TWI707688B - 副乾酪乳桿菌菌株ｇｍｎｌ-６５３用於製備改善狐臭醫藥組合物之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種副乾酪乳桿菌用於製備一改善狐臭醫藥組合物的用途，其中，該副乾酪乳桿菌是副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-653，具有共凝集以及抑制狐臭病原菌的能力，該副乾酪乳桿菌GMNL-653可進一步做為外用藥或化妝品組合物，並與香料結合使用，用於改善狐臭。

Description

副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備改善狐臭醫藥組合物之用途

本發明係關於益生菌，尤其是乳桿菌領域，用於改善狐臭之應用。

狐臭是腋下的特殊臭味，成因為汗腺分泌物與狐臭病原菌作用後產物的氣味，腋下大汗腺會產生長鏈脂肪酸(fatty acids)，長鏈脂肪酸會再結合胺基酸(amino acids)及荷爾蒙(hormones)，而生成較不易揮發且沒味道的大分子結合物，一旦狐臭病原菌與之反應降解，則會釋出易揮發，且味道強烈的小分子，造成狐臭，且在天熱多汗時較為明顯，常造成患者生活品質以及社交活動的困擾，甚至可能引起自卑及畏懼的心理，嚴重時還會阻礙人格發展，是一項常見於大眾的皮膚疾患。

人體依部位不同，有不同菌群分布，而不同菌群會產生不同的化學反應，並釋放不同的氣味，研究發現，腋下主要分布兩大菌屬，葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)及棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.)；其中，葡萄球菌屬中的人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis,S.hominis)、棒狀桿菌屬中的結核硬脂酸棒狀桿菌(Corynebacterium tuberculostearicum)及厭氧球菌屬(Anaerococcus spp.)是主要造成狐臭的病原菌。

因狐臭為一個廣泛存在之間題，往往造成患者社交、心理上的嚴重困擾，目前常見的幾種解決方式如下：第一種，為保養品的使用，目前保養品市場已積極開發可以修飾體味之產品，主要為止汗劑成分，目的通常在於阻塞汗腺開口，也可協同芳香劑使用，但一則改善狐臭問題的效果有限，如果不是藥用等級，通常效果不彰，且在夏天時更常因汗水容易沖掉止汗劑，而削弱作用效果，二則阻塞汗腺開口將造成體液無法排出，因此將代償性的從不同部位流出，而若其他區域也有能引發異味的菌群，則依舊會引發異味困擾，並非治本的方式，三則汗水為散熱的管道，一旦過度抑制汗水流出，甚至還會造成中暑等額外症狀，四則使用時間有限制，往往需要前一天晚上塗抹或是噴灑作用，因此，無法反應到立即性的需求；另一方面，也有人採取以外科手術，摘除大汗腺而徹底杜絕腺體的分泌的方式徹底根除狐臭，此方法理論上雖然可根除狐臭，但是相較於止汗劑等保養品而言，實為一筆大開銷，另一方面，手術產生的創口更需要一段時日的療養及復原，且在現行技術方面仍具有無法完全根除的風險。

目前與狐臭相關的專利，除了前述的保養品外，中國專利號CN 101554389揭示一種利用肉毒桿菌毒素的組合物，用於治療或預防皮膚腺體功能過度增強的疾病，包括狐臭，此方法透過抑制神經末端的介質傳遞，從而抑制皮膚腺體的過度分泌，然而，肉毒桿菌毒素為神經毒，此方法除了劑量使用風險外，亦因影響神經傳導，故不適宜長期使用，且因影響全身皮膚腺體，可能造成其他部位無法適當排汗的副作用。

因此，如何能解決上述現行改善狐臭保養品以及手術所具有的缺失，開發出有效、不影響人體汗腺及神經傳導系統、安全無傷害的改善狐臭方法，現仍為一亟待開發及研究的方向。

有鑑於此，本案發明人深刻瞭解前案之不足與缺陷，乃亟思加以改良創新，並經多年實驗研究後，終於成功研發本件副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備改善狐臭組合物之用途。

為解決前述現今改善狐臭方法所具有的間題以及風險，本發明提供一副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備改善狐臭醫藥組合物之用途，該副乾酪乳桿菌GMNL-653寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。

本發明顛覆現今由汗腺、神經傳導為切入點的改善狐臭方法，首度針對狐臭病原菌，提出以益生菌抑制狐臭病原菌，用於改善狐臭的概念，並由重覆實驗證明，並非所有益生菌均有功效，其中，副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有抑制並共凝集狐臭病原菌中的人型葡萄球菌的最佳效果，且不但活菌或是熱殺死菌均有功效，可彈性應用於狐臭患者，透過直接接觸病原菌方式，改善腋下的狐臭病原菌菌相。

本發明中的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653為益生菌，使用上不具有安全上的顧慮，且不會影響人體的汗腺或是神經傳導系統，解決了以往方法中可能引發的汗腺阻塞、中暑等副作用風險；且因具有短時間內共凝集人型葡萄球菌的能力，因此短時間即可見效，有效解決了以往保養品中需前一晚施用的缺陷；此外，本發明非侵入式手段，因此不會有手術所需面對的高預算、傷口癒合、未完全根除的問題；且因不論是活菌或是熱殺死菌均有顯著效果，不具有益生菌使用時，菌群均須存活的保存限制，在製程以及應用形式上，可具有更佳彈性的方向。

本發明第一實施例闡述經由共凝集實驗，由益生菌中，篩選出具共凝集狐臭病原菌中的人型葡萄球菌效果最佳的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653。

本發明第二實施例證明了副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653不論是活菌或是熱殺死菌型態均具有共凝集人型葡萄球菌功能。

本發明第三實施例例示副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653的劑量與共凝集人型葡萄球菌的功效成正相關。

本發明第四實施例透過電子顯微鏡，觀察副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653與人型葡萄球菌會呈現聚集現象，顯示兩者間具強效的交互作用。

本發明第五實施例透過抑菌圈實驗，證明副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653除了可共凝集人型葡萄球菌外，還具有抑制生長的功效。

本發明證實副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有共凝集以及抑制狐臭病原菌的功效，提出了副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備改善狐臭組合物的用途且可製備為外用藥或化妝品組合物；本發明將有利於解決以往狐臭患者使用習用的改善狐臭方法所長期存在的煩惱，無以往保養品或是手術方式的缺陷，且為益生菌用於改善狐臭用途的首度發表，並對改善狐臭的方法提出一嶄新的切入方向，屬概念上的創新，且可採取活菌或是死菌形式，具有彈性且廣泛的商業應用價值。

圖1A 為具有與人型葡萄球菌BCRC 12156共凝集能力的益生菌篩選。

圖1B 為具有與人型葡萄球菌BCRC 17959共凝集能力的益生菌篩選。

圖2 為副乾酪乳桿菌GMNL-653的活菌或熱殺死菌對人型葡萄球菌的共凝集能力的比較。

圖3 為不同劑量的熱殺死副乾酪乳桿菌GMNL-653對人型葡萄球菌的共凝集的能力的比較。

圖4 為電子顯微鏡觀察人型葡萄球菌與GMNL-653的共聚集現象。

圖5 為益生菌對於人型葡萄球菌的抑菌能力的比較。

為了達到前述希望能解決現行改善狐臭保養品以及手術所具有的缺失，提供有效、不影響人體汗腺及神經傳導系統、安全無傷害的改善狐臭方法，本案發明人以下列實施例為例，進行詳細說明如下。

本發明以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制，任何通常知識者在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作任何更動與修飾，因此本發明的保護範圍當視申請專利範圍所界定為準。

本發明所使用之材料，除有特別指明者，皆為市售易於取得之材料，本發明所使用之副乾酪乳桿菌GMNL-653寄存於台灣食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center of Food Industry Research and Development Institute,BCRC of FIRDI)，寄存編號為BCRC 910721，以及中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)，寄存編號為CCTCC M 2016226；本發明中所提到的colony forming units/ml(cfu/ml)表示每毫升培養液所含有的菌落總數，OD(optical density)600意指溶液於波長600nm的吸光值，本實施例中用作菌液濃度的換算，OD 595則意指溶液於指波長595nm的吸光值。

實施例一、具狐臭病原菌共凝集能力之益生菌株的篩選

為了篩選可與狐臭病原菌共凝集的益生菌，首先，先從益生菌中挑選出三種代表性菌種，分別為副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei,縮寫為L.paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,縮寫為L.plantarum)、及鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus,縮寫為L.rhamnosus)，並由三種菌種中再分別選擇若干菌株，進行共凝集實驗前的益生菌株製備。

益生菌株製備過程如下，首先，將菌株分別自凍管接種到1毫升(ml)的MRS(Lactosebacillus Broth acc.to DE MAN,ROGOSA and SHARPE)培養液(broth)中，再於37℃有氧下靜置培養20小時；接著，從中取10ul的培養菌液(1%的培養液體積)至1ml MRS培養液中進行二次活化，同樣於37℃有氧下靜置培養20小時，最終，以分光光度計測定菌液的OD600數值，藉以推估菌數，利用PBS(Phosphate Buffered Saline)調整菌液濃度至2x10⁹cfu/ml，待後續使用。

另一方面，同時進行狐臭病原菌的製備，本實施例中使用兩株狐臭病原菌，均屬於人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis,縮寫為S.hominis)此菌種分類下的兩株菌，編號分別為BCRC12156(亞種為hominis) 及BCRC17959(亞種為novobiosepticus)；BCRC12156以TSA(Tryptone Soy Agar)培養基進行四區劃線分離，而BCRC17959則是以TSA+5%去纖維綿羊血所製成的培養基同樣進行四區劃線，兩株菌均於於37℃有氧下培養24小時後，再取數顆單一菌落再次劃線進行二次活化，並於37℃有氧下靜置培養24小時，最後，刮取整盤菌落懸浮於PBS中，同樣使用分光光譜儀OD600nm測定菌數，調整菌液濃度為2x10⁹cfu/ml備用。

完成益生菌及狐臭病原菌的製備培養後，下一步，便進行共凝集實驗，過程如下，將調配好濃度的益生菌與病原菌各取0.5ml相加混合，是為反應組，另一方面，控制組部分，同樣取0.5ml益生菌加上0.5ml PBS作為單純益生菌組，0.5ml病原菌加上0.5ml PBS作為單純病原菌組；添加完成後，同時將各組別充分混合均勻，並靜置反應20分鐘後，觀察共凝集現象，如果共凝集能力越強，則上端將越清澈，再分別取出各管上端100μl以OD595檢測共凝集能力(coaggregation ability)，其計算方式為以下所示：共凝集能力=單純病原菌組之OD595+單純益生菌組之OD595-反應組之OD595，所得之值越高，則表示共凝集能力越強。

實驗結果顯示(見圖1A及圖1B)，副乾酪乳桿菌GMNL-653(以下簡稱GMNL-653)在所有受測試的益生菌株中，顯示出最佳的共凝集能力，不僅優於植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌，即使是同種的副乾酪乳桿菌的不同菌株間，GMNL-653也顯示出較優的共凝集能力，顯示此優異的共凝集能力為GMNL-653所特有的，並非廣泛存在於任意的益生菌中。

實施例二、活性或熱殺死之副乾酪乳桿菌GMNL-653均具有共凝集狐臭病原菌的能力

為了進一步釐清GMNL-653針對狐臭病原菌所具有的共凝集能力是否僅存在於活菌中，進一步，進行GMNL-653的活菌以及熱滅殺死菌的共凝集能力比較。

GMNL-653活菌以及病原菌(同樣使用人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959)，製備培養方式請參見前述實施例一，GMNL-653的熱殺死菌的製備方法如下所述，待活菌製備完成並調整濃度為2x10⁹cfu/ml後，將菌液於121℃下，進行高壓滅菌15分鐘，處理為熱殺死菌，待後續使用。

接續依前述實施例一說明調配控制組，並將配好濃度(2x10⁹cfu/ml)的GMNL-653活菌以及熱殺死菌分別與病原菌進行共凝集實驗，計算出其共凝集狐臭病原菌的能力。

實驗結果呈現(見圖2)，GMNL-653的活菌與熱殺死菌均具有人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959的共凝集能力，且活菌或是熱殺死菌的共凝集能力並無差異，表示GMNL-653與人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959之間的交互作用並不會受到熱殺死處理的影響。

實施例三、不同劑量之熱殺死GMNL-653均具有共凝集狐臭病原菌的能力

為釐清GMNL-653對於人型葡萄球菌的共凝集能力是否與劑量呈現正相關，熱殺死GMNL-653以及病原菌製備方式依前述實施例二所述，差異在於本次進行熱殺死處理前的GMNL-653濃度需調整為2x10¹⁰cfu/ml，再進行前述條件的熱殺處理，製備為熱殺死菌，後續再分別將濃度調整為1x10⁹、2x10⁹、2x10¹⁰cfu/ml三種條件備用，接著依先前說明 進行共凝集實驗，比較不同劑量下的GMNL-653對於人型葡萄球菌BCRC12156及BCRC17959的共凝集能力。

結果顯示(見圖3)，GMNL-653在反應劑量為0.5×10⁹至1×10¹⁰時，會與共凝集人型葡萄球菌的能力呈現一個明顯的正相關，亦表示GMNL-653的劑量提升可促進狐臭病原菌的移除。

實施例四、電子顯微鏡顯示GMNL-653與狐臭病原菌具強的交互作用

為進一步確認副乾酪乳桿菌GMNL-653與人型葡萄球菌間的交互作用，將先前共凝集實驗所得之反應組菌液滴於蓋玻片上，將玻片、蓋玻片、吸水紙、漏斗依序順序堆疊後，使用橡皮筋綁兩端，進行800rpm、5分鐘的低速離心，藉此將菌液固定至蓋玻片上，接著將蓋玻片移到24 well細胞培養盤後，加入1毫升的2.5%戊二醛(glutaraldehyde)於室溫固定一小時，接著，利用PBS進行清洗，一次5分鐘，共清洗三次，並依序分別加入40%、75%、95%乙醇，各反應10分鐘，最後則是以100%乙醇反應20分鐘，重複此步驟三次，直至脫水完成；而後，再將蓋玻片鍍金覆膜(coating)後，即可以SEM掃描式電子顯微鏡(Hitachi 3000n)進行觀察。

結果顯示(圖4)，GMNL-653與人型葡萄球菌有聚集及纏繞的現象，表示兩者具有很強的交互作用，亦代表GMNL-653具有可藉由共聚集以移除狐臭病原菌的能力。

實施例五、GMNL-653具有抑制狐臭病原菌生長的能力

為探討GMNL-653除了具有共聚集人型葡萄球菌的能力外，是否還具有抑制的功效，後續進行GMNL-653對於人型葡萄球菌的抑菌圈能 力測試。

首先，進行益生菌以及病原菌的製備，同實施例一，益生菌選用乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei,L.casei)、副乾酪乳桿菌GMNL-653、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri)、及鼠李糖乳桿菌，而病原菌使用人型葡萄球菌BCRC17959，培養製備流程同前述方式，最終備用濃度部分，益生菌濃度調為5×10⁹cfu/ml，病原菌濃度則調為1×10⁹cfu/ml。

接續進行抑菌圈實驗，由先前配置的病原菌菌液中取1x10⁸cfu均勻塗抹於固態培養基，接著，以11mm玻璃管壓出孔洞後，於每個孔洞中加入200μL菌液，分別於培養24小時和48小時時進行觀察，並使用電子式游標卡尺量測抑菌圈直徑大小(抑菌圈直徑=外圈直徑-內圈直徑)。

結果呈現(圖5)，GMNL-653不僅可抑制人型葡萄球菌，且相對於其他三種益生菌均具有明顯較佳的抑制能力，一則顯示GMNL-653不但可共凝集狐臭病原菌，還可進一步抑制之，此外，也證明並非所有益生菌均具有抑制狐臭病原菌的功能，而是於GMNL-653此菌株所特別具有的較佳功效。

由以上實施例中證明，GMNL-653具有抑制狐臭病原菌的能力，並可透過其表面分子與狐臭病原菌的交互作用，共凝集形成複合物，經由此方式達到移除、抑制病原菌的效果。

本發明實施例首先透過共凝集實驗，證實GMNL-653於待篩選的益生菌中具有最佳的共凝集能力，此外，實施例中也證實不論是活菌或熱殺處理的GMNL-653死菌，都能夠共凝集狐臭病原菌，熱殺處理不會影響兩者間的相互作用，過程中也發現隨著GMNL-653的劑量增加，可具有 更佳的共凝集效果，並於電子顯微鏡下具有顯著的結合現象，此外，除共凝集外，GMNL-653還具有直接抑制狐臭病原菌生長之功效；且透過益生菌的篩選比較，也證實並非所有益生菌均具有共凝集及抑制病原菌的功效，僅有GMNL-653具有顯著較佳的共凝集及抑制病原菌的能力，是為此菌株的獨有功效，一為本發明的一大特色。

本發明之GMNL-653可製備為組合物進一步應用於狐臭患者中，藉由改善狐臭患者的腋下菌相，降低或共凝集狐臭病原菌，達到改善狐臭症狀之目的，且因活性或熱殺死處理的GMNL-653均能有效移除狐臭病原菌，在製備型式上可有更多的彈性，可一反以往益生菌多半口服的型式，亦增添其在皮膚劑型之應用方式，直接於作用於腋下，而更能直接達到改善狐臭症狀之效果，因此不論是外用藥、化妝品領域均為可實施範圍。

本發明之GMNL-653製備為組合物用於改善狐臭之用途，可進一步製備為外用藥或化妝品組合物，並可進一步包含香料，在使用上不具有安全上的顧慮，且不像現行改善狐臭保養品般，具有影響人體的汗腺或是神經傳導系統及非即時性等缺點，也不會有手術所需面對的高預算、傷口癒合、未完全根除的問題，且因不論是活菌或是熱殺死菌效果並無差異，因此，不會有使用時，須維持菌群存活的保存限制，在製程以及應用形式上，可具有更佳彈性的方向，為現今的改善狐臭保養品市場提出了截然不同的切入思維及無副作用且安全、有效的實施方向。

故本案不僅於技術思想上確屬創新，並具備習用之傳統方法所不及之多項功效，已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

2.寄存機構-食品工業發展研究所、寄存日期-2016年2月26號、寄存編號-BCRC 910721

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

2.寄存國家-中國、寄存機構-中國典型培養物保藏中心(CCTCC)、寄存日期-2016年4月25號、寄存編號-CCTCC M 2016226

Claims (3)

1. 一種副乾酪乳桿菌用於製備改善狐臭醫藥組合物的用途，其中該狐臭是人型葡萄球菌引起的狐臭，該副乾酪乳桿菌GMNL-653具有共凝集或抑制狐臭病原菌的能力，該狐臭病原菌為人型葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，該副乾酪乳桿菌是副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-653，寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該副乾酪乳桿菌GMNL-653為活菌或/和死菌。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該死菌透過熱殺方式取得。

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