CN110680836B - 副干酪乳杆菌菌株gmnl-653用于制备改善狐臭组合物的用途 - Google Patents

副干酪乳杆菌菌株gmnl-653用于制备改善狐臭组合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明是关于益生菌，尤其是乳杆菌领域，用于改善狐臭的应用。本发明提供一种副干酪乳杆菌菌株GMNL‑653用于制备改善狐臭组合物的用途，其中，该副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL‑653，具有共凝集以及抑制狐臭病原菌的能力，该副干酪乳杆菌GMNL‑653可进一步做为外用药或化妆品组合物，并与香料结合使用，用于改善狐臭。

Description

副干酪乳杆菌菌株GMNL-653用于制备改善狐臭组合物的用途
技术领域
本发明是关于益生菌，尤其是乳杆菌领域，用于改善狐臭的应用。
背景技术
狐臭是腋下的特殊臭味，成因为汗腺分泌物与狐臭病原菌作用后产物的气味，腋下大汗腺会产生长链脂肪酸(fatty acids)，长链脂肪酸会再结合胺基酸(amino acids)及荷尔蒙(hormones)，而生成较不易挥发且没味道的大分子结合物，一旦狐臭病原菌与之反应降解，则会释出易挥发，且味道强烈的小分子，造成狐臭，且在天热多汗时较为明显，常造成患者生活质量以及社交活动的困扰，甚至可能引起自卑及畏惧的心理，严重时还会阻碍人格发展，是一项常见于大众的皮肤疾患。
人体依部位不同，有不同菌群分布，而不同菌群会产生不同的化学反应，并释放不同的气味，研究发现，腋下主要分布两大菌属，葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)及棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)；其中，葡萄球菌属中的人型葡萄球菌(Staphylococcushominis,S.hominis)、棒状杆菌属中的结核硬脂酸棒状杆菌(Corynebacteriumtuberculostearicum)及厌氧球菌属(Anaerococcus spp.)是主要造成狐臭的病原菌。
因狐臭为一个广泛存在的问题，往往造成患者社交、心理上的严重困扰，目前常见的几种解决方式如下：第一种，为保养品的使用，目前保养品市场已积极开发可以修饰体味的产品，主要为止汗剂成分，目的通常在于阻塞汗腺开口，也可协同芳香剂使用，但一则改善狐臭问题的效果有限，如果不是药用等级，通常效果不彰，且在夏天时更常因汗水容易冲掉止汗剂，而削弱作用效果，二则阻塞汗腺开口将造成体液无法排出，因此将代偿性的从不同部位流出，而若其他区域也有能引发异味的菌群，则依旧会引发异味困扰，并非治本的方式，三则汗水为散热的管道，一旦过度抑制汗水流出，甚至还会造成中暑等额外症状，四则使用时间有限制，往往需要前一天晚上涂抹或是喷洒作用，因此，无法反应到立即性的需求；另一方面，也有人采取以外科手术，摘除大汗腺而彻底杜绝腺体的分泌的方式彻底根除狐臭，此方法理论上虽然可根除狐臭，但是相较于止汗剂等保养品而言，实为一笔大开销，另一方面，手术产生的创口更需要一段时日的疗养及复原，且在现行技术方面仍具有无法完全根除的风险。
目前与狐臭相关的专利，除了前述的保养品外，中国专利号CN 101554389揭示一种利用肉毒杆菌毒素的组合物，用于治疗或预防皮肤腺体功能过度增强的疾病，包括狐臭，此方法透过抑制神经末端的介质传递，从而抑制皮肤腺体的过度分泌，然而，肉毒杆菌毒素为神经毒，此方法除了剂量使用风险外，亦因影响神经传导，故不适宜长期使用，且因影响全身皮肤腺体，可能造成其他部位无法适当排汗的副作用。
因此，如何能解决上述现行改善狐臭保养品以及手术所具有的缺失，开发出有效、不影响人体汗腺及神经传导系统、安全无伤害的改善狐臭方法，现仍为一亟待开发及研究的方向。
发明内容
有鉴于此，本案发明人深刻了解前案的不足与缺陷，乃亟思加以改良创新，并经多年实验研究后，终于成功研发本件副干酪乳杆菌菌株GMNL-653用于制备改善狐臭组合物的用途。
为解决前述现今改善狐臭方法所具有的问题以及风险，本发明提供一副干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus paracasei)GMNL-653用于制备改善狐臭组合物的用途，该副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-653，寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，寄存编号为CCTCC NO:M 2016226。
本发明颠覆现今由汗腺、神经传导为切入点的改善狐臭方法，首度针对狐臭病原菌，提出以益生菌抑制狐臭病原菌，用于改善狐臭的概念，并由重复实验证明，并非所有益生菌均有功效，其中，副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制并共凝集狐臭病原菌中的人型葡萄球菌的最佳效果，且不但活菌或是热杀死菌均有功效，可弹性应用于狐臭患者，透过直接接触病原菌方式，改善腋下的狐臭病原菌菌相。
本发明中的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653为益生菌，使用上不具有安全上的顾虑，且不会影响人体的汗腺或是神经传导系统，解决了以往方法中可能引发的汗腺阻塞、中暑等副作用风险；且因具有短时间内共凝集人型葡萄球菌的能力，因此短时间即可见效，有效解决了以往保养品中需前一晚施用的缺陷；此外，本发明非侵入式手段，因此不会有手术所需面对的高预算、伤口愈合、未完全根除的问题；且因不论是活菌或是热杀死菌均有显著效果，不具有益生菌使用时，菌群均须存活的保存限制，在制程以及应用形式上，可具有更佳弹性的方向。
本发明第一实施例阐述经由共凝集实验，由益生菌中，筛选出具共凝集狐臭病原菌中的人型葡萄球菌效果最佳的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653。
本发明第二实施例证明了副干酪乳杆菌菌株GMNL-653不论是活菌或是热杀死菌型态均具有共凝集人型葡萄球菌功能。
本发明第三实施例例示副干酪乳杆菌菌株GMNL-653的剂量与共凝集人型葡萄球菌的功效成正相关。
本发明第四实施例透过电子显微镜，观察副干酪乳杆菌菌株GMNL-653与人型葡萄球菌会呈现聚集现象，显示两者间具强效的交互作用。
本发明第五实施例透过抑菌圈实验，证明副干酪乳杆菌菌株GMNL-653除了可共凝集人型葡萄球菌外，还具有抑制生长的功效。
本发明证实副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有共凝集以及抑制狐臭病原菌的功效，提出了副干酪乳杆菌菌株GMNL-653用于制备改善狐臭组合物的用途且可制备为外用药或化妆品组合物；本发明将有利于解决以往狐臭患者使用习用的改善狐臭方法所长期存在的烦恼，无以往保养品或是手术方式的缺陷，且为益生菌用于改善狐臭用途的首度发表，并对改善狐臭的方法提出一崭新的切入方向，属概念上的创新，且可采取活菌或是死菌形式，具有弹性且广泛的商业应用价值。
附图说明
图1A为具有与人型葡萄球菌BCRC 12156共凝集能力的益生菌筛选图；
图1B为具有与人型葡萄球菌BCRC 17959共凝集能力的益生菌筛选图；
图2为副干酪乳杆菌GMNL-653的活菌或热杀死菌对人型葡萄球菌的共凝集能力的比较图；
图3为不同剂量的热杀死副干酪乳杆菌GMNL-653对人型葡萄球菌的共凝集的能力的比较图；
图4为电子显微镜观察人型葡萄球菌与GMNL-653的共聚集现象图；
图5为益生菌对于人型葡萄球菌的抑菌能力的比较图。
具体实施方式
为了达到前述希望能解决现行改善狐臭保养品以及手术所具有的缺失，提供有效、不影响人体汗腺及神经传导系统、安全无伤害的改善狐臭方法，本案发明人以下列实施例为例，进行详细说明如下。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制，任何通常知识者在不脱离本发明的精神和范围内，当可作任何更动与修饰，因此本发明的保护范围当视申请专利范围所界定为准。
本发明所使用的材料，除有特别指明者，皆为市售易于取得的材料，本发明所使用的副干酪乳杆菌GMNL-653寄存于中国台湾食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center of Food Industry Research andDevelopment Institute,BCRC of FIRDI)，寄存编号为BCRC 910721，以及中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)，寄存编号为CCTCC NO:M2016226；本发明中所提到的colony forming units/ml(cfu/ml)表示每毫升培养液所含有的菌落总数，OD(optical density)600意指溶液于波长600nm的吸光值，本实施例中用作菌液浓度的换算，OD 595则意指溶液于指波长595nm的吸光值。
实施例一、具狐臭病原菌共凝集能力的益生菌株的筛选
为了筛选可与狐臭病原菌共凝集的益生菌，首先，先从益生菌中挑选出三种代表性菌种，分别为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,缩写为L.paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,缩写为L.plantarum)、及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus,缩写为L.rhamnosus)，并由三种菌种中再分别选择若干菌株，进行共凝集实验前的益生菌株制备。
益生菌株制备过程如下，首先，将菌株分别自冻管接种到1毫升(ml)的MRS(Lactosebacillus Broth acc.to DE MAN,ROGOSA and SHARPE)培养液(broth)中，再于37℃有氧下静置培养20小时；接着，从中取10ul的培养菌液(1％的培养液体积)至1ml MRS培养液中进行二次活化，同样于37℃有氧下静置培养20小时，最终，以分光亮度计测定菌液的OD600数值，藉以推估菌数，利用PBS(Phosphate Buffered Saline)调整菌液浓度至2x109cfu/ml，待后续使用。
另一方面，同时进行狐臭病原菌的制备，本实施例中使用两株狐臭病原菌，均属于人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis,缩写为S.hominis)此菌种分类下的两株菌，编号分别为BCRC12156(亚种为hominis)及BCRC17959(亚种为novobiosepticus)；BCRC12156以TSA(Tryptone Soy Agar)培养基进行四区划线分离，而BCRC17959则是以TSA+5％去纤维绵羊血所制成的培养基同样进行四区划线，两株菌均于于37℃有氧下培养24小时后，再取数颗单一菌落再次划线进行二次活化，并于37℃有氧下静置培养24小时，最后，刮取整盘菌落悬浮于PBS中，同样使用分光光谱仪OD600nm测定菌数，调整菌液浓度为2x109cfu/ml备用。
完成益生菌及狐臭病原菌的制备培养后，下一步，便进行共凝集实验，过程如下，将调配好浓度的益生菌与病原菌各取0.5ml相加混合，是为反应组，另一方面，控制组部分，同样取0.5ml益生菌加上0.5ml PBS作为单纯益生菌组，0.5ml病原菌加上0.5ml PBS作为单纯病原菌组；添加完成后，同时将各组别充分混合均匀，并静置反应20分钟后，观察共凝集现象，如果共凝集能力越强，则上端将越清澈，再分别取出各管上端100μl以OD595检测共凝集能力(coaggregation ability)，其计算方式为以下所示：共凝集能力＝单纯病原菌组的OD595+单纯益生菌组的OD595-反应组的OD595，所得的值越高，则表示共凝集能力越强。
实验结果显示(见图1A及图1B)，副干酪乳杆菌GMNL-653(以下简称GMNL-653)在所有受测试的益生菌株中，显示出最佳的共凝集能力，不仅优于植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌，即使是同种的副干酪乳杆菌的不同菌株间，GMNL-653也显示出较优的共凝集能力，显示此优异的共凝集能力为GMNL-653所特有的，并非广泛存在于任意的益生菌中。
实施例二、活性或热杀死的副干酪乳杆菌GMNL-653均具有共凝集狐臭病原菌的能力
为了进一步厘清GMNL-653针对狐臭病原菌所具有的共凝集能力是否仅存在于活菌中，进一步，进行GMNL-653的活菌以及热灭杀死菌的共凝集能力比较。
GMNL-653活菌以及病原菌(同样使用人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959)，制备培养方式请参见前述实施例一，GMNL-653的热杀死菌的制备方法如下所述，待活菌制备完成并调整浓度为2x109cfu/ml后，将菌液于121℃下，进行高压灭菌15分钟，处理为热杀死菌，待后续使用。
接续依前述实施例一说明调配控制组，并将配好浓度(2x109cfu/ml)的GMNL-653活菌以及热杀死菌分别与病原菌进行共凝集实验，计算出其共凝集狐臭病原菌的能力。
实验结果呈现(见图2)，GMNL-653的活菌与热杀死菌均具有人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959的共凝集能力，且活菌或是热杀死菌的共凝集能力并无差异，表示GMNL-653与人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959之间的交互作用并不会受到热杀死处理的影响。
实施例三、不同剂量的热杀死GMNL-653均具有共凝集狐臭病原菌的能力
为厘清GMNL-653对于人型葡萄球菌的共凝集能力是否与剂量呈现正相关，热杀死GMNL-653以及病原菌制备方式依前述实施例二所述，差异在于本次进行热杀死处理前的GMNL-653浓度需调整为2x1010cfu/ml，再进行前述条件的热杀处理，制备为热杀死菌，后续再分别将浓度调整为1x109、2x109、2x1010cfu/ml三种条件备用，接着依先前说明进行共凝集实验，比较不同剂量下的GMNL-653对于人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959的共凝集能力。
结果显示(见图3)，GMNL-653在反应剂量为0.5×109至1×1010时，会与共凝集人型葡萄球菌的能力呈现一个明显的正相关，亦表示GMNL-653的剂量提升可促进狐臭病原菌的移除。
实施例四、电子显微镜显示GMNL-653与狐臭病原菌具强的交互作用
为进一步确认副干酪乳杆菌GMNL-653与人型葡萄球菌间的交互作用，将先前共凝集实验所得的反应组菌液滴于盖玻片上，将玻片、盖玻片、吸水纸、漏斗依序顺序堆栈后，使用橡皮筋绑两端，进行800rpm、5分钟的低速离心，藉此将菌液固定至盖玻片上，接着将盖玻片移到24孔细胞培养盘后，加入1毫升的2.5％戊二醛(glutaraldehyde)于室温固定一小时，接着，利用PBS进行清洗，一次5分钟，共清洗三次，并依序分别加入40％、75％、95％乙醇，各反应10分钟，最后则是以100％乙醇反应20分钟，重复此步骤三次，直至脱水完成；而后，再将盖玻片镀金覆膜(coating)后，即可以SEM扫描式电子显微镜(Hitachi 3000n)进行观察。
结果显示(图4)，GMNL-653与人型葡萄球菌有聚集及缠绕的现象，表示两者具有很强的交互作用，亦代表GMNL-653具有可藉由共聚集以移除狐臭病原菌的能力。
实施例五、GMNL-653具有抑制狐臭病原菌生长的能力
为探讨GMNL-653除了具有共聚集人型葡萄球菌的能力外，是否还具有抑制的功效，后续进行GMNL-653对于人型葡萄球菌的抑菌圈能力测试。
首先，进行益生菌以及病原菌的制备，同实施例一，益生菌选用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)、副干酪乳杆菌GMNL-653、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri,L.reuteri)、及鼠李糖乳杆菌，而病原菌使用人型葡萄球菌BCRC17959，培养制备流程同前述方式，最终备用浓度部分，益生菌浓度调为5×109cfu/ml，病原菌浓度则调为1×109cfu/ml。
接续进行抑菌圈实验，由先前配置的病原菌菌液中取1x108cfu均匀涂抹于固态培养基，接着，以11mm玻璃管压出孔洞后，于每个孔洞中加入200μL菌液，分别于培养24小时和48小时时进行观察，并使用电子式光标卡尺量测抑菌圈直径大小(抑菌圈直径＝外圈直径-内圈直径)。
结果呈现(图5)，GMNL-653不仅可抑制人型葡萄球菌，且相对于其他三种益生菌均具有明显较佳的抑制能力，一则显示GMNL-653不但可共凝集狐臭病原菌，还可进一步抑制之，此外，也证明并非所有益生菌均具有抑制狐臭病原菌的功能，而是于GMNL-653此菌株所特别具有的较佳功效。
由以上实施例中证明，GMNL-653具有抑制狐臭病原菌的能力，并可透过其表面分子与狐臭病原菌的交互作用，共凝集形成复合物，经由此方式达到移除、抑制病原菌的效果。
本发明实施例首先透过共凝集实验，证实GMNL-653于待筛选的益生菌中具有最佳的共凝集能力，此外，实施例中也证实不论是活菌或热杀处理的GMNL-653死菌，都能够共凝集狐臭病原菌，热杀处理不会影响两者间的相互作用，过程中也发现随着GMNL-653的剂量增加，可具有更佳的共凝集效果，并于电子显微镜下具有显著的结合现象，此外，除共凝集外，GMNL-653还具有直接抑制狐臭病原菌生长的功效；且透过益生菌的筛选比较，也证实并非所有益生菌均具有共凝集及抑制病原菌的功效，仅有GMNL-653具有显著较佳的共凝集及抑制病原菌的能力，是为此菌株的独有功效，一为本发明的一大特色。
本发明的GMNL-653可制备为组合物进一步应用于狐臭患者中，藉由改善狐臭患者的腋下菌相，降低或共凝集狐臭病原菌，达到改善狐臭症状的目的，且因活性或热杀死处理的GMNL-653均能有效移除狐臭病原菌，在制备型式上可有更多的弹性，可一反以往益生菌多半口服的型式，亦增添其在皮肤剂型的应用方式，直接于作用于腋下，而更能直接达到改善狐臭症状的效果，因此不论是外用药、化妆品领域均为可实施范围。
本发明的GMNL-653制备为组合物用于改善狐臭的用途，可进一步制备为外用药或化妆品组合物，并可进一步包含香料，在使用上不具有安全上的顾虑，且不像现行改善狐臭保养品般，具有影响人体的汗腺或是神经传导系统及非实时性等缺点，也不会有手术所需面对的高预算、伤口愈合、未完全根除的问题，且因不论是活菌或是热杀死菌效果并无差异，因此，不会有使用时，须维持菌群存活的保存限制，在制程以及应用形式上，可具有更佳弹性的方向，为现今的改善狐臭保养品市场提出了截然不同的切入思维及无副作用且安全、有效的实施方向。
【生物材料寄存】
Lactobacillus paracasei GMNL-653寄存信息：寄存国家-中国、寄存机构-中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、寄存日期-2016年4月25号、寄存编号-CCTCC NO:M 2016226。

Claims (9)

1.一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-653用于制备改善狐臭的外用组合物的用途，其特征在于，副干酪乳杆菌GMNL-653保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016226，其中，所述狐臭为由人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)所引起的狐臭。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述副干酪乳杆菌GMNL-653为活菌或/和死菌。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述死菌通过热杀方式取得。
4.一种用于改善狐臭的外用药，其特征在于，包含副干酪乳杆菌GMNL-653，所述副干酪乳杆菌GMNL-653，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016226，所述副干酪乳杆菌GMNL-653具有共凝集或抑制狐臭病原菌的能力。
5.根据权利要求4所述的外用药，其特征在于，所述外用药可进一步包含药学上可接受的载剂。
6.根据权利要求5所述的外用药，其特征在于，所述外用药形式包含贴布、药水、药膏、药油、药粉、凝胶、喷剂或其组合。
7.一种用于改善狐臭的化妆品组合物，其特征在于，包含副干酪乳杆菌GMNL-653，该副干酪乳杆菌GMNL-653，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016226，所述副干酪乳杆菌GMNL-653具有共凝集及抑制狐臭病原菌的能力。
8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物包含以下剂型：水剂、乳剂、膏剂、固状剂、粉末、凝胶、乳液、乳霜、乳膏、滚珠剂、喷雾或敷料。
9.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物可进一步包含香料。
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