 내성; (ii) 스타필로코쿠스 에피데르미디스 또는 기타 공생 피부 미생물에 대한 결합 없음; (iii) 1종 이상의 병원성 바이오필름-형성 미생물에 대한 특이적인 결합 능력; (iv) 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 바이오필름 형성의 억제 능력; (v) pH 3-8에서의 특이적 결합의 존재. 해당하는 바람직한 유도체는 예를 들면 유전 공학에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, "유전 공학에 의해 제조되는"이라는 용어에는 구체적으로 재조합 DNA 기술에 의해 유전적 변형이 유도될 수 있도록 함으로써 유전자가 변형될 수 있도록 하는, 시험관내 및 생체내 핵산 변형용으로 유전 공학 분야에서 업계 숙련자에게 익숙한 모든 방법이 포함된다.
따라서, 본 발명에는 특히 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 특성을 여전히 가지고 있는 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 단편도 포함된다. 본 발명에 있어서, "단편"은 구체적으로 본 발명에 따른 미생물의 세포 구성요소, 바람직하게는 세포 막의 일부이다. 업계 숙련자라면, 선행 기술로부터 세포 막 분획을 수득하는 방법과 적당히 친숙할 것이다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 단리 또는 정제된 형태로 존재하며, 여기서 "단리된"이라는 용어는 구체적으로 락트산 박테리아가 그의 배양 배지 - 예를 들면 그의 자연 배지 포함 -로부터 유래함을 의미한다. "정제된"이라는 용어가 절대적인 정제로 제한되는 것은 아니다.
살아있는 형태의 본 발명에 따른 미생물 이외에도, 본 발명에 따른 미생물의 불활성 형태 역시 본 발명의 영역 내에 포함되는 것이 바람직하다. 본원에서 "불활성 형태"라는 용어는 구체적으로 배양 플레이트에서 더 이상 콜로니를 형성할 수 없는 불활성화되었거나 사멸된 세포를 나타낸다. 업계 숙련자라면, 적합한 불활성화 방법 (예컨대 생물학적, 화학적 또는 물리적 불활성화 방법)과 친숙하다. 그러나, 본 건에서, 미생물은 동결건조된 형태로 사용될 수도 있다. 동결건조된 세포는 액체 또는 고체 배지에서의 적합한 배양 후 다시 성장 유도될 수 있다.
본 건에서 "불활성화된 형태" 또는 "불활성 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "돌연변이체"라는 용어에는 본 발명에 따른 미생물의 세포 및/또는 발효 상청액, 용해물, 분획 또는 추출물도 포함되며, 여기서 상기 용해물, 분획 또는 추출물은 바람직하게는 락트산 박테리아의 특성을 가지고, "용해물" -은 물론 "추출물"이라는 용어 -는 특히 본 발명에 따른 미생물 세포의 수성 배지 중 용액 또는 현탁액을 지칭하는 것으로써, 예를 들면 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등은 물론 세포 파편과 같은 거대분자를 포함한다. 용해물에는 바람직하게는 세포 벽 또는 세포 벽 구성요소도 포함된다. 용해물을 제조하는 방법에 대해서는 업계 숙련자에게 충분히 잘 알려져 있는데, 예를 들면 "프렌치 프레스" 또는 효소 용해, 유리 비드 또는 철제 비드를 사용하는 볼 밀의 사용이 포함된다. 세포는 효소적, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 파손 개방될 수 있다. 효소적 세포 용해의 예에는 개별 효소는 물론, 효소 칵테일 예컨대 프로테아제, 프로테이나제 K, 리파제, 글리코시다제가 포함될 수 있으며; 화학적 용해는 이온운반체, 세제 예컨대 SDS, 산 또는 염기에 의해 유도될 수 있고; 물리적 방법은 또한 프렌치 프레스와 같은 고압을 사용하는 것, 삼투몰농도, 온도 또는 열과 냉의 교호를 사용하는 것에 의해 실행될 수 있다. 또한, 당연히, 화학적, 물리적 및 효소적 방법이 조합될 수도 있다.
본 발명에 따른 미생물의 "불활성화된 형태" 또는 "불활성 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "돌연변이체"는 바람직하게는 상기 언급된 균주와 동일한 특성을 가진다. "불활성화된 형태" 또는 "불활성 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체"는 바람직하게는 더 이상 어떠한 대사 활성도 가지지 않는다.
본 발명에 따른 미생물의 유사체는 용해물 또는 단편의 형태이다. 본 발명에 따른 미생물의 단편은 세포 막, 거대분자 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등은 물론 세포 파편과 같은 세포의 일부이다. 업계 숙련자라면, "유사체", "단편", "유도체" 또는 "돌연변이체"와 같은 용어의 내용물을 공급할 수 있으며, 어떠한 대단한 기술적 노력도 없이 본 발명의 견지에서 해당 용어를 해석할 수 있다. 바람직한 미생물의 돌연변이체, 유도체, 단편 또는 유사체를 제공하기 위하여, 업계 숙련자라면, 돌연변이체, 유도체, 단편 또는 유사체를 제조하는 데에 사용될 수 있는 기술에 대해 개시하는 그에 가용한 표준 문헌에 의존할 수 있다.
돌연변이체 및/또는 유전적으로 변경된 변이체 또는 유도체는 예를 들면 재조합 DNA 기술 (재조합 핵산의 클로닝, 서열분석, 형질전환)은 물론, 예컨대 자외선에 의한 물리적 돌연변이체유발뿐만 아니라, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)와 같은 화학적 작용제로 인해서도 유전적으로 변경된다. 긍정적인 특성의 변경은 - 표적화된 방식, 또는 형성된 다수 돌연변이체의 평가 중 어느 하나에서 - 선택될 수 있다. 유전적으로 변경된 돌연변이체는 본 발명에 따른 미생물의 세포를 함유하며, 그의 박테리아 염색체 및/또는 플라스미드에 재조합 핵산을 동반한다. 점 돌연변이체로 인한 변형 역시 어떠한 직접적인 유전적 조작도 없이 발현/전사/번역은 물론 자발적 돌연변이체에 효과를 가질 수 있다.
유사체 또는 단편은 예컨대 표면적을 증가시키는 것에 의해 본 발명의 해당 특성을 유지하고 있거나 그것이 향상된, 본 발명에 따른 미생물의 열적으로 불활성화 (사멸)되거나 동결건조된 형태일 수 있다. 어떤 상황하에서는, 동결건조 (냉동 건조) 후에도 세포가 여전히 살아있을 수 있다. 이러한 세포는 상이한 온도에서의 특별한 저장 과정을 통하여 불활성화될 수 있다. 불활성화된 세포는 예를 들면 무손상이거나 파열된 세포 막을 가질 수 있으나, 어떠한 대사 활성도 가지지 않을 수 있다. 불활성화된 세포를 수득하는 방법에는 예를 들면 유리 비드를 사용하여 그것을 처리하는 것이 포함될 수 있는데, 여기에서는 세포와 유리 비드 사이의 전단력의 효과가 세포가 파열되도록 한다. 프렌치 프레스, 고-압 균질화, 볼 밀 또는 냉동-해동 과정 및 오토클레이빙은 물론, UV 조사, 자가용해 과정 또는 상이한 온도에서의 특별한 저장 과정과 같은 추가적인 물리적 방법 역시 본 발명에 따른 미생물의 불활성화 및 단편으로 이어진다.
본 발명에 있어서는, "락토바실루스 세포"라는 용어가 락트산 박테리아 또는 락토바실루스를 지칭하는 데에 사용될 수도 있는데, 락트산의 발효에 탄수화물 특히 글루코스 및 락토스를 필요로 하며 보통 엠덴-마이어홉(Embden-Meyerhof) 생합성 경로를 이용하는 미생물도 포함한다. 락토바실루스 세포는 분류학적으로 락토박테리아세아에(Lactobacteriaceae) 과에 분류된다. 이들은 그람-양성이며, 비포자-형성이고, 일반적으로 비이동성이다. 락토바실루스 세포는 혐기성으로 생존하지만, 내기성이고, 그럼에도 불구하고 어떠한 헤민(hemin) (시트크롬, 카탈라제)도 함유하지 않는다 (문헌 [Schleifer et al., System. Appl. Microb. 18, 461-467 (1995)] 또는 [Ludwiq et al., System. Appl. Microb. 15, 487-501 (1992)]). 락토바실루스 세포 및/또는 종은 탄수화물 이용 양식을 기준으로, 특히 API 시험 (바이오메리(Biomerieux) Co. 사)에 의해, 그리고 16sRNA 서열분석을 통하여 확인될 수 있다. 본 발명에 있어서, 여기에는 특히 동종발효성 락트산 발효 또는 이종발효성 락트산 발효에 적합한 종이 포함된다. 역시 바람직한 것은 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스 및 락토바실루스 플란타룸 (모두 동종발효성), 또한 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스는 물론, 비피도박테리움 비피둠 (모두 이종발효성)을 포함하는 군에서 선택되는 락토바실루스 세포가다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 각각 기탁 번호 DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908, DSMZ 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 2591, DSM 25913, DSM 25914 및 DSMZ 25915로 브라운슈베이의 독일 미생물 및 세포 배양 협회 (DSMZ)에 기탁되어 있는 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크리스파투스, 및 락토바실루스 인글루비에이에서 선택된다. 상기 언급된 DSMZ 기탁은 특허 기탁 목적의 미생물 기탁에 대한 국제적 공인과 관련한 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다.
상기에서 추가로 설명된 바와 같이, 본 발명은 또한 바람직하게는 살아있는 미생물 또는 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 물론, 바람직하게는 하기 중 1종 이상에서 선택되는 1종 이상의 비히클 또는 부형제를 함유하는 조성물에 관한 것이다: 화장품용으로 허용되는 비히클 또는 부형제, 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제, 또는 피부과용으로 허용되는 비히클 또는 부형제.
본 발명에 있어서, "조성물"이라는 용어에는 특히 1종 이상의 본 발명에 따른 미생물 또는 그의 단편, 유도체, 유사체 또는 돌연변이체는 물론, 임의로 다른 성분 예컨대 비히클 또는 부형제, 또는 임의로 다른 활성 성분 및 염을 가지는 어떠한 조성물도 포함되는 것으로 이해된다. 화장품용으로, 제약상 또는 피부과용으로 허용되는 부형제, 비히클 또는 첨가제에는 활성 성분 또는 조성물, 즉 본 건에서는 1종 이상의 미생물 또는 그의 유사체 또는 유도체 또는 돌연변이체 또는 단편을 화장품용으로 또는 제약상 투여, 사용 또는 활성화하기 위하여 화장품, 제약 또는 치과 분야에서 통상적으로 사용되는 어떠한 물질도 포함되는 것으로 이해된다.
조성물은 본 발명에 따른 미생물 중 1종, 또는 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편을 함유하는 것 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 미생물의 혼합물, 또는 유사체, 유도체, 돌연변이체 또는 단편의 혼합물, 또는 본 발명에 따른 미생물과 그의 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 유사체의 혼합물을 함유하는 것도 바람직하다.
조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 또는 점성 형태 또는 에어로졸일 수 있으며, 예를 들면 분말, 정제, 용액, 과립, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 페이스트, 겔, 스프레이 등의 형태로, 즉 투여에 적합한 어떠한 형태로도 사용될 수 있다. 조성물이 추가적인 프로바이오틱스, 방부제 또는 기타 항박테리아 물질, 그리고 바람직하게는 하나 임의로 당류 및 보존제, 향미제, 감미제, 비타민, 무기질 등을 포함하는 경우 역시 바람직하다. 문헌 EP　2　133　414　A1호에 바람직한 조성물에 사용될 수 있는 수많은 성분이 열거되어 있는데; 이 문헌을 명시적으로 참조한다. 또한, 바람직한 조성물에는 충전재, 유동 조절제, 유변물성 개질제, 연화제, 안정화제, 개시제 또는 반응성으로 가교결합되는 단량체, 예를 들면 메타크릴레이트가 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 특히 신체 위생, 물리 치료 및 예방에서의 용도에 사용되며, 1종 이상의 본 발명에 따른 미생물 또는 그의 유도체, 돌연변이체, 단편 또는 유사체를 함유한다.
상기 조성물 및/또는 미생물은 소독제, 예를 들면 표면 소독제 예컨대 특히 콘택트 렌즈용 세정 용액으로 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물을 사용함에 있어서의 투약 및 투여는 각각의 용도 및 각각의 환자 - 특히 연령, 체중, 일반적인 건강 등 -에 따라 달라지며, 조성물을 사용하게 될 업계 숙련자의 능력 및 평가에 속한다.
본 발명에 따른 조성물은 화장품, 의약품 또는 제약 생성물일 수 있다. 조성물은 바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.005 중량% 내지 5 중량%, 특히 바람직하게는 0.01 중량% 내지 3 중량%의 중량 기준 양으로 락트산 박테리아를 함유한다. 구체적으로 0.001 중량% 내지 10 중량% 양의 사용이 더 긴 시간 기간 동안 분해가 가용하도록 하는, 즉 안정하게 유지되도록 하게 되는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 0.005 중량% 내지 5 중량%의 양으로 락트산 박테리아가 사용될 경우, 이는 놀랍게도 조성물의 유변학적 특성에 긍정적인 효과를 초래하며, 조성물이 더 낮은 점도를 가지도록 함으로써, 피부상에 더 잘 분산되도록 하거나, 구강에 더 용이하게 도입되도록 한다. 0.01 중량% 내지 3 중량% 중량 기준 양의 락트산 박테리아 사용은 놀랍게도 조성물의 구성요소를 서로 더 잘 결합하도록 하였으며, 작용 시간이 감소됨으로써 다시 제조 비용의 감소로 이어지는 균질 조성물의 공급 가능성을 초래하였다. 그러나, 특별한 적용분야에서는 여기에서 열거된 것과 상이한 다른 양이 사용될 수도 있다는 것은 자명하다.
상기에서 설명된 바와 같이, 바람직한 실시양태에 있어서, 조성물 및/또는 미생물은 신체 위생 분야에서 상기 언급된 병원성 미생물을 응집시키는 데에, 즉 거기에 결합하는 데에 사용될 수 있다. 이후, 이러한 상호응집체는 예컨대 특히 현탁액의 경우, 그것을 헹구어 제거하는 것에 의해 용이하게 제거됨으로써, 병원성 미생물 수의 감소가 유리하게 달성될 수 있다. 따라서, 락트산 박테리아 및/또는 그것을 함유하는 조성물은 다양한 방식으로 이와 같은 목적에 사용될 수 있다. 예를 들면, 그것은 샤워 겔, 샤워 로션, 바디 로션, 액체 비누, 비누, 샤워 오일 또는 살균 용액, 호흡 장비의 필터 시스템, 코 스프레이, 콘택트 렌즈용 세정 용액, 타월 또는 세정 타월에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 신체 위생 및 의약품 및 예방 분야에서 사용되며 본 발명에 따른 락트산 박테리아를 함유하는 모든 생성물에 관한 것이기도 하다. 따라서, 상기한 실시양태는 동물에서의 처리, 치료 및 예방 분야에도 적용된다. 따라서, 상기 미생물 및/또는 그를 함유하는 조성물은 다양한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 및/또는 본 발명에 따른 미생물은 당뇨병, 피부 질환, 피부 손상, 독성 쇼크 증후군, 스타필로코쿠스 열상 피부 증후군은 물론, 장독소에 의해 야기되는 독성 감염, 종기, 큰종기, 굴염, 골수염 예컨대 패혈증, 및 이어서 수막염 및/또는 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해 야기되는 심근염 및 심장막염, 그리고 낭성 섬유증을 동반한 폐렴, 요로 감염, 소장결장염, 수막염, 외이도염, 슈도모나스 아에루기노사로 인한 화상상의 감염의 치료 또는 예방을 위한 제약 약물을 제조하는 데에 사용될 경우, 특히 바람직하다.
작용제는 이러한 질환을 유리하게 치료 및/또는 예방할 수 있는 본 발명에 따른 미생물 및 그를 함유하는 조성물을 통하여 가용하게 된다. 미생물 및/또는 그를 함유하는 조성물은 인간 및 수의과용 의약, 특히 상기에서 나타낸 바와 같이 개, 원숭이, 고양이, 말 및 설치류 (산토끼, 집토끼, 햄스터, 기니 피그) 및 상업용 동물 예컨대 닭, 돼지 및 소, 양, 염소 및 기타 가정용 및 상업용 동물에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 및/또는 미생물 - 또는 그의 단편, 유도체 또는 돌연변이체 -는 특히 식품 첨가제, 위생 제품, 미생물을 함유하는 위생 제품, 또는 제약 제제로서 사용될 수 있다. 상기 위생 제품은 예를 들면 키트의 형태일 수도 있으며, 그것은 신체 위생 장치 또는 장비, 린스, 페이스트 등에 더하여, 본 발명에 따른 미생물 또는 그를 함유하는 조성물을 함유할 수도 있다.
본 발명은 또한 적어도 하기의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 특성을 가지는 락토바실루스 sp. 속 미생물의 확인 및/또는 선별 방법에 관한 것이다: a) 바이오필름의 발생을 위하여, 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에서 선택된 병원성 미생물의 배치를 인큐베이션하는 단계, b) 조사될 락토바실루스 속 미생물을 첨가하고 배치를 인큐베이션함으로써, 병원성 미생물과 조사될 락토바실루스 속 미생물 사이에 특이적인 결합을 형성시키는 단계, c) 상청액을 제거함으로써 비결합 락토바실루스 속 미생물을 분리하는 단계, 및 d) 결합 및 응집된 락토바실루스 속 미생물과 관련하여 바이오필름을 측정하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 또한 병원성 미생물에 의한 바이오필름 형성의 억제를 조사하는 단계를 포함한다. 여기에서, 조사될 락토바실루스 속 미생물은 바이오필름-형성 병원성 미생물의 인큐베이션 동안 첨가되었다. 비결합 세포의 제거 후, 바이오필름의 형성은 바람직하게는 특히 크리스탈 바이올렛 염색 후 시험될 미생물을 첨가하지 않은 대조군과 비교하였을 때의 광학 밀도를 측정하는 것에 의해 정량된다.
상기에 언급된 특징들 및 또한 아래에서 기술되어야 할 것들이 본 발명의 영역을 벗어나지 않고도 주어진 특정 조합으로는 물론 단독으로도 사용될 수 있다는 것은 자명하다.
본 특허 출원에 따른 교시는 하기의 성질을 특징으로 한다:
- 선행 기술에서 통상적인 것으로부터의 이탈,
- 새로운 목적 설명,
- 오랜 시간 동안 해결되지 않았으나 본 발명에 의해 해결된 문제의 해결에 대한 시급한 필요성의 존재,
- 기술계 일부에서의 이전의 성공적이지 않았던 노력,
- 해결책의 단순성으로써 발명 단계를 암시함, 특히 그것이 더 복잡한 기술을 대체함,
- 다른 방향으로 가는 과학 기술의 개발,
- 추가 개발로 이어지는 실행,
- 해당 문제에 대한 해결과 관련한 기술계의 그릇된 개념 (기술 진전 예를 들면: 개선, 증가된 성능, 비용의 감소, 시간 절약, 재료, 작업 단계, 원료 획득상의 비용 또는 어려움, 증가된 신뢰성, 결점의 제거, 품질을 증가시키는 것, 유지로부터의 자유, 더 큰 효능, 더 높은 수율, 기술적 가능성의 증가, 또 다른 수단을 제공하는 것, 제2의 경로를 여는 것, 새로운 영역을 여는 것, 최초의 문제 해결, 수단 확보, 대안, 경제화 가능성, 자동화 또는 소형화, 또는 약물 자원의 보강을 막는 선입견),
- 우연한 행운, 다양한 가능성으로부터 하나의 특정 가능성이 선택되었는데, 결과는 예상할 수 없었음, 따라서 이는 특허화될 수 있는 우연한 행운임,
- 기술 문헌에서의 실수 및/또는 본 발명 주제의 매우 모순되는 제시,
- 새로운 기술 분야,
- 조합 발명, 즉 다수의 공지 요소가 조합되어 놀라운 효과를 가지는 조합을 산출함,
- 특허권의 허여,
- 기술계에 대한 찬양, 및
- 경제적 성공.
구체적으로, 본 발명의 유리한 실시양태는 상기 언급된 장점 중 하나 이상을 가지고 있다.
하기에서는, 도면 및 실시예에 기초하여 예로써 본 발명을 설명할 것인 바, 그것으로 제한되는 것은 아니다.
도 1: 비결합 세포를 3회 세척한 후의, 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해 형성되는 바이오필름에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 일 실시양태 (DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908), 그리고 그와의 비교를 위한 것으로써, 본 발명에 따른 것이 아니며 스타필로코쿠스 아우레우스에 결합할 수 있는 추가적인 락토바실루스 균주 (락토바실루스 종 1 및 락토바실루스 종 2 및 락토바실루스 종 3)의 특이적인 결합 및/또는 응집 (결합 검정); 형광 측정 (485/535 nm)에 기초한, 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의, 바이오필름에 대한 CFDA-표지된 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 결합 및/또는 응집의 특이적 정량.
도 2: 비결합 세포를 3회 세척한 후의, 슈도모나스 아에루기노사에 의해 형성되는 바이오필름에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911)의 특이적인 결합 및/또는 응집 (결합 검정), 그리고 본 발명에 따른 것이 아니며 슈도모나스 아에루기노사에 결합할 수 있는 추가적인 락토바실루스 균주 (락토바실루스 종 1 및 락토바실루스 종 2 및 락토바실루스 종 3)와의 비교; 형광 측정 (485/535 nm)에 기초한, 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의, 바이오필름에 대한 CFDA-표지된 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 결합 및/또는 응집의 특이적 정량.
도 3: 사진 문서화 시스템에서의 상호응집, 그리고 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 균주 별도 후의 슈도모나스 아에루기노사 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911)의 특이적인 결합의 거시적 대조.
도 4: 상호응집, 그리고 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 균주 별도 후의 슈도모나스 아에루기노사 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911)의 특이적인 결합의 미시적 대조. 현미경사진 (위상차, 배율 1000×).
도 5: 사진 문서화 시스템에서의 상호응집, 그리고 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 균주 별도 후의 스타필로코쿠스 아우레우스 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908)의 특이적인 결합의 거시적 대조.
도 6: 상호응집, 그리고 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 균주 별도 후의 스타필로코쿠스 아우레우스 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908)의 특이적인 결합의 미시적 대조. 현미경사진 (위상차, 배율 1000×).
도 7: 상호응집 검정에서의, 슈도모나스 아에루기노사 (DSM 22644), 스타필로코쿠스 에피데르미데스 (DSM 20044), 코리네박테리움 제이케이움 (DSM 7171) 및 마이크로코쿠스 루테우스 (DSM 20030)에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911)의 특이적인 응집; 표적 미생물 별도는 물론, 락토바실루스 균주 별도의 것 및 상호응집 배치의 것의 600 nm에서의 광학 밀도 측정에 의한 응집의 특이적 정량.
도 8: 상호응집 검정에서의, 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM 18587), 스타필로코쿠스 에피데르미데스 (DSM 20044), 코리네박테리움 제이케이움 (DSM 7171) 및 마이크로코쿠스 루테우스 (DSM 20030)에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908)의 특이적인 응집; 표적 미생물 별도는 물론, 락토바실루스 균주 별도의 것 및 상호응집 배치의 것의 600 nm에서의 광학 밀도 측정에 의한 응집의 특이적 정량.
도 9: 상호응집 검정에서의, 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM 18587)에 대한 트립신 처리가 있고 없는 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908)의 특이적인 응집; 표적 미생물 별도 및 락토바실루스 균주 별도의 것, 그리고 상호응집 배치의 것의 600 nm에서의 광학 밀도 측정에 의한 응집의 특이적 정량.
도 10: 상호응집 검정에서의, 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM 18587) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM 20232)에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25906 및 DSM 25907)의 특이적인 응집; 표적 미생물 별도 및 락토바실루스 균주 별도의 것, 그리고 상호응집 배치의 것의 600 nm에서의 광학 밀도 측정에 의한 응집의 특이적 정량.
도 11: PBS 중에서 세척된 락토바실루스 현탁액, 열-불활성화된 락토바실루스 현탁액 및 열-불활성화된 락토바실루스 현탁액의 상청액에 의한 6시간 배양 후의, 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해 형성되는 바이오필름에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25914 및 DSM 25915)의 바이오필름 형성 억제; 590 nm에서의 광학 밀도의 측정을 통한, 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 바이오필름의 정량.
도 12: PBS 중에서 세척된 락토바실루스 현탁액, 열-불활성화된 락토바실루스 현탁액 및 열-불활성화된 락토바실루스 현탁액의 상청액에 의한 6시간 배양 후의, 슈도모나스 아에루기노사에 의해 형성되는 바이오필름에 대한 본 발명에 따른 미생물의 대표적인 실시양태 (DSM 25912 및 DSM 25913)의 바이오필름 형성 억제; 590 nm에서의 광학 밀도의 측정을 통한, 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 바이오필름의 정량.
예시적인 실시양태의 상세한 설명
실시예 1
본 발명에 따른 미생물의 확인 및 선별을 위하여, 락토바실루스 균주 은행으로부터의 다양한 균주를, 먼저 그것을 병원성 피부 미생물 (이하 "표적 미생물"로도 지칭)에 결합하는 능력과 관련하여 스크리닝한 (결합 검정) 다음, 제1 단계에서 확인된 균주를, 쌍안 입체 현미경을 사용하여 각 표적 생물체와의 상호응집을 정성적으로 측정하는 마이크로티터 플레이트 스케일(microtiter plate scale)에서 상호응집 검정으로 시험하는, 4-단계 스크리닝 과정에 의해 시험하였다. 또한, 상호응집의 강도 및 표적 미생물에 대한 결합의 안정성은 물론, 바이오필름의 방지 능력을 조사하였는데, 궁극적으로 본 발명에 따라 확인된 예시적인 미생물 (락토바실루스)로 이어졌다.
결합 검정
선택된 락토바실루스 균주의 결합 활성을 정량할 수 있도록, 96-웰 플레이트에서 병원성 미생물에 대한 락토바실루스 균주 결합의 정량 검출을 가능케 하는 결합 검정을 설정하였다. 표적 생물체와의 락토바실루스 세포의 결합 활성은 상호응집 활성 및/또는 상호응집 능력과 상관된다. 이를 실험적으로 시험하였다. 이와 관련하여, 도 2는 락토바실루스 균주 DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911와 슈도모나스 아에루기노사 DSM 22644의 상호응집의 예를 나타내며, 도 1은 락토바실루스 균주 DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908과 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM 22644을 나타낸다.
측정 방법은 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 대한 본 발명에 따른 균주의 특이적 결합에 기초한다. 검정을 위하여, 정해진 양의 본 발명에 따른 균주를 형광 염료 (CFDA 용액, 인비트로겐(Invitrogen) 사)로 표지하고, 바이오필름에 결합되어 있는 정해진 양의 표적 생물체와 혼합하였다. 수회 세척 후, 형광 광도계를 사용하여 표적 균주에 결합된 본 발명에 따른 균주의 존속을 측정한다.
이러한 실험을 수행하기 위하여, 슈도모나스 아에루기노사의 경우 TSB (트립티카제 콩 브로스), 스타필로코쿠스 아우레우스의 경우 TSY (트립티카제 콩 효모 추출물 배지)를 사용하여 표준 방법에 따라, 표적 미생물인 슈도모나스 아에루기노사 (DSMZ 22644) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 18587)를 배양하였다.
락토바실루스 균주는 37℃의 MRS 배지에서 혐기성으로 배양하였다 (문헌 [de Man et al., 1960]).
표적 미생물의 후처리를 위하여, 초기 정상-상태 성장 단계에 도달한 후 세포를 수확하여, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척한 후, PBS 중에 위치시켰다. 다음에, 100 μL의 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 위치시켰다.
6-시간의 호기성 인큐베이션 동안, 표적 균주에 의해 바이오필름이 형성되었다. 인큐베이션 후, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척함으로써, 비결합 세포를 제거하였다.
락토바실루스 균주의 후처리를 위하여, 24시간 동안 배양한 후, 그것을 수확하여 PBS로 3회 세척하고, PBS에 위치시킨 후, CFDA 용액 (인비트로겐 사)을 첨가함으로써 형광-표지하였다.
결합 검정을 수행하기 위하여, 100 μL의 락토바실루스 현탁액을 각 웰의 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 첨가하였다. 병행하여, 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 대조 배치를 수행하였다. 인큐베이터에서 30℃로 1시간 동안 인큐베이션한 후, 비결합 세포를 PBS로 3회 분리 및 세척하였다. 각 세척 단계 후, 형광 플레이트 광도계 (Em 485 nm/Ex 535 nm)에서 형광을 측정하였다.
락토바실루스 세포가 없는 대조군과 비교하였을 때의 락토바실루스 균주를 함유하는 배치에서의 형광 (Em 485 nm/Ex 535 nm)의 증가를 바이오필름-결합 락토바실루스 세포의 양과 상관시켰다. 락토바실루스 세포의 결합 후 측정된 형광은 결합 강도에 부합하였다. 이 값이 높을수록, 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 대한 표지된 락토바실루스 세포의 결합은 더 우수하였으며, 시험된 락토바실루스 세포의 결합 활성은 더 컸다.
상기 실험은 결합 검정에서, 비결합 세포의 제거 후, 표적 생물체/표적 균주인 슈도모나스 아에루기노사 및/또는 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 바이오필름에 결합되어 있는 표지된 락토바실루스 세포의 결합으로 인하여, 시험된 락토바실루스 균주가 3회 세척 후 3 내지 17배의 형광 증가로 이어졌음을 보여주었다. 본 발명에 따른 미생물의 예시로서, 도 2는 슈도모나스 아에루기노사와의 락토바실루스 DSM 25909, DSM 25910 및 DSM 25911의 결합 검정 결과를 나타내며, 도 1은 스타필로코쿠스 아우레우스와의 락토바실루스 DSM 25906, DSM 25907 및 DSM 25908의 결합 검정 결과를 나타낸다. 또한, 비교 목적으로, 도 1 및 2는 또한 본 발명에 따르지 않는 것으로써 표적 생물체에 특이적으로 결합할 수 없는 락토바실루스 균주 (락토바실루스 종 1 및 2)에 대한 데이터도 보여준다.
실시예 2
상호응집 검정
0.8 mL의 부피 및/또는 24-웰 플레이트에서의 하기 검사를 사용하여, 선택된 락토바실루스 균주의 상호응집 활성을 예시한다.
본 방법에서는, 락토바실루스 및 표적 균주의 상호응집 거동을 별도로 고찰하며, 최종적으로 혼합물 중에서 서로 접촉되는 락토바실루스와 표적 균주의 상호응집을 고찰한다. 이와 같은 분석은 24-웰 플레이트의 사진을 사용하여 거시적으로 수행함은 물론, 미시적으로도 수행하였다.
이러한 시험을 수행하기 위하여, 표적 미생물인 슈도모나스 아에루기노사 (DSMZ 22644) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 18587)를 슈도모나스 아에루기노사의 경우 TSB (트립티카제 콩 브로스), 그리고 TSY (트립티카제 콩 효모 추출물 배지)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 배양하였다.
락토바실루스 균주는 37℃의 MRS 배지에서 혐기성으로 배양하였다 (문헌 [de Man et al., 1960]).
표적 미생물의 후처리를 위하여, 16시간 후에 세포를 수확하고, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척한 후, OD600=4로 조정하였다.
락토바실루스 균주의 후처리를 위하여, 16시간 후에 그것을 수확하고, PBS로 2회 세척한 다음, 일정 부피의 PBS에 위치시키고, OD600=8로 적절히 조정하였다.
상호응집 검정을 수행하기 위하여, 24-웰 플레이트에서, 400 μL의 락토바실루스 현탁액과 함께 표지된 표적 미생물의 400 μL 현탁액을 각 웰에 위치시켰다. 400 μL의 각 표적 생물체 더하기 400 μL의 PBS (대조군 1), 또는 400 μL의 각 락토바실루스 현탁액 더하기 400 μL의 PBS (대조군 2)를 포함하는 대조 배치를 병행 제조하였다. 데스크탑 교반기에서 25℃로 30분 동안 인큐베이션한 후, 사진 문서화 시스템을 이용하여 거시적으로는 물론, 각 웰의 중심으로부터 현미경 슬라이드로 3 μL를 옮김으로써 미시적으로 배치를 관찰하였다.
상호응집의 정량을 위하여, 원심분리 (10초, 300 g)에 의해 생성되는 응집체를 분리하였다. 다음에, 100 μL의 상청액을 96-웰 편평저 플레이트로 옮기고, 플레이트 광도계에서 600 nm로 광학 밀도를 측정하였다.
상호응집 활성의 백분율 계산에는 하기의 수학식을 사용하였다:
<수학식>
Figure 112013110498326-pct00001
%상호응집 활성의 계산에는 표적 미생물의 광학 밀도는 물론, 락토바실루스 균주의 것 및 상호응집 배치의 것을 사용하였다.
실험은 상호응집에서 선택된 락토바실루스 균주가 표적 미생물/표적 균주인 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대하여 혼합물 중 덩어리 (응집체)를 초래하며, 웰 내의 어두운 영역으로 인하여 이러한 응집체가 거시적으로 눈에 보인다는 것을 보여주었다. 표적 균주 및/또는 본 발명에 따른 락토바실루스 균주를 별도로 함유하는 웰에서는 응집체가 형성되지 않는다. 이는 웰 내에 형성되는 어두운 영역의 부재로 인하여 눈에 보인다. 도 5는 표적 미생물/표적 균주인 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 선택된 락토바실루스 균주의 상호응집 배치에서의 거시적 결과를 나타내며, 도 3은 표적 균주인 슈도모나스 아에루기노사에 대한 결과를 나타낸다. 미시적 관찰에서는, 본 발명에 따른 모든 락토바실루스 균주의 미시적 관찰에서, 상호응집의 미시적 고찰에서의 상이한 응집 크기로 이어지는 각 표적 균주에 대한 명백한 친화성이 발견된다. 도 4는 도 6의 표적 미생물/표적 균주인 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 선택된 락토바실루스 균주의 상호응집 배치에서의 미시적 결과를 나타낸다.
실시예 3
또한, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주, 및 표적 미생물에의 그의 응집 특성에 대한 프로테아제의 영향을 보여주기 위한 실험을 수행하였다.
이에 따라, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 균주를 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 처리하였다.
본 발명에 따른 락토바실루스 균주를 프로테아제 (여기에서 프로테아제의 예로 나타내는 것은 트립신임)로 처리하였다. 락토바실루스 균주를 처리한 후, 그것을 37℃에서 60분 동안 트립신으로 처리하였다 (12.4 단위/mg, 시그마(Sigma) 사). 다음에, 세포를 다시 PBS로 2회 세척하고, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 응집 특성을 정량하였다.
이러한 실험은 프로테아제를 사용한 처리 후, 표적 미생물의 상호응집 검정에서, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주가 표적 미생물/표적 균주인 슈도모나스 아에루기노사 및/또는 스타필로코쿠스 아우레우스에 대하여 50-76% 응집을 가진다는 것을 보여주었다. 본 발명에 따른 미생물의 예로써, 도 9는 스타필로코쿠스 아우레우스와의 트립신 처리가 있고 없는 락토바실루스 DSM 25906, DSM 25907 및 DSM 25908의 상호응집 검정의 결과를 나타낸다.
실시예 4
표적 미생물에 대한 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 응집 특성의 특이성을 보여주기 위하여, 추가적인 공생 피부 미생물을 사용하여 실험을 수행하였다. 스타필로코쿠스 에피데르미데스 (DSM 20044), 코리네박테리움 제이케이움 (DSM 7171) 및 마이크로코쿠스 루테우스 (DSM 20030)를 선택하였다. 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 미생물을 배양하고, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 후처리하였다.
이러한 시험을 수행하기 위하여, 시험될 모든 표적 미생물, 즉 슈도모나스 아에루기노사 (DSMZ 22644), 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 18587), 스타필로코쿠스 에피데르미데스 (DSM 20044), 코리네박테리움 제이케이움 (DSM 7171) 및 마이크로코쿠스 루테우스 (DSM 20030)를, 슈도모나스 아에루기노사의 경우 TSB (트립티카제 콩 브로스)를 사용하여, 그리고 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 18587), 스타필로코쿠스 에피데르미데스 (DSM 20044), 코리네박테리움 제이케이움 (DSM 7171) 및 마이크로코쿠스 루테우스 (DSM 20030)의 경우 TSY (트립티카제 콩 효모 추출물 배지)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 배양하였다.
실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 표적 균주 및 C 응집 검정을 수행하였다.
실험은 본 발명에 따른 락토바실루스 균주에 의한 조사된 추가적인 표적 균주와의 응집은 없으며, 대신 이들은 매우 특이적인 특성이었음을 보여주었다. 도 8은 본 발명에 따른 미생물에 있어서의 스타필로코쿠스 아우레우스와의 락토바실루스 DSM 25906, DSM 25907 및 DSM 25908의 상호응집 검정의 결과를 나타내며, 도 7은 슈도모나스 아에루기노사와의 락토바실루스 DSM 25909, DSM 25910 및 DSM 25911의 결과를 나타낸다.
실시예 5
또한, 동일한 속 및 종의 표적 미생물에 대한 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 결합 특성 및/또는 응집 특성의 특이성을 확인하기 위하여, 피부 미생물 중 동일한 속 및 종의 다른 미생물을 사용하여 시험을 수행하였다. 이와 같은 목적으로, 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 20232)를 선택하여, 표적 미생물과의 시험에 의해 그의 응집 특성을 명시하였다.
그에 따라, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 표적 미생물을 배양하고, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 후처리하였다.
이러한 시험을 수행하기 위하여, 조사될 모든 표적 미생물, 즉 본 실시예에서는 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 18587) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSMZ 20232)를 TSY (트립티카제 콩 효모 추출물 배지)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 배양하였다.
표적 균주를 처리하고, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 상호응집 검정을 수행하였다.
이러한 실험은 동일한 속 및 종의 다른 미생물 역시 본 발명에 따른 락토바실루스 균주로 인한 결합 및/또는 응집을 할 수 있다는 것을 보여주었다. 도 10은 본 발명에 따른 미생물의 예로 사용되는 락토바실루스 DSM 25906 및 DSM 25907의 스타필로코쿠스 아우레우스 DSMZ 18587 및 DSMZ 20232와의 상호응집 검정의 결과를 보여준다.
실시예 6
바이오필름의 억제
본 발명에 따른 미생물의 확인 및 선별을 위하여, 마이크로티터 플레이트 스케일에서의 스크리닝 방법으로 락토바실루스 데이터은행으로부터의 다양한 균주를 시험하였다. 스크리닝의 목적은 바이오필름의 형성을 방지함에 있어서의 병원성 피부 미생물 (이하 "표적 미생물"로도 지칭)에 대한 특성을 확인하는 것이었다. 바이오필름-방지 특성의 강도를 표적 미생물의 영향을 받지 않는 바이오필름 형성과 정량적으로 관련시키고 분석하여, 궁극적으로 확인된 본 발명에 따른 미생물 (락토바실루스)로 연결시켰다.
병원성 표적 미생물인 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM 18587) 또는 슈도모나스 아에루기노사 (DSM 22644)에 의한 바이오필름의 형성에 대한 그의 효과를 조사하기 위하여, 락토바실루스 균주 및/또는 그의 분획을 바이오필름 형성 개시시에 직접 표적 미생물에 첨가하고, 6시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 세포를 제거하고 바이오필름을 PBS로 2회 세척한 후, 전체 배치의 크리스탈 바이올렛 염색 후에 광학 밀도를 측정하는 것에 의해, 바이오필름을 정량하였다.
이러한 시험을 수행하기 위하여, 표적 균주를 상기에 추가 기술되어 있는 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 배양하고, 락토바실루스 균주를 MRS 배지에서 혐기성으로 배양하였다.
락토바실루스 균주의 후처리를 위해서는, 배양 후 그것을 PBS로 2회 세척한 다음, PBS 중에 위치시켰다.
락토바실루스 균주 중 일부를 PBS로 세척한 후 70℃에서 30분 동안 저온살균함으로써 열-불활성화시켰다.
또한, 열-불활성화된 락토바실루스 균주 중 일부를 사용하여 PBS로 세척한 후 상청액을 수득하였다. 현탁액의 원심분리에 의해 이를 수행한 다음, 상청액을 사용하였다.
표적 균주의 후처리를 위해서는, 평균 지수 성장 단계에 도달할 때까지 그것을 배양하여 수확한 다음, OD600nm( mL -1)=3.5로 조정하고, PBS로 2회 세척한 후, PBS 중에 위치시켰다.
바이오필름 형성 검정을 수행하기 위하여, 락토바실루스 균주를 바이오필름 형성 개시시에 직접 표적 미생물에 첨가하고, 37℃에서 6시간 동안 혐기성으로 인큐베이션하였다. 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 대조 배치를 병행하여 수행하였다. 플랑크톤성 세포를 제거하고 바이오필름을 세척한 후, 락토바실루스 및/또는 락토바실루스 분획이 있거나 없는 결합된 표적 미생물의 크리스탈 바이올렛 염색 (0.1 %, 머크(Merck) 사)에 의해 바이오필름을 정량하였다. 이를 수행하기 위하여, 크리스탈 바이올렛 염색 후 각 배치의 결합된 세포를 아세트산을 이용하여 용해시킨 다음, 현탁액 중에 위치시키고, 590 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 락토바실루스가 없는 표적 미생물의 대조군과 비교하였을 때의 590 nm에서의 광학 밀도의 감소를 바이오필름 저해의 강도와 상관시켰다. 이와 같은 감소는 락토바실루스가 없는 표적 미생물과 관련된 바이오필름 형성의 %억제로 나타내었다. 본 발명에 따른 예시적인 미생물로서, 도 11은 락토바실루스 DSM 25914 및 DSM 25915에 의한 스타필로코쿠스 아우레우스의 바이오필름 억제의 결과를 나타내고, 도 12는 DSM 25912 및 DSM 25913에 의한 슈도모나스 아에루기노사의 바이오필름 억제의 결과를 나타낸다. 실험은 그것이 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 락토바실루스 균주 및/또는 그의 분획의 대사 활성 불활성화가 존재 및 부재하는 본 발명에 따른 락토바실루스 균주에 의한 바이오필름 형성의 56-93% 억제로 이어진다는 것을 보여주었다.
이러한 실험 및 실시예는 바람직한 미생물의 선택만을 보인 것으로써, 모든 바람직한 미생물에 대하여 공통적인 유리한 특성을 실험적으로 확인한 것이다. 업계 숙련자라면, 상기 실시예 및 도면으로부터, 어떻게 본 발명의 재현, 예를 들면 바람직한 미생물의 공유되는 유리한 특성의 재현을 진행하는지에 대해 알게 될 것이다.
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Figure 112013110498326-pct00002
독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25906 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25907 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25908 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25909 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25910 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25911 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25912 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25913 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25914 20120418 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25915 20120418

Claims (32)

  1. 독일 미생물 및 세포 배양 협회(German Collection for Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되어 있으며 DSM 25906, DSM 25907, DSM 25908, DSM 25909, DSM 25910, DSM 25911, DSM 25912, DSM 25913, DSM 25914 또는 DSMZ 25915의 번호를 보유하는 미생물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 미생물 또는 그의 세포 용해물이며, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 병원성 미생물과 상호응집될 수 있는 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  2. 제1항에 있어서, 1종 이상의 병원성 미생물과의 상호응집 능력이 생물학적, 화학적 또는 물리적 사멸 후에도 존재하는 것인 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 병원성 미생물과의 상호응집 능력이 pH 3 내지 8에서 존재하는 것인 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 병원성 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는 능력을 가진 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는, 스타필로코쿠스-열상 피부 증후군, 접촉전염 농가진, 표재성 모낭염, 농가진화, 피부 농양, 종기, 농양, 연조직염, 건성 피부, 소양성 피부, 극지성 피부, 여드름, 당뇨족, 욕창성 궤양, 신경피부염, 급성 림프절염, 모소낭, 모소 누공, 모소동, 꼬리뼈 누공, 꼬리뼈낭, 피부 및 피하 조직의 국부 감염, 농피증, 화농성 피부염, 패혈성 피부염, 화농 피부염, 피부염, 습진, 아토피성 습진, 지루성 습진, 기저귀 발진, 알레르기성 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈성 피부염, 독성 접촉성 피부염, 만성 단순 태선, 양진, 소양증, 구진비늘 피부 질환, 건선, 반흔성 탈모증, 탈모성 모낭염, 다리 궤양 및 딱지로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 질환의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  6. 제1항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는 화장용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는 군에서 선택된 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 화장품용으로 허용되는 비히클 또는 부형제 또는 피부과용으로 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는 군에서 선택된 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 에어로졸 스프레이, 펌프 스프레이, 크림, 분산액, 에멀젼, 폼, 연고, 스프레이, 에어로졸, 분말, 스틱, 타월, 로션, 현탁액, 용액 또는 겔의 형태이거나 기재상에 존재하는 것인 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 피부 크림, 피부 세척 로션 또는 피부 연고의 형태인 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 고체, 액체, 또는 점성 형태이거나 에어로졸로 존재하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 피부 크림, 피부 세척 로션 또는 피부 연고가 고체, 액체 또는 점성 형태이거나 에어로졸로 존재하는 것인 조성물.
  13. 제5항에 있어서, 프로바이오틱스(probiotics) 또는 방부제를 포함하는 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는. 스타필로코쿠스-열상 피부 증후군, 접촉전염 농가진, 표재성 모낭염, 농가진화, 피부 농양, 종기, 농양, 연조직염, 건성 피부, 소양성 피부, 극지성 피부, 여드름, 당뇨족, 욕창성 궤양, 신경피부염, 급성 림프절염, 모소낭, 모소 누공, 모소동, 꼬리뼈 누공, 꼬리뼈낭, 피부 및 피하 조직의 국부 감염, 농피증, 화농성 피부염, 패혈성 피부염, 화농 피부염, 피부염, 습진, 아토피성 습진, 지루성 습진, 기저귀 발진, 알레르기성 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈성 피부염, 독성 접촉성 피부염, 만성 단순 태선, 양진, 소양증, 구진비늘 피부 질환, 건선, 반흔성 탈모증, 탈모성 모낭염, 다리 궤양 및 딱지로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 질환의 치료 또는 예방용 수의학적 조성물.
  15. 제5항에 있어서,
    a. 유비퀴논 Q10, 크레아틴, 크레아티닌, 카르니틴, 비오틴, 이소플라본, 카르디올리핀, 리포산, 동결방지 단백질, 아르크티인(arctiin), 홉 또는 홉-맥아 추출물,
    b. 결합 조직을 재구성하기 위한 촉진제,
    c. 비타민 C, 비오틴, 카르니틴, 크레아틴, 프로피온산, 녹차 추출물, 유칼립투스 오일, 우레아, 무기 염, 해양 무기질 및 삼투질로부터 선택되는 건성 피부상에서 피부 기능을 지원하기 위한 활성 성분,
    d. 세리코시드, 감초 추출물, 리코찰콘(licochalcone), 실리마린, 실리포스 또는 덱스판테놀
    의 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제5항에 있어서, 미생물이 조성물 중에 불활성화, 생존 또는 비생존 형태로 존재하는 것인 조성물.
  17. 제5항에 있어서, 미생물 또는 그의 세포 용해물이 캡슐화, 분무-건조 또는 동결건조 형태로 존재하는 것인 조성물.
  18. 제5항에 있어서, 미생물 또는 그의 세포 용해물이 0.001 중량% 내지 10 중량%의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하고, 상처 감염의 국소 치료 및 만성 상처의 치유 촉진에 특이적인 효과를 가지는 항미생물 첨가제 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는, 표면 처리용 세정제.
  21. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하고, 빌더(builder) 물질, 표면-활성 계면활성제, 효소, 유기 또는 무기 과산소 화합물, 과산소 활성화제, 수-혼화성 유기 용매, 격리제(sequestration agent), 전해질, pH 조절제, 증점제, 방오 활성 성분, 광학 증백제, 노화 억제제, 염료 전달 억제제, 폼 조절제 또는 착색제를 추가로 함유하는 세탁용 세제.
  22. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물, 및 신체 위생 장치 또는 장비, 린스 또는 페이스트를 포함하는 위생 처리용 키트.
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