CN114058547B - 一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的发酵乳杆菌命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)SYSU‑ZG3，已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21381。本发明筛选得到的发酵乳杆菌SYSU‑ZG3具有耐酸性、凝乳性和抗氧化作用，具有很好的抑菌作用。利用本发明发酵乳杆菌制备的发酵液具有良好的抗氧化性和抑菌作用，具有减少色素沉积，促进痘痘愈合及消脓，镇静消炎杀菌的功效，并且可以改变肌肤的微循环系统，调节肌肤水油平衡，且不具有副作用，安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用。
背景技术
益生菌作为一类对机体有益的活性微生物，在维持肠道内微生物平衡有很大作用。健康的肠道微生物组可以控制代谢、抵抗感染和炎症、预防自身免疫和癌症，并且在调节脑-肠轴方面起着关键作用。发酵乳杆菌属于乳杆菌属，是一种能促进人体健康的常见菌种之一，具有抗氧化活性、降低胆固醇、降血压、调节肠道菌群平衡等作用。
青春痘、粉刺、暗疮在医学上统称为痤疮，是常见的一种皮脂腺慢性病，其成因是青春期时，体内的荷尔蒙会刺激毛发生长，皮脂腺分泌旺盛，导致毛孔堵塞形成微粉刺，微粉刺堵塞毛孔诱发炎症，是丘疹、脓包、结节和囊肿的始发根源，传统治疗只是清除表面的粉刺，而微粉刺停一段时间又长出来，于是形成了痤疮反复发作的局面，造成皮脂腺长期分泌皮脂旺盛长期长痘,它由多种原因引起，并严重影响人们的美观，甚至生活。现在市面上用于祛痘的产品主要有中药成分的祛痘产品，但其治疗效果较缓慢；还有含激素成分的产品，但长期使用激素产品会使皮肤产生依赖性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种发酵乳杆菌，所述发酵乳杆菌命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)SYSU-ZG3，已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21381。
发酵乳杆菌是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，本发明筛选得到的发酵乳杆菌SYSU-ZG3具有耐酸性、凝乳性和抗氧化作用，具有很好的抑菌作用，不具有任何副作用，具有广阔的应用前景和经济价值。
作为本发明所述的发酵乳杆菌的优选实施方式，所述发酵乳杆菌的16sDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明所述的发酵乳杆菌的优选实施方式，所述发酵乳杆菌分离自健康成人粪便。
本发明还提供所述的发酵乳杆菌在制备抑制表皮金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的产品中的应用。
本发明还提供所述的发酵乳杆菌在制备祛痘产品中的应用。
本发明还提供一种发酵乳杆菌发酵液，由上述发酵乳杆菌发酵制备得到。
本发明还提供所述发酵乳杆菌发酵液在制备抑制表皮金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的产品中的应用。
本发明还提供所述发酵乳杆菌发酵液在制备祛痘产品中的应用。
作为本发明所述发酵乳杆菌发酵液在制备祛痘产品中的应用的优选实施方式，所述的发酵乳杆菌发酵液在所述产品中的质量百分浓度为6.25％-12.5％。
本发明的有益效果：本发明提供的一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用。该发酵乳杆菌具有耐酸性、凝乳性、抗氧化作用和抑菌作用，其发酵液具有良好的抗氧化性和抑菌作用，具有减少色素沉积，促进痘痘愈合及消脓，镇静消炎杀菌的功效，对各种青春痘、粉刺、痘疤、痘坑、痘印，特别是过敏性痘痘都具有快速而强大的祛除效果，并且可以改变肌肤的微循环系统，调节肌肤水油平衡，且不具有副作用，安全性高。
附图说明
图1为发酵乳杆菌SYSU-ZG3的菌落形态。
图2为发酵乳杆菌SYSU-ZG3的菌体形态。
图3为发酵乳杆菌SYSU-ZG3的耐酸性测定结果示意图。
图4为发酵乳杆菌SYSU-ZG3的抗氧化性测定结果示意图。
图5为SYSU-ZG3发酵液对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌的抑制作用图。
图6为SYSU-ZG3发酵液祛痘效果统计图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1发酵乳杆菌的保藏信息
本发明提供了一种发酵乳杆菌，将发酵乳杆菌命名为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)SYSU-ZG3，已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21381。
实施例2发酵乳杆菌的筛选及菌种鉴定
(1)发酵乳杆菌的筛选：以来源于广州城区的健康人的粪便样本，将样本经预处理后，在含25％甘油培养基中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本，吸取10μL样本加到990μL PBS溶液进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在含有15g/L琼脂的MRS培养基上，于37℃培养24～48h，挑取乳杆菌的典型菌落至含有15g/L琼脂的MRS培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，加入终浓度25％甘油保藏，分别得到菌株SYSU-ZG3和同期筛选的菌株。肉眼观察筛选得到的发酵乳杆菌落形态，并在用革兰氏染色方法制备平板，通过光学显微镜观察。
结果见图1和图2，该发酵乳杆菌SYSU-ZG3的菌落呈小的白色半透明圆形。
(2)发酵乳杆菌的菌种鉴定：取出-80℃保存的发酵乳杆菌SYSU-ZG3单菌落划线后，提取单菌落到MRS液体培养液中培养10～20h，将菌液离心取沉淀，经纯水洗涤三次后弃上清取沉淀，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书(北京天根，中国)提取发酵乳杆菌SYSU-ZG3和同期筛选菌株基因组DNA，将提取的DNA用于16S rDNA序列扩增，并对扩增的序列进行测序(由生工生物工程(上海)股份有限公司进行)，将扩增得到的序列通过BLAST和16S rDNA数据库进行比对。
实验结果显示，发酵乳杆菌SYSU-ZG3扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，为发酵乳杆菌。
实施例3发酵乳杆菌SYSU-ZG3的耐酸、凝乳、抗氧化特性测定
(1)发酵乳杆菌SYSU-ZG3的耐酸性测定：取一定量的发酵乳杆菌SYSU-ZG3的菌株培养液于离心管中，经离心后收集菌体，加入一定量的生理盐水混匀制成悬液，取一定量的菌悬液与pH为1.6的盐酸溶液混合，摇匀，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h时取悬液于12000rpm离心1min后重悬，用PBS缓冲液稀释104、106和107倍数后取100ul涂板计数。
结果如图3和表1所示。
表1
由图3和表1可知，发酵乳杆菌SYSU-ZG3在pH为1.6的盐酸溶液中培养2h后存活率在4％-13％，具有良好的耐酸性。
(2)发酵乳杆菌SYSU-ZG3的凝乳性测定：量取100ml纯牛奶，发酵乳杆菌SYSU-ZG3按体积分数1％接种于纯牛奶中，于40℃培养16h，观察是否凝乳。
实验结果：在培养16h时，牛奶凝固良好。发酵乳杆菌SYSU-ZG3在发酵时能利用牛奶中的乳糖，产生乳酸，导致牛奶的pH降低，达到酪蛋白的等电点，使其凝集。发酵乳杆菌SYSU-ZG3在发酵的16h就能使牛奶凝乳，具有很强的凝乳性。
(3)发酵乳杆菌SYSU-ZG3的抗氧化性测定：采用索莱宝公司的谷胱甘肽过氧化物酶活性试剂盒进行测定。
a.按照细菌数量104个：提取液体积(mL)500:1的比例，冰浴超声波破碎细胞(功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min)然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测；
b.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节双波长至412nm，蒸馏水调零。将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.4μmol/mL的标准溶液。再吸取20μL各标准溶液与80μL试剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.08μmol/mL。标准液混合物现用现配。样本混合物：将30μL样本与30μL试剂一混合后室温放置5min，按说明书在测定管和对照管中分别加入样品混合物、试剂二、试剂三和试剂四；
c.抑制百分率的计算：抑制百分率＝(A对照管-A测定管)÷(A对照管-A空白管)×100％；
按细胞数量计算活力单位：每104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmolGSH氧化定义为一个酶活力单位。GPX(U/104cell)＝ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V酶促÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T＝416×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量。
结果如图4所示，发酵乳杆菌SYSU-ZG3的谷胱甘肽过氧化物酶活性：0.283U/104cell。
实施例4发酵乳杆菌SYSU-ZG3的发酵液抑菌性测定
本实施例的SYSU-ZG3发酵液由实施例1所述发酵乳杆菌SYSU-ZG3发酵制备得到。
采用牛津杯法对SYSU-ZG3发酵液的抑菌能力进行测定。选用表皮金色葡萄球菌(ATCC 12228)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和阴沟肠杆菌(ATCC 700323)三种致病菌，采用营养琼脂培养基，于160rpm/min，37℃培养18小时，将培养至对数期的致病菌稀释至菌液浓度为105CEU/ml，取菌液100uL均匀涂布于固体培养基上，混匀后倒入牛津杯平板中，凝固后取出牛津杯，分别在牛津杯中加入200uL SYSU-ZG3发酵液、氨苄青霉素(Amp)对照液和MRS培养基对照液，置于37℃培养12小时，测量抑菌圈直径。选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC25923和革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌ATCC700323作为指示菌株，测定SYSU-SU3发酵液的最小使用浓度。对发酵液进行倍半稀释，使用MRS培养基为对照，加入105CFU/ml指示菌菌液，37℃培养18小时后测OD600。
试验结果如表2和图5所示，SYSU-ZG3发酵液对ATCC25923和ATCC700323最低有效浓度在6.25％-12.5％。
表2
实施例5发酵乳杆菌SYSU-ZG3的发酵液止痒祛痘功效测试
本实施例的SYSU-ZG3发酵液由实施例1所述发酵乳杆菌SYSU-ZG3发酵制备得到。
受试人群：90名试用人员年龄在13～30岁之间，脸部皮肤状况为：油性皮肤，并患有痤疮，伴有瘙痒和炎症。
使用方法：将试用人员分成3组，每组30人，分别取不同浓度的SYSU-ZG3的发酵液涂抹于面部左右颧骨、鼻尖与瞳孔交线处左右脸颊、太阳穴与嘴角交线处，早晚各使用一次，持续使用两周。
效果判断标准：痊愈：自觉症状全部消失；显效：自觉症状大部分消失或明显减轻；有效：自觉症状改善或部分症状消失；无效：自觉症状无改变，或改变不明显。
试验结果如表3和图6所示，除3人过敏反应外，起效率为96.67％，气味可接受度良好。
表3
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种发酵乳杆菌、发酵乳杆菌的发酵液及其应用
<130> 2021.09.13
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1421
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum SYSU-ZG3
<400> 1
tgcagtcgaa cgcgttggcc caattgattg atggtgcttg cacctgattg attttggtcg 60
ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct gcccagaagc gggggacaac 120
atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc gcatgaacaa cgcttaaaag 180
atggcttctc gctatcactt ctggatggac ctgcggtgca ttagcttgtt ggtggggtaa 240
tggcctacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatgggact 300
gagacacggc ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa 360
gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 420
aaagaagaac acgtatgaga gtaactgttc atacgttgac ggtatttaac cagaaagtca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agagagtgca ggcggttttc taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac 600
cggagaagtg catcggaaac tggataactt gagtgcagaa gagggtagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctacctagt 720
ctgcaactga cgctgagact cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccggagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcttgc gccaacccta gagatagggc gtttccttcg ggaacgcaat 1020
gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgttact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
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ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg g 1421
Claims (7)
1.一种发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌命名为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SYSU-ZG3，已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21381；所述发酵乳杆菌分离自健康成人粪便。
2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌在制备抑制表皮金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的产品中的应用。
4.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌在制备祛痘产品中的应用。
5.一种发酵乳杆菌发酵液，其特征在于，由权利要求1~2任一项所述发酵乳杆菌发酵制备得到。
6.根据权利要求5所述的发酵乳杆菌发酵液在制备抑制表皮金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的产品中的应用。
7.根据权利要求5所述的发酵乳杆菌发酵液在制备祛痘产品中的应用。
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