KR101494661B1 - 흑마늘박 발효물을 포함하는 두피 또는 모발 케어용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본원은 흑마늘박 발효물, 이를 포함하는 두피케어 조성물, 이를 이용하여 제조된 두피케어 제품 및 이의 제조방법을 개시한다. 본원의 흑마늘박 발효물은 발효로 인해 항산화 기능을 나타내는 생리활성 성분이 강화되어 두피 염증반응 억제 및 보습력 강화효과를 가진 두피 케어용 의약품, 의약부외품 또는 화장품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흑마늘박 발효물을 포함하는 두피 또는 모발 케어용 조성물 및 그 제조방법 {Composition for hair or scalp treatment comprising fermented black garlic residue and method of preparing the same}

본원은 기능성 천연 발효물과 관련된 분야이다.

최근 각종 질환을 예방 또는 치료하기 위해 기존의 합성물질 대신에 각종 식물을 포함하는 천연물에 대한 관심이 급증하고 있으며, 유용성분의 규명과 함께, 유용성분을 극대화시키기 위한 방법도 개발되고 있다.

한편, 인체의 모발은 약 10만 내지 15만개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 갖고 성장기, 퇴행기, 휴지기를 거쳐 성장 및 탈락한다. 정상인에서 이러한 주기는 보통 3～6년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 60～100개의 모발이 탈락하게 된다.

최근에는 식생활의 변화, 사회 환경 등에 의한 스트레스의 증가로 인해 탈모, 피지 이상 분비, 비듬균 증가와 같은 두피 및 모발의 이상 증상으로 고민하는 인구가 늘어나는 추세이다. 그에 따라 탈모를 비롯한 각종 두피 및 모발의 이상 증상을 방지하고 두피 및 모발의 상태를 개선시킬 수 있는 조성물에 대한 연구가 진행되어 왔다.

한국 공개 특허공보 제2011-0072537호는 흑마늘박과 대두를 혼합 발효시킨 기능성 흑마늘발효 청국장 및 이의 제조방법에 대하여 개시되어 있다.

한국 공개 특허공보 제2005-0014478호는 홍삼, 당약, 천궁, 목단피 및 범부채를 함유하는 두피 및 모발 개선용 조성물이 개시되어 있다.

그런데, 기존의 두피 관련 제품들은 활성물질이 화학물질인 경우가 많아 두피에 부작용을 유발하는 경우가 많아, 안전성이 뛰어나면서도 경제성이 있는 제품 개발이 요구되고 있다. 또한 다양하고 새로운 소재를 이용한 안전성이 뛰어나면서도 경제성이 있는 천연물질 유래의 제품 개발이 요구된다.

본원은 항산화성 성분과 같은 기능성 성분이 강화된 천연 발효물 및 이를 이용한 기능성 제품을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 흑마늘박 발효물 또는 발효추출물을 포함하는 헤어 및/또는 두피케어용 조성물을 제공한다. 본원에 따른 일 실시예에서 발효는 지고사카로미세스 종(Zygosaccharomyces sp.)(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii), 사카로미세스 세르비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 중 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 지고사카로미세스 룩시이가 사용된다.

본원에 따른 조성물은 발효로 인하여 항산화성분 및 미네랄 성분이 발효전과 비교하여 증가한 것으로, 이로 인해 항산화로 인해 효과가 있는 다양한 분야에 적용될 수 있으며, 예를 들면 의약품, 의약외품 또는 화장품으로 제공될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 조성물은 탈모 방지효과, 발모효과, 육모효과, 피지의 과잉생성 억제효과, 비듬균에 대한 항균효과, 가려움 방지효과, 두피 및 모발의 보습효과를 지닌 두피 및 모발 개선용 조성물로 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 두피케어 조성물을 포함하는 두피케어 제품을 제공한다. 본원의 조성물을 포함하는 제품은 사용의 편리성, 보관, 운반, 소비자의 선호도 등을 고려하여 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들면 액상, 고형, 반고형, 과립, 분말 또는 크림, 연고, 페이스트, 거품, 젤, 로션, 파우더, 스트레이, 스틱 또는 에어로졸 형태로 제조될 수 있다. 다른 측면에서 본원에 따른 제품은 두피 또는 헤어샴푸, 두피 또는 헤어바, 두피 또는 헤어트리트먼트, 두피 또는 헤어토닉, 두피 또는 헤어팩, 린스 또는 삼푸와 린스의 혼합형 등으로 제조될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 흑마늘박 발효물의 제조방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 방법은 흑마늘박에 지고사카로미세스 종(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이, 또는 사카로미세스 세르비시아 균주를 접종하는 단계; 접종 후 접종물을 온도 약 28~30℃에서 약 40~72시간동안 약 150 ~ 300rpm 교반속도로 교반하면서 발효시키는 단계; 및 발효 후 100~140℃에서 10분간 멸균하여 발효를 종료시키는 단계를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서 흑마늘박은 약 5 내지 15 중량%의 양, 특히 10 중량%로 포함되고, 다른 구현예에서 균주는 약 1 내지 3%(v/v)의 양, 특히 약 2%(v/v)로 포함된다.

본원에 따른 흑마늘박 발효물은 발효로 인해 항산화 기능이 월등히 강화되어 항산화 기능을 나타내는 생리활성 성분이 강화되어 탈모 방지효과, 발모효과, 육모효과, 피지의 과잉생성 억제효과, 비듬균에 대한 항균효과, 가려움 방지효과, 두피 및 모발의 보습 효과를 가지고 있어 두피 보호 및 모발 생장용 의약품, 의약부외품 또는 화장품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에서 사용된 흑마늘박 원료 및 흑마늘박 발효균주 및 흑마늘박 효모 발효액의 사진이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 흑마늘박 배지에서 배양시간에 따른 각종 효모균의 생육 특성을 나타낸다: (A) 지고사카로미세스 종 TS-201201(KACC 93148P); (B) 지고사카로미세스 룩시이; 및 (C) 사카로미세스 세르비시아.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 흑마늘박 원료 첨가량에 따른 효모균(지고사카로미세스 룩시이)의 생육 특성을 나타낸다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 비듬균 말라세지아 푸르푸르(KCTC7744)의 항균활성 시험결과를 나타낸다.
도 5은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물로 처리된 THP-1 세포 생존율을 나타낸다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 처리에 따른 IL-8 발현 양상을 나타낸다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 처리에 따른 TNF-알파 발현 양상을 나타낸다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 처리에 따른 MMP 발현도 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 피부 안정성 여부를 마우스 피부에 도포하여 확인한 결과이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물이 도포된 마우스 피부 조직 염색 사진을 나타낸다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물의 처리에 따른 마우스에서의 모발 생장 촉진 결과를 나타낸다.
도 12는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물을 함유하는 두피케어용 헤어샴푸 시제품의 사진이다.
도 13은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물을 함유하는 두피케어용 헤어 샴푸바이다.
도 14은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 흑마늘박 발효물을 함유하는 샴푸를 사용한 후의 두피를 일반 샴푸 사용 후의 두피와 비교한 사진이다.

본원은 흑마늘박이 발효를 통해 유용 성분이 극대화되어 유용한 기능성 물질로서 효과를 발휘할 수 있다는 발견에 기초한 것이다.

한 양태에서 본원은 흑마늘박 발효물 또는 발효추출물을 포함하는 두피 및/또는 헤어 케어용 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용되는 흑마늘박은 생마늘을 열처리하여 숙성 또는 발효시켜 제조한 통흑마늘로부터 진액성분을 추출하고 남은 찌꺼기를 말한다. 마늘(Allium sativum L.)은 파, 양파, 부추, 달래 등과 함께 식물분류학적으로 백합과(Liliaceae) 알리움(Allium)속에 속하는 다년생 구근 식물이다. 이러한 마늘은 약 60% 정도의 수분, 28% 탄수화물(주로 프록탄), 2.3% 유기 황화합물, 2% 단백질(주로 알리나제), 1.2% 유리 아미노산(주로 아르기닌), 1.5% 섬유소, 0.15% 지방, 소량의 피친산(Phytic acid, 0.08%), 사포닌(0.07%), 그리고 시토스테롤(0.0015%) 등이 함유되어 있고, 비타민 A, B1, B2, C 등의 비타민류와 칼륨, 칼슘, 구리, 아연, 게르마늄, 철, 마그네슘, 망간, 인, 황, 셀레늄 등의 무기물도 미량 함유되어 있다고 알려져 있다. 습도 조건에서 숙성하여 제조된다. 이러한 흑마늘의 제조방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 (장은경, 서지현,이삼빈, “숙성에 의해 제조된 흑마늘 추출물의 생리학적 활성 및 항산화 효과, 한국식품과학회지, 40(4), 443-448, 2008)에 기재된 방법을 사용할 수 있거나, 또한 시중에서 구입할 수 있다 (의성농산,한국).

본원에서 “발효물”또는 "발효액"이란 본 발명에 따른 균주를 이용하여 발효과정을 거친 산물을 칭하는 것으로 발효 후 고형분이 제거 또는 제거되지 않은 것이 모두 본원에 포함된다. 한 구현예에서 발효 후 고형분은 체로 거른 후 사용된다. 본원의 발효에 사용될 수 있는 균주는 본원에 따른 효과를 나타낼 수 있는 다양한 균주가 포함될 수 있으며, 예를 들면 지고사카로미세스 종(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이, 또는 사카로미세스 세르비시아 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 본원의 흑마늘박은 지고사카로미세스 룩시이를 이용하여 발효된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "추출물(extract)"란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

본원에 따른 발효된 흑마늘박은 발효공정을 통해 원료내의 유효성분들이 다양한 유용성 성분으로 전이되며, 특히 발효를 통해 다양한 항산화 성분들 예를 들면 플라보노이드 또는 폴리페놀의 함량이 강화되고, 미네랄 함량이 증가되어 기능성 성분이 활성형태로 전이되어 그 유용성이 극대화되었다.

본원에서 사용된 용어 "항산화 기능" 또는 "항산화"는 함께 사용 시 생물학적 물질의 산화를 저해, 억제하는 기능을 말하는 것으로, 자유 라디칼기, 또는 기타 반응성 산소 (O₂ ^-, H₂O₂, OH, HOCL, ferryl, peroxyl, peroxynitrite, alkoxyl)를 제거하거나 또는 이의 형성을 억제하거나 또는 이들 물질을 반응성이 약한 물질로 전환하는 기능을 가지는 것을 의미하며, 항산화 기능이 있는 물질은 산화와 관련된 질환이 치료 또는 예방에 효과가 있다. 항산화성을 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 전자공여능을 측정하는 Blois (Blois, M.S. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature, 181: 1199-1200) 이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 "두피 보호" 또는 “두피 케어”는 두피의 질환 증세를 억제 또는 지연시키거나, 증세를 호전 또는 이롭게 하는 모든 행위 또는 효과를 의미하며, 모발케어를 포함하는 개념이다. 예를 들면 두피케어로 인해 모발 생장이 촉진되며 "모발 생장"은 모발의 성장 및 탈락 주지 중에서 성장기에 있는 모발 비율이 감소하고 퇴행기 및 휴지기의 모발 비율이 증가하여 비정상적으로 모발의 탈락이 증가하는 증세를 억제 또는 지연시키는 모든 행위, 및 모발의 비율이 증가하게 하는데 영향을 미쳐 모발이 증가하는데 영향을 미치는 모든 행위를 의미한다. 본원에 따른 조성물을 이용한 두피케어에 의한 효과로는 모발 생장, 탈모 방지효과, 발모효과, 육모효과, 피지의 과잉생성 억제효과, 비듬균에 대한 항균효과, 가려움 방지효과, 두피 및 모발의 보습효과 등이 포함되며, 이러한 의미에서 모발 케어도 본원에 포함된다.

본 발명의 조성물은 흑마늘박 발효물, 발효추출물 뿐 아니라 이와 동일 또는 유사한 기능을 지닌 다른 유효성분을 추가로 함유하거나, 또는 상기 성분들과 상이한 기능을 지닌 다른 유효성분을 추가로 함유함으로써, 두피 및 모발개선용 화장품 조성물 또는 두피 및 모발 개선용 의약품 또는 의약외품 조성물로 제조될 수 있다.

이 경우 본 발명의 의약품, 의약외품 또는 화장품 조성물은 흑마늘박 발효추출물을 총 중량의 0.10～15.00 중량부로 함유한다.

본 발명의 의약품, 의약외품 또는 화장품 조성물에서 추가로 함유될 수 있는 성분들은 두피 및 모발의 국부적 표면에 직접 적용되어 두피 및 모발의 개선 효과를 증진시킬 수 있는 성분이면 모두 사용가능하며, 구체적으로는 티로시나제 활성촉진제, 침투촉진제, 혈류촉진제, 모포부활제 또는 5-리덕타제 억제제, 두피영양제, 가려움 억제제 등이 있다.

두피영양제는 구체적으로 철분, 칼슘, 망간, 필수 아미노산, 염산 피리독신, 비오틴, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 D 및 엽산으로 이루어진 1가지 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 멘톨 디엘-판테놀, 폴리쿼터늄-7, 트리세틸모늄클로라이드, 디메치콘/이소라우레스-6, 세틸트리메칠암모늄클로라이드, 세테아릴알코올, 케라틴, 아미노산, 사이클로펜타실록산/디메치콘, 디메치콘/이소라우레스-6 이외 각종 미네랄 등이 될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 발효물, 발효추출물 또는 조성물을 포함하는 헤어 또는 두피케어 제품 예를 들면 모발을 포함하는 두피케어용 기능성 제품에 관한 것이다. 본원에 따른 제품은 사용양태 등에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있으며 예를 들면 액상, 고형, 반고형, 과립, 분말 또는 크림, 연고, 페이스트, 거품, 젤, 로션, 파우더, 스트레이, 스틱 또는 에어로졸 형태로 제조될 수 있거나 또는 샴푸바, 삼푸, 트리트먼트, 토닉, 팩, 린스 또는 삼푸와 린스의 혼합형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 두피케어용 제품 또는 조성물은 일반적인 두피 및 모발용 외용제제에 배합될 수 있는 기제 성분을 필요에 따라 추가할 수 있다. 구체적으로는 용해보조제, 계면활성제, 보습제, 즘정제, pH 조정제, 방부제, 산화방지제, 금속이온봉 쇄제, 살균제, 항염증제, 항미생물제, 용제, 착색제, 또는 착향제 등이 있다. 용해보조제는 구체적으로 이소프로필 미리스테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 탄화수소, 글리콜류 등이 될 수 있다.

계면활성제 중 음이온계 계면활성제는 구체적으로 암모늄 라우릴술포숙시네이트, 암모늄 라우릴 설페이트, 소디움, 코코일 이세시오네이트, 소디움 라우릴 이세시오네이트, 소디움 라우릴 설페이트, 트리에탄올아민 라우릴 설페이트, 소디움 라우릴 에테르 설페이트(에틸렌옥사이드 1～3개) 등이 될 수 있다. 계면활성제 중 비이온성 계면활성제는 구체적으로 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유 유도체, 지방산 디에탄올아미드, 글리세릴스테아레이트 등이 될 수 있다. 계면활성제 중 양이온성 계면활성제는 구체적으로 3급 지방족 아민염, 알킬트리메칠암모늄클로라이드, 디알킬디메칠암모늄클로라이드 등이 될 수 있다. 계면활성제 중 양쪽성 계면활성제는 구체적으로 베타인, 아미드베타인형, 설포베타인형, 스테아르트리모늄클로라이드 등이 될 수 있다.

보습제는 구체적으로 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등이 될 수 있다.

점증제는 구체적으로 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카라기난, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 등의 수용성 고분자 화합물이 될 수 있다.

pH 조정제는 구체적으로 구연산, 수산화나트륨, 트리에탄올아민, 구연산나트 륨, 인산, 인산나트륨, 젖산 등이 될 수 있다.

방부제는 구체적으로 벤조산, 파라옥시안식향산에스테르, 메칠클로로이소치아졸리논의 혼합물, 페녹시에탄올, 디엠디엠 히단토인 등이 될 수 있다.

산화방지제는 구체적으로 디부틸히드록시톨루엔, 아스코르빈산 등이 될 수 있다.

금속이온봉쇄제는 구체적으로 에칠렌디아민테트라초산디나트륨,에칠렌디아민테트라초산테트라나트륨 등이 될 수 있다.

살균제는 구체적으로 클로르헥시딘 글루코네이트, 4급 암모늄염, 피록톤올아민, 아연피리치온 현탁액, 요도프로피닐 부틸카바메이트, 살리실산 등이 될 수 있다.

항염증성분은 구체적으로 글리시리진산모노암모늄, 글리시리진산디칼륨, 스테아릴글리시리지네이트, 카모마일, 알파비사보롤, 알란토인 및 이들의 혼합물 등이 될 수 있다.

항미생물성분은 구체적으로 페녹시에탄올, 클로르헥시딘, 클로르헥시딘 글루코네이트, 피록톤올아민, 케토코나졸, 아르니카추출물, 요도프로피닐부틸카바메이트, 벤잘코늄클로라이드, 벤젠토늄클로라이드, 벤조산 및 그의 염, 벤질알코올, 라벤다, 로즈마리, 살리실산, 트리클로카르반, 아연피리치온 현탁액 및 그들의 혼합물 등이 될 수 있다.

용제는 구체적으로 에탄올, 정제수, 트윈 20, 사이클로메치콘, 미네랄오일, 디메치콘 등이 될 수 있다.

착색제와 착향제는 일반적인 두피 및 모발용 제제에 사용되는 기제들을 사용할 수 있다.

본 발명의 두피케어용 조성물은 두피나 모발에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용하는 것이 바람직하다

본 발명의 조성물은 통상의 부형제 등과 배합되어 샴푸, 헤어 토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어스프레이 등과 같이, 용액, 솔젤, 에멀전, 왁스 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 샴푸 조성물은 통상적으로 샴푸 조성물에 함유되는 성분들을 포함한다. 본 발명에서 통상적인 샴푸 조성물의 기본적 속성은 다음과 같다. 먼저는 적당한 세정성을 가져야 한다. 오염은 충분히 없애야 하지만 피부 및 모발에 필요한 피지는 없애지 않는 적당한 세정력이 필요하다. 크리미(creamy)하고 풍부한 지속성이 있는 거품이 일어나야 하며, 세발 중의 마찰에 의한 손상으로부터 모발을 보호해야 한다. 또한, 세발 후 모발에 자연스러운 윤기와 적당한 유연성을 부여해야 하며, 피부, 모발 및 눈에 대한 안정성이 높아야 한다. 부가기능의 관점에서 통상적인 샴푸는 다음과 같은 타입의 샴푸가 있다. 유분을 함유하여 세정 후의 느낌을 향상시킨 오일 샴푸 혹은 크림 샴푸, 세발 중 모발의 손상을 방지하는 컨디셔닝 샴푸, 비듬 및 가려움증을 방지하는 비듬 샴푸, 피부 및 모발에 대한 자극이 통상의 것보다 낮은 저자극 샴푸, 모발 표면의 마찰저하, 정전기방지, 모발보호 등 린스 기능을 부여한 린스겸용 샴푸 등이 있으며, 본 발명의 샴푸 조성물은 이러한 기능 중에서 몇 가지를 조합하여 사용할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 조성물에 사용되는 흑마늘박 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 본원에서 발효는 이로 제한하는 것은 아니나, 지고사카로미세스 종(Zygosaccharomyces sp.)(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii), 또는 사카로미세스 세르비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 한 구현예에서는 본원의 흑마늘박은 지고사카로미세스 룩시이를 이용한다.

본원에 따른 방법은 일 구현예에서 흑마늘박에 흑마늘박에 지고사카로미세스 종(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이, 또는 사카로미세스 세르비시아를 접종하는 단계; 상기 지고사카로미세스 종(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이, 또는 사카로미세스 세르비시아는 각각 온도 약 28~30℃에서 약 40~72시간동안, 약 150 ~ 300rpm 교반속도로 교반하면서 발효시키는 단계; 및 발효 후 약 100~140℃에서 약 10분간 멸균하여 발효를 종료시키는 단계를 포함한다. 본원에 따른 방법에서 상기 흑마늘박은 약 5 내지 15 중량%, 특히 10 중량% 양으로 포함되고, 상기 균주는 약 1 내지 3%(v/v)의 양, 특히 2% 양으로 포함될 수 있다.

본원 방법에 의해 발효 제조된 흑마늘박 발효추출물은 발효하지 않은 흑마늘박추출물과 비교하여 항산화 성분, 각종 미네랄 성분, 및 아미노산 성분이 강화되고, 항염 및 항균 효과에서도 비발효물과 비교하여 우수한 효과를 나타냈다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흑마늘박 발효추출물의 대량 제조

1-1. 흑마늘박 발효를 위한 최적 미생물 균주의 선별

흑마늘박 발효에 가장 적합한 효모 균주를 선별하기 위해 참여기업이 보유한 특허균주 지고사카로미세스 종 TS-201201(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이( Zygosaccharomyces rouxii ), 및 사카로미세스 세레비시아( Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하여 흑마늘박을 주원료로 하는 배지에서 증식하는 미생물 농도에 따른 배양액 탁도를 흡광도(600nm)법으로 측정하였다.

흑마늘박 5g을 증류수 100ml와 혼합하여 멸균한 액체 배지(흑마늘박 5g+ 증류수 100ml)에 상기 3종의 균주를 각각 접종한 후 28℃에서 60시간 배양하면서 가장 높은 흡광도값을 나타내는 균주를 선별하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 지고사카로미세스 룩시이가 배양시간 전반에 걸쳐 가장 높은 흡광도 값을 보여 흑바늘박 이용성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 배양 48시간 이후에는 배양액 내의 흡광도 값 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 한편 지고사카로미세스 종 TS-201201 균주의 경우 생육 양상은 지고사카로미세스 룩시이와 거의 유사하나 최종 균체량이 다소 낮아 최종 균주는 지고사카로미세스 룩시이로 결정하였다.

1-2. 흑마늘박 발효 및 추출 조건의 최적화

흑마늘박에 포함된 총 총폴리페놀 함량을 극대화하기 위하여, 균체 생육 및 효모 발효조건을 확립하기 위한 기초 배양실험을 실시하였다.

최적 흑마늘박 원료비를 도출하기 위하여 증류수를 100ml로 고정시키고 건조시킨 흑마늘박 원료를 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%(w/v)로 달리 첨가시킨 멸균 배지를 제조한 후, 종균 효모를 이스트 추출물 3g/L, 맥아(malt) 추출물 3g/L, 펩톤 5g/L, 덱스트로즈 10g/L로 구성된 YM 배지에서 28℃, 30시간 배양한 후 균체 수가 1.4x10⁶ ~ 1.2x10⁷ CFU에 도달한 배양액 10ml를 각각 접종하여 28℃, 150rpm에서 48시간 배양하면서 배양액 탁도를 흡광도법으로 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 흑마늘박 원료 함량비가 증가될수록 균체 생육도 증가하는 양상이었으며, 특히 건조시킨 흑마늘박이 10%(w/v) 첨가되었을 경우 배양 48시간 후 최고 흡광도값을 나타내었고, 추가의 흑마늘박 원료가 공급되더라도 균체 생육에는 크게 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 따라서 최적 원료 첨가비를 건조 흑마늘박 기준 10%(w/v)로 결정하였다(표 1)

흑마늘박 발효액 제조를 위한 종균 접종량을 결정하기 위해 다른 배양조건을 동일시하고 효모 종균 접종비를 1 ~ 7%(v/v) 범위에서 1%씩 늘려가며 접종한 뒤 48시간 배양 후 균체 건조중량을 측정하였다. 그 결과 2%(v/v)까지는 종균량이 증가할수록 균체 생육이 증가하였으나 그 이상에서는 거의 유사한 양상이 관찰되었다. 따라서 종균 접종량은 종균 효모를 YM 배지에서 28℃, 30시간 배양한 후 균체 수가 1.4x10⁶ ~ 1.2x10⁷ CFU에 도달한 배양액 2%(v/v)로 결정하였다(표 1).

종균 접종량에 따른 효모균의 생육 특성
종균 접종량 (%, v/v)	흑마늘박 (%, W/v)	배양온도 (℃)	교반속도 ( rpm )	건조 균체량 (g/L)
1	10	28	150	3.9
2	10	28	150	5.2
3	10	28	150	5.1
4	10	28	150	5.3
5	10	28	150	5.2
6	10	28	150	5.1
7	10	28	150	5.4

이어서 발효 종료 시간을 결정하기 위해 흑마늘박 원료비와 종균접종량을 일정하게 하고 사용한 효모의 대수기 초반에 해당하는 배양 24시간 이후부터 72시간까지 12시간 간격으로 균체 농도와 배양액에 포함된 총폴리페놀 함량을 측정하였다. 이때 총폴리페놀 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 일부 변형하여 비색 정량하였다. 갈릭산(Sigma, USA)을 이용한 표준곡선을 작성하여 계산한 후 추출물의 총폴리페놀함량은 g당 mg 갈릭산으로 나타내었다. 그 결과 배양 48시간 이후 균체량도 거의 최대 수준에 도달하였고, 총폴리페놀 함량이 가장 높게 나오는 것으로 분석되었으며, 이를 기준으로 효모 배양을 48시간에 종료하였다(표 2).

배양 시간에 따른 효모균의 생육 및 총폴리페놀 농도 변화
배양 시간 (h)	건조 균체량 (g/L)	총 폴리페놀 ( mg /100g)
24	2.8	19.6
36	3.6	21.8
48	4.9	52.7
60	5.2	50.3
72	5.2	49.6

교반 속도를 결정하기 위해 배양 장치 교반 속도를 0~300 rpm 범위에서 50rpm씩 증가시켜가며 배양 42시간 이후 수득한 균체농도 및 총폴리페놀 함량을 측정하였다. 교반속도가 증가할수록 균체 생육이 다소 증가되는 양상을 보였으며, 200 rpm 이후부터는 균체 생육이 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 또한 총폴리페놀 함량의 경우도 균체 생육이 가장 우수한 200rpm에서 가장 높은 값으로 분석되어 최적 교반속도를 200rpm으로 결정하였다(표 3).

교반 속도에 따른 효모균의 생육 및 총 폴리페놀 농도 변화
교반 속도( rpm )	접종량 (%)	배양 온도(℃)	건조 균체량 (g/L)	총폴리페놀 ( mg /100g)
0	2	28	3.2	21.5
50	2	28	3.5	34.3
100	2	28	4.1	37.2
150	2	28	4.6	51.9
200	2	28	5.1	71.2
250	2	28	4.9	68.9
300	2	28	5.1	64.6

상기에서 얻은 흑마늘박 최적 발효 조건에 따라 수득된 발효액을 제형화하기 위한 발효 후 공정 조건을 검토하였다. 우선적으로 불필요한 발효가 진행되는 것을 막음과 동시에 발효액에 포함된 유용 성분 추출을 극대화하기 위해 배양액을 고온 고압 처리하여 이에 따른 총폴리페놀 함량 변화를 검토하였다. 발효액을 121℃에서 10분간 멸균시킨 흑마늘박 발효액의 경우 총폴리페놀 함량이 74.8 mg/100g으로 처리하지 않은 발효액보다 다소 높은 값을 나타내었다.

또한 제형화 및 보존 안정성을 위해 요구되는 고형분을 제거하기 위해 1차적으로 일반 여과체를 거쳐 나온 액상의 여액을 2차로 여과지(왓트만)로 여과시키고, 마지막으로 분자량 5만 달톤 UF 멤브레인을 이용하여 정제하였다. 정제 후 수득한 액상의 발효 추출액의 경우 고형분을 제거하기 전 총폴리페놀 함량이 약 74.8mg/100g에서 82.3mg/100g으로 다소 증가되었다. 상기 액상 또는 이를 동결건조시켜 분말형태로 제조하여 냉장 보관하면서 각종 분석에 사용하였다.

실시예 2 발효액의 이화학적 특성 및 주요 성분 분석

2-1. 흑마늘박 발효 추출물의 이화학적 특성

흑마늘박 발효추출물의 이화학적 특성 평가는 균체 제거 및 여과의 분리 정제과정을 거치고 난 후 동결 건조한 분말과 액상 시료를 이용하여 가용성, pH, 열안정성을 측정하였으며 그 결과는 표 4에 나타나 있다. 비교군은 동일 조건에서 효모를 발효시키지 않고 제조한 흑마늘박 열수 추출물을 사용하였다.

흑마늘박 발효추출물의 이화학적 특성
구분	발효 흑마늘박 추출물	무발효 흑마늘박 추출물
수용성	+++	+++
pH	4.9	4.3
열 안정성(-10℃~80℃)	+++	++
색도	갈색	흑갈색

2-2. 흑마늘박 발효 추출물에 포함된 총 폴리페놀 함량 및 항산화 활성

흑마늘박 발효추출액에 포함된 총 폴리페놀 함량은 최종 발효원액 5배 농축액을 제조하여 수원여자대학교 식품분석연구센터에 의뢰하여 분석하였다. 흑마늘박을 발효시켜 제조한 발효액을 5배 농축시킬 경우 총 폴리페놀 함량이 390.98mg/100g으로 동일 조건으로 제조한 발효시키지 않은 시료 115.12mg/100g에 비해 현저히 증가됨을 확인하였다 (표 5 참조).

흑마늘박 발효 추출액의 항산화 관련 성분분석
구분	발효 흑마늘박추출물	무발효 흑마늘박추출물
총 폴리페놀(mg/100g)	390.98	115.14
SOD 활성 (%)	29.7	19.2

흑마늘박 발효 추출물에 포함된 항산화 활성은 대표적인 항산화 효소인 SOD 활성을 SOD 어세이 킷트를 사용하여 측정하였다. 시험 방법은 식품 공전에 따라 수행하였으며, 반응 후 분광광도계를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정 후 아래와 같이 SOD 활성을 계산하였다.

SOD(%) = (1-(A-B)/C)x100

A : 잔틴 옥시다아제 시약에 시료 첨가 후 흡광도를 측정

B : 잔틴 옥시다아제 시약 대신 블랭크 버퍼 첨가 후 흡광도 측정

C : 잔틴 옥시다아제 시약에 증류수 첨가 후 흡광도 측정

상기 표 5에 나타난 바와 같이 발효 전에 비해 흑바늘박 발효추출액의 경우 항산화와 관련된 SOD 활성은 효모 발효를 통해 약 1.5배로 증가하는 양상을 나타내었다. 따라서 항산화와 관련된 각종 생리활성 기능이 강화되었음을 나타내는 것이다.

2-3. 흑마늘박 발효 추출물의 주요 미네랄 성분 분석

흑마늘박 발효 추출물의 주요 미네랄 성분 분석은 발효 전 추출물과 동일한 농축 조건에서 비교 분석하였다. 주요 생리활성 미네랄 성분으로는 마그네슘, 구리, 아연으로 이의 성분 함량을 원자흡광분광광도계를 이용하여 분석하였다. 그 결과 표 6에 나타난 바와 같이 흑마늘박 발효 추출물에 포함된 주요 미네랄 성분이 효모 발효시킬 경우 증가하였으며 특히, 아연의 경우 약 1.7배로 가장 많이 증가한 것으로 분석되었다.

흑마늘박 발효 추출물의 주요 미네랄 성분분석
구분	발효 흑마늘박추출물	무발효 흑마늘박추출물
마그네슘(ppm)	893	564
구리(ppm)	4.1	3.7
아연(ppm)	43	25

2-4. 흑마늘박 발효 추출물의 주요 아미노산 함량

흑마늘박 발효 추출물의 주요 아미노산 함량에 관한 성분 분석을 식약청 지정 식품위생검사 기관인 (주)엔텍분석연구원에 의뢰하여 수행하여 분석한 결과 흑마늘박 발효추출액의 경우 총 아미노산 함량이 약 1517.63mg/100g으로, 발효시키지 않은 시료의 647.70mg/100g에 비해 거의 2배가 증가된 것으로 분석되었다 (하기 표 7 참조). 특히 두피나 모발 영양에 도움을 준다고 알려진 메티오닌과 시스테인의 함량도 발효 후에 각각 약 15%와 47% 증가하는 양상을 보였다.

시험항목	발효 흑마늘박추출물	무발효 흑마늘박추출물
Aspartic acid(mg/100g)	151.465	77.214
Threonine(mg/100g)	63.247	26.780
Serine(mg/100g)	69.031	31.174
Glutamic acid(mg/100g)	321.212	114.031
Proline(mg/100g)	80.708	32.534
Glycine(mg/100g)	73.855	31.118
Alanine(mg/100g)	114.817	37.465
Cystine(mg/100g)	12.824	8.714
Valine(mg/100g)	93.946	47.304
Methionine(mg/100g)	12.156	10.538
Isoleucine(mg/100g)	65.063	26.408
Leucine(mg/100g)	108.688	49.744
Tyrosine(mg/100g)	49.050	25.740
Phenylalanine(mg/100g)	78.564	40.127
Histidine(mg/100g)	47.684	21.784
Lysine(mg/100g)	81.428	23.523
Arginine(mg/100g)	93.890	43.500
Total(mg/100g)	1517.629	647.698

실시예 3. 흑마늘박 발효 추출물의 항균 활성 평가

흑마늘박 발효 추출물이 갖는 총 폴리페놀 함량 증대에 따른 두피 관련 항균 활성을 검토하기 위하여 비듬균으로 알려진 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur)(KCTC7744)를 분양받아 항균 활성을 분석하였다.

항균 활성 최소 저해 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 분석은 흑마늘박 추출물을 농도별로 희석하여 시료를 준비한 후 시료액 200μL와 탁도(turbidity)를 맞춘 비듬균 배양액(O.D.600=0.268) 200μL를 순차적으로 첨가한 뒤 33℃에서 24시간 동안 배양하여 96-웰 플레이트를 이용해 600nm에서 탁도를 측정하였다. 24시간 후의 혼합액의 탁도를 측정하여 균의 생장이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다. 그 결과, 흑마늘박 발효 추출물의 경우 최소 생육저해농도는 16.3mg/ml, 발효시키지 않은 흑마늘박 추출물은 89.2mg/ml에서 최소 생육저해농도를 나타내어 발효에 의해 항균성이 약 5.5배 정도 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 비듬균 이외에 대장균(Escherichia coli) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 MIC 시험을 실시하였으며, 결과는 도 4 및 하기 표 8에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 상기 2 종류의 균에서도 발효시킨 흑마늘박 추출물의 최소 생육저해농도가 더 낮게 나오는 경향성을 확인하였다. 따라서 발효에 의해 항균성이 증대됨을 알 수 있다.

흑마늘박 발효추출물의 비듬균 및 박테리아균에 대한 최소저해농도
균주	흑마늘박 발효추출물 ( mg / ml )	흑마늘박 추출물 ( mg / ml )
비듬균	16.3±0.1	89.2±0.6
대장균	13.7±0.3	65.9±0.4
녹농균	17.2±0.1	77.1±1.3

항균활성을 검토하기 위해 말라세지아 푸르푸르 배양액 200μL를 배지 위에 도말한 후 멸균된 페이퍼 디스크를 놓고, 위에 흑마늘박 추출물 시료들을 각각 50μL씩 분주하여 24시간 배양 후 주위에 생기는 환의 지름을 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 발효시키지 않은 흑마늘박 추출물을 처리한 경우는 항균 활성이 관찰되지 않았으나 흑마늘박 발효 추출물을 처리한 경우 3.1±0.2mm의 생육 저지대가 형성됨을 확인할 수 있었다. 양성 대조군으로 비듬 치료제인 케토코나졸을 사용하여 확인하였다.

실시예 4. 흑마늘박 발효 추출물의 기초 세포생활도 평가(cell viability assay)

세포의 생존율은 제조된 추출물을 희석하여 세포에 처리한 뒤 현미경 하에서 세포 수를 측정하여 분석하였다. 염증 반응과 관련된 THP-1 세포를 2.0 x 10⁴ 세포/웰의 농도가 되도록 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에 현탁하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 200μL씩 접종하였다. 추출물을 적정 농도로 처리한 뒤 24시간 동안 배양한 후 각 웰 당 50μL를 덜어내서 헤마사이토미터를 이용해서 단위 구역당 세포 수를 측정하였다.

흑마늘박 발효 추출물과 발효시키지 않은 시료를 500μg/ml 농도까지 처리한 후 24시간 배양 후에 세포수를 측정한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 흑마늘박 발효 여부와 상관없이 흑마늘박 추출물은 THP-1 세포에 대해 세포독성은 나타나지 않았다.

실시예 5 흑마늘박 발효 추출물의 염증반응 억제 효능 평가( in vivo )

흑마늘박 발효 추출물의 두피 염증반응 개선 효능을 분석하기 위해 사람의 단핵구 세포인 THP-1 세포주를 이용하여 염증반응과 관련되는 사이토카인 중 IL-8과 TNF-알파 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 흑마늘박 발효 추출물 및 흑마늘박 추출물은 3차 증류수에 각각 100, 500μg/ml 농도로 녹인 후 사람의 단핵구인 THP-1 세포에 시료를 처리하였고, 염증 반응 억제능을 보기 위한 모델로 LPS(리포폴리사카라이드)를 처리하여 자극을 주었다. 처리 후 24시간째 배양 상층액을 분리한 후 ELISA 실시하여 사이토카인 농도를 측정하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 흑마늘박 추출물은 발효 유무와 관계없이 단독으로는 IL-8 발현에 영향을 미치지 못하였다. 하지만, 주된 염증 유발물질인 LPS로 자극을 주어 처리할 경우 흑마늘박 발효추출물의 경우 IL-8 생성을 억제하는 경향성이 유의적으로 확인되었으며, 이는 두피에서 발생할 수 있는 염증반응을 억제시킬 수 있는 가능성을 의미한다.

염증성 사이토카인 중 TNF-알파의 경우도 도 7에 나타난 바와 같이 거의 유사한 양상을 보였으며, 흑마늘박 발효추출물은 단독으로는 TNF-알파 발현에 영향을 미치지 못하였지만 LPS로 자극을 주어 처리할 경우 그 발현도가 억제되는 경향성을 확인할 수 있었다. 하지만 발효시키지 않은 흑마늘박 추출물의 경우 단독 또는 LPS 자극 후 처리시 모두 TNF-알파 발현에는 큰 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다.

실시예 6. 흑마늘박 발효추출물의 두피 노화방지 효능 평가( in vivo )

흑마늘박 발효추출물의 두피 노화 방지 효능을 분석하기 위해 MMP(matrix metallopeptidase)-9와 MMP-2 분비량을 THP-1 세포주를 이용하여 자이모그래피(zymography)로 분석하였다. 자이모그래피는 0.1% 젤라틴이 포함된 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤에서 염증반응과 관련된 MMP-9와 MMP-2를 전기영동 후 MMP-9와 MMP-2가 효소작용을 할 수 있는 조건에서 젤을 배양하여 젤라틴의 분해 정도를 통해 분비된 MMP-9와 MMP-2의 양을 측정하는 것이다.

THP-1 세포를 1.0x10⁵세포/웰의 농도가 되도록 혈청이 없는 RPMI 1640 배지에 현탁하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 접종한 뒤 흑마늘박 발효추출물, 발효시키지 않은 추출물 및 리포폴리사카라이드로 자극하였다. 자극 24시간 후 분리된 상층액과 FOZ 버퍼(4% SDS, 20% 글리세롤, 0.01% 브로모 페놀. 0.125 M-트리스-Cl)를 섞어 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동 후 2.5% 트리톤 X-100에 젤을 40분간 넣어두어 SDS를 제거한 뒤 다이제스천 버퍼(50mM 트리스-HCl, pH 7.6, 0.15M NaCl, 10mM CaCl2, 0.02% NaNO3)에 젤을 침지하여 12시간 동안 37℃에서 배양하였다.

배양 후 젤을 0.1% 쿠마씨브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250으로 염색 및 탈색을 통해 젤라틴의 분해를 확인하였다. 도 8에서 보는 바와 같이 흑마늘박 발효추출액 300㎍/ml 농도로 처리 시 LPS 자극이 있을 시 발효시키지 않은 추출액과는 달리 피부 노화촉진 효소 중의 하나인 MMP-9 생성을 억제시키는 경향성이 유의적으로 확인되었다. 이는 자외선과 열 등에 쉽게 노출되는 두피 노화를 방지함으로써 두피 개선에 도움을 줄 수 있는 가능성을 의미한다. 하지만 MMP-2 발현에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 분석되었다.

실시예 7. 시험 동물을 이용한 흑마늘박 발효추출물의 안전성 평가 및 모발생장 여부

7-1. 흑마늘박 발효추출물의 안정성 평가

흑마늘박 발효추출물의 피부에 대한 기초 안전성과 모발생장으로의 복합 기능 여부를 검토하기 위해 마우스에 대한 시험을 수행하였다. 실험군은 흑마늘박 발효추출액(A. 5g/100ml D.W.), 발효시키지 않은 흑마늘박 추출액(B, 5g/100ml D.W.), 시중 약국에서 구입한 현대약품의 5% 미녹시딜(C)과 음성대조군(정제수) 총 4군으로 나누고, 각 군마다 마우스(C57BL/6) 6주령을 5마리씩 실시하였다.

매일 오전과 오후 총 2회씩 시료를 0.3ml씩 각 개체마다 등에 도포하며 잘 흡수되도록 충분히 마사지를 해주고 발모 상태를 관찰하였으며, 실험기간은 2주간 도포하였다. 시료를 도포하면서 육안 관찰을 하는 과정에서 특히, 도포 초기(5일 경과 사진)에 발효시키지 않은 흑마늘박 추출액(B)과 5% 미녹시딜(C) 처리군에서 피부 손상이 있음을 확인하였다. B 군의 경우 도포 5일경에 피부가 붉어지다가 1주 후 회복되었으며, C 군의 경우 피부 각질화가 심하고, 각질층이 벗겨진 후 회복세를 보이는 것으로 관찰되었다(도 9).

최종 도파가 끝나고 각 군마다 2개씩 무작위로 선택하여 피부 조직을 채집하고 포항바이오정보센터에 의뢰하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 실시하고 확보한 조직 사진은 도 10과 같다. 조직학적 소견으로는 흑마늘박 발효추출액인 A 시료를 도포한 피부에서 특별한 변화를 관찰하지는 못하였고 발효시키지 않은 흑마늘박 추출액 시료 B와 5% 미녹시딜 C를 도포한 피부조직은 상대적으로 상피층이 약간 두꺼워져 있었다. 이는 피부 손상과 관련가능성이 있는 것으로 생각되었다. 이와 같은 결과로 볼때 발효시킨 흑마늘박 추출물의 경우 두피에 접촉 시 상대적으로 별다른 피부트러블을 유발시키지 않을 안정한 물질임을 나타낸다.

7-2. 흑마늘박 발효추출물의 모발 생장에 미치는 영향

상기 마우스 시험을 실시하는 동안 발효 흑마늘박 시료의 피부안정성 뿐만 아니라 도 11에 나타나있는 바와 같이 모발생장 촉진 효과를 기초적으로 육안 관찰을 통해 확인할 수 있었다. 흑마늘박을 발효시킨 추출물을 처리한 A 군에서 모발생장 속도가 빠른 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 흑마늘박 발효추출물의 기초 피부자극도 및 보습력 관련 평가

피부자극도 임상 평가를 위해 흑마늘박 발효추출액(10g/100ml)을 제조하여 피부자극도와 피부건조도 측면에서 (재)대구테크노파크 한방산업지원센터에 의뢰하여 실시하였다.

피부자극성 시험방법은 피험자의 좌측 하박 안쪽의 평평한 부위로 착색이나 피부 손상이 없는 부위에 시험물질인 흑마늘박 발효추출액을 500배, 1000배 희석한 시료와 0.1% 히알루론산 나트륨 원액을 도포하고 관찰한 사진 및 설문 평가를 수행하였다.

IQ 챔버에 필터 페이퍼를 장착하고 시험액 20㎕를 필터 중앙에 로딩하고 피부에 밀착시킨 후 3M 마이크로포어 테이프로 고정하였다. 시험물질 적용으로부터 24시간 후 IQ 챔버를 제거하고 30분 후 시험물질 적용부위의 사진촬영 및 연구자에 의한 피부반응 정도를 평가하였다. 또한 시험물질 적용부위에서의 따끔함, 화끈거림, 가려움에 관한 설문평가를 실시하였다.

결과에 따르면 만21~50세인 피부질환 및 급만성 질환이 없는 성인 12명을 대상으로 흑마늘박 발효추출물의 피부자극 정도를 평가한 결과 각 시험물질의 24시간 첩포 후 피부반응에 대한 연구자 육안평가 결과 500배 희석액은 피부자극지수가 0.11, 1000배 희석액은 0.02로 두 가지 모두 저자극성 범주에 속함을 확인할 수 있었다. 한편 음성대조군인 0.1% 히알루론산 나트륨 용액의 피부자극지수는 0.01이었다. 이때 기준으로 사용한 시험물질의 피부자극정도는 하기 표 9에 나타난 피부자극지수표를 참조하여 판정하였다.

피부자극지수	구분	비고
0.00~0.25	저자극성	6.25%
0.26~1.00	경도 자극성	25.00%
1.01~2.50	중등도 자극성	62.50%
2.51~4.00	중증 자극성	100.00%

제제예 1. 샴푸 제제의 제조

흑마늘박 발효추출물을 함유하는 두피케어용 샴푸 제형을 제조하기 위하여 하기 실험을 하였다. 흑마늘박 발효추출물 첨가시 샴푸의 색상 및 성상을 관찰하고 제형은 연갈색의 액상 타입으로 정하여 하기 표 10의 최종 성분혼합비를 결정하였다.

흑마늘박 발효 추출물을 함유한 두피케어용 샴푸 제품 성분비
성분	함량(%)	비고
천연추출물 5종 및 첨가제	15	흑마늘박 발효추출물 함량 10% 이상
소듐라우레스설페이트	8
코카미도프로필베타인	10
코마마이드엠이에이	8
프로필렌글라이콜	7
소듐클로라이드	4
폴리쿼터늄-11	2
글리세린	7
시트릭애씨드	5
디메치콘	3
디소듐이디티에이	0.1
판테놀	0.7
호호바오일	3
향료	0.2
천연보존제	2
정제수	25
계	100

통상의 샴푸 제조방법에 따라 샴푸를 제종하여 도 12의 샴푸를 제조하였다 또한 흑마늘박 발효추출물을 함유한 두피케어용 헤어 샴푸바도 제조하였다(도 13)

제품으로서의 유통안정성을 평가하기 위해 하기 표 11에서 보는 바와 같이 일정 기간 동안 온도변화에 따른 상 안정성(Phase Stability) 시험을 실시하였다. 온도 조건은 -10~45℃에서 관찰시켰고, 2개월 동안 제품의 변취, 변색, 분리, 침전 상태 변화를 관찰한 결과 안정성은 양호하였다.

평가 항목	-10℃	5℃	37℃	45℃
변취 변색 분리 침전	변화없음 변화없음 변화없음 변화없음	변화없음 변화없음 변화없음 변화없음	변화없음 변화없음 변화없음 변화없음	미세변화 변화없음 변화없음 변화없음

* 2개월 후의 상태 관찰

인체 사용감 시험은 무작위로 샴푸 후 피부가려움이나 피부 당김 현상을 호소하는 성인 남녀 20명을 선정하여 4주 동안 본 제품을 사용하게 한 후 두피쪽 피부 변화를 관찰하였다. 시험 항목과 평가방법은 하기 표 12와 같다.

흑마늘박 발효 추출물이 함유된 샴푸 제품의 사용감
평가내용	평가방법
세정력, 기포력, 헹굼력 두피 가려움증, 보습력 비듬감소, 향취	5점 : 매우 좋음, 4점 : 좋음 3점:보통, 2점:나쁨, 1점:매우나쁨

하기 표 12에서와 같이 본 연구에서 제조한 흑마늘박 발효 샴푸를 실험군으로하고 피시험자가 평소 사용하던 일반 샴푸를 대조군으로 하여 조사한 결과 일반적인 사용감은 비슷한 것으로 평가되었고 샴푸 후 두피 가려움증, 보습력 및 비듬 제거는 실험군이 우수한 것으로 평가되었다.

흑마늘박 발효 추출물이 함유된 샴푸 제품의 사용감 평가
평가내용	세정력	기포력	헹굼력	두피가려움증	보습력	비듬감소	향취
실험군 대조군	4.2 4.4	4.2 4.5	4.2 4.3	4.4 3.4	4.3 3.7	4.3 3.6	4.5 4.3

상기 사용감 시험 중 일부 시험자의 두피 사진을 찍은 결과는 하기 도 14과 같으며, 흑마늘박 발효 샴푸 후 두피 상태를 일반 샴푸 사용후와 비교할 경우 상당히 두피 부분이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 원에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

1. 흑마늘박 발효물을 포함하는 두피 또는 모발 케어용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 발효는 지고사카로미세스 종(Zygosaccharomyces sp.)(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii), 또는 사카로미세스 세르비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 중 하나 이상을 이용한 것인 두피케어용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 항산화성분 및 미네랄 성분이 강화된 것인, 두피 또는 모발 케어용 조성물.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 탈모 방지효과, 발모효과, 육모효과, 피지의 과잉생성 억제효과, 비듬균에 대한 항균효과, 가려움 방지효과, 두피 및 모발의 보습효과 중에서 선택된 하나 이상의 효과를 나타내는, 두피 또는 모발 케어용 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물이 의약품, 의약외품 또는 화장품으로 제공되는 것인, 두피 또는 모발 케어용 조성물.
   
6. 제 1 항에 따른 두피케어 조성물을 포함하는 두피 또는 모발케어 제품.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 제품은 액상, 고형, 반고형, 과립, 분말 또는 크림, 연고, 페이스트, 거품, 젤, 로션, 파우더, 스트레이, 스틱 또는 에어로졸 형태로 제공되는 되는 것인 두피 또는 모발케어 제품.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 제품은 샴푸, 바, 트리트먼트, 토닉, 팩, 린스 또는 삼푸와 린스의 혼합형인, 두피 또는 모발케어 제품.
   
9. 흑마늘박에 지고사카로미세스 종(KACC 93148P), 지고사카로미세스 룩시이, 또는 사카로미세스 세르비시아 균주를 접종하는 단계;
   접종 후 접종물을 온도 28~30℃에서 40~72시간동안 150 ~ 300rpm 교반속도로 교반하면서 발효시키는 단계; 및
   발효 후 100~140℃에서 10분간 멸균하여 발효를 종료시키는 단계를 포함하는, 흑마늘박 발효물의 제조방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 흑마늘박은 5 내지 15 중량%의 양으로 포함되고, 상기 교반은 200rpm, 및 상기 균주는 1 내지 3%(v/v)의 양으로 포함되는 것인, 흑마늘박 발효물의 제조방법.

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