TWI796851B - 促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的髮品與用途 - Google Patents

Abstract

一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的髮品與用途，該副乾酪乳桿菌菌株 是副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus paracasei GMNL-653)，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。

Description

促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的髮品與用途

本發明係關於一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的髮品，特別是關於一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus paracasei GMNL-653)的髮品及其用途。

紫外光、抽菸、空氣汙染物、化學燙染劑、微生物改變等都會造成頭皮及頭髮纖維的過氧化物增加，產生氧化壓力，加速頭皮老化，使得頭髮出現變灰、禿頭、頭皮屑等症狀。

毛囊的生長週期會經歷生長期(anagen phase)、退行期(catagen phase)及休止期(telogen phase)三個階段，而大量頭髮流失主要原因為掉髮後毛囊無法正常開始進入生長期。一些健髮有效物質可以刺激頭皮角質細胞或毛囊細胞產生一些生長因子，例如類胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、類胰島素生長因子-1接受器(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、血管內皮生長因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)，都有促進毛髮生長的效果。

頭皮毛囊的菌相平衡對於頭皮健康非常重要，例如，尋常性座瘡(患者頭皮P.acnes RT4/RT5增加)、圓禿(患者頭皮P.acnes增加而S.epidermidis降低)、雄性禿(患者頭皮P.acnes及M.restricta增加)、頭皮屑(患者頭皮S.epidermidis及Malassezia增加)、禿髮性毛囊炎(患者頭皮S.aureus感染增加及P.acnes增加)。此外，關於頭皮屑人體頭皮菌相研究更發現同為Malassezia菌屬，M.restricta是不好的酵母菌，M.globosa是好的酵母菌，因此一般抗屑成分洗髮精，如吡啶硫酮鋅(zinc pyrithione,ZP)，會抑制所有Malassezia菌屬之生長，長期使用反而會使得頭皮菌相失衡，對於頭皮屑的控制的助益不大。Malassezia furfur為已知的頭皮壞菌，其生物膜為其重要的致病因子，生物膜形成可保護其不受抑菌劑之傷害，為病原菌重要的防禦機制，因此阻止皮膚病原菌形成生物膜導致疾病發生，是非常重要的。

由上可知，習知髮品在促進頭皮健康，包括在促進生髮的效用上，仍有其改良之必要。

本發明之主要目的在於提供一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的髮品，以達到促進頭髮生成的效果。

為達上述之目的，在本發明之一實施方式中，提供一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株，該副乾酪乳桿菌菌株是副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653 (Lactobacillus paracasei GMNL-653)，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。

在本發明之一實施方式中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653的有效劑量為1.25×10⁸至5×10⁸細胞數(cells)/毫升

在本發明之一實施方式中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是死菌菌株。

為達上述之目的，在本發明之一實施方式中，還提供一種促進生髮的髮品，包括如上述之促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株；以及一界面活性劑。

在本發明之一實施方式中，該髮品的有效劑量為1.25×10⁸至5×10⁸cells/毫升。

在本發明之一實施方式中，該GMNL-653是死菌菌株。

為達上述之目的，在本發明之一實施方式中，又提供一種如上述之促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株在製備促進生髮的髮品的用途。

在本發明之一實施方式中，該髮品中的該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653係以1.25×10⁸至5×10⁸cells/毫升/天的劑量施用於需要增加髮量的一對象。

在本發明之一實施方式中，該施用的天數為1至3個月。

本發明的有益效果在於：本發明的促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株具有抗頭皮老化、促進人類皮膚纖維母細胞及角質細胞產生頭髮生長因子，例如IGF-1、VEGF、KGF，還可以調節頭皮毛囊菌相，例如增加頭皮好菌(例如：M.globosa)、抑制頭皮壞菌(例如：P.acnes及M.restricta)，進而可以達到促進頭髮再生、強健髮根、控制油質及頭皮屑，以及維持健康頭皮環境之功效。

第1A圖及第1B圖為GMNL-653抗過氧化物造成之皮膚細胞衰老(senescence)之效果，其中第1A圖示出了各組老化細胞的比例；第1B圖示出了不同的副乾酪乳桿菌菌株在抗衰老的程度比較；第2A圖至第2D圖顯示GMNL-653與皮膚病源菌之交互作用；其中第2A圖為GMNL-653共凝集病原菌之電子顯微鏡圖；第2B圖為利用細胞平臺評估S.aureus黏附細胞之能力；第2C圖為GMNL-653分離之LTA處理對於M.furur形成生物膜之影響；第2D圖為GMNL-653分離之LTA處理對於S.aureus形成生物膜之影響，其中數據利用t檢定進行統計分析；*表示與控制組比達統計差異(P<0.05)；第3A圖至第3D圖顯示GMNL-653對刺激Hs68細胞產生頭髮新生生長因子的影響，其中利用Q-PCR檢測GMNL-653刺激細胞產生頭髮新生生長因子之含量，以2^-△△CT表示相對控制組的含量，ACTB為各組之internal control基因；第3A圖為檢測IGF-1R、第3B圖為檢測VEGF、第3C圖為檢測IGF-1、第3D圖為檢測KGF；數據利用t檢定進行統計分析；*表示與控制組比達統計差異(P<0.05)；第4A圖至第4C圖顯示GMNL-653對刺激HaCaT細胞產生頭髮新生生長因子的影響，其中利用Q-PCR檢測GMNL-653刺激細胞產生頭髮新生生長因子之含量，以^2-△△CT表示相對控制組的含量，ACTB為各組之internal control基因；第4A圖為檢測IGF-1R、第4B圖為檢測VEGF、第4C圖為檢測IGF-1；數據利用t檢定進行統計分析；*表示與控制組比達統計差異(P<0.05)； 第5A圖及第5B圖為分別使用控制組洗髮精及實驗組洗髮精(含有本發明的促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株)進行人體臨床試驗的分析區域及項目，其中第5A圖顯示檢測頭皮的區域包括前、中、後(左)、檢測頭皮油量的裝置(中)及檢測頭皮髮量的裝置(右)，頭皮油量及髮量固定在檢測前、中、後位置的數據加總或平均；第5B圖顯示採用全頭頭皮屑黏貼貼紙(左上)及菌相採樣(右上)進行分析，先對受試者的頭皮黏貼貼紙，再使用Image J繪圖軟體定量皮屑面積(下)，菌相則以Q-PCR檢測；第6A至第6C圖顯示實驗組洗髮精對受試者的頭皮油脂的影響，其中第6A圖顯示所有受試者(N=20)；第6B圖顯示油性頭皮受試者(N=7)；第6C圖顯示非油性頭皮受試者(N=13)之頭皮油脂量情形，其中計算方式為頭頂(中)、頭後與頭前之加總值；數據利用成對樣本t檢定(Paired Sample t-test)進行統計分析，*表示與起始點(0個月(M))相比有統計差異(P<0.05)；#表示與使用控制組洗髮精1個月相比有統計差異(P<0.05)；第7A圖至第7C圖顯示實驗組洗髮精對受試者的頭皮屑的影響，其中第7A圖顯示所有受試者(N=18)；第7B圖顯示頭皮屑多者(N=8)；第7C圖顯示較無頭皮屑者(N=10)之全頭頭皮屑貼紙定量數據；數據利用成對樣本t檢定(Paired Sample t-test)進行統計分析，*表示與起始點(0M)比有統計差異(P<0.05)；#表示與使用控制組洗髮精1個月比有統計差異(P<0.05)；第8A圖至第8C圖顯示實驗組洗髮精對受試者的髮量的影響，其中第8A圖顯示所有受試者(N=19)；第8B圖顯示髮量少者(N=10)；第8C圖顯示髮量多者(N=9)之髮量變化，計算方式為計算頭頂(中)、頭後與頭前之平均髮量；數據利用成對樣本t檢定(Paired Sample t-test)進行統計分析，*表示與起始點(0M) 比有統計差異(P<0.05)；#表示與使用控制組洗髮精1個月(1M)比有統計差異(P<0.05)；第9A圖至第9E圖顯示實驗組洗髮精對受試者的頭皮菌相的影響，其中第9A圖至第9E圖為不同菌種與總菌種計算後，以2^-△CT表示相對含量，數據利用成對樣本t檢定(Paired Sample t-test)進行統計分析，*表示與起始點(0M)比有統計差異(P<0.05)；#表示與使用控制組洗髮精1個月比有統計差異(P<0.05)；第10A圖至第10F圖為GMNL-653洗髮精對於頭皮屑多者以及頭皮屑少者之菌相變化，其中第10A圖、第10C圖及第10E圖顯示為頭皮屑多者之不同菌相變化；第10B圖、第10D圖及第10F圖為頭皮屑少者之不同菌相變化；不同菌種與總菌種計算後，以2^-△CT表示相對含量，數據利用成對樣本t檢定(Paired Sample t-test)進行統計分析，*表示與起始點(0M)比有統計差異(P<0.05)；#表示與使用控制組洗髮精1個月比有統計差異(P<0.05)；以及第11A圖至第11F圖顯示菌相變化之相關性分析，其中將不同的菌種相對含量(第11A圖至第11C圖)或其與髮量(第11D圖、第11E圖)、頭皮油量(第11F圖)利用SPSS統計軟體進行Pearson相關性分析，R為相關性(正值為正相關，負值為負相關)；P為統計差異。

除非本文另有定義，否則本文所用的所有技術及/或科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。儘管與本文描述的那些類似或等同的方法及材料可以用於本發明的實施方式的實踐或測試中，但 是下面描述了示例性的方法及/或材料。如有抵觸，以專利說明書及其定義為准。另外，材料、方法及示例僅是說明性的，並不旨在限制。

本發明所提到的單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數引用，除非上下文另有明確規定。數值範圍(如10%至11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)。上述用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。

在本發明的一實施例中，提供一種促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株，該副乾酪乳桿菌菌株是副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus paracasei GMNL-653)，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。

上述實施例中的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653主要是從人體腸道篩選分離獲得的多個分離株的其中一株。利用表1之引子(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)進行PCR以複製多個分離株各自的16S rDNA片段，接著將其加以定序，定序完成後得到其中一株的16S rDNA基因序列(SEQ ID NO：3)；隨後，由NCBI網站比對後的結果可知，該分離株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：3)與副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)的16S rDNA序列相似，相似度為99%以上，故可知此菌株GMNL-653確實屬於副乾酪乳桿菌。

較佳地，在本實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是死菌菌株，並且該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653的有效劑量為1.25×10⁸至5×10⁸細胞數/毫升(cells/ml)，例如1.25×10⁸、1.5×10⁸、2×10⁸、2.5×10⁸、3×10⁸、3.5×10⁸、4×10⁸、4.5×10⁸、5×10⁸cells/ml。

在本發明的一實施例中，還提供了一種促進生髮的髮品，包括如上所述之促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株；以及一界面活性劑，該界面活性劑例如十二烷基聚氧乙醚硫酸鈉或椰油醯胺丙基甜菜鹼。在本實施例中，該髮品為洗髮劑。當然，本發明不以此為限。在其他實施例中，該髮品可為潤髮劑、護髮劑。此外，其他用於頭皮保養、修護的產品，例如頭皮水，亦可包括如上所述之促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株。

較佳地，在上述髮品的實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是死菌菌株，並且該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653的有效劑量為1.25×10⁸至5×10⁸cells/ml，例如1.25×10⁸、1.5×10⁸、2×10⁸、2.5×10⁸、3×10⁸、3.5×10⁸、4×10⁸、4.5×10⁸、5×10⁸cells/ml。

在本發明的一實施例中，還提供了一種如上所述之促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株在製備促進生髮的髮品的用途。

詳細而言，在本實施例中，該髮品中的該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653係以1.25×10⁸至5×10⁸cells/ml/天的劑量施用於需要增加髮量的一對象，該施用的天數為1至3個月。

本文中的「對象」，是指需要促進生髮效果的哺乳動物。一般來說，「對象」是人類。然而，在其它實施例中，「對象」可以是非人類的哺乳動物，例如非人類靈長類動物、狗、貓、牛、馬、兔、豬等等。

為了驗證本發明之益生菌組合物具有促進生髮的效果，進行了以下實驗。

以下實驗中未註明具體條件的實驗方法，係按照常規方法及條件，或按照試劑盒的說明書來進行選擇。

評估GMNL-653裂解物是否有抗衰老的能力：

將Hs68細胞株注入12孔細胞培養皿，於給予100μM過氧化氫(H₂O₂)刺激誘導細胞1小時後，再更換回含有血清細胞培養基，連續培養4天。不同乳酸菌株組別之裂解液組：則是將添加含有100μM H₂O₂及不同測試乳酸菌株裂解液之無血清細胞培養基處理1小時，再更換回含有測試乳酸菌株裂解液之10%血清細胞培養基，連續培養4天。

實驗結束後進行固定以及senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal)套組染色，計數染上藍色的細胞比例，比例越高表示細胞老化的程度越大。抗衰老比例計算公式如下，以過氧化氫造症組(Sham)與控制組(Control)之老化比例差值為100%，計算過氧化氫造症組(Sham)與乳酸菌試驗組(Test)差值之比例，即表示使用乳酸菌株後抑制過氧化物造成衰老比例，比例越高表示減緩細胞老化能力越好。

GMNL-653與皮膚病原菌交互作用：

益生菌及病原菌製備：

益生菌死菌製備步驟：自凍管接種副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-653、BCRC-910953或BCRC-910626至1ml MRS broth，並於37℃有氧下靜置培養20小時。次日，取15ul隔夜培養菌液至1.5ml MRS broth(1%二次活化)，37℃有氧下靜置培養20小時，以PBS清洗一次，以OD600nm推估菌數，並將菌數調整為2×10⁹至1×10¹⁰cells/ml，並進行高溫高壓滅菌121℃，15分鐘後備用。GMNL-653裂解物及脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)製備，是利用破菌裝置打破菌體後，進行離心後，進行一系列的萃取，GMNL-653裂解物經蛋白質定量確定濃度；而脂磷壁酸則是以純化後乾重為主，1.6×10¹³cells/g約可純化出18.73mg脂磷壁酸。

病原菌S.aureus(BCR C11863)以TSB培養基皆於37℃一般培養箱下培養，隔天進行益生菌及病原菌二次活化；並將菌數調整為2×10⁹cfu/ml。將病原菌Malassezia furfur(BCR C22243)畫盤於Leeming & Notman agar Modified(MLNA)培養皿中，置於30℃培養箱下培養，隔2天再進行病原菌二次活化。進行刮盤搜集菌體並回溶於PBS中，將菌數調為2×10⁹cell/ml備用。

觀察益生菌及病原菌共凝集實驗方法：

將熱殺乳酸菌(2×10⁹cells/ml)與病原菌(2×10⁹cfu/ml)以1：1混合均勻30分鐘後，將肉眼可見共凝集樣品取出後。利用低速離心打至蓋玻片。並進行清洗，再以2.5% glutaradehyde於室溫下固定1小時。以PBS潤洗3次後，接著進行脫水，再利用40%、75%及95%乙醇分別連續作用10分鐘，最後以100%乙醇，作用20分鐘3次。最後以掃描電子顯微鏡(SEM)觀察共凝集情形。

光學顯微鏡觀察S.aureus貼附皮膚細胞之情形：

將Hs68細胞以每孔1×10⁵cells加入已含有1公分圓形蓋玻片之24孔細胞培養皿中，靜置隔夜。將乳酸菌及病原菌回溶於PBS中。並調整乳酸菌量至1 x 10¹⁰cfu/ml後進行熱殺。病原菌調整菌量至1×10¹⁰cfu/ml。將乳酸菌及病原菌菌數以不含血清及抗生素DMEM分別稀釋為5.6×10⁸cfu/ml，並以1：1的比例混合，並置於37℃，培養0.5小時。取出隔夜培養於蓋玻片之細胞，以PBS清洗兩次後，加入0.5ml GMNL-653及S.aureus預混合液，並放入細胞專用之CO₂培養箱1小時。接著以PBS清洗細胞3次，並以1ml甲醇固定細胞，接著加入Giemsa染劑作用15分鐘後，以去離子水清洗玻片三次，最後將蓋玻片封片至載玻片上，並以光學顯微鏡觀察細胞上的病原菌貼附情形。

生物膜培養及染色方法：

分別將2種病原菌菌數調整至2×10⁸cfu/ml，取0.1ml調整菌數後之病原菌液至96孔細胞培養皿中培養。取0.1ml不同濃度之GMNL-653破菌後純化之LTA至96孔細胞培養皿中，並置於37℃培養箱共培養隔夜，以PBS小心潤洗2次，以移除懸浮或吸附力較弱的細菌，以95%乙醇作用1分鐘固定生物膜，再以0.1%結晶紫染色15分鐘，以PBS小心潤洗至少3次，將96孔細胞培養皿置於無菌操作臺中烘乾；加入10%冰醋酸(180ul/well)溶出結晶紫，並測量吸光值OD 595nm，吸光值越高表示生物膜生長越多。

分析熱殺GMNL-653死菌促進皮膚細胞產生頭髮新生相關因子：

將人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast,Hs68)(濃度：1.5×10⁵cells/well)或人類皮膚角質細胞(HaCaT)(濃度：3×10⁵cells/well)分別種至6孔盤，隔夜後以PBS清洗兩次，並換成serum free之medium處理24小時後，再加入不同劑量的之死菌菌液(0.3125至5×10⁸cells/ml)，處理24小時後，收集 細胞萃取物，抽取RNA後轉成cDNA，上述萃取出之cDNA當作模板，進行Q-PCR上機，每一個反應試劑以5微升的2x Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)，加入2微升的cDNA，再加入3微升的0.66μM Forward(F)+Reverse(R)引子。放入Q-PCR機器中執行即時定量聚合酵素鏈鎖反應(Real-time PCR)，相關基因表達量均為Q-PCR所得之CT值扣除本身持家基因(β-actin,ACTB)後，再扣控制組所得之相對表達量(2^-△△Ct)。

頭皮臨床試驗流程：

此臨床案登錄於ClinicalTrial.gov網站，登錄號為NCT04566549。共收案22位健康成人(年紀：37±6.2歲；性別：男性8名、女性14名)；受試者一開始使用控制組洗髮精(不含本發明促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株之基底洗髮精)1個月後，接著繼續使用含本發明促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株之洗髮精(實驗組)(含5×10⁸cells/ml GMNL-653)4個月。受試者使用洗髮精頻率為1次/日或1次/2日，依個人習慣使用。依時程測試頭皮油脂、毛囊髮量、頭皮屑含量及頭皮菌相分析。頭皮油脂檢測是利用C+K油脂檢測系統(Sebumeter 815,Courage+Khazaka electronic GmbH，德國)，測量頭部前、中、後三個區域的頭皮油脂含量，頭皮油脂含量為加總前、中、後三個區域數值所得。毛囊髮量檢測是利用Aram TSII頭髮分析檢測系統(Visia Complexion Analysis,Canfield Scientific,Inc.,USA)，透過60倍鏡頭對髮量進行分析，利用軟體分析單位範圍內之頭部前、中、後三個區域頭髮數量，以此評估使用測試品前後的髮量變化，髮量變化為前、中、後三個區域平均數值所得。頭皮屑含量是利用頭皮屑沾黏片，專人藉由專用膠帶沾黏整頭頭皮屑，並利用Image J計算頭皮屑在膠帶總面積所佔百分比(%)，藉此評估頭皮屑狀況。

整頭頭皮菌相分析採樣頭皮時使用棉棒沾取1ml特製緩衝液(PBS外加0.1% Triton X；121℃、15分鐘滅菌備用)，進行全頭皮採樣。採樣完畢將棉棒頭放回1.5ml eppendorf裡，再進行vortex至少30秒後室溫存放15分鐘。以13000rpm、10分鐘，將離心後棉棒取出轉移至過濾無菌水，進行旋轉及擰的動作將棉棒上的檢體全部溶解出，即可丟棄棉棒。接著進行離心13000rpm、5分鐘。吸掉上清液，留下沉澱物(pellet)進行細菌DNA萃取(Quick-DNA Fungal/Bacterial Kit)。上述萃取出之DNA當作模板，進行Q-PCR上機，每一個反應試劑以5微升的2x Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix，加入2微升的頭皮萃取DNA，再加入3微升的0.66μM Forward(F)+Reverse(R)引子。放入Q-PCR機器中執行即時定量聚合酵素鏈鎖反應，以下相關菌相均為Q-PCR所得之CT值扣除本身總菌所得之相對表達量(2^-△Ct)。

實驗結果：

UV光或空汙會產生皮膚氧化壓力，而加速頭皮老化，因此，觀察促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株的裂解物是否可以保護氧化壓力造成之頭皮老化。藉由檢測皮膚細胞中β-半乳糖苷酶含量，代表皮膚細胞老化(senescence)情形，經染色後計數藍色細胞佔比，比例越大表示老化的程度越高。本實驗利用100μM過氧化氫誘發Hs68細胞進行老化；並以GMNL-653裂解物(50μg/ml)處理下，可有效降低氧化壓力造成的皮膚細胞老化(第1A圖)。此外，比較不同副乾酪乳桿菌效果，其中GMNL-653為最佳(第1B圖)。

透過穿透式電子顯微鏡(SEM)觀察，發現副乾酪乳桿菌GMNL-653可以共凝集頭皮病原菌M.furfur及S.aureus(第2A圖)，藉此達到改變皮膚菌相的效果。進一步透過S.aureus貼附細胞實驗，發現GMNL-653明顯可以抑制S. aureus貼附至人類皮膚細胞上(第2B圖)，表示GMNL-653共凝集壞菌後，是可以達到阻止病原菌貼附的目的。另外，分離出GMNL-653之表面物質脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)，發現其可以抑制M.furfur及S.aureus生物膜的形成(第2C圖、第2D圖)，達到抑制病原菌定殖及惡化之目的。

此外，以不同劑量之GMNL-653熱殺菌觀察對人類皮膚纖維母細胞(fibroblast,HS68)及人類皮膚角質細胞株(HaCaT)釋放頭皮生長因子之影響，主要分析研究報導與頭髮新生有關的因子，包含IGF-1R(第3A圖)、VEGF(第3B圖)、IGF-1(第3C圖)、KGF(第3D圖)。結果發現，不同劑量之GMNL-653熱殺菌可以促進人類皮膚纖維母細胞IGF-1R、VEGF及KGF之基因合成；也可以促進人類皮膚角質細胞株IGF-1R(第4A圖)、VEGF(第4B圖)及IGF-1(第4C圖)之基因合成。順帶一提的是，在人類皮膚角質細胞株中，KGF表達量過低，低於Q-PCR可偵測範圍，因此沒有顯示結果。由以上結果可知，熱殺副乾酪乳桿菌GMNL-653具有刺激頭皮毛髮再生之效果。

參照下表2以及5A圖及第5B圖，進一步將熱殺副乾酪乳桿菌GMNL-653加入洗髮精(實驗組)中，進行人體臨床試驗。受試者總共22人，受試者先以控制組洗髮精洗1個月，再換成實驗組洗髮精洗4個月，中間時間點進行頭皮油脂、頭皮屑、髮量及菌相的分析觀察。

在頭皮油脂方面，分析所有受試者，使用實驗組洗髮精後1至4個月，與起始點比，頭皮油量有明顯降低(第6A圖)，且此效果在油性頭皮的受試者反應特別明顯(第6B圖)；在中性及乾性頭皮的受試者則變化不明顯(第6C圖)；表示GMNL-653會依據不同性質的頭皮來進行油量的調節。

在頭皮屑方面，分析所有受試者，使用控制組洗髮精1個月後，與起始點比，有略微增加；而在使用實驗組洗髮精0.5個月後，明顯降低頭皮屑產生(第7A圖)；而將受試者分為頭皮屑多者以及較無頭皮屑者來進行分析，結果發現，頭皮屑多者在使用實驗組洗髮精0.5個月後獲得明顯改善(第7B圖)；較無頭皮屑者則沒有多大變化(第7C圖)。

在髮量方面，分析所有受試者，使用實驗組洗髮精後2至4個月後，與實驗開始相比有明顯增加(第8A圖)；尤其在髮量較少者，效果特別顯著，不 論與0個月(實驗開始)或1個月(控制組洗完1個月)相比，皆有明顯增加的效果(第8B圖)。

以Q-PCR分析頭皮菌相方面，包含L.paracasei、M.restricta、M.globosa、P.acnes、S.epidermidis，在使用控制組洗髮精1個月後，與起始點相比可以明顯增加頭皮上M.globosa及降低P.acnes的數量，表示控制組洗髮精會造成菌相之改變。而在使用實驗組洗髮精1個月後，與起始點相比可以明顯增加頭皮上L.paracasei及M.globosa的數量以及降低P.acnes的數量，表示使用實驗組洗髮精後，頭皮上的好菌明顯增加，尤其是副乾酪乳桿菌，如第9A圖、第9C圖、第9D圖所示。

進一步地，與一些頭皮不健康狀況有關的P.acnes與實驗一開始比仍是降低的(第9D圖)。將受試者分為有頭皮屑者以及較無頭皮屑者來進行分析，發現這兩群人經過使用控制組以及實驗組洗髮精後，菌相變化不相同，其中發現在有頭皮屑者中，使用實驗組洗髮精的頭皮上的M.restricta明顯比使用控制組洗髮精的頭皮上的M.restricta來得低(第10A圖)，值得一提的是，過去研究發現M.restricta是對於頭皮屑大量產生重要之病原菌。

更進一步，將所有數據進行菌相兩兩相關性分析，發現頭皮之副乾酪乳桿菌含量與M.globosa成正相關(R=0.406、P=0.008)(第11A圖)，但與P.acnes成負相關(R=-0.324、P=0.008)(第11B圖)，表示副乾酪乳桿菌可改變頭皮菌相分佈。

若分析菌相與使用益生菌2或4個月之髮量變化之相關性，結果發現，副乾酪乳桿菌與髮量成正相關(R=0.277、P=0.028以及R=0.355、P=0.005)(第11D圖及第11E圖)。分析菌相與頭髮油量變化之相關性，結果發現P.acnes 與頭皮油量成正相關(R=0.324、P=0.011)(第11F圖)。綜上所述，以上結果均顯示菌相的確影響髮量及頭皮油脂分佈。

由上述結果可得知，副乾酪乳桿菌GMNL-653裂解物抑制過氧化物造成的頭皮老化，而有助於維持頭皮健康。此外，副乾酪乳桿菌GMNL-653細胞表面的LTA會抑制M.furfur及S.aureus生物膜之形成，可以保護頭皮免受病原菌的傷害，達到強健髮根的目的。經使用包括本發明的促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株洗髮精(實驗組)，發現副乾酪乳桿菌GMNL-653可停留於頭皮，並可經由刺激頭皮分泌刺激頭髮新生的生長因子，例如：IGF-1、IGF-1R、VEGF、KGF，以及調節菌相達到維持髮量的目的。此外，透過實驗亦發現副乾酪乳桿菌GMNL-653會降低頭皮M.restricta數量，而達到控制頭皮屑的效果，以及透過降低頭皮P.acnes達到控油的效果。

雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

【生物材料寄存】

副乾酪乳桿菌菌株Lactobacillus paracasei GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。

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          <![CDATA[<120>  促進生髮的副乾酪乳桿菌菌株及其髮品與用途]]>
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Claims (6)

1. 一種促進生髮的髮品，包括副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus paracasei GMNL-653)，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721；以及一界面活性劑。
2. 如請求項1所述之促進生髮的髮品，其中該髮品的有效劑量為1.25×10⁸至5×10⁸細胞數/毫升。
3. 如請求項1所述之促進生髮的髮品，其中該GMNL-653是死菌菌株。
4. 一種副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus paracasei GMNL-653)在製備促進生髮的髮品的用途，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653於2016年02月26日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910721。
5. 如請求項4所述之用途，其中該髮品中的該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653係以1.25×10⁸至5×10⁸細胞數/毫升/天的劑量施用於需要增加髮量的一對象。
6. 如請求項4所述之用途，其中該施用的天數為1至3個月。

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