CN114717131B - 一株对皮肤损伤具有保护作用的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供一株新型鼠李糖乳杆菌VHProbi E06（Lactobacillus rhamnosus VHProbi E06）及其应用。所述鼠李糖乳杆菌筛选自婴儿粪便样品，保藏号为CCTCC NO：M2021588。经实验验证在皮肤角质形成细胞系HaCat及3D皮肤模型水平上，该菌株能够有效缓解由细菌感染、紫外线、氧化损伤及化学损伤等多种因素造成的皮肤伤害，可应用于化妆品或药品领域。

Description

一株对皮肤损伤具有保护作用的鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌，特别是一株对皮肤损伤具有保护作用的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。益生菌最早由俄国微生物学家在20世纪初发现，发展至今已有一个多世纪，其概念以及功效已经被科学家和消费者所认同。尤其在调节肠道菌群平衡，抗病原体效应，影响人体免疫系统、增强免疫力等方面的功效已经深入人心。除此之外，近年来益生菌制剂也越来越多地用于健康皮肤护理、预防和治疗皮肤疾病以及皮肤抗氧化衰老等方面，其优点是这种方法对使用者有效，并且更天然没有副作用，代表了皮肤健康的一个新兴领域。
皮肤是人体最大的器官，直接与外环境接触，是人体重要的结构边界和感知界面，也是免疫原性器官，是抵御外界过敏原的第一道防线和生物传感器，最经常受到物理、化学、细菌及真菌的侵害。最近为了解皮肤屏障功能而进行的研究表明，皮肤的物理、免疫和细胞生物学特性与皮肤微生物菌群密切相关。多项临床研究表明，益生菌直接或间接地对皮肤有积极作用。有证据表明，益生菌疗法在预防和治疗皮肤湿疹、特应性皮炎、痤疮、过敏性炎症或皮肤过敏、紫外线引起的皮肤损伤、伤口保护等皮肤疾病方面具有巨大的潜力。
同时，实验和临床数据也证实了这样一种假设，即某些益生菌菌株或特定的细菌裂解物或提取物在肠道以外发挥作用，或直接局部应用于皮肤，并为皮肤层面带来益处。这种益生菌或提取物形式可以有助于加强皮肤屏障功能和调节皮肤免疫系统，促进皮肤的稳定状态。因此筛选优质的皮肤益生菌菌株，尤其是可以直接应用于皮肤并且对皮肤具有保护功效的菌株，仍然是本领域的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一株新型鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)及其应用。所述鼠李糖乳杆菌分离自健康婴儿粪便，经验证对多种因素造成的皮肤损伤均具有保护作用。
本发明一方面提供了一株鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌VHProbi E06(Lactobacillus rhamnosus VHProbi E06)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021588。
本发明一方面提供了鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在制备用于预防或缓解皮肤损伤的制品中的应用。
所述的制品为化妆品或药品。
本发明还提供了一种具有防晒或抗衰老功效的化妆品，包含鼠李糖乳杆菌VHProbi E06和/或鼠李糖乳杆菌VHProbi E06的发酵产物。
本发明还提供了一种用于缓解皮肤损伤的药品，包含鼠李糖乳杆菌VHProbi E06和/或鼠李糖乳杆菌VHProbi E06的发酵产物。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06耐酸性强；不产生溶血素，不溶解血细胞，对红霉素、四环素等常见的抗生素敏感，具有良好的生物安全性；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度高于8％。
所述鼠李糖乳杆菌具有较强的抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基，清除率达到38.22％。
所述鼠李糖乳杆菌能有效促进皮肤角质形成细胞(HaCat细胞)增殖。与对照组相比，添加鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体的两个处理组HaCat细胞的活力得到显著提高。
所述鼠李糖乳杆菌能有效缓解金黄色葡萄球菌感染造成的皮肤细胞损伤。被金黄色葡萄球菌侵染的对照组HaCaT细胞死亡率高达56.6％，而同时加入鼠李糖乳杆菌VHProbiE06热灭活菌体的益生菌处理组HaCaT细胞的死亡率下降至41.3％，效果非常显著
所述鼠李糖乳杆菌能有效缓解过氧化氢氧化造成的皮肤细胞损伤。与对照组相比，过氧化氢损伤组HaCat细胞的活力大幅下降，仅为49.7％；而经过鼠李糖乳杆菌VHProbiE06灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力达到59.1％，提高明显。
所述鼠李糖乳杆菌对紫外线UVB照射造成的皮肤损伤具有显著的抗炎和免疫调节作用，能有效缓解UVB照射造成的皮肤细胞损伤。与对照组相比，经过UVB光照刺激后，皮肤细胞对IL-1α、IL-1β和IL-8三种促炎症反应细胞因子的分泌水平均有显著升高；而光照刺激前，先经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤细胞对IL-1α、IL-1β及IL-8的分泌水平明显回落；且益生菌处理组皮肤细胞的活力能达到70.4％，远高于不经预处理的UVB损伤组，效果非常显著。
所述鼠李糖乳杆菌对经TritonX-100刺激造成的3D重建人体皮肤模型的皮肤屏障受损具有缓解保护作用。与对照组相比，表面涂抹0.1％TritonX-100溶液的皮肤模型的跨膜电阻值大幅下降了60.2％，而经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤模型的跨膜电阻值的下降程度有所缓解，仅比对照组降低了50.6％。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06对多种因素造成的皮肤损伤均具有一定的保护作用，可广泛应用于化妆品或药品中，应用前景广阔。
附图说明
图1为VL-2菌株菌落形态图；
图2为VL-2菌株Riboprinter指纹图谱；
图3为VL-2菌株RAPD指纹图谱；
图4为VL-2菌株rep-PCR指纹图谱；
图5为各组HaCat细胞活力对比图；
图6为金黄色葡萄球菌感染的HaCat细胞死亡率对比图；
图7为过氧化氢氧化损伤的HaCat细胞活力对比图；
图8为UVB损伤的HaCat细胞活力对比图；
图9为UVB损伤的3D皮肤模型细胞因子对比图；
图10为UVB损伤的3D皮肤模型细胞活力对比图；
图11为TritonX-100损伤的3D皮肤模型跨膜电阻值对比图。
具体实施方式
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述。
实施例1菌株的分离筛选
1.1乳酸杆菌初筛
配制MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基：纯化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g,乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0mL，柠檬酸二胺2.0g,碳酸钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15g，调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，取1g来自1岁半的半年内未食用过益生菌制剂的健康婴儿的新鲜粪便，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃培养48h，待平板长出单菌落进行镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出9株潜在乳酸杆菌，分别命名为VL-1，VL-2，……，VL-9。
1.2乳酸杆菌复筛
配置1L MRS液体培养基，115℃高压灭菌30min，待培养基冷却后，加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，制成耐酸性培养基。
将筛选得到的9株乳酸杆菌VL-1，VL-2，……，VL-9，按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃静置培养72h，取发酵液进行菌量计数。
结果显示，所述9株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值分别为8.21、8.36、7.71、7.52、6.97、7.43、7.21、5.96、6.65Log CFU/mL，VL-2菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，菌量对数值高达8.36Log CFU/mL。从而说明，本发明筛选到的VL-2号菌株耐酸能力最高。
实施例2菌株鉴定
2.1菌落形态鉴定
将VL-2菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃培养48h。VL-2的菌落形态如图1所示，菌落呈乳白色，菌落直径在2mm左右，表面湿润，显微镜下呈短杆状，二端呈圆形，通常单独出现，呈短链状。
2.2生理生化特性鉴定
在无菌条件下，取适量新鲜VL-2菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为菌悬液。
2.2.1盐度耐受性试验
在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL菌悬液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。
结果显示，VL-2菌株在1％～8％盐浓度下均可生长，其最大耐受盐浓度高于8％。
2.2.2过氧化氢酶实验
取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3％过氧化氢溶液，观察到VL-2菌株不产生气泡，是阴性反应。
2.2.3碳源代谢试验
本实验中所用的基础培养基配方如下：
蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5mL；酚红18mg；蒸馏水100mL；pH7.4±0.2。盐溶液成分：MgSO4·7H2O 11.5g，MnSO4·4H2O 2.8g，蒸馏水100mL。
配制10g/100mL的糖、醇和苷类碳水化合物溶液，并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96孔板中加入20μL除菌后的碳水化合物溶液，每种碳水化合物4个平行，然后加入170μL灭菌后含酚红的基础培养基，再加入10μL菌悬液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。37℃厌氧培养，以酚红为指示剂，观察培养基颜色变化。具体结果见表1。
表1 VL-2菌株碳源代谢结果
Figure BDA0003250855340000051
注：“+”阳性反应；“-”阴性反应。
2.3分子生物学鉴定
2.3.1 16s rDNA基因序列分析
1、基因组DNA提取
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。
2、16s rDNA基因扩增
1)引物序列:
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
2)反应体系(50μL)
表2. 16s rDNA PCR扩增体系
Figure BDA0003250855340000052
3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。
4)PCR产物测序
通过测序获得VL-2菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI数据库中进行比对，初步确定VL-2菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。序列如下所示：CGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTGC。
2.3.2 Riboprinter指纹图谱
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，VL-2菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其Riboprinter指纹图谱结果见图2。
2.3.3 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定
1、RAPD指纹图谱鉴定
1)引物序列：M13(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)；
2)RAPD反应体系
表3 RAPD反应体系
Figure BDA0003250855340000071
3)电泳
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。VL-2菌株的RAPD指纹图谱如图3所示。
2、rep-PCR指纹图谱
1)rep-PCR引物
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。
2)rep-PCR的反应体系
表4 rep-PCR的反应体系
Figure BDA0003250855340000072
3)电泳
DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。VL-2菌株的的rep-PCR指纹图谱如图4所示。
综上，将VL-2菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献De Clerck E，etal.Systematic and applied microbiology,2004，27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，VL-2菌株为一株新的鼠李糖乳杆菌，将其命名为鼠李糖乳杆菌VHProbi E06(Lactobacillus rhamnosus VHProbi E06)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021588。
实施例3鼠李糖乳杆菌VHProbi E06的溶血性及抗生素耐受性实验
3.1溶血性实验
(1)接种液制备：将冷冻保存的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06菌株划线接种于MRS琼脂培养基中，在温度37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把鼠李糖乳杆菌VHProbi E06接种到新鲜的MRS液体培养基中37℃培养24～48h，获得新鲜的菌液，作为接种液。
(2)血细胞培养基准备：称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。
(3)划线培养：将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。
结果显示：鼠李糖乳杆菌VHProbi E06不能生长，血细胞平板没有变化，说明鼠李糖乳杆菌VHProbi E06不产生溶血素，不能够溶解血细胞。
3.2抗生素耐受性实验
(1)抗生素配制：氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BSM液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度。
(2)接种液制备：取适量新鲜菌液(24h，37℃培养)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
(3)微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳杆菌VHProbi E06的最小抑菌浓度MIC值
a.96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
b.加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。
c.将96孔板于37℃培养24h后取出，测定OD600值，用24h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，具体结果见表5。
表5鼠李糖乳杆菌VHProbi E06的抗生素MIC值
Figure BDA0003250855340000081
Figure BDA0003250855340000091
MIC单位μg/mL
从表5的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06对红霉素、四环素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
实施例4鼠李糖乳杆菌VHProbi E06清除DPPH自由基能力的测定
4.1 PBS菌悬液制备
将生长状态优良的单菌落接种于3mLMRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLPBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mLPBS溶液重悬菌体备用。
4.2菌株清除DPPH自由基能力的测定
取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。
以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)IMC-4菌株为阳性对照，结果见表6。
表6 DPPH自由基清除率
Figure BDA0003250855340000092
从表6的数据可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效清除DPPH自由基，清除率达到38.22％，显著高于副干酪乳杆菌(L.paracasei)IMC-4菌株。
实施例5鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在促进细胞增殖中的应用
5.1热灭活菌体制备：
鼠李糖乳杆菌VHProbi E06使用MRS液体培养基培养至稳定期，使用无菌PBS洗涤3次，并用无菌PBS将菌体重悬至5×107CFU/mL，于70℃水浴中20分钟热灭活备用。
5.2细胞准备：
人永生化角质形成细胞HaCat使用高糖DMEM(10％FBS)培养液培养至所需用量，胰酶消化计数，细胞悬液加入24孔板中，每个细胞培养孔中的细胞个数为2×105，每孔培养液的添加量为0.6ml。置于二氧化碳培养箱(5％CO2，37℃)中培养24小时后，进行后续实验。
5.3实验方法：
将鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体按MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)值为10和100的比例分别加入HACAT中，并设置不加菌的对照组，继续培养24h后，待检测的每个细胞培养孔中加入终浓度为0.3mg/ml的MTT溶液，置于37℃5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每孔加入500ul的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。分别计算各组的细胞活力。
细胞活力(％)＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。
5.4实验结果
检测结果如图5所示：与对照组相比，添加鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体的两个益生菌处理组HaCat细胞的活力得到显著提高。从而说明本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06对HaCat细胞的增殖有明显的促进作用(MOI:10，p<0.05；MOI:100，p<0.05)。
实施例6鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在降低金黄色葡萄球菌感染细胞损伤中的应用
6.1热灭活菌体制备：
方法同实施例5。
6.2 HaCat细胞准备：
方法同实施例5。
6.3实验方法：
将HaCaT细胞原培养液更换为无抗性无血清DMEM培养液。
实验设置对照组和益生菌处理组，其中：对照组每孔细胞中接种金黄色葡萄球菌菌液1μL；益生菌处理组每孔中接种金黄色葡萄球菌菌液1μL，同时按MOI(Multiplicity ofInfection，感染复数)值为10的比例加入鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体。
将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h；细胞培养上清液离心去杂质；按照乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天C0016)产品说明进行检测操作并计算细胞毒性或死亡率(％)。
6.4实验结果：
从图6的结果可知，被金黄色葡萄球菌侵染的对照组HaCaT细胞死亡率高达56.6％，而同时加入鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体的益生菌处理组HaCaT细胞的死亡率下降至41.3％，效果非常显著(P<0.005)。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效降低金黄色葡萄球菌感染造成的细胞损伤。
实施例7鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在降低细胞氧化损伤中的应用
7.1热灭活菌体制备：
方法同实施例5。
7.2 HaCat细胞准备：
方法同实施例5。
7.3实验方法：
实验设置对照组、过氧化氢损伤组、益生菌处理组。其中：对照组：细胞正常培养；过氧化氢损伤组：加入终浓度为0.5mM的过氧化氢溶液；益生菌处理组：先按MOI值为10的比例将鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体加入HaCat细胞中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3h，然后加入终浓度为0.5mM的过氧化氢溶液。
以上各组细胞均置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养1h。
各组细胞弃掉原培养液，并使用PBS润洗两次，每孔再加入0.6mL的新鲜培养液。置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h。将待检测的每个细胞培养孔中加入终浓度为0.3mg/ml的MTT溶液，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的DMSO，37℃孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。分别计算各组的细胞活力。
细胞活力％＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。
7.4实验结果：
从图7的结果可知，与对照组相比，过氧化氢损伤组HaCat细胞的活力大幅下降，仅为49.7％；而经过鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力达到59.1％，提高明显(P<0.005)。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效降低过氧化氢造成的细胞损伤。
实施例8鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在降低细胞光损伤中的应用
8.1热灭活菌体制备：
方法同实施例5。
8.2 HaCat细胞准备：
方法同实施例5。
8.3实验方法：
实验设置对照组、UVB损伤组、益生菌处理组，其中：
(1)对照组：细胞正常培养，不加益生菌，未经UVB照射；
(2)UVB损伤组：UVB紫外灯下进行光照，光剂量为60mJ/cm2；
(3)益生菌处理组：先将鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体按MOI值为100的比例加入HaCat细胞中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3h；然后UVB紫外灯下进行光照，光剂量为60mJ/cm2；
照射结束后，将细胞置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h。
待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，终浓度为0.3mg/ml，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。分别计算各组的细胞活力。
细胞活力％＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。
8.4实验结果：
从图8的结果可知，与对照组相比，UVB损伤组HaCat细胞的活力大幅下降，仅为50.2％，而经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力高达70.1％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效降低紫外线UVB照射造成的皮肤细胞损伤。
实施例9鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在缓解皮肤UVB光损伤中的应用
9.1热灭活菌体制备：
方法同实施例5。
9.2 3D重建人体皮肤模型：
3D重建人体皮肤模型EpiSkinTM购于上海斯安肤诺生物科技有限公司，是一种正常人类角质形成细胞在胶原基质上经过气液培养而成的体外重建人类表皮模型。该模型在组织结构上能够模拟正常人类表皮的分层结构，包含具有屏障功能的角质层。
9.3实验方法：
EpiSkinTM3D皮肤模型分为对照组、UVB损伤组、益生菌处理组，其中：
(1)对照组：在皮肤模型表面均匀涂抹无菌PBS，未经UVB照射；
(2)UVB损伤组：在皮肤模型表面均匀涂抹无菌PBS，37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3h后，置于UVB紫外灯下进行光照刺激，光剂量为200mJ/cm2；
(3)益生菌处理组：先在皮肤模型表面均匀涂抹鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体，37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3h后，置于UVB紫外灯下进行光照刺激，光剂量为200mJ/cm2；
照射结束后，将皮肤模型置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养72h。
培养结束后，分别进行促炎症反应细胞因子和细胞活力检测，每组设3个平行样本检测。
细胞因子检测方法：
吸取下层培养液，使用ELISA方法对培养液中的IL-1α、IL-1β及IL-8含量进行测定。结果如图9所示。
皮肤细胞活力检测方法：
使用MTT法，即将3D皮肤组织在含有终浓度为0.3mg/mlMTT的检测培养基中孵育3h，使用打孔器将皮肤组织从支架中切割分离，置于1.5mlEP管中，加入1ml DMSO，在避光条件下将皮肤组织浸泡2h，并涡旋震荡，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。计算各组皮肤细胞的活力，如图10所示。
细胞活力(％)＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。9.4实验结果：
从图9的结果可知，与对照组相比，经过UVB光照刺激后，皮肤细胞对IL-1α、IL-1β和IL-8三种促炎症反应细胞因子的分泌水平均有显著升高；而光照刺激前，先经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤细胞对IL-1α、IL-1β及IL-8的分泌水平明显回落(p<0.005)。从而表明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06对紫外线UVB照射造成的皮肤损伤具有显著的抗炎和免疫调节作用。
从图10的结果可知，与正常对照组相比，经过UVB光照刺激后，皮肤细胞活力大幅降低，仅有50.1％，而光照刺激前，先经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理后的益生菌处理组细胞的活力能达到70.4％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效缓解紫外线UVB对皮肤造成的损伤。
实施例10鼠李糖乳杆菌VHProbi E06在缓解TritonX-100造成的皮肤损伤中的应用
10.1热灭活菌体制备：
方法同实施例5。
10.2 3D重建人体皮肤模型
同实施例9。
10.3实验方法：
TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种非离子表面活性剂，能破坏脂质双分子层，除去细胞的质膜和内膜系统，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原。0.1％的TritonX-100处理皮肤样本，会对皮肤细胞造成损伤，而损伤后的皮肤跨膜电阻值会显著下降。
EpiSkinTM3D皮肤模型分为对照组、TritonX-100损伤组、益生菌处理组，其中：
(1)对照组：在皮肤模型表面上均匀涂抹无菌PBS；
(2)TritonX-100损伤组：在皮肤模型表面均匀涂抹0.1％的TritonX-100溶液；
(3)益生菌处理组：先在皮肤模型表面均匀涂抹鼠李糖乳杆菌VHProbi E06热灭活菌体，37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3h后，再涂抹0.1％的TritonX-100溶液；
将各组皮肤模型置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h；然后使用无菌PBS缓冲液反复冲洗皮肤模型表面至少10次，擦干表面液体，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养24h后，分别检测皮肤模型的跨膜电阻值。每组设3个平行样本检测。
跨膜电阻值检测方法为：将EVOM2跨膜电阻仪的功能开关调至OHMs，连接电极，将电极放入预热至37℃的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中平衡20min。移除皮肤模型培养板中的培养基，加入预热的HBSS，上层每孔加0.5ml，下层每孔加1.5ml，37℃平衡20min，移除HBSS，重新加入37℃预热的HBSS，测定跨膜电阻值。用一个未接种皮肤细胞的空白载体重复上述步骤以获得空白值。计算各组皮肤模型的跨膜电阻值。
跨膜电阻值(TEER)＝(测定电阻值—空白值)*皮肤模型表面积(cm2)。
10.4实验结果：
从图11的结果可知，与对照组相比，表面涂抹0.1％TritonX-100溶液的皮肤模型的跨膜电阻值大幅下降了60.2％，而经鼠李糖乳杆菌VHProbi E06灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤模型的跨膜电阻值的下降程度有所缓解，仅比对照组降低了50.6％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06能有效降低TritonX-100对皮肤造成的损伤，效果显著。
综上所述，本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06耐酸性强，不产生溶血素，不能溶解血细胞，对红霉素、四环素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。该菌株具有很强的抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基。该菌株对HaCat细胞的增殖有明显的促进作用；并且能有效降低金黄色葡萄球菌感染、过氧化氢氧化、紫外线UVB照射以及TritonX-100刺激造成的各种皮肤损伤，效果非常显著。本发明提供的鼠李糖乳杆菌VHProbi E06及其发酵产物可广泛应用于化妆品或药品中，应用前景广阔。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一株对皮肤损伤具有保护作用的鼠李糖乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400> 1
cggctcgctc cctaaaaggg ttacgccacc ggcttcgggt gttacaaact ctcatggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta 120
ctagcgattc cgacttcgtg taggcgagtt gcagcctaca gtccgaactg agaatggctt 180
taagagatta gcttgacctc gcggtctcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg 240
tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300
tcaccggcag tcttactaga gtgcccaact aaatgctggc aactagtcat aagggttgcg 360
ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420
tgtcattttg cccccgaagg ggaaacctga tctctcaggt gatcaaaaga tgtcaagacc 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc 600
gttagctgcg gcactgaagg gcggaaaccc tccaacacct agcattcatc gtttacggca 660
tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tacccatgct ttcgagcctc agcgtcagtt 720
acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc 780
tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc 840
ctcggttaag ccgagggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc 900
ccaataaatc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960
gccgtggctt tctggttgga taccgtcacg ccgacaacag ttactctgcc gaccattctt 1020
ctccaacaac agagttttac gacccgaaag ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc 1080
agacttgcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg 1140
tctcagtccc aatgtggccg atcaacctct cagttcggct acgtatcatt gccttggtga 1200
gccgttacct caccaactag ctaatacgcc gcgggtccat ccaaaagcga tagcttacgc 1260
catctttcag ccaagaacca tgcggttctt ggatttatgc ggtattagca tctgtttcca 1320
aatgttatcc cccacttaag ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccactcgt 1380
tcaaaattaa atcaagatgc aagcaccttt caataatcag aactcgttcg actgc 1435

Claims (5)

1.一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）VHProbi E06，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2021588。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备用于预防或缓解皮肤损伤的化妆品中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌为灭活菌体。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备用于预防或缓解皮肤损伤的药品中的应用。
4.一种具有防晒或抗衰老功效的化妆品，其特征在于，所述的化妆品包含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌的灭活菌体。
5.一种用于缓解皮肤损伤的药品，其特征在于，所述的药品包含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌。
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