CN116694705B - 超低分子透明质酸发酵液、含其产品、及其制备和应用 - Google Patents
超低分子透明质酸发酵液、含其产品、及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种超低分子透明质酸发酵液、含其产品、及其制备和应用。超低分子透明质酸发酵液的制备包括如下步骤：将酿酒酵母菌接种到发酵底物中，经有氧发酵培养，灭菌，即可；发酵底物包括粘均分子量为120万~130万的高分子透明质酸钠和水；高分子透明质酸钠占发酵底物的质量百分比为0.1%~0.5%；酿酒酵母菌包括保藏编号为CICC 1747和CICC 1308的酿酒酵母菌；单位质量的发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为107~2×107CFU/g。本申请制得的产品具有理想的美容功效，其反应条件温和，减少化学试剂使用，改善产品味道，提取工艺简单，成本低，实现节能环保，为超低分子透明质酸的制备提供新思路。
Description
技术领域
本申请属于化妆品技术领域，尤其涉及一种超低分子透明质酸发酵液、含其产品、及其制备和应用。
背景技术
透明质酸（Hyaluronic Acid，HA），又称玻尿酸，是一种以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺为双糖单位交替链接而成的黏多糖。是人体真皮层、眼睛及关节中的重要组分。透明质酸的分子量分布广泛，不同分子量的HA作用于皮肤的部位不同，也会发挥不同的功效。
超低分子HA：分子量为1万以下，会透皮吸收至真皮层，深层锁水，肌底养护。目前对于超低分子量的透明质酸的制备工艺主要有两种，分别为酸碱分解法及酶解法。其中，酸碱分解法会破坏透明质酸的分子结构，易导致制得的产品附有异味，设备要求较高；而可对大分子透明质酸进行特异性剪切的酶解法，采用的酶来源于产酶微生物，在纯化过程中需严格控制降解条件，在保证酶活的情况下去除杂蛋白，因而导致制造成本较高，浪费资源。目前，获取超低分子量透明质酸的常用方法是上述两者的综合，首先获取超高分子量透明质酸，经过酸碱降解成大分子或低分子透明质酸，随后采用酶解法获得超低分子量透明质酸，期间还需经过除杂、醇沉等步骤，工艺繁琐，增加工艺制造成本。
因此，本领域亟需研发一种可高效制备超低分子透明质酸的方法，且工艺简单，减少化学试剂使用量，制备成本低，适用于工业化生产，并保证制得的超低分子透明质酸具有理想的美容功效，且无异味。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中制备超低分子透明质酸的方法会破坏透明质酸结构、制得产品有异味、生产成本高或不适合工业化生产等缺陷，而提供一种超低分子透明质酸发酵液、含其产品、及其制备和应用。本申请采用特定混合酿酒酵母菌发酵剪切高分子透明质酸钠，制得超低分子透明质酸发酵液，提高原料高分子透明质酸钠的利用率，反应条件温和，减少化学试剂使用量，改善产品味道，并且制得的超低分子透明质酸发酵液更为天然、纯净、温和；提取工艺简单，设备要求较低，有效控制原料成本，实现节能环保。并且制得的超低分子透明质酸发酵液具有理想的抗氧化功效、修复肌肤功效和保湿功效，为超低分子透明质酸的制备提供新思路。
本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：
本申请提供一种超低分子透明质酸发酵液的制备方法，其包括如下步骤：将酿酒酵母菌接种到发酵底物中，经有氧发酵培养，灭菌，制得所述超低分子透明质酸发酵液；
其中，所述发酵底物包括粘均分子量为120万~130万的高分子透明质酸钠和水；所述高分子透明质酸钠占所述发酵底物的质量百分比为0.1%~0.5%；所述酿酒酵母菌包括购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1747酿酒酵母菌和保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌；单位质量的所述发酵底物中接种的所述酿酒酵母菌的数量为107~2×107CFU/g。
本申请中，所述粘均分子量为使用乌氏粘度计测试并计算得到。所述粘均分子量测试时的温度为25℃。
一些实施例中，保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌和保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌的接种量比可为1：（0.5~2），较佳地为1：（0.8~1）。
一些实施例中，所述酿酒酵母菌可按照本领域常规以酿酒酵母菌菌液的形式添加，所述酿酒酵母菌菌液中所述酿酒酵母菌的浓度可为105~109CFU/mL。
一些实施例中，所述有氧发酵培养的方法可为本领域常规，一般可在摇床上进行，所述摇床的转速可为250~300rpm，较佳地为270~280 rpm。
一些实施例中，所述有氧发酵培养的时间可为30~48h，较佳地为35~40h。
一些实施例中，所述有氧发酵培养的温度可为25~35℃，较佳地为28~30℃。
一些实施例中，所述有氧发酵培养的操作后还可进一步包括离心，收集上清液的操作。
其中，所述离心的转速可为本领域常规，一般可为3000~5000rpm，例如4800rpm。
其中，所述离心的时间可为本领域常规，一般可为20~40min，例如30min。
一些实施例中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，一般可为95~105℃，例如100℃。
当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为30~40min，较佳地为30~35min。
一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括与防腐剂混合的操作。
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为70~80℃，更佳地为70~75℃。
与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5%~1%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5%~2%；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%。
一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可按照本领域常规包括灭菌的操作。
其中，对所述发酵底物进行所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，一般可为95~105℃，例如100℃。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为30~40min。
其中，所述发酵底物经所述灭菌的操作后还可进一步包括降至室温的操作。
本申请还提供一种超低分子透明质酸发酵液，其由如上所述的超低分子透明质酸发酵液的制备方法制得。
本申请还提供一种如上所述的超低分子透明质酸发酵液作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
一些实施例中，所述超低分子透明质酸发酵液可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、修复肌肤活性成分和保湿活性成分中至少一种。
本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的超低分子透明质酸发酵液。
一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括美白活性成分、保湿活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种。
一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。
一些实施例中，所述超低分子透明质酸发酵液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5%~99%，较佳地为60%~99%。
一些实施例中，所述室温一般指15~40℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本申请所用试剂和原料均市售可得。
本申请的积极进步效果在于：本申请采用特定混合酿酒酵母菌发酵剪切高分子透明质酸钠，制得超低分子透明质酸发酵液，提高原料高分子透明质酸钠的利用率，反应条件温和，减少化学试剂使用量，改善产品味道，并且制得的超低分子透明质酸发酵液更为天然、纯净、温和；提取工艺简单，设备要求较低，有效控制制备成本，实现节能环保，为超低分子透明质酸的制备提供新思路。并且制得的超低分子透明质酸发酵液具有理想的抗氧化功效、修复肌肤功效和保湿功效。
附图说明
本申请可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本申请的优选实施例和解释本申请的原理和优点。其中：
图1为实施例1~4和对比例8制得产品中蛋白质含量对比图；
图2为实施例1和对比例8制得产品的DPPH自由基清除能力对比图；
图3为实施例1和对比例8制得产品的羟自由基清除能力对比图；
图4为实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中过氧化氢酶活力的影响对比图；
图5为实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中SOD酶活力的影响对比图；
图6为实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中Nrf-2 mRNA表达能力的影响对比图；
图7为实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中ROS含量的影响对比图；
图8为采用实施例1制得产品处理肌肤后，肌肤含水量随时间变化图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例和对比例中，采用的保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；配制成活菌数为109CFU/mL的CICC 1747酿酒酵母菌菌液，备用；
下述实施例和对比例中，采用的保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；配制成活菌数为109CFU/mL的CICC 1308酿酒酵母菌菌液，备用；
下述对比例中，采用的保加利亚乳杆菌购自郑州和合生物工程技术有限公司，产品编号为HH-LB57的保加利亚乳杆菌；配制成活菌数为109CFU/mL的保加利亚乳杆菌菌液，备用。
实施例1
（1）将1.5g粘均分子量为120~130万的高分子透明质酸钠和300g水混合，在温度为100℃条件下高温灭菌处理30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物；
（2）在步骤（1）制得的发酵底物中接种1.5mL上述配制的保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌菌液和1.5mL上述配制的保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌菌液，在温度为28℃条件下有氧发酵培养35 h，有氧发酵培养在转速为280rpm的摇床上进行；有氧发酵培养完成后，在转速为4800 rpm条件下离心30 min，收集上清液，将上清液在温度为100℃条件下灭菌30min，灭菌结束后，冷却至室温，制得超低分子透明质酸发酵液。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中菌种接种量不同，具体接种3mL上述配制的保藏编号为CICC1747的酿酒酵母菌菌液和3mL上述配制的保藏编号为CICC1308的酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中有氧发酵培养的时间不同，本实施例中有氧发酵培养的时间为40h，其他条件参数同实施例1。
实施例4
与实施例2相比，区别仅在于将步骤（1）中高分子透明质酸钠占发酵底物的质量百分比调整为0.1%，具体地将0.3g粘均分子量为120~130万的高分子透明质酸钠和300g水混合，其他条件参数同实施例2。
对比例1
（1）将1.5g粘均分子量为120~130万的高分子透明质酸钠和300g水混合，在温度为100℃条件下高温灭菌处理30 min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物；
（2）在步骤（1）制得的发酵底物中接种3mL上述配制的购自郑州和合生物的产品编号为HH-LB57的保加利亚乳杆菌菌液，在温度为28℃条件下静置发酵培养15 h；静置发酵培养完成后，在转速为4800 rpm条件下离心30 min，收集上清液，将上清液在温度为100℃条件下灭菌30min，灭菌结束后冷却至室温，即可。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中接种的菌种不同，采用单菌发酵的方法，具体为将混合发酵菌种替换为3mL上述配制的保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中接种的菌种不同，采用单菌发酵的方法，具体为将混合发酵菌种替换为3mL上述配制的保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中菌种的接种量不同，具体接种7.5mL上述配制的保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌菌液和7.5mL上述配制的保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中菌种的接种量不同，具体接种15mL上述配制的保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌菌液和15mL上述配制的保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。
对比例6
与实施例1相比，区别仅在于步骤（1）中发酵底物的制备方法不同，具体包括如下步骤：将3g粘均分子量为120~130万的高分子透明质酸钠和300g水混合，在温度为100℃条件下高温灭菌处理30 min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物，其他条件参数同实施例1。
对比例7
本对比例为实施例1步骤（1）中制得的发酵底物，不进行有氧发酵培养处理，具体包括如下步骤：将1.5g粘均分子量为120~130万的高分子透明质酸钠和300g水混合，在温度为100℃条件下高温灭菌处理30 min，灭菌后冷却至室温，即可。
对比例8
称取购自广州伊臣士生物科技有限公司，批号为HA20171113的超低分子量透明质酸钠，产品的粘均分子量为1W，并配制成浓度为1wt%的透明质酸钠溶液。
效果实施例1 粘均分子量测定
将0.2mol/L氯化钠溶液经垂熔玻璃滤器滤过，弃去初滤液10mL，取续滤液，在(25±0.1)℃下用乌氏粘度计，测定流出时间，重复测定两次，两次测定值应相同，为溶剂的流出时间(T0)。将供试液经垂熔玻璃滤器滤过，同法操作，测定流出时间，重复测定至少两次，两次测定值相差不应超过0.2s，取两次的均值为供试液的流出时间(Ti)。
应符合以下两个条件：
a)T大于100s；
b)Ti/T0在1.3~1.5之间。
特性黏度[η] 计算公式如下，式中C2为供试液浓度，单位为g/100mL（以干品计）；T0为溶剂的流出时间，单位为秒（s）；Ti为供试液的流出时间，单位为秒（s）：
通过下述公式计算粘均分子量，结果见表1：
。
表1
结果表明，实施例1~4制得的产品均属于超低分子透明质酸，粘均分子量均小于1万。而根据对比例1~7的结果可知，当采用乳酸菌发酵、仅采用单一酿酒酵母菌发酵、接种量过多或发酵底物浓度过高时，均无法制得超低分子透明质酸。
效果实施例2 蛋白质含量测定
采用购自百瑞极生物的BCA试剂盒测试上述实施例1~4和对比例8制得产品中蛋白质含量，测试方法如下，测试结果见表3和图1。
（1）试剂配制
1）按照试剂盒中说明配制BCA 蛋白定量检测工作液。
2）标准品溶液的制备
利用PBS将10 mg/mL 蛋白标准品稀释到1000μg/mL，然后再稀释成500、250、125、62.5、31.2μg/mL 浓度梯度的溶液，用于标准曲线测定。
（2）测试过程
1）待测液的配制
在测定前可将上述实施例1或对比例8制得的产品进行一定的稀释，使得测定结果在标准曲线范围之内，制得待测液。
2）使用96孔板，参考下表2依次加入样品，混匀，37℃孵育1小时。
表2
孵育结束后，利用酶标仪测定A562nm，并将测试结果代入标准曲线中，最终计算出上述实施例1和对比例8中蛋白质的浓度，结果见表3和图1。蛋白标准曲线为y=1.8428x+0.0685（R2= 0.9947）。
表3
结果表明，JIEGUO NQING 与市售超低分子透明质酸钠（对比例8）相比，实施例1~4制得的产品中蛋白含量更高，推测可能是采用特定混合酿酒酵母菌发酵代谢高分子透明质酸钠时，产生众多包括胞外蛋白酶在内的代谢产物，胞外蛋白酶在降解高分子透明质酸钠中起着重要的作用。
效果实施例3
本实验对不同浓度实施例1和对比例8制得的产品进行DPPH自由基清除能力检测。
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
待测液的配制：
将实施例1或对比例8制得的产品分别和纯净水混合，配制成体积百分数为6.25%、12.5%、25%、50%和100%的待测液。
DPPH溶液的配制：采用无水乙醇溶解DPPH，配制成浓度为0.2mM的DPPH溶液，现用现配，避光保存。
实验方法（在96孔板中测试，每个样品设置3个复孔）：
（1）样品组A1：取500μL的待测液与500μL的 DPPH溶液混匀；
（2）空白组A2：取500μL的待测液与等体积无水乙醇溶液混匀；
（3）对照组A3：取500μL的水与同体积的DPPH溶液混匀；
（4）避光反应30min后，在517nm下测A1管、A2管、A3管吸光度值；DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A3]×100%，测试结果见表4和图2（表4和图2中，***p＜0.001，表示与相同浓度对比例8制得产品的DPPH自由基清除率相比，具有极其显著性统计学差异；**p＜0.01，表示与相同浓度对比例8制得产品的DPPH自由基清除率相比，具有显著性统计学差异）。
表4
结果表明，本申请中经特定种类酿酒酵母菌发酵制得的超低分子透明质酸发酵液体外抗氧化效果更佳。实施例1制得的产品随着体积分数的增加，DPPH自由基清除率也随之升高。
效果实施例4 羟自由基清除实验
羟基自由基是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基。在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕获羟基自由基，并产生有色产物2,3-二羟基苯甲酸，有色产物在510nm处有强吸收峰。
若在体系中加入具有清除羟基自由基功能的样品，且样品捕捉羟基自由基的作用大于水杨酸时，便能及时清除羟基自由基，从而使有色产物的生成量减少导致吸光度减小。所以采用固定反应时间法，在510nm处测量含待测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定样品对羟自由基的清除作用。
羟自由基清除实验的具体实验步骤为：
待测液配制：将实施例1或对比例8制得的产品分别和纯净水混合，配制成体积百分数为6.25%、12.5%、25%、50%和100%的待测液。
样品组：在试管中依次加入200μL浓度为6mM的FeSO4水溶液，200μL浓度为6mM的H2O2水溶液，再加入200μL待测液，摇匀静置15min，随后加入200μL浓度为6mM水杨酸醇溶液摇匀，于37℃水浴锅中加热反应30min；随后离心取上清200μL于96孔板中，利用酶标仪测定其517nm处的吸光度A样品组。
空白组：在试管中依次加入200μL浓度为6mM的FeSO4水溶液，200μL浓度为6mM的H2O2水溶液，再加入200μL纯化水，摇匀静置15min，随后加入200μL浓度为6mM水杨酸醇溶液摇匀，于37℃水浴锅中加热反应30min；随后离心取上清200μL于96孔板中，利用酶标仪测定其517nm处的吸光度A空白组。
样品底值：在试管中依次加入200μL浓度为6mM的FeSO4水溶液，200μL浓度为6mM的H2O2水溶液，再加入200μL待测液，摇匀静置15min，随后加入200μL纯化水摇匀，于37℃水浴锅中加热反应30min；随后离心取上清200μL于96孔板中，利用酶标仪测定其517nm处的吸光度A样品组。
羟自由基清除率= [（A样品底值+A空白组-A样品组）/A空白组]×100%。
测试上述实施例1和对比例8制得产品配制成不同浓度待测液的羟自由基清除率，结果见表5和图3（表5和图3中，***p＜0.001，表示实施例1与相同浓度对比例8制得产品的羟自由基清除率相比，具有极其显著性统计学差异；**p＜0.01，表示实施例1与相同浓度对比例8制得产品的羟自由基清除率相比，具有显著性统计学差异）。
表5
结果表明，本申请中经过特定酿酒酵母菌发酵制得的超低分子透明质酸发酵液体外抗氧化效果更佳。实施例1制得的产品随着体积分数的增加，羟自由基清除率也随之升高。
效果实施例5过氧化氢酶（CAT）活性测定
本实验通过检测过氧化氢酶活力，验证上述实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中过氧化氢酶活力的影响，进而评价上述实施例1和对比例8制得产品的抗氧化能力。
待测液配制：
将实施例1或对比例8制得的产品用无血清的DMEM稀释至体积浓度为1%的待测液。
实验方法：
将对数生长期人皮肤成纤维细胞，以106个/mL 的密度接种于6孔板中，每孔2mL，分为空白组、模型组、实验组和阳性对照组（VC组），每组设置三个平行。用DMEM完全培养基培养至80%汇合度，去除培养基，用PBS小心冲洗2次，加入1mL的PBS，覆盖细胞。
模型组、阳性对照组和实验组中加入2mL浓度为1000μmol/L的H2O2处理细胞两个小时后加入2mL的无血清DMEM；空白组加入2mL的无血清DMEM；继续培养过夜，吸弃培养基，用PBS洗涤后，实验组添加2mL由上述实施例1或对比例8制得产品配制而成的体积浓度为1%的待测液（溶剂为无血清DMEM培养基）；阳性对照组添加2mL浓度为50μg/mL的VC溶液（溶剂为无血清DMEM培养基）；空白组和模型组添加2mL无血清DMEM培养基，添加后培养24h。培养后取出，用PBS洗涤2次，加入500μL的裂解液（含终浓度为1mM的PMSF），用移液器吹打均匀，于4℃，10000rpm离心10min，收集上清，以便后续检测，采用碧云天过氧化氢检测试剂盒检测上清液中过氧化氢酶活力，结果见表6和图4。
测试过程中得到标准曲线为y = 63.045x+0.047（x为残余过氧化氢摩尔数，R2=0.9996）；表6和图4中，###p＜0.001，表示与空白组相比有极其显著性降低； *p＜0.05，表示与模型组相比有差异，***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性差异。
表6
上述结果表明，细胞经过氧化氢处理后CAT活力显著降低。上述实施例1制得的产品可有效提高细胞中过氧化氢酶的活力，加速自由基的清除，证明实施例1制得的产品具有理想的抗氧化功效，且抗氧化功效显著优于对比例8的产品。
效果实施例6 SOD酶活力检测
SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，可清除自由基，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。本实验通过检测SOD酶活力，验证上述实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中SOD酶活力的影响，进而评价上述实施例1和对比例8制得产品对受损肌肤的修复能力和抗氧化能力。
待测液的配制方法：
将实施例1或对比例8制得的产品用无血清的DMEM稀释至体积浓度为1%的待测液。
实验方法：
将对数生长期人皮肤成纤维细胞接种于6孔板，每孔2mL，分为空白组、模型组、实验组和阳性对照组（VC组），每组设置三个平行。用DMEM完全培养基培养至80%汇合度，去除培养基，用PBS小心冲洗2次，加入1mL的PBS，覆盖细胞。
模型组、阳性对照组和实验组中加入2mL浓度为1000μmol/L的H2O2处理细胞两个小时后加入2mL的无血清DMEM；空白对照组加入2mL的无血清DMEM；继续培养过夜，吸弃培养基，用PBS洗涤后，实验组添加2mL由上述实施例1或对比例8制得产品配制而成的提体积浓度为1%的待测液（溶剂为无血清DMEM培养基）；阳性对照组添加2mL浓度为50μg/mL的VC溶液（溶剂为无血清DMEM培养基）；空白对照组和模型组添加2mL 无血清DMEM培养基，添加后培养6h。培养后取出，用PBS洗涤2次，加入200 μL的500 uL裂解液（含终浓度为1mM的PMSF），用移液器吹打均匀，于4℃下离心10 min，收集上清液，以便后续检测，采用ELISA试剂盒检测检测上清液中SOD酶的活力，结果见表7和图5；（表7和图5中，###p＜0.001，表示与空白对照组相比有极其显著性差异； **p＜0.01，表示与模型组相比有显著性差异，***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性差异）。
表7
上述结果表明，细胞经H2O2处理后SOD酶活力显著降低。上述实施例1制得的产品可有效提高细胞中SOD酶活力，加速自由基的清除，并且采用实施例1制得的产品处理后，细胞中SOD酶活力比空白对照组还高，证明实施例1制得的产品具有理想的细胞修复功效和抗氧化功效。
效果实施例7细胞中Nrf-2 mRNA水平测试
Nrf-2信号通路是细胞抗氧化应激的关键通路，通路被激活后可诱导HO-1等保护性基因的转录，进而抵抗各种刺激对机体产生的氧化应激损伤。本实验通过检测Nrf-2mRNA的表达水平评估上述实施例1和对比例8制得产品的抗氧化应激损伤能力。
待测液配制：
将实施例1或对比例8制得的产品用无血清的DMEM稀释至体积浓度为1%的待测液。
实验方法：
将对数生长期人皮肤成纤维细胞，以106个/mL 的密度接种于6孔板，每孔2mL，分为空白组、模型组、实验组和阳性对照组（VC组），每组设置三个平行。用DMEM完全培养基培养至80%汇合度，去除培养基，用PBS小心冲洗2次，加入1mL的PBS，覆盖细胞。
模型组、阳性对照组和实验组中加入2mL浓度为1000μmol/L的H2O2处理细胞两个小时后加入2mL的无血清DMEM；空白组加入2mL的无血清DMEM；继续培养过夜，吸弃培养基，用PBS洗涤后，实验组添加2mL由上述实施例1或对比例8制得产品配制而成的体积浓度为1%的待测液（溶剂为无血清DMEM培养基）；阳性对照组添加2mL浓度为50μg/mL的VC溶液（溶剂为无血清DMEM培养基）；空白组和模型组添加2mL无血清DMEM培养基；添加后培养24h。培养后取出，吸弃培养基，用PBS洗涤后收集细胞。根据碧云天 Trizol 试剂说明书提取细胞中RNA。使用EasyScript ® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反转录试剂盒进行 cDNA 第一条链合成反应，其反应体系如表8所示。
表8
引物的设计与合成：
根据 NCBI 中发布的基因序列，通过 PrimerExpress 软件设计引物，以管家基因β-actin 作为内参基因，Nrf2的特异性引物序列（Real-Time PCR 引物序列）见表9。
表9
根据 TransStart ® Top Green qPCR SuperMix 试剂盒进行操作，总反应体系为20μL，具体试剂与用量如表10所示：
表10
循环参数：94℃预变性30s，然后按94℃ 15 s，60℃ 15s，72℃ 10s，共40个循环，72℃收集荧光数据。反应在QuanStudio 3荧光定量PCR仪上进行，结果见表11和图6（表11和图6中，###P＜0.001，表示与空白对照组相比有极其显著性差异； ***P＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性差异；**P＜0.01，表示与模型组相比有显著性差异）。
表11
上述结果表明，细胞经过氧化氢处理后Nrf-2 mRNA相对表达量显著降低。上述实施例1制得的产品可提高细胞中Nrf-2 mRNA的表达，修复因过氧化氢引起的损伤，证明实施例1制得的产品具有理想的修复功效和抗氧化功效，且效果比市售相近分子量的透明质酸效果理想。
效果实施例8对ROS清除能力
本实验通过检测上述实施例1和对比例8制得产品对受损细胞中ROS的清除能力，进而评价上述实施例1和对比例8制得产品对受损肌肤细胞的修复能力和抗氧化能力。
待测液配制：
将实施例1或对比例8制得的产品用无血清的DMEM稀释至体积浓度为1%的待测液。
将对数生长期人皮肤成纤维细胞以 5×104个/mL 的密度接种于6孔板，每孔2mL。分为空白组、模型组、实验组和阳性对照组（VC组），每组设置三个平行。用DMEM完全培养基培养至80%汇合度，去除培养基，用PBS小心冲洗2次，加入 1mL的PBS，覆盖细胞。
模型组、阳性对照组和实验组中加入2mL浓度为1000μmol/L的H2O2处理细胞两个小时后加入2mL的无血清DMEM；空白对照组加入2mL的无血清DMEM；继续培养过夜，吸弃培养基，用PBS洗涤后，实验组添加2mL由上述实施例1或对比例8制得产品配制而成的体积浓度为1%的待测液（溶剂为无血清DMEM培养基）；阳性对照组添加2mL浓度为50μg/mL的VC溶液（溶剂为无血清DMEM培养基）；空白对照组和模型组添加2mL 无血清DMEM培养基，添加后继续培养24h，每个样品做三个平行，每个平行样品检测三次结果。培养后取出，用PBS洗涤2次。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10um/L，加入到上述各组洗涤好的贴壁细胞中，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3~5分钟轻颠混匀一下，使探针和细胞充分接触。随后用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。最后加入1mL的PBS收集细胞，使用488nm激发波长，525nm发射波长，检测各组荧光值的强弱。结果见表12和图7；（表12和图7中，###P＜0.001，表示与空白组相比有极其显著性差异； ***P＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性差异）。
表12
上述结果表明，细胞经H2O2处理后细胞内ROS含量显著升高。上述实施例1制得的产品可有效抑制H2O2对细胞的损伤，降低细胞内ROS含量，并且采用实施例1制得的产品处理后，细胞中ROS含量比空白对照组还低，证明实施例1制得的产品具有理想的细胞修复功效和抗氧化功效。
效果实施例9保湿功效
根据《化妆品保湿功效评价指南》，用角质层含水量测试皮肤的水分含量，筛选出10位符合条件的志愿者参加测试，在温度为22±2℃，湿度为40%~60%的环境中，测试实施例1制得产品对志愿者的保湿效果。
其中，测试方法如下：
清洁皮肤15min后，测定双侧前臂本底值（未涂抹产品的皮肤），取受试者双侧前臂内侧用记号笔画出面积为3.5×3.5cm正常皮肤，采用皮肤水分测试探头CorneometerCM825测试5min后、20min后、1h后受试部位的皮肤含水量。将面膜布分别剪成3×3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，把样品（实施例1制得的产品）用胶头滴管滴在面膜布上，15min后取下面膜布，取下后分别在5min、20min、60min测试皮肤含水量，结果见表13和图8（表13中，**p＜0.01，表示与本底值相比有显著性差异，*p＜0.05，表示与本底值相比有差异）。
表13
结果表明，实施例1制得的产品具有理想的保湿功效，使用5min后的水含量达到最大，使用后随着时间的延长逐渐降低并趋于平缓，水分含量均高于使用前。
最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本申请的具体实施例的描述对本申请进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本申请的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本申请所要求保护的范围内。
Claims (10)
1.一种超低分子透明质酸发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将酿酒酵母菌接种到发酵底物中，经有氧发酵培养，灭菌，制得所述超低分子透明质酸发酵液；
其中，所述发酵底物包括粘均分子量为120万~130万的高分子透明质酸钠和水；所述高分子透明质酸钠占所述发酵底物的质量百分比为0.1%~0.5%；所述酿酒酵母菌包括购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌和保藏编号为CICC1308的酿酒酵母菌；单位质量的所述发酵底物中接种的所述酿酒酵母菌的数量为107~2×107CFU/g；
保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌和保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌的接种量比为1：（0.8~1）。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述有氧发酵培养在摇床上进行，所述摇床的转速为250~300rpm；
所述有氧发酵培养的时间为30~48h；
所述有氧发酵培养的温度为25~35℃；
所述有氧发酵培养的操作后还进一步包括离心，收集上清液的操作；
所述灭菌的方法为高温灭菌法；
所述灭菌的操作后，还进一步包括与防腐剂混合的操作。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述有氧发酵培养在摇床上进行，所述摇床的转速为270~280 rpm；
所述有氧发酵培养的时间为35~40h；
所述有氧发酵培养的温度为28~30℃；
所述离心的转速为3000~5000rpm；
所述离心的时间为20~40min；
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为70~80℃；
与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%~1%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%~2%。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物在使用前还包括灭菌的操作。
6.一种超低分子透明质酸发酵液，其特征在于，由如权利要求1~5中任意一项所述的超低分子透明质酸发酵液的制备方法制得。
7.一种如权利要求6所述的超低分子透明质酸发酵液作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述超低分子透明质酸发酵液作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、修复肌肤活性成分和保湿活性成分中至少一种。
9.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的超低分子透明质酸发酵液。
10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂满足下述条件中至少一种：
所述皮肤外用剂中还进一步包括美白活性成分、保湿活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种；
所述超低分子透明质酸发酵液占所述皮肤外用剂的质量百分比为5%~99%。
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