KR100441420B1

KR100441420B1 - 락토바이오신을 함유하는 여드름 및 염증 방지용 화장료조성물

Info

Publication number: KR100441420B1
Application number: KR10-2001-0067097A
Authority: KR
Inventors: 김광수; 김기환; 홍진천; 김영택; 박성순; 오세종; 김경태; 백영진
Original assignee: 나드리화장품주식회사; 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2004-07-22
Also published as: KR20030035157A

Abstract

본 발명은 락토코커스 스피시스 HY 49(기탁번호 KFCC-10842호)에 의해 생산된 락토바이오신 배양액을 조성물의 총중량을 기준으로 0.01 내지 10중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 여드름 및 염증 방지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부에 상재하여 여드름 및 염증유발에 관여하는 미생물의 생장을 억제함으로써 피부염증 및 여드름 유발을 억제할 뿐만 아니라 미생물 오염에 대해 화장료의 장기보존성을 증대시켜 천연 방부효능을 갖는 효과가 있다.

Description

락토바이오신을 함유하는 여드름 및 염증 방지용 화장료 조성물 {COSMETICS COMPOSITION FOR ANTI-ACNES AND ANTI-INFLAMMATION CONTAINING LACTOBIOCIN}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여드름 및 피부염증 방지효과를 지닌 화장료 조성물에 관한 것이다.

여드름은 피지관련질환으로 남성호르몬에 기인한 과잉 피지에 의해 발생하는 것으로, 구체적으로는 남성호르몬에 의해 피지가 생성되고 모공각화가 유발되어 피지가 모공밖으로 배출되지 못해 미세면포가 형성되며, 피지 내에 존재하는 혐기성 상재균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)가 작용하여 여드름이 발생한다.

또한 피부에는 그램양성균주인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 파이오진스(Streptococcus pyogenes), 마이크로코커스 루터스(Mycrococcus luteus)와 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium xerosis), 그램음성균주인 대장균(Escherichia coli)과 슈도모나스 아우루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 효모인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 말라쎄지아 푸푸(Malassezia furfur) 및 곰팡이인 트리코피톤 멘타그로피티스(Trichophyton Mentagrophytes)가 상재하고 있으며, 이들 중 스타필로커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스 및 스트렙토코커스 파이오진스 등은 피부에 화농성 감염증이나 농피증(cellulitis) 또는 일반적 염증을 유발할 수 있는 대표적인 균주이다.

일반적으로, 여드름이나 염증과 같은 피부질환 치료를 위해서는 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항균물질을 사용하고 있다. 그러나 이러한 항균물질은 내성균을 유발시키고, 광과민작용 등의 부작용을 일으키는 등 많은 문제점을 야기시켜 왔다.

미생물이 생산하는 항균성 단백질인 박테리오신은 광범위한 미생물에 대한 저해능력을 가지면서 고등생물에 대한 선택독성이 낮으며 그 생산원가가 저렴하다. 이들 박테리오신은 식품 품질보존의 목적을 갖는 식품첨가제로서 뿐만 아니라 가축의 생육촉진이나 질병예방에도 사용가능하며, 피부를 통해 직ㆍ간접적으로 인체에 흡수되어도 인체내 단백질 가수분해효소에 의해 쉽게 분해될 수 있다.

따라서, 피부질환 치료를 위하여 항균활성을 가진 유산균의 대사산물인 박테리오신을 이용하는 방법이 모색되고 있다. 박테리오신은 유산균에 의해 생산되므로 인체에 무해하여 이미 그 안전성이 확보되어 있을 뿐 아니라, 소화기관의 단백질분해효소에 의해 쉽게 분해되므로 잔류성이 없고, 유전자로부터 직접 생합성되므로 생물공학적 응용이 쉽다는 장점이 있다.

그러나, 대표적인 박테리오신인 나이신(nisin)은 항균범위가 넓고 열에 안정하지만, 약산성 또는 중성의 pH에서 용해성이 낮고 인지질에 대한 흡착력이 있어 쉽게 불활성화 된다는 단점이 있으며, 기타 박테리오신들도 열에 쉽게 불활성화되거나(헬베티신J), 항균범위가 좁은(애시도신에이, 류코신에이, 페디오신 등) 등의 단점을 가지고 있어, 이러한 단점을 해결한 새로운 박테리오신이 절실히 요구되고 있다.

상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 비교적 항균범위가 넓고, 유기용매 및 세정제에 안정하며, 피부자극도가 낮고, 생체유래 방부기능을 가진 박테리오신을 이용한 여드름 및 염증 방지용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 분리정제된 락토바이오신의 매스 스펙트럼 결과를 나타내는 그래프,

도 2는 여드름 유발균 및 피부상재균에 대한 락토바이오신의 생장저해효과를 나타내는 그래프.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 락토바이오신을 함유하는 여드름 및 염증 방지용 화장료 조성물은 락토코커스 스피시스 HY 49(기탁번호 FCC-10842호)에 의해 생산되고 TGY 배지에서 배양된 락토바이오신 배양액을 조성물의 총중량을 기준을 0.01 내지 10중량% 함유하며, 스타필로커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 파이오진스 및 프로피오니박테리움 아크네스의 생육을 억제하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 여드름 및 염증을 방지하기 위하여 락토코커스 스피시스 HY49 (Lactococcussp. HY49)(기탁번호 KFCC-10842호)가 생산하는 박테리오신 {이하, "락토바이오신"(Lactobiocin)이라 함} 배양액을 화장료 조성물에 첨가한다.

본 발명에서 사용되는 락토코커스 스피시스 HY49에 대해서는 특허 제123946호에 상세하게 개시되어 있다.

락토바이오신은 락토코커스 스피시스 HY49 세포를 접종하여 배양한 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 남은 상등액에 프로판올과 염화나트륨을 첨가하여 정치시킨 후 원심분리하여 침전물을 얻고, 얻어진 침전물을 구연산나트륨 완충용액에 용해시킨 다음, 투석하여 얻는다.

락토바이오신을 생산하기 위한 배지로는 트립톤 0.7-1.5 중량%, 효모추출물 0.1-0.2중량%, 당 1.0-10.0중량%, 트윈80 0.01-0.1중량% 및 증류수로 이루어진 TGY(Tryptone glucose yeast extract)배지를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 TGY 배지에서 얻어진 락토바이오신의 활성이 가장 우수할 뿐만 아니라, 조성이 간단하고 저가이어서 대량배양에 적합하기 때문이다.

통상적인 유산균 증균배지로 널리 이용되는 MRS, M17-유당, 17-포도당 배지 등도 사용할 수 있으나, 그 조성이 매우 복잡하여 박테리오신의 회수에 어려움이 많고, 고가여서 대량배양시 적합하지 않은 문제점이 있다.

락토바이오신은 총 32개의 아미노산으로 구성된 것으로 추정되는 폴리펩타이드로서, 분자량은 3354이고, N-말단부터 확인된 4개의 잔기는 류신-글루타민-프롤린-글리신(Leu-Gln-Pro-Gly)이다. 또한, 그 아미노산 조성에 있어서 다른 아미노산에 비해 이소류신, 류신, 메티오닌, 글리신, 리신 등이 많으며, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판과 같은 방향족 아미노산은 존재하지 않는 것으로 보인다.

락토바이오신은 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 아크네스와, 피부상재균인 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 파이오진스 및 스타필로코커스 에피더미디스에 대한 생육 억제효과가 뛰어나 이들 미생물에 의한 염증 유발시 항생물질 대신 사용할 수 있다. 또한, 그램양성균 뿐만 아니라 대장균 및 슈도모나스 스피시스와 같은 병원성 및 부패성 그램음성균에 대해서도 뛰어난 항균 효과가 있어 방부제로서의 기능도 가진다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상의 화장료 조성물에 조성물의 총중량을 기준으로 상기 락토바이오신을 0.01 내지 10중량% 함유시키는 것이 바람직하다. 이는 0.01중량% 미만 함유하는 경우에는 항균효과가 비교적 낮고, 10중량%를 초과하는 경우 첨가량을 증가시켜도 항균효과가 크게 증가하지 않으므로 경제적 효율성이 떨어지기 때문이다.

이러한 락토바이오신을 적용한 본 발명의 화장료조성물은 피부 염증 및 여드름 생성을 억제하고, 화장료 자체의 보관성을 증진시키고, 부패 미생물의 오염을 방지할 수 있다. 또한, 생합성에 의한 제조물이므로 피부자극이나 기타 부작용도 없어 안전한 장점이 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1)

락토바이오신 생산

TGY 배지(트립톤 0.7-1.5 중량%, 효모추출물 0.1-0.2중량%, 당1.0-10.0중량%, 트윈 80 0.01-0.1중량% 및 증류수) 1ℓ에 락토코커스 스피시스 HY 49 균주 1×10⁶cfu/㎖을 접종하여 16시간 배양하여 락토코커스 스피시스 HY49 배양액을 제조하였다. 얻어진 락토코커스 스피시스 HY49 배양액을 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 균을 제거하였다. 상등액에 ℓ당 100 ㎖의 프로판올과 300g의 염화나트륨을 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 다음 10,000 ×g에서 30분간원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 20mM의 구연산나트륨 완충용액에 용해시킨 다음, 투석막을 이용하여 동일 완충액에서 24시간 투석하여 락토바이오신을 회수하였다.

(실시예 1-1)

락토바이오신 생산 최적배지의 확인

락토바이오신의 활성이 최대가 되는 배지를 확인하기 위하여, TGY, MRS 및 표준한천배지에서 락토코커스 스피시스 HY 49 균주를 배양하여 배양액의 흡광도를 측정하고, 배양액으로부터 락토바이오신을 회수한 후 락토바이오신활성을 측정하였다.

TGY 배지의 조성은 상기 실시예 1과 같으며, MRS 배지는 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 육엑기스 10g, 포도당 20g, 트윈 80 1g, 암모늄 시트레이트 2g, 나트륨 아세테이트 5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g, 디포타슘포스페이트 2g 및 증류수 1ℓ으로 구성되고, 표준한천배지는 트립톤 5g, 효모 추출물 0.7g, 포도당 1g 및 증류수 1ℓ로 구성된다.

TGY 배지, MRS 배지 및 표준한천배지 각각 1ℓ에 락토코커스 스피시스 HY 49 균주 1×10⁶cfu/㎖을 접종하여 16시간 배양하여 락토코커스 스피시스 HY49 배양액을 제조하였다. 얻어진 락토코커스 스피시스 HY49 배양액을 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 균을 제거하였다. 상등액에 ℓ당 100 ㎖의 프로판올과 300g의 염화나트륨을 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 다음 10,000 ×g에서 30분간원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 20mM의 구연산나트륨 완충용액에 용해시킨 다음, 투석막을 이용하여 동일 완충액에서 24시간 투석하여 락토바이오신을 회수하였다.

각 배지에서 배양한 배양액의 흡광도 및 배양 후 회수한 락토바이오신의 활성을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

	배양후 배양액의 흡광도	배양후 락토바이오신 활성
TGY배지	0.198	105,015
MRS배지	0.393	72,330
표준한천배지	0.090	24,250

상기 표 1의 결과로부터, TGY배지에서 배양하여 회수한 락토바이오신의 활성이 MRS 배지 및 표준한천배지에 비해 높아 대량생산에 적합하다는 것을 알 수 있다.

(실시예 2)

락토바이오신의 분리 정제 및 아미노산의 구조 분석

TGY 배지에서 32℃에서 16시간 배양한 락토코커스 스피시스 HY 49 배양액을 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하여(Dupont, Sorvall RC 28S, GSA rotor) 균체를제거하였다.

남은 상등액에 30% 포화 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 용액을 첨가하여 4℃에서 약 12시간 동안 정치시킨 후, 실시예 1과 동일한 조건으로 원심분리하여 침전물을 얻었다.

소수성 크로마토그래피(옥틸세파로즈 씨엘4B, 파마시아사제)를 사용하여 침전물을 분리정제하였다. 이때 용출조건은, 크로마토그래피 초기에는 1.7몰 황산암모늄을 농도구배를 저하시키는 방향으로 3배 칼럼부피 이상 흘려주었고, 그 다음 증류수로 3배 칼럼부피 이상 흘려주었다. 여기에 에틸알콜을 사용하여 농도구배를 증가시키면서 분획하였다. 활성분획을 모아 다음 단계인 역상 크로마토그래피에서 단일피크로 정제한 후 아미노산 분석시료로서 사용하였다.

상기 방법으로 분리 정제된 락토바이오신의 아미노산 배열은 에드만(Edman) 방법을 사용하여 단백질을 분해한 후 단백질 서열분석기로 분석하였다. 분석된 아미노산 잔기는 총 4개이었고 그 이후의 잔기는 확인하지 못하였다. N-말단부터 확인된 4개의 잔기는 류신-글루타민-프롤린-글리신(Leu-Gln-Pro-Gly)으로 밝혀졌다.

또한, 동일한 시료에 대하여 아미노산 조성을 분석한 결과, 다른 아미노산에 비해 이소류신, 류신, 메티오닌, 글리신, 리신 등이 많았으며, 총 32개의 아미노산으로 구성된 것으로 추정할 수 있었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

아미노산	결과(pmol)	몰%	잔기수
CYA^*	33.49	2.9	1.0 (1)
ASX^**	57.25	4.96	1.73(2)
GLX^***	54.17	4.70	1.6 (2)
세린(SER)	62.40	5.41	1.9 (2)
글라이신(GLY)	147.08	12.75	4.4 (4)
히스티딘(HIS)	57.87	5.02	1.74(2)
알기닌(ARG)	15.02	1.30	0.4 (0)
스레오닌(THR)	15.51	1.34	0.4 (0)
알라닌(ALA)	65.75	7.44	2.0 (2)
프롤린(PRO)	62.51	5.42	1.9 (2)
타이로신(TYR)	5.05	0.44	0.15(0)
발린(VAL)	53.38	4.63	1.6 (2)
메티오닌(MET)	124.80	10.82	3.7 (4)
아이소류신(ILE)	154.24	13.57	4.6 (5)
류신(LEU)	106.00	9.19	3.2 (3)
페닐알라닌(PHE)	11.77	1.02	0.4 (0)
트립토판(TRP)	3.35	0.29	0.1 (0)
리신(LYS)	103.63	8.99	3.1 (3)
* CYA: 시스테인산과 산화시스틴의 합 ASX: 아스파라긴과 아스파르트산의 합* GLX: 글루타민과 글루탐산의 합

정제된 락토바이오신의 UV 스펙트럼을 조사한 결과, 222 nm에서 최대 흡광치를 보였으며, 일반단백질의 경우와는 달리 280 nm에서 흡광치를 보이지 않았다. 이는 박테리오신 중에 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판과 같은 방향족 아미노산이 존재하지 않기 때문인 것으로 생각되며, 아미노산 조성 분석 결과도 이와 일치하였다. 매스 스펙트럼 분석을 한 결과, 락토바이오신의 분자량은 3354로 나타났다. 이러한 결과를 도 1에 나타내었다.

(실험예 1)

피부 상재균 및 여드름 균주에 대한 락토바이오신의 생장저해효과

실시예 1에서 얻은 시료를 이용하여, 여드름 및 피부상재 균주에 대한 항균작용을 관찰하였다.

지시균으로는 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 아크네스(ATCC 6919), 피부상재 염증유발균인 스타필로코커스 아우레우스(ATCC 65389), 스트렙토코커스 파이오진스(ATCC 21059), 및 스타필로코커스 에피더미디스(ATCC 12228)의 4가지를 사용하였다.

락토바이오신을 생산하는 락토코커스 스피시스 HY 49를 TGY배지 1ℓ에 배양하여 30% 암모늄 설페이트 처리한 농축액을 100배 희석하여, 대조군은 0 ㎖, 10 유닛은 0.08 ㎖, 50 유닛은 0.4 ㎖, 100 유닛은 0.8 ㎖을 처리하고, 각 접종균의 균수는 1×10⁶ea/ml 정도로 하였으며, 0, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간의 시간대별 흡광도(650 nm) 및 균수를 측정하였다. 프로피오니박테리움 아크네스의 경우, 균주의 생육이 느린 점을 감안하여, 성장 도중 4시간 지점에서 락토바이오신을 첨가하여 흡광도 및 균수를 측정하였다.

락토바이오신을 첨가한 후 본 발명에 사용된 4가지의 균주에 대해 시간대별로 흡광도(650 nm)를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 A는 스트렙토코커스 파이오진스, B는 스타필로코커스 아우레우스, C는 스타필로코커스 에피더미디스, D는 프로피오니 박테리움 아크네스를 나타낸다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 첨가 농도에 따라 유의성 있는 균의 성장 저해가 이루어짐을 볼 수 있다. 프로피오니박테리움 아크네스의 경우 4시간 배양 후 락토바이오신을 첨가하여 배양한 결과, 락토바이오신 첨가 20시간 경과 후 대조군과 현저한 차이를 나타냈으며, 적용된 균주 모두 최소 10 유닛의 처리에도 확실한 생장억제 효과를 얻을 수 있었다.

(실험예 2)

락토바이오신과 종래 화장료성분의 균주에 대한 생장억제효과 비교

락토바이오신에 의한 세균의 생장 저지 효과를 종래의 화장료성분과 비교하기 위하여, 실시예 1에서 얻어진 락토바이오신과, 종래의 화장료 조성물 중에서 여드름 및 피부염증 억제효과를 가진 것으로 알려진 티 트리 오일(Tea tree oil), 살리실산, 로비좀아크네(Rovisome acnes), 피코싸카라이드 안티아크네(Phycosaccharide antiacne), 트리클로산(Triclosan), 아젤라익산(Azelaic acid) 및 피토스핑고신(Phytosphingoshine)에 대하여 실험하였다.

트립틱 소이 한천{TSA(Tryptic soy agar); Difco co.}을 고체 평판한 고체평판배지에 각각의 균 1×10⁷ea/ml를 도말한 후 정중앙에 각각의 시료를 20㎕씩 떨어뜰리고 자연건조시켰다. 각각의 시료는 100배 희석하여 10g/ℓ의 농도로 사용하였다. 자연건조후 37℃에서 24시간 배양하여 투명한 저지환의 생성 유·무를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	S. aureus	S. epidermis	S. pyogens	P. acnes
락토바이오신	++	++	+++	++
티 트리 오일	-	-	-	+
살리실산	-	-	-	+
로비좀 아크네	-	-	-	+
피코싸카라이드안티아크네	+/-	-	-	+
트리클로산	++	++	++	+
아젤라익산	-	-	-	+
피토스핑고신	+	+	-	+
- : 저지환 생성 못함,+/- : 저지환 생성 후 균주 성장,+ :약한 저지환 생성,++·+++ : 강한 저지환 생성

표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 종래의 원료들은 4가지 균주 중 일부의 균주에 영향을 미치며, 그 중 트리클로산이 가장 강한 효과를 나타내었다.

반면, 락토바이오신을 처리한 경우에는 4가지 균주 모두에 강한 저지환을 생성시켰다. 특히, 스트렙토코커스 파이오진스에 대해 강력한 효과를 나타냈으며, 생장 저지환의 뚜렷한 경계선이 나타남으로써 피부 염증 유발균의 저해효과 뿐만 아니라 세포용해 역할을 함으로써 강한 저해 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 피부상재균에 의한 염증 및 여드름을 치료 또는 예방하기 위해 화장료에 사용되는 원료들에 비해, 락토코커스 스피시스 HY 49가 생산해 내는 락토바이오신이 탁월한 효과를 가진다. 또한 생합성에 의한 제조물이므로 상기 종래의 화장료성분과 달리 피부자극이나 부작용이 없어 안전한 장점이 있다.

(제조예 1-6, 비교예 1)

락토바이오신 함유 화장료의 제조

동종업계에서 보편적으로 사용되는 조성을 이용하여 표 4의 조성에 따라, 유성 및 수성성분과 계면활성제 등을 실시예 1의 락토바이오신과 혼합하여 호모믹서기로 교반한 후 가열 및 냉각하여 균일 혼합된 화장료인 제조예 1-6을 제조하였다.또한 비교를 위해 락토바이오신이 함유되지 않은 것을 제외하고는 제조예 1 내지 6과 동일한 조성으로 비교예 1의 화장료를 제조하였다.

원료명	제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	비교예1
폴리 솔베이트-60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
세로 스테아릴알콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
세릴옥타노에이트	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
카보머	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
락토바이오신 추출물	0.005	0.01	0.1	1	10	20	-
향료	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
방부제	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
정제수	합 100

(실험예 3)

여드름 유발균 및 피부상재균에 대한 생육억제효과

제조예 1-6 및 비교예 1에서 제조된 화장료의 여드름 유발균 및 피부상재균에 대한 생육억제 효과를 측정하기 위해, GEM 배양액 한천배지와 뉴트리언트 한천배지(Nutrient agar)에 4가지 균주를 배양하였다.

초기의 접종균수를 측정한 후, 제조된 화장료 0.5g씩을 각 배지에 첨가하여 배양용 접시에 깔고, 균수가 측정된 (2.1×10⁷ea/㎖) 4가지 균주를 접종시켰다. 프로피오박테리움 아크네스는 혐기배양기에서 3일간 배양하고, 나머지 3가지 균주는 일반 배양기에서 3일간 배양하여 균주의 수를 측정하였다. 그 결과를 표 5a 내지 표 5d에 나타내었다.

프로피오니박테리움 아크네스에 대한 생육억제효과

	0일	3일	저해능력(%)
제조예 1	2.30E+07	1.62E+06	92.956
제조예 2	2.30E+07	1.45E+06	93.696
제조예 3	2.30E+07	3.01E+03	99.987
제조예 4	2.30E+07	1.12E+02	99.990
제조예 5	2.30E+07	1.48E+06	93.560
제조예 6	2.30E+07	1.52E+06	93.390
비교예 1	2.30E+07	2.30E+07	0

슈도모나스 아우루기노사에 대한 생육억제효과

	0일	3일	저해능력(%)
제조예 1	2.55E+08	2.43E+07	90.470
제조예 2	2.55E+08	1.38E+06	99.459
제조예 3	2.55E+08	1.157E+05	99.954
제조예 4	2.55E+08	1.11E+03	99.990
제조예 5	2.55E+08	2.24E+07	91.216
제조예 6	2.55E+08	2.28E+07	91.058
비교예 1	2.55E+08	2.55E+08	0

스트렙토코커스 파이오진스에 대한 생육억제효과

	0일	3일	저해능력(%)
제조예 1	2.32E+09	5.98E+07	97.422
제조예 2	2.32E+09	6.12E+06	99.736
제조예 3	2.32E+09	3.84E+05	99.983
제조예 4	2.32E+09	1.24E+04	99.990
제조예 5	2.32E+09	3.44E+07	98.517
제조예 6	2.32E+09	3.48E+07	98.500
비교예 1	2.32E+09	2.32E+09	0

스트렙토코커스 에피더미디스에 대한 생육억제효과

	0일	3일	저해능력(%)
제조예 1	2.50E+09	6.42E+07	97.432
제조예 2	2.50E+09	5.49E+06	99.780
제조예 3	2.50E+09	3.75E+05	99.985
제조예 4	2.50E+09	1.26E+04	99.999
제조예 5	2.50E+09	3.42E+07	98.632
제조예 6	2.50E+09	3.51E+07	98.596
비교예 1	2.50E+09	2.50E+09	0

표 5a 내지 5d의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1-6에서 락토바이오신 함유 화장료의 우수한 생장억제 능력을 확인할 수 있으나, 제조예 1의 경우 제조예 2-6에 비해 전반적인 저해능력이 비교적 낮음을 확인할 수 있다. 또한 제조예 5와 제조예 6을 비교해볼 때 락토바이오신의 함량이 2배로 증가했음에도 생장억제 능력은 크게 증가되는 경향을 나타내지 않는다. 따라서, 화장료 조성물에 함유되는 락토바이오신의 함량은 0.01 내지 10중량%가 바람직하다.

(실험예 4)

인체첩포실험

락토바이오신을 함유한 화장료 조성물이 피부자극, 기타 부작용이 없음을 확인하기 위하여, 상기 비교예 1과 제조예 3의 크림제형을 대상으로 인체에 대한 첩포실험(Patch test)을 실시하였다.

검사는 건강한 성인 남·여 30명으로 등 부위에 핀쳄버(Finn chamber)를 이용하여 알루미늄 원판속에 화장제품을 직접 넣거나 종이 디스크에 묻혀서 40㎕를 처리하여 이를 스켄포어 테잎(scanpore tape)으로 피부에 고정시키고, 24시간 후 첩포를 떼어내고, 그 뒤 4시간 후 결과를 판정하였다.

결과는 홍반과 부종의 정도에 따라 수치로 나타내며, 판정기준은 국제접촉피부염 연구위원회 (International Contact Dermatitis Research Group;ICDRG)의 기준에 의한다(Wooding et al, 1967; Rietschell, 1982; Fischer & Maibach, 1984; Aberer et al, 1993).

판정기준은 다음과 같다.

0 : 발적없음

1 : 발적(erythema)

2 : 발적 및 구진(papules)

3 : 발적, 구진 및 소수포(vesicles)

4 : 심한 부종 및 소수포

상기 판정기준에 따라 판정한 점수에 근거하여 하기 식에 따라 자극도를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

자극도(%) = (양성반응을 나타내는 반응도 / 자체모집단의 반응도) ×100

	비교예 1	제조예 3
자극도(%)	5.0	0.01

상기 표 6의 결과에서 알 수 있듯이, 피부염증 또는 기타 자극은 없었다.

(실험예 5)

락토바이오신 함유 화장료의 동물 임상실험

제조예 3 및 비교예 1을 사용하여 여드름 및 일반 염증에 대한 동물 임상효과 실험을 실시하였다.

무모마우스(Hairless Mouse; 이하 "실험동물"이라 함)(6주령, 암컷) 10마리의 등부위를 2구획하고 아라키돈산(Arachidonic acid; 시그마사제)으로 염증을 초기 유발하여 육안으로 관찰한 후, 4가지 균주 2 ×10⁵ea를 2-3일 간격으로 200㎕씩 누적 도포하여 여드름 및 염증유발 동물 모델을 구성하였다.

구성모델의 왼쪽에 제조예 3의 샘플을, 오른쪽에 비교예 1의 샘플을 매일 2 ㎎/㎠로 여드름 및 염증이 유발될 때까지 도포하였다. 여드름 및 염증이 유발되었을 때 환부에서 농양을 채취한 후 배양하여 동일 균주임을 동정하였다.

본 발명에 사용된 균주와 동일한 균주에 의해 발생된 환부에 크림제형의 화장료를 왼쪽에 제조예 3의 샘플을, 오른쪽에 비교예 1의 샘플을 매일 2 ㎎/㎠로 한달 동안 도포하여 매일 관찰하면서 그 효과를 측정하였다.

본 임상실험 효과의 판정은 자체적으로 하기 표 7과 같이 기준을 설정하여 관찰자 2-3명이 그 기준에 대한 점수 또는 등급을 결정하여 상대적인 비교를 실시하였다.

	환부 상태	효과
1	정상적으로 치유	우수
2	환부가 중간이거나 더 이상 진행안됨	보통
3	환부가 크거나 염증이 더욱 진행	없음

표 7의 기준에 따라 한달 경과 후 실험동물의 환부에 대한 육안판정을 한 결과를 동물모델의 마리수로 표 8에 나타내었다.

효과(마리수)제형	효과 우수	효과 보통	효과 없음	계
제조예 3	8	2	-	10
비교예 1	-	1	9	10

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 10마리의 실험동물 중 80%가 제조예 3의 제형에서 우수한 효과를 나타내었고, 비교예 1의 경우 90%가 효과가 없는 것으로 나타났다.

따라서 여드름 및 염증이 유발된 환부에 대한 임상실험 결과, 락토바이오신이 첨가된 화장료에서 여드름 및 염증완화 효과가 탁월함을 알 수 있다.

본 발명에 의한 락토바이오신 함유 화장료는 피부에 상재하여 여드름 및 염증유발에 관여하는 미생물, 스타필로커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 파이오진스 및 프로피오니박테리움 아크네스의 생장을 억제함으로써 피부염증 유발을 억제할 뿐만 아니라 미생물 오염에 대해 화장료의 장기보존성을 증대시켜 천연 방부효능을 갖는다.

Claims

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락토코커스 스피시스 HY 49(기탁번호 FCC-10842호)에 의해 생산되고 TGY 배지에서 배양된 락토바이오신 배양액을 조성물의 총중량을 기준을 0.01 내지 10중량% 함유하며, 스타필로커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 파이오진스 및 프로피오니박테리움 아크네스의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 락토바이오신을 함유하는 여드름 및 염증 방지용 화장료 조성물.