CN114410548A - 具有各种功能的新型乳酸杆菌及其用途 - Google Patents

具有各种功能的新型乳酸杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型乳酸杆菌菌株、新型双歧杆菌菌株、或从朝鲜泡菜或人粪便中分离出来的乳酸菌混合物。本发明所述的某种乳酸杆菌菌株或某种双歧杆菌菌株是从朝鲜泡菜或人粪便中分离出来的，因此安全性高，具有抗氧化活性、β‑葡萄糖醛酸酶抑制活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性或紧密连接蛋白表达诱导活性等各种生理活性。因此，本发明所述的乳酸杆菌菌株、双歧杆菌菌株或其混合物可用作用于预防、减轻或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎性疾病或肥胖症的功能性食品或药物材料。

Description

具有各种功能的新型乳酸杆菌及其用途
本申请是申请日为2016年9月7日、申请号为201680066778.X、发明名称为“具有各种功能的新型乳酸杆菌及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新型乳酸菌等，更具体涉及新型乳酸菌或新型乳酸菌混合物，其从朝鲜泡菜或人粪便中分离出来且具有如抗氧化活性、β-葡糖醛酸糖苷酶抑制活性、抑制脂多糖(LPS)产生的活性或诱导紧密连接蛋白表达的活性等各种生理活性。此外，本发明涉及新型乳酸菌或新型乳酸菌混合物的各种食物和药用用途。
背景技术
随着人类已经发展成为一个繁荣的社会，快餐迅速流行起来，疾病模式也发生了巨大变化。特别是在现代人中，由于基于肉和脂肪、饮食不规律、饮酒过度、缺乏锻炼、压力过大、暴露于有害环境等快餐饮食习惯，肠道菌群紊乱、肠道通透性综合征、结肠炎、肝脏疾病、过敏性疾病、肥胖症等正在增加。
肠道菌群紊乱
人体胃肠道中生活着很多细菌。人体约有10万亿个正常细胞，但约有100万亿个比正常细胞大10倍左右的细菌。这些细菌可以分为对人体肠道健康有益的有益细菌和对人体健康有害的有害细菌。当有益的细菌如乳酸杆菌、双歧杆菌、链球菌、明串珠菌、片球菌、芽孢杆菌等在胃肠道中比有害细菌更占优势时，人体可以保持健康。否则，会引起如肥胖、肠道通透性综合征、肝脏疾病、加速老化、肠炎等疾病。
肠道通透性综合征
人体的胃肠道由粘液和绒毛组成，能有效吸收营养成分，但是能阻止高分子量病原微生物或由这些微生物产生的毒素的吸收。另外，人体具有能够保护身体免受具有高分子量的外部抗原侵袭的免疫系统。然而，由于许多病原微生物或毒素的感染、过度的压力、摄入能够增殖胃肠道中有害细菌的高脂饮食等食物、过量饮酒、滥用药物(例如抗生素)等，肠道菌群紊乱、胃肠道免疫系统发生异常、紧密连接蛋白的表达受到抑制。如果紧密连接蛋白的表达被抑制，则肠粘膜的紧密连接变得松散，以及由于免疫系统的松散的间隙和异常而导致大分子侵入体内。肠道通透性综合征也称为漏肠综合征，是指由于形成胃肠道的上皮细胞的紧密连接屏障系统不顺畅，而将外部致病因子如不消化的食物、病原微生物、毒素等连续导入血液中的症状。当肠道通透性综合征发生时，通常不被人体吸收的外部抗原进入人体，从而引起溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肝损伤、肝功能障碍、过敏性疾病(包括哮喘)、特应性、自身免疫性疾病、脂肪泻、消化吸收障碍、痤疮、加速老化、内毒素血症、肠道感染、湿疹、肠易激综合征、慢性疲劳综合征、牛皮癣、类风湿性关节炎、胰腺功能不全、炎性关节疾病等。
结肠炎
尽管之前已知欧洲人的溃疡性结肠炎和克罗恩病的发病率很高，但由于如饮食习惯等生活方式的改变，最近包括韩国在内的东方国家的溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者数量迅速增加。然而，原因尚不清楚，因此这些疾病的基本治疗方法尚未建立。出于这个原因，用药不是为了彻底治疗，而是为了缓解症状并在最长的可能时间内保持缓解状态。作为这种对症疗法的药物，主要使用氨基水杨酸药物，肾上腺皮质类固醇药物，免疫抑制剂等，但据报道会引起各种副作用。例如，经常用作氨基水杨酸药物的柳氮磺胺吡啶会引起包括恶心、呕吐、厌食、皮疹、头痛、肝损伤、白细胞减少、异常红细胞、蛋白尿、腹泻等副作用。另外，肾上腺皮质类固醇药一般用氢化波尼松口服、输液、栓剂、静脉注射等给药，但长期使用会引起强烈的副作用，如胃溃疡或股骨坏死。然而，停药会导致症状复发，因此必须持续使用这些药物。因此，需要开发用于治疗肠道疾病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病等，且具有优异的效果、安全且无副作用的药剂。肠易激综合征(IBS)也是一种慢性腹部疾病，其原因尚不清楚。目前，没有针对IBS并且为了缓解每种IBS的症状而进行对症治疗的基本治疗剂。例如，对于腹泻-IBS，使用具有抑制平滑肌收缩的解痉作用的抗胆碱能药，对于便秘-IBS，使用盐泻药。对于难以用药物控制的交替-IBS，基本上使用改善胃肠运动功能的药剂。
肝脏疾病
人体的肝脏起着比如能量代谢(营养物质处理和储存、废物排泄)、毒素解毒、合成血清蛋白、以及通过胆汁分泌顺利地吸收肠内脂肪的作用，并且在免疫系统维护(身体防御)和维生素代谢中也起重要作用。然而，感染肝炎病毒或过量摄入酒精或高脂肪膳食可能会引起肝脏疾病，如肝炎、脂肪肝或肝硬化。此外，肝病也可能由药物(结核治疗药物、阿司匹林、抗生素、麻醉剂、抗高血压药、口服避孕药等)、先天性代谢紊乱、心力衰竭、休克等引起。肝病发生时，可发展为慢性肝炎，从急性肝炎开始，伴有疲劳、呕吐、腹泻、厌食、黄疸、右上腹痛、发热或肌肉疼痛。
过敏性疾病
随着社会越来越复杂，工业和文明的发展，环境污染和压力增加，随着饮食习惯的改变，过敏性疾病患者每年都在增加。1980年患有过敏性疾病如特应征、厌食症(anaxylosis)、哮喘的患者低于1％，但在2000年代迅速上升至5％以上，估计超过10％，包括潜在患者。过敏性疾病是由机体的过度免疫反应引起的，这是由抗原抗体反应引起的，过敏性疾病根据反应时间和是否有补体被分为1型至4型超敏反应。1型超敏反应包括特应性、过敏性休克、支气管哮喘、荨麻疹、花粉症等；2型超敏反应包括输血不足、自身免疫性溶血性贫血、药物引起的溶血性贫血、粒细胞减少症、血小板减少性紫癜等；3型过敏反应包括红斑、淋巴肿胀、关节痛、关节炎、肾炎、链球菌感染后的急性肾小球肾炎等；4型超敏反应包括慢性炎症等。为改善过敏性疾病，最好通过淋浴或洗澡去除皮肤上的过敏原(屋尘，螨等)，并避免过敏原摄入。然而，当过敏性疾病没有得到改善时，使用诸如类固醇、抗组胺药、免疫抑制剂等药物，容易引起诸如皮肤萎缩、血管舒张、变色、紫癜(类固醇)、困倦(抗组胺药)、肾衰竭(免疫抑制剂)等副作用。迄今为止开发的药物中，没有任何药物可以完全治愈过敏症，这些药物有望改善症状，但有引起显著副作用的问题。
肥胖症
肥胖症是由卡路里摄入和消耗的不平衡引起的代谢障碍，由形态学上的体内脂肪细胞的增加的大小(肥大)或增加的数目(增生)引起。肥胖不仅是西方社会最常见的营养不良症，由于饮食习惯的改善和生活方式的西化，韩国的肥胖症患病率也迅速增加。因此，肥胖症的治疗和预防的重要性受到了极大的重视。肥胖是在心理方面干扰个人的重要因素，并且在社会方面也增加了各种成人疾病的风险。已知肥胖与各种成人疾病例如2型糖尿病、高血压、高脂血症、心脏病等的增加的患病率直接相关(细胞87：377,1999)，与肥胖相关的疾病统称为代谢综合征或胰岛素抵抗综合征，据报道这些疾病会导致动脉硬化和心血管疾病。目前已知的罗氏鲜(罗氏制药，瑞士)，诺美婷(雅培，美国)，艾力斯(Exolise)(健康法玛，法国)等肥胖症治疗剂主要分为食欲抑制剂、能量消耗促进剂和脂肪吸收抑制剂。大多数肥胖症治疗剂是抑制食欲的食欲抑制剂，其通过控制与下丘脑相关的神经递质来抑制食欲。然而，传统的治疗剂引起如心脏病、呼吸系统疾病、神经系统疾病等副作用，并且其作用持续性也低。因此，需要开发改善的肥胖症治疗剂。另外，在目前开发的产品中，很少或没有治疗剂有令人满意的治疗效果且没有副作用，因此需要开发新的肥胖治疗剂。
益生菌统称为活微生物，可改善动物(包括人)胃肠道中宿主的微生物环境，并对宿主的健康有益。有效的益生菌必须具有优异的耐酸性、抗胆汁性和对上皮细胞的粘附性，因为大多数这些益生菌在口服时应达到小肠并且必须粘附在肠表面。乳酸菌被用作益生菌，因为它们在生活在人体消化系统中时起到分解纤维和复杂蛋白质以生产重要营养素的作用。据报道，乳酸菌具有比如维持肠道正常菌群、改善肠道菌群、抗糖尿病和抗高脂血症、抑制癌变、抑制结肠炎以及宿主免疫系统的非特异性活性等作用。在这些乳酸菌中，乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)菌株是生活在人体肠内的正常微生物群落的主要成员，并且长期以来一直被认为对维持健康的消化道和阴道环境很重要。目前，根据美国公共卫生服务准则，所有保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的乳酸杆菌菌株被归类为“生物安全性1级”，被认为没有已知的导致人或动物疾病的潜在风险。同时，参与朝鲜泡菜发酵的朝鲜泡菜乳酸菌已被报道具有免疫增强作用、抗菌作用、抗氧化作用、抗癌作用、抗肥胖作用、高血压的预防作用或便秘的预防作用[Hivak P，Odrska J，Ferencik M，Ebringer L，JahnovaE，Mikes Z.：施用一年益生菌菌株屎肠球菌M-74降低血清胆固醇水平.：Bratisl lekListy 2005；106(2)；67-72；Agerholm-Larsen L.Bell ML.Grunwald GK.Astrup A.：益生菌奶制品对血浆胆固醇的影响：短期干预研究的元分析(metaanalysis)；Eur J ClinNutr.2000；54(11)856-860；Renato Sousa，Jaroslava Helper，Jian Zhang，Strephen JLewis和Wani O Li；嗜酸乳酸杆菌超微粉(supernants)对大鼠体重和瘦素表达的影响；BMC补充和替代药物。2008；8(5)1-8]。
由于已知乳酸菌的各种生物活性，所以近年来进行了开发具有优异功能并对人类安全的乳酸菌株的研究，并将这些菌株应用于药物或功能性食品。例如，韩国公开号为10-2009-0116051的专利申请公开了具有治疗和预防结肠炎作用的短乳酸杆菌HY7401。此外，韩国公开号为10-2006-0119045的专利申请公开了用于预防或治疗特应性皮炎的乳酸菌，所述乳酸菌选自下组：柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)KACC91035、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)KCTC 3100和短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)KCTC 3498。此外，韩国公开号为10-2013-0092182非专利申请公开了一种用于预防酒精性肝病或缓解宿醉的功能性保健食品，其包含具有优异的分解醇的能力的短乳酸杆菌HD-01(保藏号：KACC91701P)。另外，韩国公开号为10-2010-0010015的专利申请公开了具有血液胆固醇降低和抗肥胖活性的约氏乳酸杆菌(Lactobacillusjohnsonii)HFI 108菌株(KCTC 11356BP)。另外，韩国公开号为10-2014-0006509的专利申请公开了包含产生共轭亚油酸作为活性成分的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CGB-C11菌株(保藏号：KCTC 11979BP)的用于预防或治疗肥胖症的组合物。
然而，目前还没有能够缓解或治疗现代人中正在增加的肠道菌群失调、肠道通透性综合征、结肠炎、肝脏疾病、过敏性疾、肥胖症等乳酸菌相关技术的报道。因此，需要筛选具有各种功能的新型菌株并通过使用该菌株来开发药物，功能性食品等。
【本发明】
【技术问题】
本发明是在上述背景技术下完成的，本发明的一个目的是提供具有益生菌所需的各种生理活性或功能的新型乳酸菌及其食品和药用用途。
本发明的另一个目的是提供一种能够表现出各种最大化的生理活性或功能的新型乳酸菌混合物及其食物和药用用途。
【技术方案】
本发明人从朝鲜泡菜或人粪便中筛选出大量乳酸菌，并发现在这些筛选的乳酸菌中，某种乳酸杆菌菌株、双歧杆菌菌株或其混合物对改善肠道通透性综合征等肠损伤、脂肪肝等肝损伤、特应性皮炎等过敏性疾病、结肠炎等炎症性疾病或肥胖症具有优异效果，从而完成了本发明。
为实现上述目的，本发明的一个实施方案提供了一种乳酸菌，所述乳酸菌选自：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16SrDNA核苷酸序列。短乳酸杆菌，植物乳酸杆菌或长双歧杆菌具有抗氧化活性、β-葡萄糖醛酸酶抑制活性、抑制脂多糖(LPS)产生的活性或诱导紧密连接蛋白表达的活性。本发明的另一个实施方式提供用于预防或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎性疾病或肥胖症的药物组合物，其包含乳酸菌，所述乳酸菌选自下组：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列，乳酸菌的培养物、乳酸菌的裂解物或乳酸菌的提取物作为活性成分。本发明的另一个实施方式提供用于预防或缓解肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎性疾病或肥胖症的食物组合物，其包含短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16SrDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列，乳酸菌的培养物、乳酸菌的裂解物或乳酸菌的提取物作为活性成分。
为了实现本发明的其他目的，本发明的一个实施方案提供了两种或更多种乳酸菌的混合物，所述混合物选自下组：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ IDNO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列。乳酸菌混合物具有抗氧化活性、β-葡萄糖醛酸酶抑制活性、脂多糖(LPS)生产抑制活性或紧密连接蛋白表达诱导活性。本发明的另一个实施方案提供用于预防或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎症性疾病或肥胖症的组合物，其包含两种或更多种乳酸菌的混合物，其选自下组：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列，乳酸菌混合物的培养物、乳酸菌混合物的裂解物或乳酸菌混合物的提取物作为活性成分。本发明的另一个实施方式提供用于预防或缓解肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎性疾病或肥胖症的食物组合物，其包含两种或更多种乳酸菌的混合物，其选自下组：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列，乳酸菌混合物的培养物、乳酸菌混合物的裂解物或乳酸菌混合物的提取物作为活性成分。
【有益效果】
本发明的某种乳酸杆菌菌株或某种双歧杆菌菌株从朝鲜泡菜或人粪便中分离，因此安全性高，具有抗氧化活性、β-葡萄糖醛酸酶抑制活性、脂多糖(LPS)生成抑制活性或紧密连接蛋白表达诱导活性等各种生理活性。因此，本发明的某种乳酸杆菌菌株或某种双歧杆菌菌株或其混合物可用作用于预防、减轻或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎症性疾病或肥胖症的功能性食品或药物材料。
【附图说明】
图1显示了在本发明的第一个实验中，当将乳酸菌施用于具有D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物时GOT值的变化。
图2显示了在本发明的第一个实验中，当将乳酸菌施用于具有D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物时GPT值的变化。
图3显示了在本发明的第一个实验中，当将乳酸菌施用于具有D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物时MDA值的变化。
图4显示了本发明的第一个实验中筛到的乳酸菌对脂多糖(LPS)诱导的树突状细胞的炎症反应的影响。图4中的左图显示了乳酸菌对未用LPS(脂多糖)处理的细胞的影响，右图显示了乳酸菌对用LPS(脂多糖)处理的细胞的影响。
图5显示了在本发明的第一个实验中，长双歧杆菌CH57对LPS(脂多糖)诱导的巨噬细胞炎症反应的影响。
图6显示了在本发明的第一个实验中，通过荧光活化细胞分选系统分析短乳酸杆菌CH23对T细胞(从脾中分离)分化成Th17细胞或Treg细胞的影响的结果。
图7显示了在本发明的第一个实验中，分析短乳酸杆菌CH23、长双歧杆菌CH57或其混合物对CaCO2细胞中ZO-1蛋白表达的影响的结果。
图8显示了在本发明的第一个实验中，结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性表明了长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图9的组织学图像显示了在本发明的第一个实验中，长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图10显示了在本发明的第一个实验中，炎症相关细胞因子水平表明长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图11显示了在本发明的第一个实验中，结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性表明了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图12结肠的组织学图像显示了在本发明的第一个实验中，短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图13显示了在本发明的第一个实验中，T细胞分化模式表明了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图14显示了在本发明的第一个实验中，炎症相关细胞因子水平表明了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图15显示了在本发明的第一个实验中，结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图16的组织学图像显示了在本发明的第一个实验中，长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图17显示了在本发明的第一个实验中，炎症相关细胞因子水平表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图18显示了在本发明的第一个实验中，体重变化表明长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响。
图19显示了在本发明的第一个实验中，结肠外观、髓过氧化物酶(MPO)活性、结肠的组织学图像等表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响。
图20显示了在本发明的第一个实验中，炎症相关细胞因子水平表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响。
图21显示了在本发明的第一个实验中，炎症反应标记物表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响。
图22显示了在本发明的第二个实验中，T细胞分化成Th17细胞表明了乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图23显示了在本发明的第二个实验中，T细胞分化成Treg细胞表明了乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图24显示了在本发明的第二个实验中，炎症反应标记物表明了乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。
图25显示了在本发明的第二个实验中，乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡的小鼠的胃粘膜的作用。
图26显示了在本发明的第二个实验中，总的胃损伤分数(gross gastric lesionscore)显示了乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响。
图27显示了在本发明的第二个实验中，溃疡指数显示了乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响。
图28显示了在本发明的第二个实验中，组织学活性指数显示了乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响。
图29显示了在本发明的第二个实验中，髓过氧化物酶(MPO)活性显示了乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响。
图30显示了在本发明的第二个实验中，CXCL4表达水平显示了乳酸菌对由乙醇诱导的具有胃溃疡的小鼠的胃粘膜的影响。
图31显示了在本发明的第二个实验中，TNF-α表达水平显示了乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响。
【发明方式】
如本文所用，将定义本发明中使用的术语。
如本文所用，术语“培养物”是指通过在已知液体培养基或固体培养基中培养微生物获得的产物，因此旨在包括微生物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”和“在医学上可接受的”指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的活性物质的生物学活性和特性。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用本发明的组合物来抑制症状或延缓特定疾病进展的所有行为。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用本发明的组合物减轻或有益地改变特定疾病症状的所有行为。
如本文所使用的，术语“减轻”是指至少减少与待治疗的病症有关的参数的所有行为，例如，症状的程度。
如本文所用，术语“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的组合物提供给受试者。如本文所用，术语“受试者”是指具有特定疾病的所有动物，包括人、猴、狗、山羊、猪或大鼠，其症状可以通过施用本发明的组合物而缓解。
如本文所用，术语“药学有效量”是指足以治疗疾病的量，以适用于任何医疗的合理利益/风险比率。药物有效量可以根据受试者疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗持续时间、和与组合物一起使用的药物以及医学领域已知的其他因素来确定。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明的一个方面涉及具有各种生理活性的新型乳酸菌或涉及具有提高生理活性的新型乳酸菌混合物。
本发明一个实施方案所述的新型乳酸菌选自：短乳酸杆菌(Lactobacillusbrevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列，并具有抗氧化活性、β-葡糖醛酸糖苷酶抑制活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性或紧密连接蛋白表达诱导活性。
包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌是从朝鲜泡菜分离的厌氧芽孢杆菌，对革兰氏染色呈阳性，可在大温度范围、低pH和高盐浓度下存活并产生葡萄糖苷酶。此外，包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌利用D-核糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、七叶苷、水杨苷、麦芽糖、蜜二糖、5-酮-葡萄糖酸盐等作为碳源。此外，包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌优选为短乳酸杆菌CH23(保藏号：KCCM 11762P)。包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌是从人粪便分离的厌氧芽孢杆菌，对革兰氏染色呈阳性并产生葡萄糖苷酶。此外，包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖等作为碳源。另外，包含由SEQ ID NO：3表示表的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌优选长双歧杆菌CH57(保藏号：KCCM 11764P)。包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌是从朝鲜泡菜分离的厌氧芽孢杆菌并且对革兰氏染色呈阳性。此外，包含由SEQID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌利用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶甙、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖等作为碳源。此外，包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌优选为植物乳酸杆菌LC5(保藏号：KCCM 11800P)。包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌是从朝鲜泡菜分离的厌氧芽孢杆菌，并且对革兰氏染色呈阳性。此外，包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶甙、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖等作为碳源。另外，包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌优选为植物乳酸杆菌LC27(保藏号：KCCM 11801P)。包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌是从人粪便分离的厌氧杆菌，并且对革兰氏染色呈阳性。此外，包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、七叶甙、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖等作为碳源。另外，包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌优选长双歧杆菌LC67(保藏号：KCCM11802P)。
本发明的一个实施方案所述的乳酸菌混合物是两种或更多种乳酸菌的混合物选自：短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)，其包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，其包含由SEQ ID NO：5表示的16SrDNA核苷酸序列，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列。考虑到乳酸菌的协同效应，本发明的实施方式所述的乳酸菌混合物优选为包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌和包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌的组合。另外，考虑到乳酸菌的协同效应，本发明的实施方式所述的乳酸菌的混合物优选为一种或多种乳酸杆菌的组合，其选自包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌或包含由SEQ ID NO：5表示的16SrDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌；和包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌。由于特定的乳酸杆菌和特定的双歧杆菌的协同作用，乳酸菌混合物比单一乳酸菌具有更高的抗氧化活性、β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性或紧密连接蛋白表达诱导活性，且在功能性食品和药物方面更具优势。在本发明的实施方案所述的乳酸菌混合物中，包含由SEQ ID NO：1表示的16SrDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌优选为短乳酸杆菌CH23(保藏号：KCCM11762P)；包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌优选长双歧杆菌CH57(保藏号：KCCM 11764P)；包含由SEQ ID NO：4表示的16SrDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌优选为植物乳酸杆菌LC5(保藏号：KCCM 11800P)；包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌优选为植物乳酸杆菌LC27(保藏号：KCCM 11801P)；包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌优选长双歧杆菌LC67(保藏号：KCCM 11802P)。
本发明的另一方面涉及新型乳酸菌或新型乳酸菌混合物的各种用途。作为新型乳酸菌的用途，本发明提供了一种用于预防、缓解或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎症性疾病或肥胖症的组合物，其包含选自下组的乳酸菌：包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌、包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌、包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌、包含由SEQ ID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌或包含由SEQ ID NO：7表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物作为活性成分。此外，作为新型乳酸菌混合物的用途，本发明提供了一种用于预防、缓解或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎症性疾病或肥胖症的组合物，其包含2种或多种选自下组的乳酸菌混合物：包含由SEQ ID NO：1表示的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌、包含由SEQ ID NO：3表示的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌、包含由SEQ ID NO：4表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌、包含由SEQID NO：5表示的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌或包含由SEQ ID NO：7表示的16SrDNA核苷酸序列的长双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物作为活性成分。在本发明的组合物中，短乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和长双歧杆菌的技术特征如上所述，因此省略其说明。肠损伤是指由肠内菌群紊乱等引起的肠功能(特别是小肠或大肠)异常的状态。优选地，肠损伤是肠道通透性综合征。此外，肝脏损伤是指由于外部因素或内部因素肝功能异常的情况。优选地，肝损伤选自肝炎、脂肪肝或肝硬化。此外，肝炎包括所有非酒精性肝炎和酒精性肝炎。此外，脂肪肝包括所有非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝。此外，过敏性疾病如果由活体的过度免疫反应引起，则其种类不受限制，并且优选选自过敏性皮炎、哮喘、咽炎或慢性皮炎。此外，炎性疾病如果由炎症反应引起，则其种类不受限制，并且优选选自胃炎、胃溃疡、关节炎或结肠炎。此外，关节炎包括类风湿性关节炎。结肠炎是指由于肠内容物的细菌感染或病态发酵而在大肠中发生炎症的情况。结肠炎包括感染性结肠炎和非感染性结肠炎。结肠炎的具体实例包括炎性肠病、肠易激综合征等。此外，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克罗恩氏病等。
在本发明中，乳酸菌培养物或乳酸菌混合物培养物是通过在培养基中培养某种菌株或菌株混合物而产生的。培养基可以选自已知的液体培养基或固体培养基，例如可以是MRS液体培养基、MRS琼脂培养基或BL琼脂培养基。
在本发明中，组合物可以体现为药物组合物、食品添加剂、食品组合物(特别是功能性食品组合物)、饲料添加剂等，取决于预期的用途或方面。另外，作为有效成分的乳酸菌或乳酸菌混合物的含量也可以根据组合物的具体种类，用途或方面在大范围内进行调整。
作为本发明药物组合物中的活性成分的新型乳酸菌、新型乳酸菌混合物、其培养物、其裂解物或其提取物的含量没有特别限制。例如，基于组合物的总重量，其含量可以是0.01-99wt％，优选0.5-50wt％，更优选1-30wt％。另外，除了活性成分之外，本发明所述的药物组合物还可以步含有添加剂如药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。可以包含在本发明所述的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，本发明的药物组合物除了新型乳酸菌以外，还可以含有新型乳酸菌混合物、其培养物、其裂解物或其提取物，一种或多种具有预防或治疗肠损伤、肝损伤、过敏性疾病、炎性疾病或肥胖症的影响的活性成分。本发明所述的药物组合物可以制备成用于口服给药的制剂或用于肠胃外给药的制剂，并且制剂可以通过使用常用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制备。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体制剂可以通过将活性成分与至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶混合来制备。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉。用于口服给药的液体制剂除了常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，还包括悬浮液、溶液、乳液和糖浆，并且可以含有各种赋形剂，例如润湿剂、调味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冷冻干燥制剂和栓剂。丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等可用作非水溶剂或悬浮剂。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂肪、甘油明胶等。此外，组合物可以优选根据每种疾病或组分通过本领域已知的合适方法或宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司出版的《雷明顿的医药科学》(最新版)公开的方法(配制。根据所需方法，本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给予包括人在内的哺乳动物。用于肠胃外给药的途径包括皮肤外用、腹膜内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射、胸腔内注射等。本发明药物组合物的剂量只要是药物有效量就没有特别限制。剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方式、排泄率和疾病的严重程度而改变。本发明药物组合物的日剂量没有特别限制，但基于活性成分优选为0.1-3000mg/kg，更优选为1-2000mg/kg，并且可以一天给药一次或数次。
此外，作为本发明食品组合物中活性成分的新型乳酸菌、新型乳酸菌混合物、其培养物、其裂解物或其提取物的含量为0.01-99wt％，优选为0.1-50wt％，更优选为0.5-25wt％，基于组合物的总重量，但不限于此。本发明的食物组合物可以是丸剂、散剂、颗粒剂、输液剂、片剂、胶囊剂、液体剂型等形式，食品的具体实例可以包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、糖果点心、比萨饼、拉面、其他面条、口香糖、乳制品，包括冰淇淋、各种汤、饮料、茶、功能水、饮料、含酒精饮料、维生素复合物等，而且可以包括一般意义上的所有健康食品。除了活性成分之外，本发明的食物组合物还可含有作为附加成分的食物可接受的载体、各种调味剂或天然碳水化合物。此外，本发明的食品组合物可以含有各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体状增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，本发明的食物组合物可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以独立使用或作为混合物使用。上述天然碳水化合物可以包括单糖如葡萄糖和果糖、二糖如麦芽糖和蔗糖、多糖如糊精和环糊精以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为调味剂，可以使用天然香味剂如奇异果甜蛋白或甜叶菊提取物，或合成调味剂例如糖精或阿斯巴甜。
在下文中，将参照实施例进一步详细描述本发明。应该理解，这些实施例仅仅是为了清楚地说明本发明的技术特征，并不限制本发明的范围。
I.筛选乳酸菌的第一个实验及其效果的评估
1.乳酸菌的分离和鉴定
(1)从朝鲜泡菜中分离乳酸菌
将大白菜泡菜、萝卜泡菜和大葱泡菜粉碎，并将粉碎的液体悬浮在MRS液体培养基(MRS肉汤；Difco，美国)中。然后，收集上清液，转移至MRS琼脂培养基(Difco，美国)，并在37℃下厌氧培养约48小时，然后将形成菌落的菌株分离出来。
(2)从人粪便中分离乳酸菌
将人粪便悬浮于GAM液体培养基(GAM肉汤；Nissui Pharmaceutical，日本)中。然后，收集上清液，转移至BL琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical，日本)，并在37℃下厌氧培养约48小时，然后将出形成菌落的双歧杆菌菌株分离出来。
(3)鉴定筛选的乳酸菌
分析从朝鲜泡菜或人粪便中分离的菌株的生理特征和16S rDNA序列，以鉴定菌株的种类，并给菌株命名。下表1列出了从大白菜泡菜、萝卜泡菜、大葱泡菜和人类粪便中分离出的乳酸菌的对照号和菌株名称。
表1
Figure BDA0003529036060000161
Figure BDA0003529036060000171
在上表1中显示的菌株中，短乳酸杆菌CH23是革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，不形成孢子，即使在有氧条件下也能存活。此外，短乳酸杆菌CH23在10至42℃下存活，是在pH 2下稳定2小时的耐酸菌株。此外，短乳酸杆菌CH23即使在2％氯化钠溶液中也能存活并生成葡萄糖苷酶。另外，为了对短乳酸杆菌CH23进行化学分类，对其16S rDNA进行了分析，结果表明短乳酸杆菌CH23具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。通过BLAST在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中鉴定短乳酸杆菌CH23的16S rDNA核苷酸序列，结果，未发现与短乳酸杆菌CH23具有相同的16S rDNA核苷酸序列的短乳酸杆菌菌株，并且短乳酸杆菌CH23与短乳酸杆菌菌株FJ004的16S rDNA序列显示出99％的同源性。
在上表1中显示的菌株中，约氏乳酸杆菌CH32是革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，不形成孢子，并且在有氧条件下能够存活。此外，约氏乳酸杆菌CH32在高达45℃的温度下稳定存活，并且是在pH 2下稳定2小时的耐酸菌株。而且，约氏乳酸杆菌CH32产生β-葡萄糖苷酶，但不产生β-葡萄糖醛酸糖苷酶。另外，为了对约氏乳酸杆菌CH32进行化学分类，对其16S rDNA进行了分析，结果表明约氏乳酸杆菌CH32具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。通过在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST鉴定约氏乳酸杆菌CH32的16S rDNA核苷酸序列，结果，未发现与约氏乳酸杆菌CH32具有相同的16S rDNA核苷酸序列的约氏乳酸杆菌菌株，并且约氏乳酸杆菌CH32与约氏乳酸杆菌菌株JCM2012的16S rDNA序列显示出99％的同源性。
在上表1所示的菌株中，长双歧杆菌CH57是革兰氏阳性厌氧杆菌，不形成孢子，并且在有氧条件下的存活力非常低。此外，长双歧杆菌CH57是热不稳定的。此外，长双歧杆菌CH57产生葡萄糖苷酶，但不产生β-葡萄糖醛酸糖苷酶。另外，为了对长双歧杆菌CH57进行化学分类，对其16S rDNA进行了分析，结果显示长双歧杆菌CH57具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。通过BLAST在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中鉴定长双歧杆菌CH57的16SrDNA核苷酸序列，结果，未发现与长双歧杆菌CH57具有相同的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌菌株，并且长双歧杆菌CH57与长双歧杆菌菌株CBT-6的16S rDNA序列显示出99％的同源性。
此外，在短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32和长双歧杆菌CH57的生理特征中，碳源利用率通过API试剂盒，采用糖发酵进行分析(型号：API 50CHL；由梅里埃，美国制造)。下表2显示了分析短乳酸杆菌CH23的碳源利用率的结果；下表3显示了分析约氏乳酸杆菌CH32的碳源利用率的结果；下表4显示了分析长双歧杆菌CH57的碳源利用率的结果。在表2、3和4中，“+”表示碳源利用率为正的情况；“-”表示碳源利用率为负的情况；“±”表示碳源利用不明确的情况。如下表2、3和4所示，对于一些碳源，短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32和长双歧杆菌CH57与相同物种的其他菌株的碳源利用率不同。
表2
Figure BDA0003529036060000181
Figure BDA0003529036060000191
1)Suriasih K.，Aryanta WR，MahardikaG，Astawa NM，由巴厘牛奶制成的)克非尔的微生物和化学性质。食品科学与质量管理2012；6：112-22。
表3
Figure BDA0003529036060000192
Figure BDA0003529036060000201
2)Pridmore RD，Berger B，Desiere F，Vilanova D，Barretto C，Pittet AC，Zwahlen MC，Rouvet M，Altermann E，Barrangou R，Mollet B，Mercenier A，KlaenhammerT，Arigoni F，Schell MA，益生菌肠道细菌约氏乳酸杆菌NCC 533的基因组序列。Proc NatlAcad Sci U S A.2004，2月，24；101(8)：2512-7。
表4
Figure BDA0003529036060000202
Figure BDA0003529036060000211
3)Lukacova D，Karovucova J，Greifova M，Greif G，Sovcikova A，Kohhajdova Z.植物乳酸杆菌和长双歧杆菌的选定益生菌特征的体外测试。食品和营养研究期刊2006；45：77-83。
(4)乳酸菌的保藏信息
本发明人于2015年9月1日以保藏号KCCM 11762P在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)保藏了短乳酸杆菌CH23。此外，本发明人于2015年9月1日以保藏号KCCM 11763P在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)保藏了约氏乳酸杆菌CH32。此外，本发明人于2015年9月1日以保藏号KCCM11764P在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)保藏了长双歧杆菌CH57。
2.评估乳酸菌对减轻肠损伤或肠渗透性的效果
为了评估从朝鲜泡菜或人粪便分离的乳酸菌对减轻肠道损伤或内部渗透性的效果，检测了乳酸菌的抗氧化活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性、β-葡萄糖醛酸酶(有害肠内酶)抑制活性和紧密连接蛋白表达诱导活性。
(1)实验方法
*抗氧化活性
将DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼基)溶解于乙醇中至0.2mM的浓度以制备DPPH溶液。向0.1ml的DPPH溶液中加入乳酸菌悬浮液(1×10 8CFU/ml)或维生素C溶液(1μg/ml)，并在37℃下培养20分钟。将培养物以3000rpm离心5分钟，收集上清液。然后，测定上清液在517nm处的吸光度，算出乳酸菌的抗氧化活性。
*脂多糖(LPS)的产生抑制活性
将0.1g人新鲜粪便悬浮于0.9ml无菌生理盐水中，并用普通厌氧培养基稀释100倍以制备粪便悬浮液。在9.8ml无菌无氧培养基(Nissui Pharmaceuticals，日本)中加入0.1ml粪便悬浮液和0.1ml乳酸菌(1×104或1×105CFU)并厌氧培养24小时。然后，将培养物超声处理约1小时以破坏细菌的外细胞膜，并以5000×g离心并收集上清液。然后，通过LAL(鲎变形细胞溶解物)检测试剂盒(由Cape Cod Inc.，美国制造)测定上清液中的LPS(脂多糖)(典型的内毒素)的含量。另外，为了评估乳酸菌的大肠杆菌增殖抑制活性，将通过上所述相同实验获得的培养物稀释1000倍和100000倍，并在DHL培养基中培养，然后计数大肠杆菌细胞的数量。
*β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性
将0.1ml的0.1mM对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷溶液、0.2ml的50mM磷酸缓冲生理盐水、0.1ml的乳酸菌悬浮液(将乳酸菌培养物悬浮于5ml生理盐水中制备)置于反应器中并进行β-葡糖醛酸糖苷酶酶促反应，并加入0.5ml的0.1mM NaOH溶液以终止反应。然后，将反应溶液以3000rpm离心5分钟，收集上清液。然后测定405nm处的上清液的吸光度。
*紧密连接蛋白表达诱导活性
从韩国细胞系库获得的Caco2细胞在RPMI 1640培养基中培养48小时，然后将培养的Caco2细胞以2×106个细胞/孔的密度分配到12孔板中的各个孔。然后，将各孔用1μg的LPS(脂多糖)或1μg的LPS(脂多糖)和1×103CFU的乳酸菌一起处理并温育24小时。然后，收集各孔培养的细胞，并通过免疫印迹方法测定细胞中紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。
(2)实验结果
测定从朝鲜泡菜或人粪便分离的乳酸菌的抗氧化活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性、β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性和紧密连接蛋白表达诱导活性，并将测定结果示于下表5和6。如下表5和6所示，弯曲乳酸杆菌CH5、沙克乳酸杆菌CH11、短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32、假小链双歧杆菌CH38和长双歧杆菌CH57具有优异的抗氧化活性，强烈抑制脂多糖(LPS)产生和β-葡萄糖醛酸糖苷酶活性，并强烈诱导紧密连接蛋白的表达。这些乳酸菌具有优异的抗氧化效果，对抑制与炎症和致癌相关的肠道菌群的有害菌的酶活性具有优异的效果，抑制肠道菌群有害菌产生的内毒素LPS(脂多糖)的产生，诱导紧密连接蛋白的表达。因此，这些乳酸菌可以改善肠道通透性综合征。
表5
Figure BDA0003529036060000231
表6
Figure BDA0003529036060000232
Figure BDA0003529036060000241
*测定抗氧化活性时乳酸菌的最终浓度：1×104CFU/ml；添加用于测定β-葡糖醛酸糖苷酶抑制活性和脂多糖(LPS)生成抑制活性的乳酸菌浓度：1×104CFU/ml；测定紧密连接蛋白表达诱导活性时乳酸菌的浓度：1×104CFU/ml。*测量乳酸菌各种活性的标准：非常强烈(+++；>90％)；强烈(++；>60-90％)；弱(+；>20-60％)；不低于20％(-；<20％)。
3.评估乳酸菌对减轻肝损伤的效果
基于乳酸菌对减轻肠损伤或肠渗透性综合征的影响的评估，选择以下七种菌株：弯曲乳酸杆菌CH5、沙克乳酸杆菌CH11、发酵乳酸杆菌CH15、短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32、假小链双歧杆菌CH38和长双歧杆菌CH57。用各种肝损伤模型动物评估这些被选菌株或这些菌株的混合物对减轻肝损伤的影响。
(1)通过用由D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物的实验来测定乳酸菌的肝脏损伤缓解效果
1)实验方法
将小鼠(C57BL/6，雄性)分成若干组，每组由6只组成。以800mg/kg的剂量向除正常组以外的组的试验动物腹膜内施用D-半乳糖胺以诱导肝损伤。腹膜内施用D-半乳糖胺后2小时，给正常组和阴性对照组以外的组的试验动物口服1×109CFU的乳酸菌，每天一次，共3天。另外，用水飞蓟素代替乳酸菌，给阳性对照组的试验动物以100mg/kg的剂量口服施用，每天一次，共3天。在最后一次给药后6小时，从心脏取血。将取得的血液在室温下放置60分钟，并以3,000rpm离心15分钟以分离血清。使用血液测定试剂盒(ALT&AST测定试剂盒；AsanPharm.Co.韩国)。测定分离的血清中的GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶)水平。
另外，从试验动物中切下肝组织，测定肝组织中的丙二醛(MDA)的量。丙二醛是脂质过氧化的标记物。具体地，将0.5g解剖的肝脏组织加入到16倍体积的RIPA溶液中(0.21M甘露醇、0.1M EDTA-2Na、0.07M蔗糖、0.01M Trizma碱)，然后用匀浆器匀浆。将匀化的溶液以3,000rpm离心10分钟，并收集肝脏匀浆。将0.5ml肝匀浆加入到0.4ml 10％SDS中，在37℃温育30分钟，然后冷却，向其中加入3ml 1％磷酸盐缓冲液和1ml 0.6％TBA，然后在100℃水浴加热45分钟以形成样品溶液。将显色的样品溶液加入并与4ml正丁醇混合，然后以3000rpm离心10分钟，并收集上清液。测量535nm处收集的上清液的吸光度以定量MDA。另外，用1,1,3,3-四乙氧基丙烷绘制MDA测量的标准曲线。
2)实验结果
图1显示了向D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物施用乳酸菌时的GOT值的变化的图；图2显示了向D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物施用乳酸菌时的GPT值变化的图；图3显示了向D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型动物施用乳酸菌时的MDA值变化的图。
在图1-3的x轴上，“Nor”表示正常组；“Con”表示阴性对照组，其没有向D-半乳糖胺诱导的具有肝损伤的模型动物施用任何药物；“ch11”表示施用沙克乳酸杆菌CH11的组；“ch15”表示施用发酵乳酸杆菌CH15的组；“ch23”表示施用短乳酸杆菌CH23的组；“ch32”表示施用约氏乳酸杆菌CH32的组；“ch38”表示施用假小链双歧杆菌CH38的组；“ch57”表示施用长双歧杆菌CH57的组；“ch57+ch11”表示施用以相同量混合长双歧杆菌CH57和沙克乳酸杆菌CH11制备的乳酸菌混合物的组；“ch57+ch23”表示施用以相同量混合长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23制备的乳酸菌混合物的组；“ch57+ch32”表示施用以相同量混合长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32制备的乳酸菌混合物的组；“SM”表示施用用水飞蓟素代替乳酸菌的阳性对照组。
如图1-图3所示，在因肝损伤导致GOT、GPT、MAD值增加的模型动物中，施用短乳杆菌CH23、约氏乳杆菌CH32、长双歧杆菌CH57时，肝损伤得到缓解。特别是当施用长双歧杆菌CH57和短乳杆菌CH23的乳酸菌混合物或长双歧杆菌CH57和约氏乳杆菌CH32的乳酸菌混合物时，肝损伤大大减轻。另外，与用作治疗肝损伤的药物的水飞蓟素相比，特定的乳酸菌或从其中选择的乳酸菌混合物对减轻肝损伤的效果更好。这些结果表明，特定的乳酸菌或从其中选择的乳酸菌的混合物对减轻由酒精和高脂饮食引起的脂肪肝或缓解由氧化应激引起的肝脏疾病是有效的。
(2)通过用叔丁基过氧化物诱发肝损伤模型动物的实验来测定乳酸菌的肝脏损伤缓解效果
1)实验方法
将小鼠(C57BL/6，雄性)分成若干组，每组由6只组成。以2.5mmol/kg的量向正常组以外的组的试验动物腹腔内施用叔丁基过氧化物以诱导肝损伤。腹膜内施用过氧化叔丁基后2小时，对正常组和阴性对照组以外的组的试验动物口服2×109CFU的乳酸菌，每天一次，共3天。另外，用水飞蓟素代替乳酸菌，给阳性对照组的试验动物以100mg/kg的剂量口服施用，每天一次，共3天。在最后一次给药后6小时，从心脏取血。将取得的血液在室温下放置60分钟，并以3,000rpm离心15分钟以分离血清。使用血液测定试剂盒(ALT&AST测定试剂盒；Asan Pharm.Co.韩国)测定分离的血清中的GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶)水平。
2)实验结果
下表7示出了当给过氧化叔丁基诱导的具有肝损伤的模型动物施用乳酸菌时，GOT和GPT值的变化。如下表7所示，与水飞蓟素相比，短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32和长双歧杆菌CH57对缓解肝损伤显示出优异的效果，并且长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的乳酸菌混合物或长双歧杆菌CH57和约氏乳杆菌CH32的乳酸菌混合物对减轻肝损伤的效果更好。
表7
试验组 GOT(IU/L) GPT(IU/L)
正常组 36.1 26.3
阴性对照组 84.1 96.1
施用CH23的组 58.0 74.2
施用CH32的组 53.0 70.5
施用CH57的组 57.6 71.2
施用CH57和CH23的组 48.6 64.3
施用CH57和CH32的组 51.2 68.4
施用水飞蓟素的组 61.7 69.1
在上表7中，“CH23”表示短乳酸杆菌CH23；“CH32”表示约氏乳酸杆菌CH32；“CH57”表示长双歧杆菌CH57；“CH57+CH23”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23制备的乳酸菌混合物；“CH57+CH32”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32制备的乳酸菌混合物。
4.评估乳酸菌对减轻过敏症的效果
(1)乳酸菌对脱粒抑制作用的测定
将RBL-2H3细胞系(大鼠细胞系，韩国细胞系库，保藏号22256)在含有10％FBS(胎牛血清)和L-谷氨酰胺的DMEM(Dulbeccos的改良的伊格尔培养基，Sigma，22256)中在37℃潮湿的5％CO2培养箱中培养。用胰蛋白酶-EDTA溶液悬浮培养基中的细胞，分离悬浮的细胞，收集细胞并用于实验。将收集的RBL-2H3细胞以5×105个细胞/孔的密度分配到24孔板中，并通过与0.5μg/ml的小鼠单克隆IgE温育12小时致敏。用0.5ml斯拉加尼亚缓冲液(119mM NaCl，5mM KCl，0.4mM MgCl 2，25mM PIPES，40mM NaOH，pH 7.2)洗涤致敏的细胞，然后在37℃下用0.16ml斯拉加尼亚缓冲液(补充有5.6mM葡萄糖，1mM CaCl 2，0.1％BSA)培养10分钟。然后，将作为测试药物的乳酸菌添加至细胞培养物中至浓度为1×104CFU/ml，或者将0.04ml作为对照药物的DSCG(色甘酸二钠)加入到细胞培养物中，20分钟后，将细胞用0.02ml抗原(1μg/ml DNP-BSA)在37℃下活化10分钟。然后，将细胞培养物以2000rpm离心10分钟，收集上清液。将0.025ml收集的上清液转移到96孔板中，向其中加入0.025ml 1mM p-NAG(在0.1M柠檬酸盐缓冲液中的对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-葡糖酰胺溶液，pH 4.5)，然后使混合物在37℃下反应60分钟。然后，通过添加0.2ml 0.1M Na2CO3/NaHCO3来停止反应，并且通过ELISA分析仪测量405nm处的吸光度。
(2)乳酸菌抑制瘙痒的测定
将BALB/c小鼠分成几组，每组由5只组成。将1×109CFU乳酸菌(测试药物)口服给予正常组和对照组以外的测试组，每天一次，连续3天，或将DSCG(色甘酸二钠)或氮卓斯汀(对照药物)以0.2mg/小鼠的量口服给药，每天一次，持续3天。在最后一次给药后1小时，将小鼠放置在观察笼(24cm×22cm×24cm)中10分钟以适应环境，然后将头脑勺剃光。然后，给正常组的小鼠注射生理盐水，并通过29号针头向其他实验组的小鼠注射瘙痒诱导剂(50μg化合物48/80；Sigma，美国)。然后，立即将每只小鼠封闭在观察笼中，通过用8-mm摄像机(SV-K80，Samsung)记录1小时，在无人看管状态下观察发痒行为。用后脚搔抓注射部位被认为是瘙痒行为，不考虑划伤其他部分。
(3)乳酸菌抑制血管通透性的测定
已知诱导瘙痒的区域提高血管的通透性。进行该实验是为了检测乳酸菌是否能够有效地抑制由各种化合物引起的血管通透性。按照与上述用于测定瘙痒抑制活性的实验相同的方法，将药物施用给相同的小鼠。然后，将生理盐水皮下注射到正常组小鼠的后脑勺，将瘙痒诱导物(50μg化合物48/80；Sigma，美国)皮下注射到另一试验组小鼠的后脑勺。然后，将0.2ml 1％埃文斯蓝溶液(Sigma，美国)注射到尾静脉中，1小时后让小鼠安乐死。解剖皮下注射区域的皮肤，并在37℃下在1ml1N KOH中温育过夜。第二天，将温育的皮肤组织与4ml 0.6N磷酸-丙酮(5:13)混合物混合，3000rpm离心15分钟，收集上清液并在620nm下测量吸光度。用下面的等式计算血管通透性抑制率(％)：
抑制率(％)＝{1-[用药物和瘙痒诱导剂处理的区域的吸光度-未用瘙痒诱导剂处理的区域的吸光度]/[用瘙痒诱导剂处理的区域的吸光度-未用瘙痒诱导剂处理的区域的吸光度]}×100
(4)实验结果
下表8显示了测定乳酸菌的脱粒抑制率、瘙痒抑制率和毛细通透性抑制率的结果。在下表8中，“CH5”表示弯曲乳酸杆菌CH5；“CH11”表示沙克乳酸杆菌CH11；“CH15”表示发酵乳酸杆菌CH15；“CH23”表示短乳酸杆菌CH23；“CH32”表示约氏乳酸杆菌CH32；“CH38”表示假小链双歧杆菌CH38；“CH57”表示长双歧杆菌CH57；“CH57+CH11”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和沙克乳酸杆菌CH11制备的乳酸菌混合物；“CH57+CH23”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和短乳杆菌CH23制备的乳酸菌混合物；“CH57+CH32”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32制备的乳酸菌混合物。
如下表8所示，弯曲乳酸杆菌CH5、短乳酸杆菌CH23、约氏乳酸杆菌CH32和长双歧杆菌CH57有效地抑制了嗜碱性粒细胞的脱粒，长双歧杆菌CH57强烈抑制瘙痒和血管通透性。另外，与单独的这些乳酸杆菌相比，这些乳酸杆菌的混合物，特别是长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物或长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32的混合物显示出较高的脱粒抑制率、瘙痒抑制率和血管通透性抑制率。因此可以看出，这些乳酸菌或其混合物可以有效地缓解过敏性特异反应、哮喘、咽炎、慢性皮炎等。
表8
Figure BDA0003529036060000291
Figure BDA0003529036060000301
5.体外评估乳酸菌的抗炎作用和肠道通透性抑制效果
(1)树突状细胞的分离和炎症标志物的测定
通过用RPMI 1640(含有10％FBS、1％抗生素、1％谷氨酰胺、0.1％巯基乙醇)从C57BL/6小鼠(雄性，20-23克)的骨髓中分离免疫细胞。用RBC裂解缓冲液处理分离的细胞，洗涤，分配到24孔板中，用GM-CSF和IL-4以1:1000的比例处理，然后培养细胞。培养5天后，换成新鲜培养基，并在8天时收集树突状细胞。然后，将树突状细胞以0.5×106个细胞/孔的密度接种在24孔板上，并用乳酸菌(测试物质)和炎症诱导剂LPS(脂多糖)处理2小时或24小时，然后收集上清液和细胞。用收集的上清液，通过免疫印迹方法测定IL-10和IL-12的表达水平。
图4显示了本发明筛选的乳酸菌对脂多糖(LPS)诱导的树突状细胞的炎症反应的影响。图4中的左图显示了乳酸菌对未用LPS(脂多糖)处理的细胞的效果，右图显示了乳酸菌对用LPS(脂多糖)处理的细胞的效果。另外，在图4的x轴上，“Nor”表示未用测试乳酸菌和炎症诱导剂LPS(脂多糖)处理的组；“LPS”表示用炎症诱导剂LPS(脂多糖)处理的组；“ch11”表示用沙克乳酸杆菌CH11处理的组；“ch15”表示用发酵乳杆菌CH15处理的组；“ch23”表示用短乳酸杆菌CH23处理的组；“ch32”表示用约氏乳酸杆菌CH32处理的组；“ch38”表示用假小链双歧杆菌CH38处理的组；“ch57”表示用长双歧杆菌CH57处理的组；“ch57+ch11”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和沙克乳酸杆菌CH11制备的乳酸杆菌混合物处理的组；“ch57+ch23”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23制备的乳酸杆菌混合物处理的组；“ch57+ch32”表示用混合相同量的长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32制备的乳酸杆菌混合物处理的组。
如图4所示，沙克乳酸杆菌CH11、短乳酸杆菌CH23和约氏乳酸杆菌CH32诱导树突细胞IL-10的产生，树突细胞从骨髓分离后通过分化获得，有效抑制LPS(脂多糖)诱导的IL-12的产生，并且当与长双歧杆菌CH57组合使用时效果增加。具体而言，长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物在抑制炎症方面表现出最佳效果。当树突细胞受到控制时，可以有效控制Treg细胞(调节性T细胞)。因此，本发明中筛选出的乳酸菌可以有效缓解结肠炎等慢性炎症性疾病，类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
(2)巨噬细胞的分离和炎症标志物的测定
6周龄的C57BL/6J雄性小鼠(20-23g)购自RaonBio Co.，Ltd。向每只小鼠的腹腔内施用2ml的4％无菌巯基乙酸盐，96小时后麻醉小鼠，并将8ml RPMI 1640培养基放到每只小鼠的腹腔中。5至10分钟后，取出小鼠腹腔内的RPMI培养基(包括巨噬细胞)，1000rpm离心10分钟，然后用RPMI 1640培养基洗涤两次。将巨噬细胞以0.5×106个细胞/孔的密度接种在24孔板上，并用测试物质乳酸菌和炎症诱导剂LPS(脂多糖)处理2小时或24小时，然后收集上清液和细胞。收集的细胞在缓冲液(Gibco)中匀浆。用ELISA试剂盒测定收集的上清液，以测定细胞因子如TNF-α和IL-1β的表达水平。另外，通过免疫印迹法测定收集的细胞，以测定p65(NF-kappa B)、p-p65(磷-NF-kappa B)和β-肌动蛋白的表达水平。具体地，取50μg上清液，在SDS 10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上电泳1小时30分钟。将电泳的样品转移到硝酸纤维素膜上，在100V和400mA下保持1小时10分钟。将样品转移的硝酸纤维素膜用5％脱脂乳封闭30分钟，然后用PBS-Tween洗涤三次，每次5分钟，并与1:100稀释的一抗(Santa CruzBiotechnology，美国)一起温育过夜。然后，洗膜三次，每次10分钟，并与1：1000稀释度的二抗(Santa Cruz Biotechnology，美国)孵育1小时20分钟。然后，洗膜3次，每次15分钟，通过荧光显影。
图5显示了长双歧杆菌CH57对LPS(脂多糖)诱导的巨噬细胞炎症反应的影响。如图5所示，长双歧杆菌CH57有效地抑制LPS(脂多糖)诱导的炎症反应。
(3)从脾脏分离T细胞和分化成Th17细胞或Treg细胞的测定
从C56BL/6J小鼠中分离脾脏，适当粉碎，悬浮于含10％FCS的RPMI 1640培养基中，用CD4 T细胞分离试剂盒(美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)分离CD4T细胞。将分离的CD4T细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，将抗CD3(1μg/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)和抗CD28(1μg/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)也加到板中，或加入抗CD3(1μg/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)、抗-CD28(1μg/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)、重组IL-6(20ng/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)和重组转化生长因子β(1ng/ml，美天旎，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)。培养细胞时，向其中加入1×103或1×105CFU的乳酸菌，并培养4天。然后，将培养细胞用抗FoxP3或抗IL-17A抗体染色，用FACS(荧光激活细胞分选)系统(C6流式细胞仪系统，San，美国)分析Th17和Treg细胞的分布。
图6显示了通过荧光激活细胞分选系统分析短乳酸杆菌CH23对T细胞(从脾分离)分化成Th17细胞或Treg细胞的影响的结果。如图6所示，短乳酸杆菌CH23抑制T细胞分化成Th17细胞(T辅助细胞17)并促进T细胞分化成Treg细胞。这些结果表明，短乳酸杆菌CH23可以有效缓解结肠炎和关节炎等炎症性疾病。
(4)乳酸菌对CaCO2细胞的ZO-1蛋白质表达的影响的测定
将从韩国细胞系库获得的Caco2细胞在RPMI 1640培养基中培养48小时，然后将培养的Caco2细胞以2×106个细胞/孔的密度分配到12孔板中。然后，将各孔用1μgLPS(脂多糖)处理，或用1μgLPS(脂多糖)和1×103CFU或1×105CFU乳酸菌一起处理，然后温育24小时。然后，从各孔收集培养的细胞，并通过免疫印迹方法测定紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。图7显示了分析短乳酸杆菌CH23、长双歧杆菌CH57或其混合物对CaCO 2细胞的ZO-1蛋白表达的影响的结果。在图7中，“CH23”表示短乳酸杆菌CH23；“CH57”表示长双歧杆菌CH57；“混合物”表示通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和约氏乳酸杆菌CH32制备的乳酸杆菌混合物。如图7所示，用短乳酸杆菌CH23和长双歧杆菌CH57处理增加紧密连接蛋白ZO-1的表达，用长双歧杆菌CH57和约氏乳杆菌CH32的混合物处理协同增加紧密连接蛋白ZO-1的表达。当紧密连接蛋白的表达增加时，有毒物质的体内渗透可被阻断，从而防止结肠炎、关节炎和肝损伤的恶化。
6.体内评估乳酸菌抗炎和缓解结肠炎效果
(1)测试动物
从OrientBio购买5周龄的C57BL/6雄性小鼠(24-27g)，并将其置于受控的环境(湿度：50±10％，温度：25±2℃，12小时光照/12小时黑暗循环)，然后用于实验。使用标准实验饲料(韩国三洋)，且动物随意饮水。在所有的实验中，一组由6只动物组成。
(2)通过TNBS诱导结肠炎和样品施用
将一组试验动物用作正常组，并将其他组的试验动物用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)处理以诱发急性结肠炎。具体地，将试验动物用乙醚轻度麻醉，然后将2.5g TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)和100ml 50％乙醇的混合溶液通过1ml圆形注射器通过肛门施用于结肠，每次0.1ml，垂直提起并保持30秒，从而诱发炎症。另一方面，正常组口服0.1ml生理盐水。第二天，将作为试验样品的乳酸菌或乳酸菌混合物悬浮在盐水中，并以2.0×109CFU的量向每只小鼠口服给药，每天一次，共3天。在样品给药后的第二天，将动物用二氧化碳杀死，并解剖和使用从盲肠到紧肛前的部位的结肠部分。同时，正常组的试验动物仅用盐水代替乳酸菌口服给药。此外，阴性对照组的试验动物在TNBS诱导结肠炎后仅用盐水代替乳酸菌口服给药。此外，阳性对照组的试验动物口服50mg/kg柳氮磺吡啶(一种治疗结肠炎的药物)代替乳酸菌。
(3)结肠的宏观分析
观察解剖结肠的长度和外表，并根据下表9中所示的标准(Hollenbach等,2005,结肠炎程度的标准)通过评分来分析外表。彻底清除结肠内容物后，用盐水清洗结肠组织。将洗过的结肠组织的一部分用4％甲醛溶液固定以用作病理组织样品，并将其余部分在-80℃冷冻储存用于分子生物学分析。
表9
宏观分数 标准
0 没有发现任何溃疡和炎症。
1 没有发现出血的水肿。
2 发现有水肿的溃疡。
3 仅在一处发现溃疡和炎症。
4 在两处或两处以上发现溃疡和炎症。
5 溃疡的大小增加了2厘米或更多。
(4)髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
将100mg结肠组织在200μl含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中匀浆。将匀浆的组织在10,000×g、4℃下离心10分钟，收集上清液。将50μl上清液加入到0.95ml反应溶液(含有1.6mM四甲基联苯胺和0.1mM H2O2)中并使其在37℃下反应，并且在反应期间的各个时间点测量650nm处的吸光度。为了计算髓过氧化物酶(MPO)活性，用由反应产生的1μmol/ml过氧化物作为1个单位。
(5)炎症标记物的测定
用蛋白质印迹测定炎症标志物如p-p65、p65、iNOS、COX-2和β-肌动蛋白。具体地，按照与髓过氧化物酶(MPO)活性测定实验相同的方法，获得上清液。取50μg上清液并在SDS10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上电泳1小时30分钟。将电泳的样品转移到硝酸纤维素膜上，在100V和400mA的条件下保持1小时10分钟。将样品转移的硝酸纤维素膜用5％脱脂乳封闭30分钟，然后次用PBS-Tween洗涤三次，每次5分钟，并与1:100稀释的一抗(Santa CruzBiotechnology，美国)孵育过夜。然后，洗膜三次，每次10分钟，并与1：1000稀释度的二抗(Santa Cruz Biotechnology，美国)孵育1小时20分钟。然后，洗膜3次，每次15分钟，通过荧光显影。
另外，用ELISA试剂盒测定炎症相关细胞因子如TNF-α、IL-1β等。
(6)实验结果
图8显示了结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性，表明长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的影响；图9显示了结肠的组织学图像，其显示长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的影响；图10显示了炎症相关细胞因子水平，表明长双歧杆菌CH57对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的影响。在图8至10中，“NOR”表示正常组；“TNBS”表示阴性对照组；“CH57”表示施用长双歧杆菌CH57的组；“SS50”表示施用柳氮磺吡啶的组。如图8-10所示，考虑到有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物的体重、结肠炎标志物、结肠长度、髓过氧化物酶(MPO)活性等，长双歧杆菌CH57有效缓解结肠炎，且对缓解结肠炎的效果比柳氮磺胺吡啶好。此外，长双歧杆菌CH57在具有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物中可以抑制炎性细胞因子的产生并增加抗炎细胞因子IL-10的产生。
图11显示了结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性，表明了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的效果；图12显示了结肠的组织学图像，其显示了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的效果；图13显示了T细胞分化模式，表明短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的效果；图14显示了炎症相关细胞因子水平，表明了短乳酸杆菌CH23对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的效果。在图11至14中，“N”表示正常组；“TNBS”表示阴性对照组；“CH23”表示施用短乳酸杆菌CH23的组；“SS”表示施用柳氮磺吡啶的组。如图11-14所示，考虑到有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物的体重、结肠炎标志物、结肠长度、髓过氧化物酶(MPO)活性等，短乳酸杆菌CH23有效缓解结肠炎，而且比柳氮磺吡啶的缓解效果更好。此外，短乳酸杆菌CH23在有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物中抑制T细胞分化成Th17细胞并诱导T细胞分化成Treg细胞。此外，短乳酸杆菌CH23在有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物中可以抑制炎性细胞因子的产生并增加抗炎细胞因子IL-10的产生。
图15显示了结肠外观或髓过氧化物酶(MPO)活性，表明长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的效果；图16显示了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的影响的组织学图像；图17显示了炎症相关细胞因子水平，表明长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的影响。在图15至17中，“NOR”表示正常组；“TNBS”表示阴性对照组；“BL”表示施用相同量的通过混合长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23制备的乳酸菌混合物的组；“SS50”表示施用柳氮磺吡啶的组。如图15-17所示，长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的乳酸菌混合物明显改善了有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物体重减轻、结肠炎标志物水平增加、结肠长度缩短和髓过氧化物酶(MPO)活性增加的效果，对缓解结肠炎的疗效明显优于柳氮磺胺吡啶。此外，长双歧杆菌CH57和短酸乳杆菌CH23的乳酸菌混合物在有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物中显著抑制炎症细胞因子的产生并显著增加抗炎细胞因子IL-10的产生。
7.体内评估乳酸菌的减肥和抗炎效果
(1)实验方法
从RaonBio Co.，Ltd购买24只C57BL6/J小鼠，并在温度20±2℃、湿度50±10％和12小时光照/12小时黑暗周期的条件下适应饮食(Purina)1星期。然后，将测试动物分成三组(LFD，HFD和HFD+BL)，每组由8只组成，LFD组正常饮食(LFD，10％来自脂肪的卡路里；Research，NJ，USA)喂食4周，HFD组和HFD+BL组以高脂饮食(HFD，来自脂肪的60％卡路里；Research，NJ，USA)喂食4周。然后，在用正常饮食喂养4周的同时，LFD组口服PBS。此外，HFD组在口服高脂饮食4周的同时口服PBS。通过以相同的量混合长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23来制备乳酸菌混合物。
(2)乳酸菌混合物的抗肥胖效果和抗炎效果的分析
通过重量变化分析乳酸菌混合物的抗肥胖效果。另外，用与TNBS诱导的急性结肠炎模型动物实验相同的方法分析乳酸菌混合物的抗炎效果。
(3)实验结果
图18显示了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响的体重变化；图19显示了结肠外观、髓过氧化物酶(MPO)活性、结肠的组织学图像等，其表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响；图20显示了炎症相关细胞因子水平，表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响；图21显示了炎症反应标记，表明了长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的混合物对肥胖诱导的模型动物的影响。如图18-21所示，长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的乳酸菌混合物大大降低了由高脂肪饮食诱导肥胖的模型动物体重增加、结肠炎标志物水平升高和髓过氧化物酶(MPO)活性增加，并且抑制了结肠炎的发展。此外，长双歧杆菌CH57和短乳酸杆菌CH23的乳酸菌混合物在由高脂饮食诱导肥胖的模型动物中极大地抑制了炎性细胞因子的产生并增加了抗炎细胞因子IL-10的产生。
II.乳酸菌筛选的第二实验及其效果评估
1.乳酸菌的分离和鉴定
(1)从朝鲜泡菜中分离乳酸菌
将大白菜泡菜、萝卜泡菜和大葱泡菜各自粉碎，并将粉碎的液体悬浮在MRS液体培养基(MRS肉汤；Difco，美国)中。然后，收集上清液，转移到MRS琼脂培养基(Difco，美国)中，在37℃无氧培养约48小时，然后根据形状分离形成菌落的长双歧杆菌菌株。
(2)从人粪便中分离乳酸菌
将人粪便悬浮于GAM液体培养基(GAM肉汤；Nissui Pharmaceutical，日本)中。然后，收集上清液，转移至BL琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical，日本)，并在37℃无氧培养约48小时，然后分离形成菌落的双歧杆菌菌株。
(3)鉴定筛选的乳酸菌
分析从朝鲜泡菜或人粪便中分离得到的菌株的革兰氏染色特征、生理特征和16SrDNA序列，以确定菌株的种类，并给菌株命名。下表10列出了从大白菜泡菜、萝卜泡菜和大葱泡菜中分离出的乳酸菌的对照数和菌株名称，下表11显示了从人粪便分离的乳酸菌的对照数和菌株名称。
表10
对照数 菌株名称 对照数 菌株名称
1 植物乳酸杆菌LC1 26 植物乳酸杆菌LC26
2 植物乳酸杆菌LC2 27 植物乳酸杆菌LC27
3 植物乳酸杆菌LC3 28 植物乳酸杆菌LC28
4 植物乳酸杆菌LC4 29 植物乳酸杆菌LC29
5 植物乳酸杆菌LC5 30 植物乳酸杆菌LC30
6 植物乳酸杆菌LC6 31 植物乳酸杆菌LC31
7 植物乳酸杆菌LC7 32 植物乳酸杆菌LC32
8 植物乳酸杆菌LC8 33 植物乳酸杆菌LC33
9 植物乳酸杆菌LC9 34 植物乳酸杆菌LC34
10 植物乳酸杆菌LC10 35 植物乳酸杆菌LC35
11 植物乳酸杆菌LC11 36 植物乳酸杆菌LC36
12 植物乳酸杆菌LC12 37 植物乳酸杆菌LC37
13 植物乳酸杆菌LC13 38 植物乳酸杆菌LC38
14 植物乳酸杆菌LC14 39 植物乳酸杆菌LC39
15 植物乳酸杆菌LC15 40 植物乳酸杆菌LC40
16 植物乳酸杆菌LC16 41 植物乳酸杆菌LC41
17 植物乳酸杆菌LC17 42 植物乳酸杆菌LC42
18 植物乳酸杆菌LC18 43 植物乳酸杆菌LC43
19 植物乳酸杆菌LC19 44 植物乳酸杆菌LC44
20 植物乳酸杆菌LC20 45 植物乳酸杆菌LC45
21 植物乳酸杆菌LC21 46 植物乳酸杆菌LC46
22 植物乳酸杆菌LC22 47 植物乳酸杆菌LC47
23 植物乳酸杆菌LC23 48 植物乳酸杆菌LC48
24 植物乳酸杆菌LC24 49 植物乳酸杆菌LC49
25 植物乳酸杆菌LC25 50 植物乳酸杆菌LC50
表11
Figure BDA0003529036060000371
Figure BDA0003529036060000381
上述表10中所示的植物乳酸杆菌LC5是革兰氏阳性厌氧杆菌，并且其16S rDNA具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。通过Genebank的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定了植物乳杆菌LC5的16S rDNA核苷酸序列，结果，没有发现具有与植物乳酸杆菌LC5相同的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌菌株，植物乳酸杆菌LC5与植物乳酸杆菌菌株KF9的16S rDNA序列有99％的同源性。此外，上述表10中显示的植物乳酸杆菌LC27是革兰氏阳性厌氧杆菌，其16S rDNA具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列。通过Genebank的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定了植物乳杆菌LC27的16S rDNA核苷酸序列，结果，没有发现具有与植物乳酸杆菌LC27相同的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌菌株，植物乳酸杆菌LC27与植物乳酸杆菌菌株JL18的16S rDNA序列有99％的同源性。另外，上述表10中所示的植物乳杆菌LC28是革兰氏阳性厌氧杆菌，其16S rDNA具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列。通过Genebank的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定了植物乳杆菌LC28的16S rDNA核苷酸序列，结果，没有发现具有与植物乳酸杆菌LC28相同的16S rDNA核苷酸序列的植物乳酸杆菌菌株，植物乳酸杆菌LC28与植物乳酸杆菌菌株USIM01的16S rDNA序列有99％的同源性。
上表11所示的长双歧杆菌LC67是革兰氏阳性厌氧杆菌，其16S rDNA具有SEQ IDNO：7的核苷酸序列。通过Genebank的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定了长双歧杆菌LC67的16S rDNA核苷酸序列，结果，没有发现具有与长双歧杆菌LC67相同的16SrDNA核苷酸序列的长双歧杆菌菌株，长双歧杆菌LC67与长双歧杆菌菌株CBT-6的16S rDNA序列有99％的同源性。上表11所示的长双歧杆菌LC68是革兰氏阳性厌氧杆菌，其16S rDNA具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列。通过Genebank的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定了长双歧杆菌LC68的16S rDNA核苷酸序列，结果，没有发现具有与长双歧杆菌LC68相同的16S rDNA核苷酸序列的长双歧杆菌菌株，长双歧杆菌LC67与长双歧杆菌菌株IMAUFB067的16S rDNA序列有99％的同源性。
此外，在植物乳酸杆菌LC、植物乳酸杆菌LC27、长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68的生理特征中，通过API试剂盒(型号：API 50CHL；由生物梅里埃，美国制造)用糖发酵分析碳源利用率。下表12显示了分析植物乳酸杆菌LC5和植物乳酸杆菌LC27的碳源利用率的结果，下表13显示了分析长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68的碳源利用率的结果。在下表12和13中，“+”表示碳源利用率为正的情况；“-”表示碳源利用率为负的情况；“±”表示碳源利用不确定的情况。如下面的12和13所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC27、长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68显示碳源的利用率与一些碳源的相同物种的已知菌株的利用率不同。
表12
Figure BDA0003529036060000391
Figure BDA0003529036060000401
表13
Figure BDA0003529036060000402
Figure BDA0003529036060000411
(4)乳酸菌的保藏信息
本发明人在韩国微生物保藏中心保藏了植物乳杆菌LC5(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)，国际保藏单位，2016年1月11日，保藏号为KCCM 11800P。此外，本发明人在韩国微生物保藏中心保藏了植物乳杆菌LC27(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)，国际保藏单位，2016年1月11日，保藏号为KCCM 11801P。此外，本发明人在韩国微生物保藏中心保藏了长双歧杆菌LC67(地址：韩国首尔西大门区弘济洞2街45号友林大厦)，国际保藏单位，2016年1月11日，保藏号为KCCM 11802P。
2.评估乳酸菌对减轻肠损伤或肠渗透性的效果
为了评估从朝鲜泡菜或人粪便分离的乳酸菌对减轻肠道损伤或内部渗透性的效果，对乳酸菌的抗氧化活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性、β-葡萄糖醛酸酶(有害肠内酶)抑制活性和紧密连接蛋白表达诱导活性进行测定。
(1)实验方法
*抗氧化活性
将DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼基)溶于乙醇中至浓度为0.2mM，以制备DPPH溶液。向0.1ml的DPPH溶液中加入乳酸菌悬浮液(1×108CFU/ml)或维生素C溶液(1μg/ml)，并在37℃下培养20分钟。将培养物以3000rpm离心5分钟，收集上清液。然后，测定517nm处的上清液的吸光度，算出乳酸菌的抗氧化活性。
*脂多糖(LPS)产生抑制活性
将0.1g人新鲜粪便悬浮于0.9ml无菌生理盐水中，并用普通厌氧培养基稀释100倍以制备粪便悬浮液。在9.8ml无菌厌氧培养基(Nissui Pharmaceuticals，日本)中加入0.1ml粪便悬浮液和0.1ml乳酸菌(1×104或1×105CFU)并无氧培养24小时。然后，将培养物超声处理约1小时以破坏细菌的外细胞膜，并以5000×g离心并收集上清液。然后，通过LAL(鲎变形细胞溶解物)测定试剂盒(由Cape Cod Inc.，美国制造)测定上清液中的LPS(脂多糖)(典型的内毒素)的含量。另外，为了评估乳酸菌的大肠杆菌增殖抑制活性，将通过如上所述相同的实验获得的培养物稀释1000倍和100000倍，并在DHL培养基中培养，然后计数大肠杆菌细胞的数量。
*β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性
0.1ml 0.1mM对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷溶液、0.2ml 50mM磷酸缓冲盐溶液和0.1ml乳酸菌悬浮液(将乳酸菌培养物悬浮于5ml生理盐水中制备)置于反应器中，进行β-葡糖醛酸糖苷酶酶促反应，并加入0.5ml 0.1mM NaOH溶液以终止反应。然后，将反应溶液以3000rpm离心5分钟，收集上清液。然后测定405nm处的上清液的吸光度。
*紧密连接蛋白表达诱导活性
从韩国细胞系库获得的Caco2细胞在RPMI 1640培养基中培养48小时，然后将培养的Caco2细胞以2×106个细胞/孔的密度分配到12孔板中的各孔。然后，将各孔用1μg的LPS(脂多糖)或1μg的LPS(脂多糖)和1×103CFU的乳酸菌一起处理并温育24小时。然后，收集各孔培养的细胞，并通过免疫印迹方法测定细胞中紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。
(2)实验结果
测定从朝鲜泡菜或人粪便分离的乳酸菌的抗氧化活性、脂多糖(LPS)产生抑制活性、β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性和紧密连接蛋白表达诱导活性，并将测定结果示于下表14-16。如下表14-16所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC15、植物乳酸杆菌LC17、植物乳酸杆菌LC25、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC55、长双歧杆菌LC65、长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68具有优异的抗氧化活性，强烈抑制脂多糖(LPS)产生和β-葡萄糖醛酸糖苷酶活性，并强烈诱导紧密连接蛋白的表达。特别地，长双歧杆菌LC67显示出的紧密连接蛋白表达诱导活性最好。这些乳酸菌具有优异的抗氧化效果，对抑制与炎症和致癌相关的肠道菌群的有害菌的酶活性具有优异的效果，抑制肠道菌群有害菌产生的内毒素LPS(脂多糖)的产生，诱导紧密连接蛋白的表达。因此，这些乳酸菌可以改善肠道通透性综合征。
表14
Figure BDA0003529036060000421
Figure BDA0003529036060000431
Figure BDA0003529036060000441
表15
Figure BDA0003529036060000442
Figure BDA0003529036060000451
Figure BDA0003529036060000461
表16
Figure BDA0003529036060000462
Figure BDA0003529036060000471
*测定抗氧化活性时乳酸菌的最终浓度：1×104CFU/ml；添加用于测定β-葡糖醛酸糖苷酶抑制活性和脂多糖(LPS)生成抑制活性的乳酸菌浓度：1×104CFU/ml；测定紧密连接蛋白表达诱导活性时乳酸菌的浓度：1×104CFU/ml。
*测量乳酸菌各种活性的标准：非常强烈(+++；>90％)；强烈(++；>60-90％)；弱(+；>20-60％)；不低于20％(-；<20％)。
3.评估乳酸菌对减轻肝损伤的影响
基于评估乳酸菌对减轻肠道损伤或肠渗透性综合症的影响，选择以下十种菌株：植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC15、植物乳酸杆菌LC17、植物乳酸杆菌LC25、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC55、长双歧杆菌LC65、长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68。这些乳酸菌菌株或这些菌株的混合物对减轻肝损伤的效果用有由叔丁基过氧化物诱导的肝损伤的模型动物评估。
1)实验方法
将小鼠(C57BL/6，雄性)分成若干组，每组由6只组成。以2.5mmol/kg的剂量向除正常组以外的组的试验动物腹腔内施用叔丁基过氧化物，以诱导肝损伤。从施用叔丁基过氧化物2小时后，给除正常组和阴性对照组以外的组的试验动物口服施用2×109CFU的乳酸菌，每天一次，共3天。在最后一次给药后6小时，从心脏取血。将取得的血液在室温下放置60分钟，并以3,000rpm离心15分钟以分离血清。使用血液分析试剂盒(ALT&AST测量试剂盒；韩国Asan Pharm.Co.)测定分离的血清中的GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT(谷氨酸草氨酸转氨酶)水平。另外，将从各试验动物切下的1g肝脏组织加入到生理盐水中，用匀浆器进行匀浆化，通过ELISA试剂盒对上清进行分析，以测定TNF-α的水平。
(2)实验结果
下表17显示了将乳酸菌施用给有由叔丁基过氧化物诱导的肝损伤的模型动物时，GOT、GPT和TNF-α值的变化。如下表17所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC67和长双歧杆菌LC68与水飞蓟素相比在减轻肝损伤方面显示出优异的效果，并且这些乳酸菌的混合物在减轻肝损伤方面显示现出更好的效果。
表17
Figure BDA0003529036060000481
Figure BDA0003529036060000491
在上表17中，“LC5”表示植物乳酸杆菌LC5；“LC15”表示植物乳酸杆菌LC15；“LC17”表示植物乳酸杆菌LC17；“LC25”表示植物乳酸杆菌LC25；“LC27”表示植物乳酸杆菌LC27；“LC28”表示植物乳酸杆菌LC28；“LC55”表示长双歧杆菌LC55；“LC65”表示长双歧杆菌LC65；“LC67”表示长双歧杆菌LC67；“LC68”表示长双歧杆菌LC68；“LC5+LC67”表示通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC5和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物；“LC5+LC68”表示通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC5和长双歧杆菌LC68制备的乳酸菌混合物；“LC27+LC67”表示通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物；“LC27+LC68”表示通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC68制备的乳酸菌混合物；和“LC28+LC67”表示通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC28和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物。在下面显示实验结果的表中，对于单独乳酸菌或乳酸菌混合物使用相同的符号。
4.评估乳酸菌对减轻过敏症的影响
(1)乳酸菌对脱粒抑制作用的测定
将RBL-2H3细胞系(大鼠肥大细胞系，韩国细胞系库，货号22256)在含有10％FBS(胎牛血清)和L-谷氨酰胺的DMEM(Dulbeccos改良的伊格尔培养基，Sigma，22256)中在37℃潮湿的5％CO2培养箱中培养。用胰蛋白酶-EDTA溶液悬浮培养基中含有的细胞，分离、收集悬浮的细胞并用于实验。将收集的RBL-2H3细胞以5×105个细胞/孔的密度分配到24孔板中，并通过与0.5μg/ml的小鼠单克隆IgE一起温育12小时而致敏。用0.5ml丝氨酸缓冲液(119mM NaCl、5mM KCl、0.4mM MgCl2、25mM PIPES、40mM NaOH、pH 7.2)洗涤致敏的细胞，然后在37℃下用0.16ml丝氨酸缓冲液(补充有5.6mM葡萄糖、1mM CaCl2、0.1％BSA)培养10分钟。然后，将作为测试药物的乳酸菌添加至细胞培养物中至浓度为1×104CFU/ml，或者将0.04ml作为对照药物的DSCG(色甘酸二钠)加入到细胞培养物中，20分钟后，将细胞用0.02ml抗原(1μg/ml DNP-BSA)在37℃下活化10分钟。然后，将细胞培养物以2000rpm离心10分钟，收集上清液。将0.025ml收集的上清液转移到96孔板中，然后向其中加入0.025ml 1mMp-NAG(对硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡糖酰胺在0.1M柠檬酸盐缓冲液中的溶液，pH 4.5)，然后使混合物在37℃下反应60分钟。然后，通过添加0.2ml 0.1M Na2CO3/NaHCO3来停止反应，并通过ELISA分析仪测量405nm处的吸光度。
(2)实验结果
以下表18显示测量乳酸菌脱粒抑制(％)的结果。如表18所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC67、长双歧杆菌LC68及其混合物有效地抑制了嗜碱性粒细胞的脱粒。因此，这些乳酸菌或其混合物可以非常有效地缓解过敏、哮喘、咽炎、慢性皮炎等。
表18
药物 脱粒抑制(％)
无 0
LC5 65
LC15 45
LC17 43
LC25 48
LC27 52
LC28 54
LC55 38
LC65 42
LC67 65
LC68 61
LC5+LC67 65
LC5+LC68 60
LC27+LC67 65
LC27+LC68 59
LC28+LC67 62
DSCG(色甘酸二钠) 62
5.体外评估乳酸菌的抗炎和免疫调节影响
(1)巨噬细胞的分离和炎症标记物的测定
从RaonBio Co.有限责任公司购买6周龄C57BL/6J雄性小鼠(20-23g)。向每只小鼠的腹腔内施用2ml的4％无菌巯基乙酸盐，96小时后，将小鼠麻醉，并将8ml RPMI 1640培养基施用到每只小鼠的腹腔中。5-10分钟后，取出小鼠腹腔内的RPMI培养基(包括巨噬细胞)，以1000rpm离心10分钟，然后用RPMI 1640培养基洗涤两次。将巨噬细胞以0.5×106个细胞/孔的密度接种在24孔板上并用测试物质乳酸菌和炎症诱导剂LPS(脂多糖)处理2小时或24小时，然后收集上清液和细胞。在这种情况下，用浓度为1×104CFU/ml的乳酸菌来处理细胞。将收集的细胞在缓冲液(Gibco)中匀浆。通过ELISA试剂盒用收集的上清液来测定细胞因子如TNF-α的表达水平。另外，用收集的细胞，通过免疫印迹法测量p65(NF-kappa B)，p-p65(荧光物质-NF-kappa B)和β-肌动蛋白的表达水平。具体地，取50μg上清液并在SDS10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上电泳1小时30分钟。将电泳的样品在100V和400mA的条件下转移到硝酸纤维素膜上1小时10分钟。将样品转移的硝酸纤维素膜用5％脱脂乳封闭30分钟，然后用PBS-Tween洗涤三次，每次5分钟，并与1:100稀释的一抗(Santa CruzBiotechnology，美国)一起温育过夜。然后，将膜洗涤三次，每次10分钟，并与1:1000稀释的二抗(Santa Cruz Biotechnology，美国)一起温育1小时20分钟。然后，洗膜3次，每次15分钟，通过荧光显影。测量显影带的强度，然后用下列方程计算抑制率(％)。在下面的方程中，正常组表示单独用盐水处理巨噬细胞的组；用LPS处理的组表示单独用LPS处理巨噬细胞的组；用乳酸菌处理的组表示用乳酸菌和LPS处理巨噬细胞的组。
抑制率(％)＝(用LPS处理的组中的表达水平-用乳酸菌处理的组中的表达水平)/(用LPS处理的组中的表达水平-在正常组中的表达水平)×100
下表19显示了当用LPS(脂多糖)诱导炎症的巨噬细胞用乳酸菌处理时，NF-kappaB活化和TNF-α表达的抑制。如下表19所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC67、长双歧杆菌LC68及其混合物有效地抑制由LPS(脂多糖)诱导的炎症。
表19
Figure BDA0003529036060000511
Figure BDA0003529036060000521
(2)从脾脏分离T细胞和分化成Th17细胞或Treg细胞的测定
将脾脏与C56BL/6J小鼠分离，适当粉碎并悬浮于含10％FCS的RPMI 1640培养基中，用CD4T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，德国)分离出CD4T细胞。将分离的CD4 T细胞以5×105个细胞/孔的密度接种于12孔板中，并将抗CD3(1μg/ml，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)和抗CD28(1μg/ml，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)加入其中，或加入抗CD3(1μg/ml，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，德国)、抗-CD28(1μg/ml，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)、重组IL-6(20ng/ml，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)和重组转化生长因子β(1ng/ml，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)。培养细胞时，向其中加入1×103或1×105CFU的乳酸菌，细胞培养4天。然后，用抗FoxP3或抗IL-17A抗体对培养的细胞进行染色，并用FACS(荧光激活细胞分选)系统(C6流式
Figure BDA0003529036060000523
系统，圣何塞，加利福尼亚州，美国)分析Th17细胞和Treg细胞的分布。
下表20显示了当用抗-CD3、抗-CD28、IL-6和TGF-β处理T细胞时T细胞(从脾中分离)分化成Th17细胞的水平，下表21显示了当用抗CD3和抗CD28处理T细胞时T细胞(从脾中分离)分化成Treg细胞的水平。如下表20和21所示，植物乳酸杆菌LC5、植物乳酸杆菌LC27、植物乳酸杆菌LC28、长双歧杆菌LC67、长双歧杆菌LC68及其混合物抑制T细胞分化成Th17细胞(T辅助细胞17细胞)并促进T细胞分化成Treg细胞。这些结果表明乳酸菌或其混合物可以有效缓解诸如结肠炎或关节炎的炎性疾病。
表20
Figure BDA0003529036060000522
Figure BDA0003529036060000531
表21
Figure BDA0003529036060000532
6.体内评估乳酸菌的抗炎和缓解结肠炎影响
(1)实验动物
从OrientBio购买5周龄的C57BL/6雄性小鼠(24-27g)，并置于受控的环境条件(湿度：50±10％、温度：25±2℃、12小时光照/12小时黑暗循环)中，然后用于实验。使用标准实验饲料(韩国三洋)，并且动物饮水自由。在所有的实验中，一组由6只动物组成。
(2)由TNBS诱导的结肠炎和样品施用
将一组试验动物用作正常组，并将其他组的试验动物用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)处理以诱发急性结肠炎。具体地，将试验动物用乙醚轻度麻醉，然后将2.5g TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)和100ml 50％乙醇的混合溶液通过1ml圆形注射器通过肛门施用于结肠，每次0.1ml，垂直提起并保持30秒，从而诱发炎症。另一方面，正常组口服0.1ml生理盐水。第二天，将作为试验样品的乳酸菌或乳酸菌混合物悬浮在盐水中，并以2.0×109CFU的量向每只小鼠口服给药，每天一次，共3天。在样品给药后的第二天，将动物用二氧化碳杀死，并解剖和使用从盲肠到紧肛前的部位的结肠部分。同时，正常组的试验动物仅用盐水代替乳酸菌口服给药。此外，阴性对照组的试验动物在TNBS诱导结肠炎后仅用盐水代替乳酸菌口服给药。此外，阳性对照组的试验动物口服50mg/kg柳氮磺吡啶(一种治疗结肠炎的药物)代替乳酸菌。
(3)结肠的宏观分析
观察解剖结肠的长度和外观，并根据下表22中所示的标准(Hollenbach等人，2005，结肠炎程度标准)通过评分对外观进行分析。彻底清除结肠内容物后，用盐水清洗结肠组织。将洗过的结肠组织的一部分用4％甲醛溶液固定以用作病理组织样品，并将其余部分在-80℃冷冻储存用于分子生物学分析。
表22
宏观分数 标准
0 没有发现任何溃疡和炎症。
1 没有发现出血的水肿。
2 发现有水肿的溃疡。
3 仅在一处发现溃疡和炎症。
4 在两处或两处以上发现溃疡和炎症。
5 溃疡的大小增加了2厘米或更多。
(4)髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
将100mg结肠组织在200μl含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中匀浆。将匀浆的组织在10,000×g、4℃下离心10分钟，收集上清液。将50μl上清液加入到0.95ml反应溶液(含有1.6mM四甲基联苯胺和0.1mM H2O2)中并使其在37℃下反应，并且在反应期间的各个时间点测量650nm处的吸光度。为了计算髓过氧化物酶(MPO)活性，用由反应产生的1μmol/ml过氧化物作为1个单位。
(5)炎症标记物的测定
用蛋白质印迹测定炎症标志物如p-p65、p65、iNOS、COX-2和β-肌动蛋白。具体地，按照与髓过氧化物酶(MPO)活性测定实验相同的方法，获得上清液。取50μg上清液并在SDS10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上电泳1小时30分钟。将电泳的样品转移到硝酸纤维素膜上，在100V和400mA的条件下保持1小时10分钟。将样品转移的硝酸纤维素膜用5％脱脂乳封闭30分钟，然后次用PBS-Tween洗涤三次，每次5分钟，并与1:100稀释的一抗(Santa CruzBiotechnology，美国)孵育过夜。然后，洗膜三次，每次10分钟，并与1：1000稀释度的二抗(Santa Cruz Biotechnology，美国)孵育1小时20分钟。然后，洗膜3次，每次15分钟，通过荧光显影。
另外，用ELISA试剂盒测定炎症相关细胞因子如TNF-α、IL-17、IL-10等。
(6)免疫调节标记物的分析
将解剖的结肠用2.5mM EDTA溶液洗涤两次。将清洗过的结肠在含有1mg/ml VIII型胶原酶(Sigma)的RPMI培养基中于30℃搅拌20分钟，并过滤以分离拉尼娅菌(Laminapropria)。然后，用30-100％细胞分离液(Percoll)溶液处理拉尼娅菌(Lamina propria)并离心分离T细胞。将分离的T细胞用抗FoxP3或抗IL-17A抗体染色，并用FACS(荧光激活细胞分选)系统(C6流式
Figure BDA0003529036060000551
系统，圣何塞，加利福尼亚州，美国)分析Th17和Treg细胞的分布。
(7)实验结果
下表23显示当将乳酸菌施用于有TNBS诱导的模型动物时，乳酸菌对结肠的重量、结肠外观、髓过氧化物酶(MPO)活性和炎症相关的细胞因子含量的影响。如下表23所示，由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物显示出体重减轻、结肠宏观评分降低、结肠长度缩短和MPO活性增加。然而，当将乳酸菌施用给TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物时，所有标记物都升高。具体地，单独施用长双歧杆菌LC67或施用长双歧杆菌LC67和植物乳杆菌LC5的混合物在缓解结肠炎方面表现出非常优异的效果。另外，有TNBS诱导的急性结肠炎的模型动物显示TNF-α和IL-17水平增加，IL-10水平降低。然而，当将乳酸菌施用给TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物时，所有这些标记物都升高。特别地，当单独施用长双歧杆菌LC67或施用长双歧杆菌LC67和植物乳杆菌LC5的混合物时，TNF-α和IL-17水平大大降低，并且IL-10水平大大增加。
表23
Figure BDA0003529036060000561
图22显示了T细胞向Th17细胞的分化图，其表明乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。图23显示T细胞向Treg细胞的分化图，其表明乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。在图22和23中，“NOR”表示正常组；“TNBS”表示阴性对照组；“LC5”表示施用植物乳酸杆菌LC5的组；“LC27”表示施用植物乳酸杆菌LC27的组；“LC67”表示施用长双歧杆菌LC67的组；“LC68”表示施用长双歧杆菌LC68的组；“LC5+LC67”表示施用通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC5和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物的组；“LC27+LC68”表示施用相同量的通过混合植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC68而制备的乳酸菌混合物的组；“SS”表示施用柳氮磺吡啶的组。如图22和图23所示，在TNBS诱导的急性结肠炎动物的情况下，促进T细胞向Th17细胞的分化，抑制T细胞向Treg细胞的分化。但是，对TNBS诱导的急性结肠炎动物施用乳酸菌时，T细胞向Th17细胞的分化受到抑制，促进了T细胞分化为Treg细胞。特别地，当单独施用长双歧杆菌LC67或施用长双歧杆菌LC67和植物乳酸杆菌LC5的混合物时，T细胞向Th17细胞的分化被显著抑制，并且T细胞向Treg细胞的分化被显著促进。
图24显示了炎症反应标记物，其表明乳酸菌对由TNBS诱导的具有急性结肠炎的模型动物的影响。在图24中，“Nor”表示正常组；“T”表示阴性对照组；“LC5”表示施用植物乳酸杆菌LC5的组；“LC27”表示施用植物乳酸杆菌LC27的组；“LC67”表示给予长双歧杆菌LC67的组；“LC68”表示施用长双歧杆菌LC68的组；“LC5+LC67”表示施用通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC5和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物的组；“LC27+LC68”表示施用相同量的通过混合植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC68而制备的乳酸菌混合物的组；“SS”表示施用柳氮磺吡啶的组。如图24所示，在由TNBS诱导的有急性结肠炎的模型动物的情况下，NF-κB被活化(p-p65)并且COX-2和iNOS的表达水平增加。然而，当施用乳酸菌时，NF-κB(p-p65)的活化受到抑制，，并且COX-2和iNOS的表达水平也降低。特别地，单独施用长双歧杆菌LC67或施用长双歧杆菌LC67和植物乳酸杆菌LC5的混合物在抑制NF-κB活化(p-p65)和抑制COX-2和iNOS的表达方面表现出优异的效果。
7.体内评估乳酸菌对减轻酒精引起的胃溃疡的效果
(1)实验动物
从OrientBio购买5周龄的C57BL/6雄性小鼠(24-27g)，并将其置于受控的环境条件(湿度：50±10％、温度：25±2℃、12小时光照/12小时黑暗循环)，然后用于实验。使用标准实验饲料(韩国三洋)喂养，并且动物饮用自由。在所有实验中，每组由6只动物组成。
(2)用酒精诱导胃溃疡并施用样品
对于一个试验组，口服1×109CFU的植物乳酸杆菌LC27悬液，每天一次，连续3天。另一试验组口服1×109CFU的长双歧杆菌LC67悬液，每天一次，连续3天。在另一试验组中，将通过混合相同量的植物乳杆菌LC27和长双歧杆菌LC67制备的1x10 9CFU的乳酸菌混合物悬液口服给药，每天一次，连续3天。另外，对于阳性对照组，雷尼替丁(一种治疗胃溃疡的商业试剂)以50mg/kg的量口服给药，每天一次，连续3天。另外，对于正常组和阴性对照组，口服给药0.2ml盐水，每天一次，连续3天。在口服给药3天后，将试验小鼠禁食并停止喂水18小时。在实验的第4天，在施用生理盐水1小时后，对正常组以外的全部试验组的小鼠口服给药0.2ml的99％纯乙醇，以诱发胃溃疡。另外，对于正常组，施用0.2ml盐水代替乙醇。
(3)与胃损伤相关的宏观标志物的测定
施用乙醇后3小时，杀死试验小鼠，纵向切开胃组织并用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液洗涤，然后用肉眼或显微镜观察胃损伤程度并评分(参见Park,S.W.,Oh,T.Y.,Kim,Y.S.,Sim,H.等，亚细亚蒿提取物保护对乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤。J.Gastroenterol.Hepatol.2008,23,976-984)。
(4)髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
将100mg胃组织在200μl含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中匀浆。然后，将组织溶液以10,000×g和4℃离心10分钟，并收集上清液。将50μl上清液加入到0.95ml反应溶液(含有1.6mM四甲基联苯胺和0.1mM H2O2)中并使其在37℃下反应，并且在反应期间的各个时间点测量650nm处的吸光度。用由反应产生的1μmol/ml过氧化物作为1个单位，以计算髓过氧化物酶(MPO)活性。
(5)炎症标记物的测定
通过Qiagen RNeasy迷你试剂盒从胃组织分离2μgmRNA，并使用Takara PrimeScript逆转录酶合成cDNA。然后，使用定量实时聚合酶链式反应测量CXCL4[趋化因子(C-X-C基序)配体4]和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的表达水平(Qiagen热循环仪，Takara SYBER预混剂，热循环条件：在95℃下激活DNA聚合酶5分钟，随后进行95℃下10秒和60℃下45秒的40个循环)。下表24显示了在定量实时聚合酶链式反应中用于分析每种细胞因子的引物序列。
表24
Figure BDA0003529036060000581
(6)实验结果
图25的图像显示了在本发明的第二实验中，乳酸菌对由乙醇诱发的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响；图26显示了胃损伤分数，表明了在本发明的第二实验中，乳酸菌对由乙醇诱发的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响；图27是表示在本发明的第二实验中表示乳酸菌对由乙醇诱发的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响的溃疡指数的图；图28显示了在本发明的第二实验中，乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡的小鼠的胃粘膜的影响的组织学活性指数。此外，图29显示了在本发明的第二实验中，乳酸菌对由乙醇诱导的胃溃疡的小鼠的胃粘膜的影响的髓过氧化物酶(MPO)的活性。另外，图30显示了在本发明的第二实验中，乳酸菌对乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响的CXCL4的表达水平；图31显示了在本发明的第二实验中，乳酸菌对乙醇诱导的胃溃疡小鼠的胃粘膜的影响的TNF-α表达水平。在图30和31中，除正常组以外的试验组中的CXCL4表达水平和TNF-α表达水平相对于正常组中的表达水平的表达倍数变化。在图25至31，“Nor”表示正常组；“乙醇”表示具有乙醇诱导的胃溃疡并以生理盐水为样品给药阴性对照组；“乙醇+雷尼替丁”表示具有乙醇诱导的胃溃疡的并以雷尼替丁为样品给药的试验组；“乙醇+LC27”表示具有乙醇诱导的胃溃疡并且将植物乳酸杆菌LC27为样品给药的试验组；“乙醇+LC67”表示具有乙醇诱导的胃溃疡并以长双歧杆菌LC67为样品给药的试验组；“乙醇+LC27/LC67”表示具有乙醇诱导的胃溃疡并以通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物作为样品给药的试验组。如图25至29所，长双歧杆菌LC67、植物乳酸杆菌LC27或其混合物有效缓解由乙醇诱导的胃损伤或胃溃疡。而且，如图30和31所示，长双歧杆菌LC67、植物乳酸杆菌LC27或其混合物大大降低了具有乙醇诱导的胃损伤或胃溃疡的小鼠中的炎性标志物水平。
8.体内评估乳酸菌对减轻酒精诱导的肝损伤的影响
(1)试验动物
从OrientBio购买5周龄的C57BL/6雄性小鼠(24-27g)，并将其置于受控的环境条件(湿度：50±10％、温度：25±2℃、12小时光照/12小时黑暗循环)，然后用于实验。用标准实验饲料(韩国三洋)喂养，并且动物饮水自由。在所有实验中，每组由6只动物组成。
(2)酒精引起的肝损伤和样品施用
对于一个试验组，口服1×109CFU的植物乳酸杆菌LC27悬液，每天一次，连续3天。另一试验组口服1×109CFU的长双歧杆菌LC67悬液，每天一次，连续3天。在另一试验组中，将通过混合相同量的植物乳杆菌LC27和长双歧杆菌LC67制备的1x10 9CFU的乳酸菌混合物悬液口服给药，每天一次，连续3天。另外，对于阳性对照组，水飞蓟素(一种治疗肝损伤的商业试剂)以50mg/kg的量口服给药，每天一次，连续3天。另外，对于正常组和阴性对照组，口服给药0.1ml盐水，每天一次，连续3天。在口服样品或生理盐水3天后3小时，对正常组以外的全部试验组的小鼠口服给药6ml/kg乙醇，以诱导肝损伤。另外，对于正常组，用盐水代替乙醇，以6ml/kg的量施用与腹膜。然后，将试验小鼠禁食并禁水12小时，然后处死，从心脏取血。
(3)肝功能标志物的测定和结果
将取得的血液在室温下静置60分钟，并以3,000rpm离心15分钟以分离血清。使用血液测定试剂盒测量分离的血清中GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT(谷氨酸草氨酸转氨酶)水平(ALT&AST测定试剂盒；韩国牙山医药公司)，测定结果显示在下表25中。如下表25所示，长双歧杆菌LC67、植物乳酸杆菌LC27或其混合物有效地减轻了乙醇诱导的肝损伤。特别地，长双歧杆菌LC67显示出比水飞蓟素更好的效果。
表25
实验组s GOT(IU/L) GPT(IU/L)
正常组 52.1 42.2
阴性对照组 107.7 156.3
施用乙醇和LC27的组 82.3 95.4
施用乙醇和LC67的组 62.5 65.8
施用乙醇和LC27/LC67的组 71.4 78.3
施用乙醇和水飞蓟的组 79.5 87.5
*LC27：植物乳酸杆菌LC27
*LC67：长双歧杆菌LC67
*LC27/LC67：通过混合相同量的植物乳酸杆菌LC27和长双歧杆菌LC67制备的乳酸菌混合物。
尽管以上参照实施例描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施例，并且在不脱离本发明的范围和构思的情况下可以进行各种修改。因此，本发明的保护范围应被解释为包括落入所附权利要求书内的所有实施方式。
<110>庆熙大学校产学协力团
株式会社那笔制药
<120> 具有各种功能的新型乳酸杆菌及其用途
<130> PCT-16-130
<150> KR 10-2015-0130124
<151> 2015-09-15
<150> KR 10-2016-0005018
<151> 2016-01-15
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1132
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
agggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca acaaaatccg catggatttt 60
gtttgaaagg tggcttcggc tatcacttct ggatgatccc gcggcgtatt agttagttgg 120
tgaggtaaag gcccaccaag acgatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca 180
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 240
ggacgaaagt ctgatggagc aatgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact 300
ctgttgttaa agaagaacac ctttgagagt aactgttcaa gggttgacgg tatttaacca 360
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 420
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc 480
ggcttaaccg gagaagtgca tcggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga 540
actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 600
tgtctagtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac 660
cctgstagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt 720
gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 780
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga 840
agaaccttac caggtcttga catcttctgc caatcttaga gataagacgt tcccttcggg 900
gacagaatga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 960
tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat tcagttgggc actctggtga 1020
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1080
acctgggcta cacacgtgct acaatggacg gtacaacgag tcgcgaagtc gt 1132
<210> 2
<211> 1258
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
gtaacttgcc caagagactg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc ggataacaac 60
actagacgca tgtctagagt ttgaaagatg gttctgctat cactcttgga tggacctgcg 120
gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggca atgatgcata gccgagttga 180
gagactgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 240
agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg 300
tttcggctcg taaagctctg ttggtagtga agaaagatag aggtagtaac tggccttgat 360
ttgacggtaa ttccccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 420
aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gtgcaggcgg ttcaataagt 480
ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccggag aattgcatca gaaactgttg aacttgagtg 540
cagaagagga gagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 600
ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 660
cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggga 720
ggtttccgcc tctcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 780
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 840
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccagtgcaaa cctaagagat 900
taggtgttcc cttcggggac gctgagacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 960
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tcattagttg ccatcattaa 1020
gttgggcact ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1080
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagaag 1140
cgaacctgcg aaggcaagcg gatctcttaa agccgttctc agttcggact gtaggctgca 1200
actcgcctac acgaagctgg aatcgctagt aatcgcggaa cagtacgccg cggtgaat 1258
<210> 3
<211> 1348
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
cgggctttgc ttggtggtga gagtggcgaa cgggtgagta atgcgtgacc gacctgcccc 60
atacaccgga atagctcctg gaaacgggtg gtaatgccgg atgctccagt tgatcgcatg 120
gtcttctggg aaagctttcg cggtatggga tggggtcgcg tcctatcagc ttgacggcgg 180
ggtaacggcc caccgtggct tcgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacattg 240
ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg 300
cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatggaggc cttcgggttg taaacctctt 360
ttatcgggga gcaagcgaga gtgagtttac ccgttgaata agcaccggct aactacgtgc 420
cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagggc 480
tcgtaggcgg ttcgtcgcgt ccggtgtgaa agtccatcgc ttaacggtgg atccgcgccg 540
ggtacgggcg ggcttgagtg cggtagggga gactggaatt cccggtgtaa cggtggaatg 600
tgtagatatc gggaagaaca ccaatggcga aggcaggtct ctgggccgtt actgacgctg 660
aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720
gtggatgctg gatgtggggc ccgttccacg ggttccgtgt cggagctaac gcgttaagca 780
tcccgcctgg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa gaaattgacg ggggcccgca 840
caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tgggcttcac 900
atgttcccga cggtcgtaga gatacggctt cccttcgggg cgggttcaca ggtggtgcat 960
ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1020
gccccgtgtt gccagcggat tatgccggga actcacgggg gaccgccggg gttaactcgg 1080
aggaaggtgg ggatgacgtc agatcatcat gccccttacg tccagggctt cacgcatgct 1140
acaatggccg gtacaacggg atgcgacgcg gcgacgcgga gcggatccct gaaaaccggt 1200
ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagg cggagtcgct agtaatcgcg 1260
aatcagcaac gtcgcggtga atgcgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat 1320
gaaagtgggc agcacccgaa gccggtgg 1348
<210> 4
<211> 1421
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
ctggtattga ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt 60
aacacgtggg aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg 120
cataacaact tggaccgcat ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga 180
tggtcccgcg gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta 240
gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 360
tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac 420
tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg 540
gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg 600
aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 660
atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 720
agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct 780
aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa 960
atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt 1080
gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt 1200
acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat 1260
tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac 1380
acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc t 1421
<210> 5
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
tttacatttg attgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 60
gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 120
tttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 180
ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 240
tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 300
gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 360
tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag 420
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 480
ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 540
gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 600
ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 660
gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 720
ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 780
ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa 840
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa 900
gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg 960
acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020
cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag 1080
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1140
cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag 1200
ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1260
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320
caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa caccca 1356
<210> 6
<211> 1325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 60
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 120
ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 180
tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 240
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300
ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 360
taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 420
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 540
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 600
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 660
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 720
tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 780
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 840
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 960
cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1080
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1140
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1200
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1260
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcattccg cggtgaatac gttcccgggc 1320
cttgt 1325
<210> 7
<211> 1342
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
ggctttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga cctgccccat 60
acaccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat gctccagttg atcgcatggt 120
cttctgggaa agctttcgcg gtatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt gacggcgggg 180
taacggccca ccgtggcttc gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacattggg 240
actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 300
caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atggaggcct tcgggttgta aacctctttt 360
atcggggagc aagcgagagt gagtttaccc gttgaataag caccggctaa ctacgtgcca 420
gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg ttatcccgga attattgggc gtaaagggct 480
cgtaggcggt tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg 540
gtacgggcgg gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt 600
gtagatatcg ggaagaacac caatggcgaa ggcaggtctc tgggccgtta ctgacgctga 660
ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg 720
tggatgctgg atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat 780
cccgcctggg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag aaattgacgg gggcccgcac 840
aagcggcgga gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacct gggcttgaca 900
tgttcccgac ggtcgtagag atacggcttc ccttcggggc gggttcacag gtggtgcatg 960
gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg 1020
ccccgtgttg ccagcggatt atgccgggaa ctcacggggg accgccgggg ttaactcgga 1080
ggaaggtggg gatgacgtca gatcatcatg ccccttacgt ccagggcttc acgcatgcta 1140
caatggccgg tacaacggga tgcgacgcgg cgacgcggag cggatccctg aaaaccggtc 1200
tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaaggc ggagtcgcta gtaatcgcga 1260
atcagcaacg tcgcggtgaa tgcgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagtcatg 1320
aaagtgggca gcacccgaag cg 1342
<210> 8
<211> 1343
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
cggcttcggg tgctgcccac tttcatgact tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac 60
gcattcaccg cgacgttgct gattcgcgat tactagcgac tccgccttca cgcagtcgag 120
ttgcagactg cgatccgaac tgagaccggt tttcagggat ccgctccgcg tcgccgcgtc 180
gcatcccgtt gtaccggcca ttgtagcatg cgtgaagccc tggacgtaag gggcatgatg 240
atctgacgtc atccccacct tcctccgagt taaccccggc ggtcccccgt gagttcccgg 300
cataatccgc tggcaacacg gggcgagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc 360
tcacgacacg agctgacgac gaccatgcac cacctgtgaa cccgccccga agggaagccg 420
catctctacg accgtcggga acatgtcaag cccaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa 480
ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa tttctttgag ttttagcctt 540
gcggccgtac tccccaggcg ggatgcttaa cgcgttagct ccgacacgga acccgtggaa 600
cgggccccac atccagcatc caccgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agtaacggcc cagagacctg ccttcgccat 720
tggtgttctt cccgatatct acacattcca ccgttacacc gggaattcca gtctccccta 780
ccgcactcaa gcccgcccgt acccggcgcg gatccaccgt taagcgatgg actttcacac 840
cggacgcgac gaaccgccta cgagcccttt acgcccaata attccggata acgcttgcac 900
cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggt gcttattcaa cgggtaaact 960
cactctcgct tgctccccga taaaagaggt ttacaacccg aaggcctcca tccctcacgc 1020
ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag 1080
gagtctgggc cgtatctcag tcccaatgtg gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt 1140
cgaagccacg gtgggccgtt accccgccgt caagctgata ggacgcgacc ccatcccata 1200
ccgcgaaagc tttcccagaa gaccatgcga tcaactggag catccggcat taccacccgt 1260
ttccaggagc tattccggtg tatggggcag gtcggtcacg cattactcac ccgttcgcca 1320
ctctcaccac caagcaaagt ctc 1343

Claims (9)

1.保藏号为KCCM 11802P的长双歧杆菌LC67或其培养物。
2.包含保藏号为KCCM 11802P的长双歧杆菌LC67或其培养物的组合物在制备用于治疗一种或多种选自下组的疾病：肠损伤、肝损伤、过敏性疾病和炎性疾病的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种选自下组的乳酸菌：保藏号为KCCM 11762P的短乳酸杆菌CH23、保藏号为KCCM 11764P的长双歧杆菌CH57和保藏号为KCCM 11800P的植物乳酸杆菌LC5。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肠损伤为肠道通透性综合征。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肝损伤选自肝炎、脂肪肝或肝硬化。
6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述过敏性疾病选自过敏性皮炎、哮喘、咽炎或慢性皮炎。
7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述炎性疾病选自胃炎、胃溃疡、结肠炎或关节炎。
8.一种用于治疗一种或多种选自下组的疾病：肠损伤、肝损伤、过敏性疾病和炎性疾病的药物组合物，包含权利要求1所述的长双歧杆菌LC67或其培养物。
9.一种食品组合物，包含权利要求1所述的长双歧杆菌LC67或其培养物。
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