CN115181698B - 一种益生菌组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种益生菌组合物及应用。所述益生菌组合物含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)cb39Y4和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)cb20y1；所述益生菌组合物能够显著抑制痤疮丙酸杆菌(P.ances)的生长，抑菌率高于90％，具有显著的抑菌效果；同时对炎症因子IL‑8和IL‑1β的表达具有显著的抑制作用，具有抗炎活性；而且对皮肤油脂的分泌具有抑制作用；可应用于预防或治疗痤疮，增强皮肤屏障，可制备祛痘制剂、药物或化妆品，为痘痘的预防、治疗或皮肤的修复提供新的选择。

Description

一种益生菌组合物及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种益生菌组合物及应用。
背景技术
痤疮患者普遍出油较多，皮脂腺分泌旺盛，人皮脂腺细胞大量分泌脂质是发生痤疮的前提条件。痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，也叫毛囊周围炎，常见于人的面部、头皮或前胸后背等皮脂腺分泌旺盛的地方，对人的生理和心理均有不同程度影响。
根据痤疮的病因及症状，痤疮的治疗可从抑制皮肤油脂、抑制皮肤炎症、抑制痤疮相关病原菌等方面入手。现有技术公开虽然公开了可以利用益生菌乳酸杆菌对痤疮进行治疗，但其仅仅是针对抑制痤疮病原菌痤疮丙酸杆菌的增殖，作用有限。因此，十分有必要研究作用更广，效果更佳的祛痘产品。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中祛痘产品作用有限的不足，提供一种益生菌组合物及应用。
本发明的目的在于提供一种益生菌组合物。
本发明的目的还在于提供所述益生菌组合物在制备祛痘制剂方面的应用。
本发明的目的还在于提供所述益生菌组合物在制备抑制炎症、抑制皮肤油脂分泌和/或抗菌的制剂方面的应用。
本发明的目的还在于提供所述益生菌组合物在制备祛痘药物和/或日化品中的应用。
本发明的目的还在于提供一种祛痘的制剂。
本发明的目的还在于提供一种祛痘的药物。
本发明的目的还在于提供一种祛痘的日化品。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一种益生菌组合物，含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2，于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022885，保藏地址为中国，武汉，武汉大学；
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4，于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022886，保藏地址为中国，武汉，武汉大学；
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
所述5b4m2菌株采集自湖北武汉地区5岁小孩粪便微生物样本，经分离纯化筛选获得。该5b4m2菌株的16S rRNA的核苷酸序列长度为1041bp，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，该5b4m2菌株与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)同源性为98.01％，鉴定其为植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum 5b4m2；
所述cb39Y4菌株采集自湖北武汉地区健康成人粪便微生物样本，经分离纯化筛选获得。该cb39Y4菌株的16S rRNA的核苷酸序列长度为1085bp，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，该菌株与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)同源性为96％以上，鉴定其为长双歧杆菌，命名为Bifidobacterium longum cb39Y4；
该cb20y1菌株采集自健康产妇粪便微生物样本，经分离纯化筛选获得。该菌株的16S rRNA的核苷酸序列长度为1000bp，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，该菌株与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)同源性为98％以上，鉴定其为长双歧杆菌，命名为Bifidobacterium longum cb20y1。
所述益生菌组合物在制备祛痘制剂方面的应用也在本发明的保护范围之内。
所述益生菌组合物在制备抑制炎症、抑制皮肤油脂分泌和/或抗菌的制剂方面的应用也在本发明的保护范围之内。
所述益生菌组合物在制备祛痘药物和/或日化品中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种祛痘制剂，利用所述益生菌组合物制备得到。
优选地，利用所述益生菌组合物的发酵产物制备得到。
进一步优选地，所述发酵产物为发酵上清液和/或发酵溶胞物。
进一步优选地，利用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
一种祛痘的药物，利用所述益生菌组合物制备得到。
优选地，利用所述益生菌组合物的发酵产物制备得到。
进一步优选地，所述发酵产物为发酵上清液和/或发酵溶胞物。
进一步优选地，利用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
一种祛痘的日化品，利用所述益生菌组合物制备得到。
优选地，所述日化品为护肤品或化妆品。
优选地，利用所述益生菌组合物的发酵产物制备得到。
进一步优选地，所述发酵产物为发酵上清液和/或发酵溶胞物。
进一步优选地，利用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
优选地，所述发酵产物是相同接种浓度、相同发酵时间下，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵产物、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵产物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵产物以体积比1～2:1～2:1～2制备得到。
优选地，所述发酵产物是相同接种浓度、相同发酵时间下，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液以体积比1～2:1～2:1～2制备得到。
优选地，所述发酵产物是相同接种浓度、相同发酵时间下，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵产物、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵产物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵产物以体积比1:1:1制备得到。
优选地，所述发酵产物是相同接种浓度、相同发酵时间下，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液以体积比1:1:1制备得到。
优选地，所述发酵上清液是植物乳杆菌5b4m2或长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
作为所述发酵上清液的具体实施例，所述发酵上清液是将植物乳杆菌5b4m2或长双歧杆菌cb20y1的菌悬液在37℃，按照体积百分数3％～5％的接种量接种至植物乳杆菌5b4m2发酵培养基或长双歧杆菌cb20y1发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵，转速200r/min，培养19～21h后结束发酵；发酵结束后，将发酵液经过滤除菌处理，得到的滤液即为植物乳杆菌5b4m2的发酵上清液或长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液。
所述发酵溶胞物为长双歧杆菌cb39Y4经发酵后，破碎细胞，过滤的滤液。
作为所述发酵溶胞物的一个具体实施例，所述发酵溶胞物的制备方法为：将所述长双歧杆菌cb39Y4的菌悬液按照体积百分数3％～5％的接种量接种至长双歧杆菌cb39Y4发酵培养基，置于37℃培养14～25h，发酵完成后，破碎细胞，过滤的滤液即为所述发酵溶胞物。
所述益生菌组合物可以质量百分数5％～15％的添加量加入到乳液基质中，制备祛痘日化品。如精华液、面霜、面膜等。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的益生菌组合物能够显著抑制痤疮丙酸杆菌(P.ances)的生长，抑菌率高于90％，具有显著的抑菌效果；同时对炎症因子IL-8和IL-1β的表达量具有显著的抑制作用，具有抗炎活性；而且对皮肤油脂的分泌具有抑制作用；本发明的益生菌组合物可应用于预防或治疗痤疮，增强皮肤屏障，可单独或作为辅料制备祛痘制剂、药物或化妆品，为痘痘的预防或治疗、皮肤的修复提供新的选择。
附图说明
图1为本发明实施例6炎症因子IL-8、IL-1β的分泌量。
图2为本发明实施例7中SZ95细胞染色后镜检结果。
图3为本发明实施例7中SZ95细胞油脂相对分泌率。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
MRS固体培养基：大豆蛋白胨30g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温80 0.5mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：大豆蛋白胨30g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温80 0.5mL/L、L-半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
植物乳杆菌5b4m2发酵培养基：5g豆粕、5g玉米、5g麸皮、2g葡萄糖、0.5g MgSO47H2O、0.5g酵母浸粉，采用去离子水定容至1L。
长双歧杆菌cb39Y4发酵培养基：10g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g NaCl、以及0.5gMgSO4 7H2O，0.5g L-半胱氨酸盐酸盐，采用去离子水定容至1L，调pH调至6～6.5。
长双歧杆菌cb20y1发酵培养基：20g葡萄糖，30g大豆蛋白胨，0.35g MgSO47H2O，1gL-半胱氨酸盐酸盐，采用去离子水定容至1L，调pH调至6～6.5。
实施例1植物乳杆菌5b4m2的筛选及鉴定
1.菌株的分离和纯化
收集得到湖北武汉地区5岁小孩粪便微生物样本，经过无菌无氧水梯度稀释后，将不同梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基(pH＝6.8，添加溴甲酚绿作为指示剂)，37℃培养48小时至长出菌落。挑取周边变黄、菌落形态为杆状的典型单菌落，采用平板划线法在MRS固体培养基进一步纯化，得到纯菌落。
2.纯菌落的筛选
对实施例1得到的纯菌落进行抗生素耐药性测试，利用双层平板法分别测试纯菌落对氯霉素(Cm)、呋喃唑酮(Fz)、红霉素(Ery)、四环素(TCs)、氨苄西林(Amp)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)、萘啶酸(NA)和利福平(Rif)9种抗生素的耐药性。
双层平板下层为1.5％的营养琼脂培养基，上层用0.5％的软琼脂培养基，上层培养基与各纯菌落制备的母液以100：1混匀。待平板固化和表面干燥后，放入商品化抗生素药敏片(氯霉素Cm，呋喃唑酮Fz，红霉素Ery，四环素TCs，氨苄西林Amp，新霉素Neo，庆大霉素Gen，萘啶酸NA和利福平Rif)过夜培养，根据抑菌圈大小，观察各纯菌落对抗生素的抗性。根据NCCLS标准进行判读：抑菌圈直径≤12mm为抗生素耐药，直径越小，耐药性越好；抑菌圈直径≥18mm为抗生素敏感。
经过测试发现，耐药性最好的一株菌并命名为5b4m2，5b4m2对9种抗生素抑菌效果如表1所示，
表1
表1结果显示，5b4m2对氯霉素(Cm)、四环素(TCs)、氨苄西林(Amp)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)和萘啶酸(NA)均有耐药性；其中对氯霉素(Cm)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)和萘啶酸(NA)的耐药性更显著。
3.菌株5b4m2的鉴定
采用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)对菌株5b4m2进行16s rDNA测序，测序得到的序列如SEQ ID NO:1所示，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，本发明分离纯化得到的菌株5b4m2的16S rDNA序列与Lactobacillusplantarum同源性为98.01％，进化距离最近，鉴定为一株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌5b4m2(Lactobacillus plantarum 5b4m2)，于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022885，保藏地址是中国，武汉，武汉大学。
实施例2长双歧杆菌cb39Y4的筛选及鉴定
1.菌株的分离和纯化
收集得到湖北武汉地区健康成人粪便微生物样本，经过无菌无氧水梯度稀释后，将不同梯度的稀释液涂布于添加溴甲酚绿指示剂的MRS固体培养基，37℃培养48小时至长出菌落。挑取典型单菌落，采用平板划线法在MRS固体培养基划线2～3次纯化，培养得到纯菌落。
采用16s rDNA对纯菌落进行测序鉴定，采用的引物是通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增并测序，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，发现了一株与Bifidobacterium longum同源性最高，进化距离最近的菌株，命名为长双歧杆菌cb39Y4(Bifidobacterium longum cb39Y4)，长双歧杆菌cb39Y4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，长双歧杆菌cb39Y4于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022886，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例3长双歧杆菌cb20y1的筛选及鉴定
1.菌株的分离、纯化及筛选
收集得到健康产妇粪便微生物样本，经过无菌无氧水梯度稀释后，将不同梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时至长出菌落。挑取典型单菌落，采用平板划线法在MRS固体培养基进一步纯化，得到纯菌落。
采用琼脂扩散法，以痤疮丙酸杆菌作为指示菌，将灭菌后的MARS培养基放于室温待其冷却至48～50℃，吸取指示菌稀释液100μl加入到10ml的MARS培养基中并将其倒入90mm的培养皿中，摇匀，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl菌悬液，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，经过抑菌活力筛选比较，发现cb20y1菌株的抑菌活性最高。
2.cb20y1菌株的鉴定
提取菌株cb20y1的基因组，以提取的基因组为模板，采用的引物是通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增并测序，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，cb20y1菌株的16S rDNA序列与Bifidobacterium longum同源性最高，进化距离最近，鉴定为一株长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌cb20y1(Bifidobacteriumlongum cb20y1)，长双歧杆菌cb20y1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址是中国，武汉，武汉大学。
实施例4菌株的发酵及益生菌组合物的制备
1.植物乳杆菌5b4m2的发酵上清液的制备
菌种活化：将保存于-80℃冰箱的实施例1得到的植物乳杆菌5b4m2的甘油冻存管取出，置于室温融化，在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体斜面，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为植物乳杆菌5b4m2且无污染后，挑取平板上的单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃摇瓶，厌氧培养24小时。
菌株发酵：将活化后的菌液在37℃按照体积百分数3％～5％的接种量接种至植物乳杆菌5b4m2发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵(转速200r/min)，发酵培养19～21h。发酵完成后，得到发酵液，将发酵液经过过滤除菌处理，得到的滤液即为植物乳杆菌5b4m2的发酵上清液。
2.长双歧杆菌cb39Y4的发酵溶胞物的制备
菌种活化：将保存于-80℃冰箱的实施例2得到的长双歧杆菌cb39Y4的甘油冻存管取出，置于室温融化，在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体斜面，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌cb39Y4且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃摇瓶，厌氧培养24小时。
菌株发酵：将活化后的菌液在37℃按照体积百分数3％～5％的接种量接种至长双歧杆菌cb39Y4发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵(转速：200r/min)，培养19～21h即可结束发酵。发酵完成后，得到发酵液，发酵液经高压均质或超声或酶解破碎裂解细胞，过滤收集到的滤液即为长双歧杆菌cb39Y4的发酵溶胞物。
3.长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液的制备
菌种活化：将保存于-80℃冰箱的实施例3得到的长双歧杆菌cb20y1的甘油冻存管取出，置于室温融化，在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体斜面，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌cb39Y4且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃摇瓶，厌氧培养24小时。
菌株发酵：将活化后的菌液在37℃，按照体积百分数3％～5％的接种量接种至长双歧杆菌cb20y1发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵(转速：200r/min)，培养19～21h。发酵完成后，得到发酵液，将发酵液经过过滤除菌处理，得到的滤液即为长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液。
4.益生菌组合物的制备
将本实施例制得的植物乳杆菌5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液按照体积比1:1:1混合，即得。实施例5益生菌组合物的抑菌效果测试
1.实验方法
选择痤疮丙酸杆菌(P.ances，ATCC6919)作为病原菌，测试1wt％实施例4制备的益生菌组合物对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。首先制备病原菌菌悬液：Ep管里加入1ml BHI，制备浓度105CFU/ml的P.ances菌悬液，按照实验分组：
对照组：600μl P.ances菌悬液+600μl PBS；
实验组：600μl P.ances菌悬液+600μl 1wt％实施例4制备的益生菌组合物；
对照组和实验组在37℃分别培养48h后利用点板方法分别测定两组的P.ancesCFU值，测定结果如表1所示。根据《一次性使用卫生用品卫生标准》(GB15979-2002)中“溶出性抗(抑)菌产品抑菌性能试验方法”计算抑菌率，若抑菌率≥50％～90％，产品有抑菌作用，若抑菌率≥90％，产品有较强抑菌作用。
表1
组别 P.ances CFU值(CFU/ml) 抑菌率 判定结果
对照组 1～2*1010 - -
实验组 3～4.8*107 ＞90％ 较强抑菌效果
表1的结果表明，1％益生菌组合物对痤疮丙酸杆菌的抑制率超过90％，能有效抑制痤疮丙酸杆菌。
实施例6益生菌组合物的抗炎效果测试
通过测试痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激的HaCaT细胞炎症因子IL-8、IL-1β的分泌水平，评价益生菌组合组的抗炎效果。
(1)热灭活的痤疮丙酸杆菌悬浮液的制备：痤疮丙酸杆菌(P.acne，保藏编号：ATCC6919)：培养至菌悬液浓度108CFU/ml，菌液80℃下加热30min灭活，热灭活的痤疮丙酸杆菌的悬浮液，保存在4℃冰箱。
(2)细胞处理：
HaCaT细胞以3×104个/孔的密度接种到96孔板中，37℃，5％CO2条件下培养24小时后吸除上清，实验分组，
CK组：加入200μl的PBS；
模型组：加入100μl热灭活的痤疮丙酸杆菌的悬浮液(108CFU/孔)和100μl PBS；
实验组：加入100μl热灭活的痤疮丙酸杆菌的悬浮液(108CFU/孔)和100μl的1wt％实施例4制备的益生菌组合物。
各组加样结束后，37℃，5％CO2条件下处理24小时，收集细胞培养上清，并用ELISA试剂盒测量炎症因子IL-8、IL-1β的分泌水平。
(3)结果：炎症因子IL-8、IL-1β的分泌量如图1所示，图1结果显示，与CK组相比，模型组IL-8、IL-1β的分泌量均显著增加，说明模型组构建成功；与模型组相比，添加1％益生菌组合物后IL-8、IL-1β的分泌量显著降低，说明本发明的益生菌组合物能够显著的抑制炎症因子IL-8、IL-1β的表达，具有显著的抑制炎症的效果。
实施例7益生菌组合物对皮肤油脂分泌的影响
(1)油酸培养基的配制：制备浓度1M的油酸水溶液(OA，分子量282.46)；5.0g牛血清白蛋白(BSA)用水定容至50ml，制备质量百分数为10％的BSA溶液；将16μL 1M的OA水溶液与2ml质量百分数10％的BSA溶液混合，37℃摇床6～8h，得OA浓度为80mM的混合液，将1ml混合液与40ml DMEM培养基混合，过滤，即得油酸培养基，储存于4℃。
(2)油红O工作液的配制：1g油红O溶于200ml异丙醇中，搅拌混匀溶解，即得油红O储存液，可4℃避光保存。将油红O储存液与超纯水以体积比3:2混合，静置10min，滤纸过滤，即得油红O染色工作液。
(3)细胞处理：以3×104个/孔的密度将SZ95细胞(人皮脂腺细胞)接种到96孔板中，37℃，5％CO2条件下培养24小时后，PBS洗一次，吸除上清，按照以下分组加样：
阴性对照组：添加DMEM(无血清)培养基；
模型组：添加现配置的油酸培养基；
实验组：添加现配置的油酸培养基和1wt％实施例4制备的益生菌组合物。
加样后继续培养SZ95细胞24h，将各组培养24h后的SZ95细胞用PBS洗1次，然后利用4％甲醛固定细胞5min(甲醛没过细胞即可，弃液，PBS洗1次；然后利用60％的异丙醇处理细胞5min(没过细胞即可)，弃液；将各组以120μL/每孔的添加量加入油红O染色工作液，避光染色处理1小时；染色结束后，用真空泵吸去油红O染色工作液，然后每孔加入200μL60wt％异丙醇溶液处理3min，弃去异丙醇，然后利用显微镜观察，细胞染色红色越多，表明油脂越多；每孔加入200μL，100％异丙醇，避光，摇床孵育5min，使与油脂结合的油红O充分洗涤下来；然后将洗涤下来的油红O洗涤液转移150μL到96孔板中，利用酶标仪在OD500nm处测量吸光值。并按照以下公式计算油脂相对分泌率：
油脂相对分泌率(％)＝OD实验组/OD模型组*100。
(4)结果：
SZ95细胞染色后镜检结果如图2所示，其中，A为模型组，B为实验组。
图2显示，模型组有较大面积的红色区域，说明造模成功；模型组的红色区域显著高于实验组，说明，添加1wt％实施例4制备的益生菌组合物后油脂的分泌得到了显著的抑制，说明本发明的益生菌组合物具有抑制油脂分泌的作用。
SZ95细胞油脂相对分泌率如图3所示，图3结果显示，模型组油脂相对分泌率为100％，显著高于阴性对照组，说明模型组造模成功；与模型组相比，添加1wt％实施例4制备的益生菌组合物后油脂相对分泌率显著降低，抑油率达64.5％，说明本发明的益生菌组合物具有抑制油脂分泌的作用。
实施例8益生菌组合物的刺激性测试
利用鸡胚实验评价益生菌组合物的刺激性。测试受试物引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，标准描述了评价被评估物质潜在的刺激性的要素和过程。试验环境和操作需符合SN/T 2285规范要求。
选取孵9日龄鸡胚蛋，用牙科弯镊小心剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴几滴生理盐水使充分润湿，倾出后，用镊子小心除去蛋壳膜。
受试物分组：
阴性对照组：选用质量浓度为0.9％氯化钠溶液；
阳性对照组：选用0.1mol/L氢氧化钠溶液；
实验组：1wt％实施例4制备的益生菌组合物。
将各组溶液或组合物分别取0.3mL直接滴加于鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)表面，观察反应情况，并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间。
按表2的刺激性分类评分标准给与评分(ES)；各组受试物的ES值及刺激性分类如表3所示。
表2
终点评分 刺激性分类
ES≤12 无/轻刺激性
12＜ES＜16 中度刺激性
ES≥16 严重刺激性
表3
表3的结果显示，1wt％益生菌组合物的ES值为0，刺激性分类为无刺激性；说明了本发明的益生菌组合物对皮肤温和无刺激性，可安全应用于皮肤涂覆用制剂如化妆品、护肤品等。
将实施例4制得的植物乳杆菌5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液按照体积比1:2:2混合或者以体积比2:1:1混合，制备的益生菌组合物均具有抑制痤疮丙酸杆菌、抑制炎症因子IL-8、IL-1β的表达、抑制油脂分泌的作用，且对皮肤温和无刺激性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院
<120> 一种益生菌组合物及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1041
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum 5b4m2(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
catctctgtc ccttaggcgg ctggttccta aaaggttacc ccaccgactt tgggtgttac 60
aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat 120
gctgatccgc gattactagc gattccgact tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg 180
aactgagaat ggctttaaga gattagctta ctctcgcgag ttcgcaactc gttgtaccat 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca ccagagtgcc caacttaatg ctggcaactg 360
ataataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
caaccatgca ccacctgtat ccatgtcccc gaagggaacg tctaatctct tagatttgca 480
tagtatgtca agacctggta aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac 540
cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc ttgcggccgt actccccagg 600
cggaatgctt aatgcgttag ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagcat 660
tcatcgttta cggtatggac taccagggta tctaatcctg tttgctaccc atactttcga 720
gcctcagcgt cagttacaga ccagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc 780
tacgcatttc accgctacac atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtttcccag 840
tttccgatgc acttcttcgg ttgagccgaa ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct 900
gcgctcgctt tacgcccata aatccggaca cgcttgcccc tacgtttacc gcgctgctgg 960
acgtaatagc cggggtttct ggtaataccg ccatacctga cagtactctc agattgtctt 1020
ctttacaaca aattttcagc c 1041
<210> 2
<211> 1085
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum cb39Y4(Bifidobacterium longum)
<400> 2
acgtcacgct gcttaccatg cagtcgaacg ggatccatca ggctttgctt ggtggtgaga 60
gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga cctgccccat acaccggaat agctcctgga 120
aacgggtggt aatgccggat gctccagttg atcgcatggt cttctgggaa agctttcgcg 180
gtatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt gacggcgggg taacggccca ccgtggcttc 240
gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacattggg actgagatac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc 360
cgcgtgaggg atggaggcct tcgggttgta aacctctttt atcggggagc aagcgagagt 420
gagtttaccc gttgaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480
ggtgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagggctc gtaggcggtt cgtcgcgtcc 540
ggtgtgaaag tccatcgctt aacggtggat ccgcgccggg tacgggcggg cttgagtgcg 600
gtaggggaga ctggaattcc cggtgtaacg gtggaatgtg tagatatcgg gaagaacacc 660
aatggcgaag gcaggtctct gggccgttac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt ggatgctgga tgtggggccc 780
gttccacggg ttccgtgtcg gagctaacgc gttaagcatc ccgcctgggg agtacggccg 840
caaggctaaa actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa gcggcggaac atgcggatta 900
attcgatgca ccgcgaagaa ccttacctgg gcttgacatg ttcccgacgg tcgaaaaaaa 960
cggcttccct tcgggcgggt tccaggtggg gctggcctcc caactccggc cggaaagttg 1020
ggttaatccc ccaccaaggc accctccccc cggttccacg gatatccggg aatcccgggg 1080
aaccc 1085
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum cb20y1(Bifidobacterium longum)
<400> 3
ggcgcatggg ggctacctgc agtcgacggg attccatcag gctttgcttg gtggtgagag 60
tggcgaacgg gtgagtaatg cgtgaccgac ctgccccata caccggaata gctcctggaa 120
acgggtggta atgccggatg ctccaacttt ccgcatggtt tgctgggaaa gctttcgcgg 180
tatgggatgg ggtcgcgtcc tatcagcttg acggcggggt aacggcccac cgtggcttcg 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacattggga ctgagatacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tggaggcctt cgggttgtaa acctctttta tcggggagca agcgagagtg 420
agtttacccg ttgaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gtgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg 540
gtgtgaaagt ccatcgctta acggtggatc cgcgccgggt acgggcgggc ttgagtgcgg 600
taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca 660
atggcgaagg caggtctctg ggccgttact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg gatgctggat gtggggcccg 780
ttccacgggt tccgtgtcgg agctaacgcg ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa 900
ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt tcccgacggt cgtaaaaaac 960
ggcttccctt cgggcgggtt cccaggtggg gatggcctcg 1000

Claims (7)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)cb20y1；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2，于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022885；所述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)cb39Y4，于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022886；所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984。
2.权利要求1所述益生菌组合物在制备祛痘制剂方面的应用。
3.权利要求1所述益生菌组合物在制备抑制皮肤油脂分泌和/或抗菌的制剂方面的应用，其特征在于，所述抗菌为抗痤疮丙酸杆菌。
4.权利要求1所述益生菌组合物在制备祛痘药物和/或日化品中的应用。
5.一种祛痘制剂，其特征在于，利用权利要求1所述益生菌组合物中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
6.一种祛痘的药物，其特征在于，利用权利要求1所述益生菌组合物中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
7.一种祛痘的日化品，其特征在于，利用权利要求1所述益生菌组合物中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5b4m2的发酵上清液、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb39Y4的发酵溶胞物和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1的发酵上清液制备得到。
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