KR102441226B1 - 혼합 프로바이오틱스 발효물을 포함하는 피부 마이크로바이옴 개선용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혼합 프로바이오틱스 발효물을 포함하는 피부 마이크로바이옴 개선용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 통한 피부 마이크로바이옴 개선능, 독성지표인 LDH (Lactate dehydrogenase), 염증지표인 IL-8의 발현을 저감능 및 보습지표인 히알루로난 (hyaluronan) 함유량 개선능이 있고, 이를 통해 피부염증 질환 개선 및 보습 효과를 제공할 수 있다.

Description

혼합 프로바이오틱스 발효물을 포함하는 피부 마이크로바이옴 개선용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물 {A COMPOSITION FOR SKIN MICROBIOME COMPRISING MIXED PROBIOTICS FERMENTATION PRODUCT AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

피부 마이크로바이옴 개선용 혼합 프로바이오틱스 발효물을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 '장내 균총을 개선시켜 줌으로써 숙주동물에게 유익한 영향을 주는 생균제제'라고 Fuller가 1989년 정의한 것을 시작으로 2001년에 발표된 '충분한 양을 섭취하였을 때 숙주의 건강에 도움이 되는 살아있는 미생물'이라는 FAO/WHO 정의가 널리 사용되고 있다. 이에 더하여 1999년 Salminen 등은 '숙주에 유익한 작용을 갖는 미생물 제제 또는 미생물의 성분'으로 정의하여 생균에서부터 사균으로까지 프로바이오틱스의 범위를 확대시킨 해석도 있다. 프로바이오틱스를 포함한 인간의 장내 미생물이 인간의 건강에 중요한 영향을 미친다는 연구결과 및 과학적 자료가 증가함에 따라 프로바이오틱스에 대한 소비자들의 인식이 더욱 확대되었으며, 그에 따라 프로바이오틱스 제품의 수요가 점차 증가하고 있다. 현재 식약처에서 등재한 락토바실러스(Lactobacillus) 11종(L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbruekii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius)과 락토코커스(Lactococcus) 1종(Lc. lactis), 엔테로코커스(Enterococcus) 2종(E. faecium, E. faecalis), 스트렙토코커스(Streptococcus) 1종(S. thermophilus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 4종(B. bifidum, B. breve, B. longum, B. animalis subsp. lactis)까지 19종의 균주에 대하여 프로바이오틱스로 고시하였고 많은 기업체들이 프로바이오틱스에 대한 연구 및 제품을 판매하고 있다.

여드름은 주로 피부의 얼굴, 가슴, 목, 어깨 등에 발생하는 모낭 피지선의 염증질환으로 면포, 구진, 농포 및 결절을 형성하고 심하면 반흔을 남기며 주로 청소년들에게 발생 되나, 최근에는 나이에 관계없이 연령층이 넓어 지고 있는 실정이다. 여드름의 발생원인은 유전적 원인, 피로와 스트레스 등 복합적으로 발생하는 것으로 알려 져 있다 일반적으로 피지 분비의 증가, 피지선의 기능이 항진되어 생성된 과잉의 피지가 모낭벽의 과각화로 인 하여 모낭 내에 정체된 피지는 모낭을 막아 공기순환을 차단하게 되어 모낭 내부에 상주하는 Propionibacterium acnes균이 잘 자라는 환경이 되어 증식 및 염증 등을 유발하는 것이다.

피부 상재균 중 피부에 염증을 유발하는 세균으로 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogens 등이 있으며, 여드름 원인균으로 Propionibacterium. acnes이 잘 알려져 있다. P. acnes는 모낭내에 존재하는 그람양성의 혐기성 세균으로 비운동성이며, 여드름의 염증이나 염증 후의 면포에 관여한다고 여겨지나 여드름은 모창 등의 모낭염이나 농가진 등의 세균감염증과는 다르다. 그러나 여드름의 병인으로서 P. acnes의 역할은 대단히 중요하다. 사춘기 때 성호르몬 분비 시 피지선(sebaceous gland)과 피지 (sebum)에서 과다한 지방 분비 영향을 받아 모낭과 피지선에 혐기성 P. acnes 균이 침입하여 혐기성 조건이 갖추어졌을 때 균이 증식하면서 여드름이 형성된다. S. epidermidis (표피포도상구균) 은 포도상구균속의 세균으로 코아귤라제(coagulase) 생산, 만니톨(mannitol)을 분해하지 못하는 특성이 있으며, 이들 성상이 병원성 황색포 도상구균(S. aureus)과 다르며, 인축의 피부, 점막 등에 농을 유발하거나 저항성이 저하된 동물에 심내막염이나 패혈증을 일으킬 수도 있다.

피지선의 비정상적인 각질화에 의해 피지의 생성이 증가되면 P. acnes균이 colony를 형성하게 하고, P. acnes균 은 지방분해효소 등을 분비하여 자유지방산을 만들고 백혈구가 모낭주위에 모이게 하며, 이들이 모낭 벽을 자극 하고 파괴하여 모낭 내용물이 진피내로 유출되고 염증을 유발하게 한다. 한편 S. epidermidis 같은 호기성 균주 들은 염증의 원인이 되지는 않지만 염증이 생긴 후 2차 요인으로 작용하여 여드름 발생을 더 악화시킨다.

여드름 치료에는 과잉의 피지생성억제, 모낭벽의 과각화억제, P. acnes균 증식 및 염증을 억제하여야 한다. 여드름 치료에는 증상이 경미할 경우 국소도포요법과 증상이 심할 경우, 국소도포요법과 경구요법을 병행하여 치료하는 것이 효과적이다. 주로 치료에 사용하는 항생제로서 benzol peroxide, azelaic acid, resorcinol, salicylic acid, erythromycin 등이 있지만 이들 항생제는 구순염, 점막 건조감, 최기형성작용, 기미, 혈전증, 항생제 내성 균주의 출현, 치료를 중단할 때 쉽게 재발되는 부작용이 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 피부 염증개선 효과가 우수한 프로바이오틱스를 찾기 위해 지속적인 연구를 한 결과, 락토바실러스 락티스 HY449 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주들의 배양 혼합물이 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 통한 피부염증 저감 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR10-2020-0062441A1 (2020.06.04)

본 발명은 락토바실러스 락티스 HY449 (Lactococcus lactis HY449, 수탁번호 : KFCC-10842) 균주 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 (Lactobacillus helveticus HY7801, 수탁번호 : KCTC 11315BP) 균주들의 배양 혼합물을 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부염증 질환 저감용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 혼합 프로바이오틱스 발효물을 포함하는 피부 마이크로바이옴 개선용 조성물로서 락토바실러스 락티스 HY449 (Lactococcus lactis HY449, 수탁번호 : KFCC-10842) 균주 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 (Lactobacillus helveticus HY7801, 수탁번호 : KCTC 11315BP) 균주들의 배양 혼합물을 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 배양 혼합물이란, 하나의 발효조에서 균을 혼합하고 배양하여 얻은 배양물뿐만 아니라, 각각의 균주들을 별도로 배양하여 얻은 배양물들을 혼합한 것도 포함한다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하며, 상기 배양액은 특정 균주들을 포함하는 것을 의미하고, 상기 배양 여과액은 특정 균주들을 실질적으로(여기서, 실질적으로는 여과등에 의해 분리되는 특정 균주들을 배제한다는 것을 의미하는 것으로서 여과액에 균주들이 완전히 배제된다는 것을 의미하지는 않는다.) 포함하지 않는 것을 의미한다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.

본 발명에 따른 균주를 배양하기 위한 배지의 종류로는 크게 제한되지 않으며, 선택된 혼합 균에 최적인 공지의 배지를 사용할 수 있다. 구체적으로 MRS 배지, TGY 배지, BHI 배지, M17 배지 등이 있다. 또한 배지의 pH 는 선택된 균주들에 양립될 수 있는 범위라면 크게 제한되지 않으며, 일 예로 약 4.5~7.0이다. 본 발명에 따른 균주들을 배양하기 위한 배양 온도 또한, 선택된 균주들에 양립할 수 있는 범위라면, 크게 제한되지 않으며, 일 예로 약 25~45℃이다.

본 발명에 있어서, "개선"이란 치료, 예방 또는 증상의 경감을 의미하고, 구체적으로는 피부염증 질환의 치료, 예방 또는 증상의 경감을 의미한다.

본 발명에 있어서, "피부염증 질환"이란 염증 반응이 직접, 또는 간접적 원인이 되어 발생하는 피부 질환으로서, 여드름, 아토피 피부염을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, "여드름"이란 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 뿐만 아니라 다른 여드름 원인균에 의해 생성된 물질들의 자극에 의해 발생한 염증 반응과 직접 또는 간접적으로 관련된 여드름을 모두 포함한다. 또한, 통상의 아토피 피부염은 그 발병 시기 또는 그 발명 대상에 따라 유아형 아토피 피부염과 소아형 아토피 피부염과 성인형 아토피 피부염 그리고 임산부 아토피 피부염으로 분류되는데, 본 발명에 있어서, "아토피 피부염"이란 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 뿐만 아니라 다른 아토피 원인균에 의한 염증 반응뿐만 아니라, 염증 반응과 직접 또는 간접적으로 관련된 것이라면, 이러한 모든 유형의 아토피 피부염을 포함한다.

본 발명에 있어서, "Propionibacterium acnes" 는 비교적 느리게 성장하는, 전형적인 aerotolerant anaerobic 그람 양성세균으로 여드름의 피부 상태와 관련이 있다. 대부분 공생하고 가장 건강한 성인 인간의 피부에 존재하는 피부 미생물상의 일부이다. 보통 건강한 유아기의 피부에서는 거의 검출되지 않는다. 처음 발견당 시 Bacillus acnes로 명명되었으나, propionic acid를 생성하는 능력으로 인해 Propionibacterium acnes로 명명되었다. 2016년 P. acnes는 생화학적 및 게놈 연구의 결과로 분류학적으로 재분류되어 피부 종을 위해 새로운 속 Cutibacterium속이 만들어 지면서 Cutibacterium acnes로 최종 명명 되었다.

상기 락토바실러스 락티스 HY449 균주는 유제품에서 분리하여 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) HY449로 명명된 것으로, 한국 종균협회에 HY49의 이름으로 1994년 9월 2일자로 기탁되었다 (기탁번호 제KFCC-10842호).

또한, 상기 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주는 건강한 한국인 성인 및 신생아의 분변에서 분리하여 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 명명된 것으로, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 4월 17일자로 기탁되었다 (기탁번호: KCTC 11315BP).

본 발명의 일 예시로 상기 배양 혼합물은 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물을 1:0.5 내지 1:2, 구체적으로는 1:0.7 내지 1:1.3, 더욱 구체적으로는 1:1의 혼합 비율로 포함할 수 있다. 상기 배양물의 비율범위 외의 경우 본 발명의 조성물의 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능, 염증 저감능 및 보습 개선 효과를 얻을 수 없다.

그리고 상기 배양 혼합물은 20 Brix 의 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 20 Brix 의 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물이 혼합된 것으로, 이러한 배양 혼합물은 20 내지 80 ul/ml, 구체적으로는 25 내지 50 ul/ml 농도로 포함된 것이다. 상기 배양 혼합물이 상기 범위 외로 포함될 경우 본 발명의 조성물의 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능, 염증 저감능 및 보습 개선 효과를 얻을 수 없거나, 높은 배양물 농도로 피부에 자극을 줄 수 있다.

상기 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 가질 수 있다. 구체적으로 상기 조성물은 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물을 혼합 사용함으로써 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물 개별적으로 이용하였을 때 보다, 우수한 P. acnes 및 S. aureus 항균능을 나타낸다.

그리고, 상기 조성물은 독성지표인 LDH(Lactate dehydrogenase) 저감능, 염증지표인 IL-8의 발현을 저감능 및 보습지표인 히알루로난(hyaluronan) 함유량 개선능 중 어느 하나 이상을 가지는 것일 수 있고, 구체적으로는 독성지표인 LDH (Lactate dehydrogenase), 염증지표인 IL-8의 발현을 저감시키고, 보습지표인 히알루로난(hyaluronan) 함유량을 개선시킬 수 있다. 상기 조성물은 전술한 작용을 통해 피부염증 질환 개선 및 보습 효과를 나타낼 수 있다 (실험예 5 내지 7, 도8 내지 13).

본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 상기 균주들을 배양하여 얻은 배양 혼합물 그 자체로도 구성될 수 있으나, 구체적으로는 보관 안정성, 제형으로의 가공성, 제품에서의 다른 성분과의 양립성 등을 향상시키기 위해 다양한 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다. 사용되는 보조 첨가제는 그 기능에 따라, 계면활성제, 증강제, 점도 조절제, 착색제, 향미료 등 그 종류가 다양하며, 구체적으로 글리세린(Glycerin), 캐스터 오일(Caster oil), 글리신 (Glycine), 트윈(Tween), 덱스트린(Dextrin), 유기산(예를 들어, 락트산, 타르타르산, 아딥산, 숙신산, 시트르산, 아스코르브산, 글리콜산, 말산, 만델산, 아세트산, 소르브산, 벤조산, 및 살리실산), 항균 효소, 당, 당 알코올, 구아 검, 셀룰로오스 검, 실리콘 소포제, 인공 감미료 등이 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 액상 형태, 고형의 분말 형태, 또는 에멀젼 형태로 존재할 수 있으며, 보관 안정성 및 취급의 용이성을 고려할 때 에멀젼 형태인 것이 바람직하다. 분말 형태의 피부 개선용 조성물의 제조방법은 일 예로 균주들을 배양하여 얻은 배양 혼합물에 완충제(Buffering agent)로 글리신(Glycine)을 소량 첨가하여 용해시키고, 농축한 후 분무건조기(Spray dryer) 또는 동결건조기로 건조하는 방법일 수 있다. 액상 형태의 피부 개선용 조성물의 제조방법은 일 예로 균주들을 배양하여 얻은 배양 혼합물에 글리세린(Glycerin), 덱스트린(Dextrin)을 소량 첨가하고 용해시킨 후 젖산(Lactic acid)으로 pH를 5.0으로 조정하는 방법일 수 있다. 에멀젼 형태의 피부 개선용 조성물의 제조방법은 일 예로 균주들을 배양하여 얻은 배양 혼합물에 유상 매질 및 유화 안정제를 첨가하고 전단력을 가하여 에멀젼화시키는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

본 발명의 피부 개선용 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 통한 피부 마이크로바이옴 개선능, 독성지표인 LDH (Lactate dehydrogenase), 염증지표인 IL-8의 발현을 저감 효과 및 보습지표인 히알루로난(hyaluronan) 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 피부염증 질환 개선 및 보습 효과를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부염증 질환 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 피부염증 질환 개선용 화장료 조성물은 상기 조성물을 포함하여 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능, 독성지표인 LDH (Lactate dehydrogenase), 염증지표인 IL-8의 발현을 저감 효과 및 보습지표인 히알루로난(hyaluronan) 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 피부염증 질환 개선 및 보습 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 피부 염증질환 개선용 화장료 조성물에서 피부 개선용 조성물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~20 중량%, 바람직하게는 0.1~10 중량%이다. 상기 범위 이외의 경우 피부 염증질환 개선 효과가 없거나 오히려 피부 염증을 야기할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분인 피부 개선용 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 이러한 성분들로는 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데 이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 오일, 식물성 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 피부 개선용 조성물 및 이를 포함한 화장료 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 통한 피부 마이크로바이옴 개선능, 독성지표인 LDH (Lactate dehydrogenase), 염증지표인 IL-8의 발현을 저감능 및 보습지표인 히알루로난(hyaluronan) 함유량 개선능이 있고, 이를 통해 피부염증 질환 개선 및 보습 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 실험예 1-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 다양한 균주 배양물의 S. aureus 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05)
도 2는 실험예 1-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 다양한 균주 배양물의 P. acnes 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05).
도 3은 실험예 2-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 락토바실러스 락티스 HY449 (Lactococcus lactis HY449) 균주 배양물, 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 (Lactobacillus helveticus HY7801) 균주 배양물 및 이들의 배양 혼합물의 S. aureus 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05).
도 4는 실험예 2-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 락토바실러스 락티스 HY449 (Lactococcus lactis HY449) 균주 배양물, 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 (Lactobacillus helveticus HY7801) 균주 배양물 및 이들의 배양 혼합물의 P. acnes 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05).
도 5는 실험예 3-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 본 발명의 피부 개선 조성물의 농도 별 S. aureus 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05).
도 6는 실험예 3-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 본 발명의 피부 개선 조성물의 농도 별 P. acnes 항균 효과 수준을 확인한 결과이다 (* P<0.05).
도 7은 실험예 4에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 대조군(Con)과 본 발명의 배양 혼합물 처리군 (배양 혼합물의 농도 별) 세포 생존율을 확인한 결과이다 (* P <0.05).
도 8은 실험예 5-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 음성 대조군(Con), S. aureus만이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 S. aureus 와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 LDH(Lactate dehydrogenase) 분비량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).
도 9는 실험예 5-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 음성 대조군(Con), P. acnes 이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 P. acnes 와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 LDH(Lactate dehydrogenase) 분비량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).
도 10은 실험예 6-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서 음성 대조군(Con), S. aureus만이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 S. aureus 와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 IL-8 발현량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).
도 11은 실험예 6-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 음성 대조군(Con), P. acnes 이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 P. acnes 와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 IL-8 발현량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).
도 12은 실험예 7-1에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 음성 대조군(Con), S. aureus만이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 S. aureus 와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 히알루로난(hyaluronan) 단백질 함량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).
도 13은 실험예 7-2에 따른 결과를 나타내는 그래프로서, 음성 대조군(Con), P. acnes만이 처리된 양성 대조군 (Vehicle) 및 P. acnes와 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 세포(HY7801+HY449 complex)의 히알루로난(hyaluronan) 단백질 함량을 확인한 결과이다 (*, # P <0.05).

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 다양한 균주 배양물의 S. aureus 및 P. acnes 항균 효과 수준 확인

1-1. 다양한 균주 배양물의 S. aureus 항균 효과 수준 확인

다양한 균주 배양물의 준비

10가지 균주 중 HY2782, HY7601, HY7715, HY7717, HY7801, HP7, KY1032, HY449를 1L의 MRS 액체배지에 HY8002, HY8004를 BL 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 1L Filter System (0.45㎛ CA)을 통해 균주 배양물을 1차로 제조하고, 그 1차 제조물을 Rotary Evaporator를 통해 농축을 진행하여, 20 Brix의 각각의 배양물을 최종적으로 제조하였다.

Lactic acid 및 Vancomycin 의 준비

Lactic acid 는 L-(+)-Lactic acid (Sigma, L1750)를 멸균된 증류수(Sterile distilled water)에 용해하여 pH 4의 기준으로 Lactic acid 용액을 제조하였다.

그리고, Vancomycin은 Vancomycin supplement (Oxoid, SR0247E)를 멸균된 증류수(Sterile distilled water)에 용해하여 1 mg/㎖의 농도로 Vancomycin 용액을 제조하였다.

S. aureus 의 준비

S. aureus 는 ATCC (American Type Culture Collection) 에서 Staphylococcus aureus ATCC 6538 분양받았다. 분양 받은 S. aureus의 16sRNA 정보는 아래 표 1과 같다.

Description	Max score	Total score	Query cover	Per. identity	Accession
Staphylococcus aureus strain S33 R	2730	2730	99%	99.80%	NR_037007
Staphylococcus aureus strain ATCC 12600	2730	5455	99%	99.73%	NR_118997

분양 받은 S. aureus는 Nutrient Broth (MBcell, MB-N1037) 액체 배지에 접종하여 진탕배양기에서 37℃, 24시간 배양하였다. (1x10⁹ cfu/㎖).

S. aureus 항균 효과 수준 확인

1.5ml Microtube에 실험군으로 1x10⁹ cfu/㎖ 의 S. aureus에 상기 10종의 프로바이오틱스 배양물을 100㎕/㎖ 의 농도로 처리 하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였고, 양성대조군으로 Lactic acid (100㎕/㎖), Vancomycin (1㎍/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다. 음성 대조군과 비교하여 유의한 경우 * (P<0.05)표시 함.

그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이 다양한 균주의 배양물이 S. aureus 항균효과를 가지고 있음을 알 수 있었고, 특히 HY7801 배양물이 가장 우수한 S. aureus 항균효과를 가짐을 알 수 있었다.

1-2. 다양한 균주 배양물의 P. acnes 항균 효과 수준 확인

다양한 배양물과 Lactic acid 및 Vancomycin 의 준비

상기 실험예 1-1과 같은 방법으로 다양한 배양물과 Lactic acid 및 Vancomycin 을 준비하였다.

P. acnes 의 준비

P. acnes 는 한국 미생물 보존센터에서 미생물명 Propionibacterium acnes KCCM41747 (=ATCC 6919)를 분양받았다.

P. acnes 의 16sRNA 정보는 아래 표 2와 같다.

Description	Max score	Total score	Query cover	Per. identity	Accession
Cutibacterium acnes strain ATCC619	2667	2667	99%	99.93%	NR_040847
[Propionibacterium] namnetense strain NTS 31307302	2667	5156	98%	98.31%	NR_151943

분양 받은 P. acnes 는 Reinforced Clostridial Broth (MB cell, MB-R1602) 액체 배지에 접종하여 배양기에서 37℃ 혐기조건으로, 72시간 배양하였다 (1x10⁹ cfu/㎖).

P. acnes 항균 효과 수준 확인

1.5ml Microtube에 실험군으로 1x10⁹ cfu/㎖ 의 P. acnes에 10종의 프로바이오틱스 배양물을 100㎕/㎖ 의 농도로 처리 하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였고, 양성대조군으로 Lactic acid (100㎕/㎖), Vancomycin (1㎍/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다. 음성 대조군과 비교하여 유의한 경우 * (P<0.05)표시 함.

그 결과 도 2에서 확인되는 바와 같이 다양한 균주의 배양물이 P. acnes 항균효과를 가지고 있음을 알 수 있고, HY449 균주가 가장 우수한 P. acnes 항균효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

상기 실험예 1-1 및 1-2의 결과를 통해 HY7801 균주 배양물 및 HY449 균주 배양물을 S. aureus 및 P. acnes 항균 효과 (피부 마이크로바이옴 개선)를 위한 균주 배양물로 선정하였다. 선정된 HY7801 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 4월 17일자로 기탁된 것이고 (기탁번호: KCTC 11315BP), HY449 균주는 한국 종균협회에 HY49의 이름으로 1994년 9월 2일자로 기탁된 것이다 (기탁번호 제KFCC-10842호).

제조예 1: 배양 혼합물의 제조

상기 실험예 1-1.에서 제조된 20 Brix HY7801 프로바이오틱스 발효물과 20 Brix HY449 프로바이오틱스 발효물을 1 : 1 의 중량비로 혼합하여 프로바이오틱스 발효 복합물을 제조하였다.

실험예 2: 배양 혼합물의 S. aureus 및 P. acnes 항균 효과 수준 확인

2-1. 배양 혼합물의 S. aureus 항균 효과 수준 확인

제조예 1에서 제조된 배양 혼합물의 S. aureus 항균 효과 수준 확인하였다.

구체적으로 1.5ml Microtube에 실험군으로 실험예 1-1의 1x10⁹ cfu/㎖ 의 S. aureus 에 실험예 1-1의 HY7801 프로바이오틱스 배양물과 HY449 프로바이오틱스 배양물을 각각 100㎕/㎖ 의 농도로 처리하였고, 더불어 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물(HY7801+HY449 complex)을 100㎕/㎖ 의 농도로 처리하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕ 씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다. 유의한 차이가 있는 경우 * (P<0.05)표시 함.

그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물은 대조군 및 HY449 프로바이오틱스 배양물에 비하여 우수한 S. aureus 항균 효과가 있는 것을 확인하였다.

2-2. 배양 혼합물의 P. acnes 항균 효과 수준 확인

제조예 1에서 제조된 배양 혼합물의 P. acnes항균 효과 수준 확인하였다.

구체적으로 1.5ml Microtube에 실험군으로 실험예 1-2의 1x10⁹ cfu/㎖ 의 P. acne에 실험예 1-1의 HY7801 프로바이오틱스 배양물과 HY449 프로바이오틱스 배양물을 각각 100㎕/㎖ 의 농도로 처리하였고, 더불어 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물(HY7801+HY449 complex)을 100㎕/㎖ 의 농도로 처리하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕ 씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다. 유의한 차이가 있는 경우 * (P<0.05)표시 함.

그 결과 도 4에서 확인되는 바와 같이 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물은 대조군 및 HY7801 프로바이오틱스 배양물에 비하여 우수한 P. acne 항균 효과가 있는 것을 확인하였다.

실험예 3: 배양 혼합물 농도 별 S. aureus 및 P. acnes 항균 효과 수준 확인

3-1. 배양 혼합물 농도 별 S. aureus 항균 효과 수준 확인

제조예 1의 배양 혼합물의 농도별 S. aureus 항균 효과 수준을 확인하였다.

구체적으로, 배양 혼합물의 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 를 측정하기 위해 1.5ml Microtube에 실험군으로 실험예 1-1의 1x10⁹ cfu/㎖ 의 S. aureus 에 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물 (HY7801+HY449 complex)을 100㎕/㎖의 농도에서 1/2씩 희석(2-fold Serial dilution with PBS)에 하여 1.56㎕/㎖ 까지의 농도로 처리 하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다.

그 결과 도 5에서 확인되는 바와 같이 프로바이오틱스 배양 혼합물 (HY7801+HY449 complex)이 12.5㎕/㎖보다 고농도 일 때 유의적인 S. aureus 항균효과가 있음을 확인하였다.

3-2. 배양 혼합물 농도 별 P. acnes 항균 효과 수준 확인

제조예 1의 배양 혼합물의 농도별 P. acnes 항균 효과 수준을 확인하였다.

구체적으로, 배양 혼합물의 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 를 측정하기 위해 1.5ml Microtube에 실험군으로 실험예 1-2의 1x10⁹ cfu/㎖ 의 P. acnes 에 제조예 1의 프로바이오틱스 배양 혼합물 (HY7801+HY449 complex)을 100㎕/㎖의 농도에서 1/2 씩 희석(2-fold Serial dilution with PBS)에 하여 1.56㎕/㎖ 까지의 농도로 처리 하였다. 음성 대조군으로 PBS(100㎕/㎖)을 사용하였다. 96 well에 100㎕ 씩 분주하여 37℃로 세팅한 후 microplate reader를 이용하여 620nm에서 흡광도를 0시간과 72시간을 측정하였다. 그리고 72시간 흡광도 값에서 0시간 흡광도 값의 차를 그래프로 나타내었다.

그 결과 도 6에서 확인되는 바와 같이 프로바이오틱스 배양 혼합물 (HY7801+HY449 complex)이 25㎕/㎖보다 고농도 일 때 유의적인 P. acnes 항균효과가 있음을 확인하였다.

실험예 4: 피부 개선 조성물의 농도별 세포 생존율 확인

본 발명의 배양 혼합물을 포함하는 피부 개선 조성물의 세포 독성여부 및 사멸 개선효과를 확인하였다.

인체유래 각질세포(HaCaT) 세포의 배양

10% FBS(fetal bovine serum) antibiotics free DMEM 배지(Gibco, USA)에서 인체유래 각질세포(HaCaT)와 DMEM을 1:4의 중량비율로 2~3일에 한 번씩 계대 배양하여 사용하였다(배양 조건: 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기).

계대를 위하여 DMEM 배지를 제거하고 PBS 4㎖로 1회 세척한 후, Trypsin-EDTA Solution 1X(1XTE, Sigma)를 1㎖ 처리하여 배양기에 10~15분 동안 넣어두었다. 인체유래 각질세포(HaCaT)의 부착이 떨어진 것을 확인한 후 DMEM 배지 4㎖를 넣어 인체유래 각질세포(HaCaT)를 회수하였다. 상기 회수된 인간유래 각질세포(HaCaT)를 1,200rpm으로 3분 동안 원심분리를 한 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고, DMEM 배지 1㎖를 넣어 세포 펠렛을 풀어 주었다. 인체유래 각질세포(HaCaT)와 DMEM 배지를 1:4의 중량비율로 희석한 후 100Ψ 세포배양접시에 넣고 잘 혼합한 후 배양기에서 2~3일간 배양하여 사용하였다.

세포 생존율의 확인

프로바이오틱스 배양 혼합물(HY7801+HY449 complex)의 최적 처리농도를 확인하기 위하여 인체유래 각질세포(HaCaT)를 96웰에 웰당 2x10⁵cells로 접종한 후, 24~48시간 동안 배양한 후, FBS가 들어가지 않은 DMEM 배지로 1회 세척하여 주었다. 상기 프로바이오틱스 배양 혼합물 (HY7801+HY449 complex)을 80㎕/ml 농도에서 1/2씩 희석(2-fold Serial dilution with PBS)하여 5㎕/㎖까지의 농도로 처리 하였다. 24시간 동안 배양한 후, Cell Counting Kit-8(Dojindo, CK04)로 세포생존율을 측정하였다.

그 결과 도 7에서 확인되는 바와 같이 80㎕/ml 농도의 배양 혼합물 처리 시 유의적으로 세포생존율이 떨어지는 것을 확인하였고, 5 내지 40㎕/ml 농도의 배양 혼합물 처리 시 대조군과 유사 또는 더 높은 세포 생존율을 확인할 수 있다.

실험예 5: LDH( Lactate dehydrogenase) 분비량 저감 효과 확인

5-1. S. aureus 에 대한 혼합 발효물의 LDH ( Lactate dehydrogenase) 분비량 저감 효과 확인

위해균에 의한 세포사멸 및 프로바이오틱스 발효 복합물의 세포 손상 및 사멸 개선 효과를 보기 위하여 Cytotox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 LDH 발현 저감 효과를 확인하였다.

구체적으로, 실험예 4의 인체유래 각질세포(HaCaT)를 96웰에 웰당 2x10⁵cells로 접종한 후, 24~48시간 동안 배양한 후, PBS로 1회 세척하여 주었다. FBS 및 페놀 레드(Phenol red), 항생제가 들어가지 않은 DMEM 배지에 S. aureus를 처리하지 않은 음성 대조군 (con), S. aureus를 1x10⁸ cfu/㎖ 처리한 양성 대조군 (Vehicle), S. aureus를 처리한 후, 프로바이오틱스 배양 혼합물을 20 ㎕ 처리 (HY7801+HY449 complex)한 실험군을 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상등액을 취하여 96웰에 웰당 50 u㎕씩 옮기고 이어서 각 웰에 50 u㎕의 substrate mix를 추가하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후 50 u㎕의 반응 중지 용액을 넣고 490 nm에서 흡광도를 측정하였고 음성대조군 (con)의 흡광도 측정 값을 100%로 하여 비교하였다.

그 결과, 도 8에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 IL-8발현량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 IL-8 발현량이 유의적으로 감소하였고, 이는 음성 대조군과 유사한 수준인 것을 확인하였다.

5-2. P. acnes 에 대한 혼합 발효물의 LDH( Lactate dehydrogenase) 분비량 저감 효과 확인

S. aureus를 사용하는 대신 P. acnes 를 사용하는 것 외에는 상기 5-1과 동일한 방법으로 LDH 발현 저감 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 9에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 IL-8발현량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 IL-8 발현량이 유의적으로 감소하였고, 이는 음성 대조군과 유사한 수준인 것을 확인하였다.

실험예 6: IL-8 발현량 저감 효과 확인

6-1. S. aureus 에 대한 혼합 발효물의 IL-8 발현량 저감 효과 확인

본 발명의 혼합 발효물이 유해균 (S. aureus)에 의해 증가된 염증지표 (IL-8)를 저감시킬 수 있는지를 확인하였다.

구체적으로, 상기 시험예 4의 인체유래 각질세포(HaCaT)를 96웰에 웰당 2x10⁵cells로 접종한 후, 24~48시간 동안 배양한 후, FBS가 들어가지 않은 DMEM 배지로 1회 세척하여 주었다. FBS가 들어가지 않은 DMEM 배지에 S. aureus를 처리하지 않은 음성 대조군 (con), S. aureus를 1x10⁶ cfu/㎖ 처리한 양성 대조군 (Vehicle), S. aureus를 처리한 후, 프로바이오틱스 배양 혼합물을 20 ㎕ 처리 (HY7801+HY449 complex)한 실험군을 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 eppen tube에 수거하여 13,000 rpm에서 10분간 cell down 한 후, 상등액만 수거하여 실험을 진행하였다.

그리고, 상등액의 IL-8은 ELISA를 통해 확인하였다.

구체적으로, Human IL-8 ELISA set (BD Bioscience, San Diego, CA, USA)가 사용되었다. 간단하게, 96 웰 마이크로플레이트에 50 ㎕의 희석한 capture reagent를 넣고 4℃에서 overnight 하였다. Wash buffer를 3번 well을 wash한 다음, 100 ㎕의 Assay Diluent로 1시간 동안 block 한다. wash 후에 수거한 상등액과 standard 희석액을 50 ㎕ 씩 넣어준 후 2시간 상온에 방치한다. wash 후, 50 ㎕의 Working Detector (Detection antibody + SAv-HRP reagent)를 넣고 1시간 상온에 방치한다. wash 후, 50 ㎕의 Substrate solution을 넣고 30분 동안 암실, 상온에 방치한다. 마지막으로 stop solution을 25 ㎕ 씩 넣은 후 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다(450, 540 nm).

그 결과 도 10에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 IL-8발현량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 IL-8 발현량이 유의적으로 감소하였고, 이는 음성 대조군과 유사한 수준인 것을 확인하였다.

6-2. P. acnes 에 대한 혼합 발효물의 IL-8 발현량 저감 효과 확인

S. aureus를 사용하는 대신 P. acnes 를 사용하는 것 외에는 상기 6-1과 동일한 방법으로 IL-8 발현량 저감 효과 확인하였다.

그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 IL-8발현량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 IL-8 발현량이 유의적으로 감소하였고, 이는 음성 대조군과 유사한 수준인 것을 확인하였다.

실험예 7: 히알루로난(hyaluronan) 증가 효과 확인

7-1. S. aureus 에 대한 배양 혼합물의 히알루로난(hyaluronan) 증가 효과 확인

본 발명의 혼합 발효물이 유해균 (S. aureus)에 의해 감소된 히알루로난을 증가시킬 수 있는지를 확인하였다.

구체적으로, 상기 시험예 4의 인체유래 각질세포(HaCaT)를 96웰에 웰당 2x10⁵cells로 접종한 후, 24~48시간 동안 배양한 후, FBS가 들어가지 않은 DMEM 배지로 1회 세척하여 주었다. FBS가 들어가지 않은 DMEM 배지에 S. aureus를 처리하지 않은 음성 대조군 (con), S. aureus를 1x10⁶ cfu/㎖ 처리한 양성 대조군 (Vehicle), S. aureus를 처리한 후, 프로바이오틱스 배양 혼합물을 20 ㎕ 처리 (HY7801+HY449 complex)한 실험군을 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 eppen tube에 수거하여 13,000 rpm에서 10분간 cell down 한 후, 상등액만 수거하여 실험을 진행하였다.

그리고, 상등액의 ELISA를 통해 확인하였다.

구체적으로, Hyaluronan ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)가 사용되었다. 간단하게, 50 ㎕의 Assay Diluent RD1-14를 넣어준 후 standard와 sample(상등액)을 적절하게 희석하여 50 ㎕ 씩 넣어준다. wash buffer로 세척한 후 50 ㎕의 Hyaluronan conjugate를 넣고 쉐이커에 올린 뒤 2시간, 상온 방치한다. 세척 후 50 ㎕의 Substrate solution을 넣고 30분동안 방치한다. 50 ㎕의 Stop solution을 넣은 후 30분 안에 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다(450, 540 nm).

그 결과 도 12에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 히알루로난이 유의적으로 감소하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 히알루로난이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.

7-2. P. acnes 에 대한 배양 혼합물물의 히알루로난 (hyaluronan) 증가 효과 확인

S. aureus를 사용하는 대신 P. acnes 를 사용하는 것 외에는 상기 7-1과 동일한 방법으로 히알루로난 함량을 확인하였다.

그 결과, 도 13에서 확인되는 바와 같이 양성 대조군이 음성 대조군에 비해 히알루로난이 유의적으로 감소하였고, 본 발명의 혼합 발효물을 처리한 실험군은 양성 대조군에 비해 히알루로난이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국종균협회 KFCC10842 19940902 한국생명공학연구원 KCTC11315BP 20080417

Claims (8)

1. 락토바실러스 락티스 HY449 (Lactococcus lactis HY449, 수탁번호 : KFCC-10842) 균주 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 (Lactobacillus helveticus HY7801, 수탁번호 : KCTC 11315BP) 균주들의 배양 혼합물을 포함하는 피부염증 저감 및 보습 효과를 가지는 피부 개선용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 배양 혼합물은 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물을 1:0.5 내지 1:2의 혼합 비율로 포함하는 피부 개선용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 배양 혼합물은 20 Brix 의 락토바실러스 락티스 HY449 균주 배양물 및 20 Brix 의 락토바실러스 헬베티커스 HY7801 균주 배양물이 혼합된 것으로, 상기 배양 혼합물은 20 내지 80 ul/ml 농도로 포함하는 피부 개선용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, S. aureus) 항균능을 가진 피부 개선용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 독성지표인 LDH(Lactate dehydrogenase) 저감능, 염증지표인 IL-8의 발현을 저감능 및 보습지표인 히알루로난 (hyaluronan) 함유량 개선능 중 어느 하나 이상을 가지는 것인 피부 개선용 조성물.
   
6. 삭제
7. 제1항의 조성물을 포함하는 피부염증 저감용 화장료 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 개선용 조성물을 화장료 조성물 전체 중량 기준으로 0.01~20 중량% 포함하는 것인 화장료 조성물.

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