JP6664637B1 - ストレス低下用及び／又は体重回復用経口組成物、並びにプラズマローゲン含有組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】プラズマローゲンを含む菌体又はその処理物を含み、ストレス低下や体重減少の回復に用いられる経口組成物を提供すること。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有する組成物である。【選択図】図１
Description
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有する経口組成物や、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又はその処理物を用いたプラズマローゲン含有組成物の製造方法に関する。
図１３に示すように、グリセロリン脂質には、グリセロール骨格のｓｎ−１の結合の相違からジアシルリン脂質とエーテルリン脂質が存在する。さらに、エーテルリン脂質は、ｓｎ−１の結合様式にアルキル結合とアルケニル（ビニルエーテル）結合の２種類が存在しており、アルケニル結合しているものは、一般にプラズマローゲンとよばれている。それに対して、ジアシルリン脂質では、ｓｎ−１、ｓｎ−２共に脂肪酸がアシル結合している。図１３中、Ｘは、グリセロリン脂質のヘッドグループ（head group）で、エタノールアミン、コリン、セリンなどである。
ところで、プラズマローゲンは、ほとんどすべての哺乳動物組織にみられ、哺乳動物におけるリン脂質の約２０％を占めているが、その存在量は各組織で異なっている。プラズマローゲンは、脳、心臓、骨格筋、腎、白血球（免疫細胞）、網膜、精子などに多く、肝臓には少ない。
哺乳動物では、プラズマローゲンは、細胞膜の構成成分として存在しているだけでなく、エイコサノイドなどの細胞における２次伝達物質(second messenger)の貯蔵庫としての機能、細胞膜におけるイオンの輸送機能、コレステロールの細胞からの排出機能、細胞膜の融合機能、細胞膜における抗酸化作用の他、シグナル伝達にも関与することなどが認められている。
このプラズマローゲンは、非脊椎動物、脊椎動物には広く存在しているが、真菌や植物細胞では、プラズマローゲンの存在は確認されていない。プラズマローゲンは、いくつかの偏性嫌気性菌にみられるが、通性嫌気性細菌や好気性細菌には見られない（非特許文献１参照）。
一方、プラズマローゲンは、ヒトにおける種々の病気（疾患）との関係も報告されている。例えば、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、メタボリック症候群、うつ病、炎症性腸症候群あるいは種々の癌などで、血漿や赤血球膜中のプラズマローゲンの異常が示唆されている。実際、本発明者らは、アルツハイマー型認知症患者約３００人に対して、２重盲検試験で、精製したプラズマローゲンの投与を行い、プラズマローゲンの経口的服用の効果を認めた（非特許文献２参照）。したがって、今後、ヒトの病気の予防・治療や健康維持促進のためにプラズマローゲンの需要が増加していくことが予想される。
Goldfine H, Progress Lipid Res, 49,493-498,2010
EBiomedicine,17,199-205,2017
本発明の課題は、プラズマローゲンを含む菌体又はその処理物を含み、ストレス低下及び／又は体重減少の回復に用いられる経口組成物を提供することにある。また、菌体からプラズマローゲンを取得する方法を提供することにある。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）及びビフィドバクテリウム・アニマリス（B.animalis）は、哺乳動物の腸内細菌叢において最も重要なプロバイオティクス細菌であると考えられているが、ビフィドバクテリウムに、プラズマローゲンが存在することは報告されていない。
本発明者らは、腸内細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガムに、プラズマローゲン（カルジオリピンプラズマローゲン）が存在することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りのものである。
［１］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有し、ストレス低下作用を有することを特徴とするストレス低下用経口組成物。
［２］ カルジオリピンプラズマローゲンを含有することを特徴とする［１］記載のストレス低下用経口組成物。
［３］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有し、薬物投与による体重減少からの回復作用を有することを特徴とする体重回復用経口組成物。
［４］ カルジオリピンプラズマローゲンを含有することを特徴とする［３］記載の体重回復用経口組成物。
［５］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体からプラズマローゲンを得るプラズマローゲン取得工程を有することを特徴とするプラズマローゲン含有組成物の製造方法。
［６］ 前記プラズマローゲンが、カルジオリピンプラズマローゲンを含むことを特徴とする［５］記載のプラズマローゲン含有組成物の製造方法。
［１］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有し、ストレス低下作用を有することを特徴とするストレス低下用経口組成物。
［２］ カルジオリピンプラズマローゲンを含有することを特徴とする［１］記載のストレス低下用経口組成物。
［３］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体又はその処理物を含有し、薬物投与による体重減少からの回復作用を有することを特徴とする体重回復用経口組成物。
［４］ カルジオリピンプラズマローゲンを含有することを特徴とする［３］記載の体重回復用経口組成物。
［５］ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体からプラズマローゲンを得るプラズマローゲン取得工程を有することを特徴とするプラズマローゲン含有組成物の製造方法。
［６］ 前記プラズマローゲンが、カルジオリピンプラズマローゲンを含むことを特徴とする［５］記載のプラズマローゲン含有組成物の製造方法。
本発明の経口組成物は、ストレス低下や体重減少の回復に有用である。
本発明の経口組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）の菌体又はその処理物を含有することを特徴とする。ビフィドバクテリウム・ロンガムはビフィズス菌の一種であり、人体によい影響を与える微生物、すなわち、プロバイオティクスとして知られているが、この菌体にプラズマローゲンが存在することは知られていなかった。このビフィドバクテリウム・ロンガムに存在するカルジオリピンプラズマローゲン等のプラズマローゲンは、ストレスを低下させる効果や、薬物投与（抗生物質投与）に起因する体重減少を回復する効果を有する。なお、同じプロバイオティクスであり、同じビフィドバクテリウム属であるビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）では、プラズマローゲンは同定されなかった。
ビフィドバクテリウム・ロンガムは、市販のヨーグルト等から培養することができる。培養する培地としては、特に制限はなく、通常乳酸菌の培養に使用される培地や、その改変培地を適宜選択して用いることができる。
本発明の経口組成物に含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。
また、本発明の経口組成物においては、菌体そのものの他、菌体に対して溶媒抽出処理を施した抽出物や、菌体を破砕した破砕物等の処理物を用いることができる。処理物を用いることにより、プラズマローゲンを高濃度に含む経口組成物とすることができる。
溶媒抽出に用いる溶媒としては、水、有機溶媒、これらの混合物を用いることができ、有機溶媒としては、エタノール、ｎ−ヘキサン、アセトン等を例示することができる。抽出溶媒を用いて抽出された抽出物は、液状のまま、又は濃縮若しくは希釈して、液状、ゲル状、ペースト状の形態で用いることができる。さらに、これを乾燥した乾燥物として用いることができる。乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、流動乾燥等の当業者が通常用いる方法により行うことができる。
また、破砕方法としては、機械的に破砕する方法、超音波を用いた破砕方法等を挙げることができる。
本発明の経口組成物は、例えば、医薬品（医薬部外品を含む）や、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の所定機関より効能の表示が認められた機能性食品などのいわゆる健康食品等として用いることができる。
本発明のストレス低下用経口組成物としては、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又はその処理物を含有し、ストレス低下に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、本発明に係る製品の本体、包装、説明書、宣伝物（広告媒体）のいずれかに、ストレス低下機能がある旨を表示したものが本発明の範囲に含まれる。なお、一般的な食品であっても、ストレス低下の用途を示唆して製造販売されるものは本発明の範囲に含まれる。
具体的に、いわゆる健康食品においては、「ストレスから守る」、「ストレスに負けない」、「ストレスを低減する」「ストレス社会に」、「ストレス緩和」、「ストレスケア」等を表示したものを例示することができる。
同様に、本発明の体重回復用経口組成物としては、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又はその処理物を含有し、体重回復に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、本発明に係る製品の本体、包装、説明書、宣伝物（広告媒体）のいずれかに、体重回復機能がある旨を表示したものが本発明の範囲に含まれる。なお、一般的な食品であっても、体重回復の用途を示唆して製造販売されるものは本発明の範囲に含まれる。
具体的に、いわゆる健康食品においては、「体重の維持に」、「体重の回復に」等を表示したものを例示することができる。
本発明の経口組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又はその処理物の他に、ビタミン、ミネラル等の他の成分を配合してもよい。
また、本発明経口組成物の形態としては、例えば、錠状、カプセル状、粉末状、顆粒状、液状、粒状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、ペースト状、クリーム状、カプレット状、ゲル状、チュアブル錠状、スティック状等を挙げることができる。
本発明のプラズマローゲン含有組成物の製造方法としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体からプラズマローゲンを得るプラズマローゲン取得工程を有することを特徴とする。
菌体からのプラズマローゲンの取得方法としては、上記のような溶媒抽出や破砕といった処理方法を挙げることができる。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムを培養した培養液から得ることもできる。
本発明の製造方法により得られる組成物に含まれるプラズマローゲンとしては、例えば、下記に示すカルジオリピンプラズマローゲンを挙げることができる。
プラズマローゲンは、ヒトへの有用な各種作用を有することが知られており、製造されたプラズマローゲン含有組成物は、食品、医薬品、化粧品等の原料として用いることできる。
［実施例１］
ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）に、プラズマローゲンが存在することを以下の方法により確認した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）に、プラズマローゲンが存在することを以下の方法により確認した。
［試験］
＜プラズマローゲンの同定法＞
ホスホリパーゼA1（PLA1）はグリセロリン脂質のsn-1位のアシル結合を加水分解するが、リン脂質のアルケニルおよびアルキル結合には作用しない。一方、グリセロリン脂質のアルケニル結合（ビニルエーテル結合）のみが酸加水分解を受けやすい。したがって、PLA1による加水分解と酸加水分解との組み合わせによって、アルキルアシルおよびアルケニルアシルリン脂質を含むグリセロリン脂質のサブクラスを同定することが可能である。プラズマローゲンの酸加水分解によって、リゾリン脂質とアルデヒドが生成し、リゾリン脂質はHPLC-ELSD法によって検出することができ、アルデヒドはDNPHで標識し、HPLC-UVおよび/またはESI検出器によって検出した。
＜プラズマローゲンの同定法＞
ホスホリパーゼA1（PLA1）はグリセロリン脂質のsn-1位のアシル結合を加水分解するが、リン脂質のアルケニルおよびアルキル結合には作用しない。一方、グリセロリン脂質のアルケニル結合（ビニルエーテル結合）のみが酸加水分解を受けやすい。したがって、PLA1による加水分解と酸加水分解との組み合わせによって、アルキルアシルおよびアルケニルアシルリン脂質を含むグリセロリン脂質のサブクラスを同定することが可能である。プラズマローゲンの酸加水分解によって、リゾリン脂質とアルデヒドが生成し、リゾリン脂質はHPLC-ELSD法によって検出することができ、アルデヒドはDNPHで標識し、HPLC-UVおよび/またはESI検出器によって検出した。
＜被験菌体＞
本発明の菌体であるB.longumとしては、以下のものを用いた。
（１）森永乳業株式会社製ヨーグルトから培養したB.longum BB536
（２）理研バイオリソース研究センター（RIKEN BRC）より入手したB.longum subsp Infantis JCM 1210
（３）RIKEN BRCより入手したB.longum subsp.suis JCM 1269
（４）RIKEN BRCより入手したB.longum subsp.longum JCM 1217
本発明の菌体であるB.longumとしては、以下のものを用いた。
（１）森永乳業株式会社製ヨーグルトから培養したB.longum BB536
（２）理研バイオリソース研究センター（RIKEN BRC）より入手したB.longum subsp Infantis JCM 1210
（３）RIKEN BRCより入手したB.longum subsp.suis JCM 1269
（４）RIKEN BRCより入手したB.longum subsp.longum JCM 1217
比較として、以下のビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）を用いた。
（５）RIKEN BRCより入手したB.animalis subsp.lactis JCM10602
（６）RIKEN BRCより入手したB. animalis subsp. animalis JCM1190
（５）RIKEN BRCより入手したB.animalis subsp.lactis JCM10602
（６）RIKEN BRCより入手したB. animalis subsp. animalis JCM1190
また、参考として、プラズマローゲンが存在することが公知の（７）American Type Culture Collection（ATCC）のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）（ATCC 6015）を用いた。
＜被験菌体（バクテリア）の培養＞
上記被験菌体（１）〜（６）を、AnaeroPack-Anaero（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気的条件下で、TOSプロピオン酸寒天培地（株式会社ヤクルト本社）で40℃で2日間培養した。また、被験菌体（７）のClostridium beijerinckii（ATCC 6015）は、AnaeroPak-Anaeroを用いて1.5％寒天を含む強化クロストリジウム培地（Oxoid CMO149）により37℃で2日間培養した。
上記被験菌体（１）〜（６）を、AnaeroPack-Anaero（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気的条件下で、TOSプロピオン酸寒天培地（株式会社ヤクルト本社）で40℃で2日間培養した。また、被験菌体（７）のClostridium beijerinckii（ATCC 6015）は、AnaeroPak-Anaeroを用いて1.5％寒天を含む強化クロストリジウム培地（Oxoid CMO149）により37℃で2日間培養した。
＜被験菌体（バクテリア）からの脂質抽出及びリン脂質の検出＞
培養プレート上の細菌のコロニーをこすり落とすことによってガラス管に集め、細菌を遠心分離によって集めた。
まず、1 mLの水をペレットに添加し、30秒間超音波処理し、3.75 mLのクロロホルム／メタノール（1:2、v / v）を添加した。激しく混合した後、チューブを室温に30分間置いた。1.25 mLのクロロホルムを加え、次いで1.25 mLの水を加えた。短時間の遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し、残った水層を1 mLのクロロホルムで再抽出した。合わせたクロロホルム層を窒素ガス下減圧乾燥し、ヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）に再懸濁した後、HPLC - ELSDシステムに注入した。
培養プレート上の細菌のコロニーをこすり落とすことによってガラス管に集め、細菌を遠心分離によって集めた。
まず、1 mLの水をペレットに添加し、30秒間超音波処理し、3.75 mLのクロロホルム／メタノール（1:2、v / v）を添加した。激しく混合した後、チューブを室温に30分間置いた。1.25 mLのクロロホルムを加え、次いで1.25 mLの水を加えた。短時間の遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し、残った水層を1 mLのクロロホルムで再抽出した。合わせたクロロホルム層を窒素ガス下減圧乾燥し、ヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）に再懸濁した後、HPLC - ELSDシステムに注入した。
《ＨＰＬＣ》
カラム；Lichrosphere DIOL（250x3mm ,5μm、メルク社）
移動相Ａ；ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（82:17:1）+ 0.08%トリエチルアミン
移動相Ｂ；イソプロパノール／水／酢酸（85:14:1）+ 0.08%トリエチルアミン
流量0.8mL／分、カラム温度50℃で、下記のグラジエントで行った。
カラム；Lichrosphere DIOL（250x3mm ,5μm、メルク社）
移動相Ａ；ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（82:17:1）+ 0.08%トリエチルアミン
移動相Ｂ；イソプロパノール／水／酢酸（85:14:1）+ 0.08%トリエチルアミン
流量0.8mL／分、カラム温度50℃で、下記のグラジエントで行った。
分 Ａ（％） Ｂ（％）
0 96 4
21 63 37
25 15 85
26 15 85
29 96 4
35 96 4
0 96 4
21 63 37
25 15 85
26 15 85
29 96 4
35 96 4
検出は、蒸発光散乱器（ＥＬＳＤ）で行った。
＜ホスホリパーゼＡ１（PLA 1）による全脂質の加水分解処理によるリン脂質の変化＞
総脂質の一定分量をPLA1で加水分解した。25％ PLA1を含有する100 mg / mLの酵素調製物を0.1 Mクエン酸緩衝液（pH 4.5）で調製し、1 mLの酵素溶液を総脂質抽出物に添加した。超音波浴で乳化した後、懸濁液を45℃で60分間インキュベートした。脂質を上記のクロロホルム−メタノール法で抽出し、合わせたクロロホルム層を窒素ガス下で乾燥した。脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）で再調製し、HPLC - ELSDシステムに注入した。
なお、PLA1として、Aspergillus oryzae由来のPLA1（Phosphatidate 1-acylhydrolase, E.C. 3.1.1.32）（三菱ケミカルフーズ株式会社社製）を用いた。酵素製剤は、25％のPLA1および75％のデキストリンからなり、その酵素活性は10,000〜13,000 u/ gである。
総脂質の一定分量をPLA1で加水分解した。25％ PLA1を含有する100 mg / mLの酵素調製物を0.1 Mクエン酸緩衝液（pH 4.5）で調製し、1 mLの酵素溶液を総脂質抽出物に添加した。超音波浴で乳化した後、懸濁液を45℃で60分間インキュベートした。脂質を上記のクロロホルム−メタノール法で抽出し、合わせたクロロホルム層を窒素ガス下で乾燥した。脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）で再調製し、HPLC - ELSDシステムに注入した。
なお、PLA1として、Aspergillus oryzae由来のPLA1（Phosphatidate 1-acylhydrolase, E.C. 3.1.1.32）（三菱ケミカルフーズ株式会社社製）を用いた。酵素製剤は、25％のPLA1および75％のデキストリンからなり、その酵素活性は10,000〜13,000 u/ gである。
＜酸加水分解処理によるリン脂質（プラズマローゲン）の変化＞
アルケニルアシルリン脂質（プラズマローゲン）の酸加水分解は、２，４‐ジニトロフェニルヒドラジン−塩酸塩溶液（DNPH-HCl溶液）によって行われた。なお、DNPH-HCl溶液はSigma-Aldrich社から購入したものを用いた。
PLA1加水分解後に、0.5 mLのDNPH - HCl溶液を乾燥エーテルリン脂質に添加した。室温で20分後、加水分解されたリン脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）で抽出し、クロロホルム層を窒素ガス下で乾燥した。乾燥した脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2 v / v）で再調製し、一定分量をHPLC - ELSDに注入した。
アルケニルアシルリン脂質（プラズマローゲン）の酸加水分解は、２，４‐ジニトロフェニルヒドラジン−塩酸塩溶液（DNPH-HCl溶液）によって行われた。なお、DNPH-HCl溶液はSigma-Aldrich社から購入したものを用いた。
PLA1加水分解後に、0.5 mLのDNPH - HCl溶液を乾燥エーテルリン脂質に添加した。室温で20分後、加水分解されたリン脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2、v / v）で抽出し、クロロホルム層を窒素ガス下で乾燥した。乾燥した脂質をヘキサン／イソプロパノール（3:2 v / v）で再調製し、一定分量をHPLC - ELSDに注入した。
また、HCl-DNPH加水分解後の一定分量の脂質をHPLCに注入し、アルデヒドの生成を確認した（図８）。
HPLCシステムは、４極ポンプ、オートサンプラー、ダイオードアレイ検出器からなるAgilent 1200シリーズであり、システムはESI検出器（Agilent 6270）に接続し、356 nmのUVによって検出した。ESI検出はネガティブモードで行った。カラムはXBridge BEA C18（3.0×150、2.5μm、Waters Co）であった。流速は0.3 mL / minであり、カラム温度は35℃であった。 移動相Aはアセトニトリルであり、移動相Bは5 mM酢酸アンモニウムであった。グラジエント溶出を行い、100％Aを5分で90％Ａまで直線的に減少させ、30分まで90％ Aを維持した。
HPLCシステムは、４極ポンプ、オートサンプラー、ダイオードアレイ検出器からなるAgilent 1200シリーズであり、システムはESI検出器（Agilent 6270）に接続し、356 nmのUVによって検出した。ESI検出はネガティブモードで行った。カラムはXBridge BEA C18（3.0×150、2.5μm、Waters Co）であった。流速は0.3 mL / minであり、カラム温度は35℃であった。 移動相Aはアセトニトリルであり、移動相Bは5 mM酢酸アンモニウムであった。グラジエント溶出を行い、100％Aを5分で90％Ａまで直線的に減少させ、30分まで90％ Aを維持した。
［結果］
＜（１）B.longum BB536＞
図１（上）に示すように、B.longum BB536では、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。
また、図１（中）に示すように、PLA1による全リン脂質の加水分解後は、ほとんどのリン脂質がクロマトグラム上に残った。これは、主要リン脂質のほとんどがエーテルリン脂質であることを示す。
また、図１（下）に示すように、PLA１加水分解リン脂質をDNPH−HCl溶液で処理すると、クロマトグラム上の主ピークが消失した。これは、B.longum BB536のリン脂質のほとんどがsn-1位にビニルエーテル結合を有していることを示す。さらに、リゾリン脂質ピーク（リゾ-p-脂質）の出現が見られた。これもまた、sn-1位にビニルエーテル結合が存在することを示す。
さらに、図８に示すように、DNPH−HCl溶液で処理したリン脂質には、アルデヒドが検出された。これもまた、プラズマローゲンの存在を示す。
以上のとおり、B.longum BB536には、カルジオリピンプラズマローゲンをはじめとするプラズマローゲンが存在していることが示された。
＜（１）B.longum BB536＞
図１（上）に示すように、B.longum BB536では、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。
また、図１（中）に示すように、PLA1による全リン脂質の加水分解後は、ほとんどのリン脂質がクロマトグラム上に残った。これは、主要リン脂質のほとんどがエーテルリン脂質であることを示す。
また、図１（下）に示すように、PLA１加水分解リン脂質をDNPH−HCl溶液で処理すると、クロマトグラム上の主ピークが消失した。これは、B.longum BB536のリン脂質のほとんどがsn-1位にビニルエーテル結合を有していることを示す。さらに、リゾリン脂質ピーク（リゾ-p-脂質）の出現が見られた。これもまた、sn-1位にビニルエーテル結合が存在することを示す。
さらに、図８に示すように、DNPH−HCl溶液で処理したリン脂質には、アルデヒドが検出された。これもまた、プラズマローゲンの存在を示す。
以上のとおり、B.longum BB536には、カルジオリピンプラズマローゲンをはじめとするプラズマローゲンが存在していることが示された。
＜（２）B.longum subsp Infantis JCM 1210＞
図２（上）に示すように、B.longum subsp Infantis JCM 1210では、B.longum BB536同様、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。また、図２（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp Infantis JCM 1210には、B.longum BB536同様、プラズマローゲンが存在していることが示された。
図２（上）に示すように、B.longum subsp Infantis JCM 1210では、B.longum BB536同様、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。また、図２（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp Infantis JCM 1210には、B.longum BB536同様、プラズマローゲンが存在していることが示された。
＜（３）B.longum subsp.suis JCM 1269＞
図３（上）に示すように、B.longum subsp.suis JCM 1269では、B.longum BB536同様、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。また、図３（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp.suis JCM 1269には、B.longum BB536同様、プラズマローゲンが存在していることが示された。
図３（上）に示すように、B.longum subsp.suis JCM 1269では、B.longum BB536同様、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。また、図３（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp.suis JCM 1269には、B.longum BB536同様、プラズマローゲンが存在していることが示された。
＜（４）B.longum subsp.longum JCM 1217＞
図４（上）に示すように、B.longum subsp.longum JCM 1217の主要なリン脂質は、ホスファチジン酸（PA）であった。他のB.longumと主要リン脂質は異なるものの、図４（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp.longum JCM 1217には、プラズマローゲンが存在していることが示された。
図４（上）に示すように、B.longum subsp.longum JCM 1217の主要なリン脂質は、ホスファチジン酸（PA）であった。他のB.longumと主要リン脂質は異なるものの、図４（中）（下）及び図８に示すように、B.longum subsp.longum JCM 1217には、プラズマローゲンが存在していることが示された。
＜（５）B.animalis subsp.lactis JCM10602、（６）B. animalis subsp. animalis JCM1190＞（比較例）
図５及び図６に示すように、PLA1による全リン脂質の加水分解後、全てのピークの消失を引き起こした。これは、B. animalisの全てのリン脂質がジアシルリン脂質であり、エーテルリン脂質（プラズマローゲン）でないことが示す。なお、図８に示すように、DNPH−HCl溶液で処理したものも、アルデヒドが検出されなかった。
図５及び図６に示すように、PLA1による全リン脂質の加水分解後、全てのピークの消失を引き起こした。これは、B. animalisの全てのリン脂質がジアシルリン脂質であり、エーテルリン脂質（プラズマローゲン）でないことが示す。なお、図８に示すように、DNPH−HCl溶液で処理したものも、アルデヒドが検出されなかった。
＜（７）Clostridium beijerinckii（ATCC 6015）＞（参考例）
図７に示すように、Clostridium beijerinckii（ATCC 6015）は、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。PLA 1による処理及びDNPH-HClによる処理による結果は、B.longum BB536と同様であり、本発明のプラズマローゲンの確認方法の正当性が裏付けられた。
図７に示すように、Clostridium beijerinckii（ATCC 6015）は、ホスファチジルグリセロール（PG）とカルジオリピン（CL）が最も多いリン脂質であった。PLA 1による処理及びDNPH-HClによる処理による結果は、B.longum BB536と同様であり、本発明のプラズマローゲンの確認方法の正当性が裏付けられた。
［実施例２］
（１）B.longum BB536のプラズマローゲンの詳細を検討した。
ESIにより、B.longum BB536のsn-1位の脂肪族アルコール種を調査した。その結果を図９に示す。図９に示すように、B.longum BB536では、偶数の脂肪族アルデヒドの他、奇数の脂肪族アルデヒド（C19：0）も観察された。
また、B.longum BB536のカルジオリピンプラズマローゲンの存在をネガティブモードのESIにより確認した。その結果を図１０に示す。図１０（ａ）に示すように、HCl処理後にピークは消失し、これはピークがプラズマローゲンであることを示している。図１０（ｂ）は、B.longum BB536のカルジオリピンプラズマローゲンの存在をLC/MS/MSにより確認したもので、例として下記に示すカルジオリピンプラズマローゲンを挙げることができる。
（１）B.longum BB536のプラズマローゲンの詳細を検討した。
ESIにより、B.longum BB536のsn-1位の脂肪族アルコール種を調査した。その結果を図９に示す。図９に示すように、B.longum BB536では、偶数の脂肪族アルデヒドの他、奇数の脂肪族アルデヒド（C19：0）も観察された。
また、B.longum BB536のカルジオリピンプラズマローゲンの存在をネガティブモードのESIにより確認した。その結果を図１０に示す。図１０（ａ）に示すように、HCl処理後にピークは消失し、これはピークがプラズマローゲンであることを示している。図１０（ｂ）は、B.longum BB536のカルジオリピンプラズマローゲンの存在をLC/MS/MSにより確認したもので、例として下記に示すカルジオリピンプラズマローゲンを挙げることができる。
［実施例３］
＜抗ストレス試験＞
幼若マウスを用いて、（１）B.longum BB536の抗生物質誘発ストレスに与える影響を調査した。
試験は、３ヶ月齢のB6C3F1マウス（雄）に、抗生物質と共に、B.longum BB536を１週間毎日経口投与した。１週間後にマウスの血清をＥＬＩＳＡアッセイにかけてコルチゾール（ストレスホルモン）レベルを調べた。その結果を図１１に示す。なお、controlは、抗生物質及びB.longum BB536の両者を投与しないものであり、これを基準とした。Abは、抗生物質のみを投与したものであり、Ab＋Plsは、抗生物質及びプラズマローゲン（エタノールアミン型及びコリン型の混合物）を投与したものである。
＜抗ストレス試験＞
幼若マウスを用いて、（１）B.longum BB536の抗生物質誘発ストレスに与える影響を調査した。
試験は、３ヶ月齢のB6C3F1マウス（雄）に、抗生物質と共に、B.longum BB536を１週間毎日経口投与した。１週間後にマウスの血清をＥＬＩＳＡアッセイにかけてコルチゾール（ストレスホルモン）レベルを調べた。その結果を図１１に示す。なお、controlは、抗生物質及びB.longum BB536の両者を投与しないものであり、これを基準とした。Abは、抗生物質のみを投与したものであり、Ab＋Plsは、抗生物質及びプラズマローゲン（エタノールアミン型及びコリン型の混合物）を投与したものである。
図１１に示すように、抗生物質と共にB.longum BB536を投与することにより、プラズマローゲン（エタノールアミン型及びコリン型の混合物）を投与した場合と同様に、コルチゾールレベルがコントロールと同程度まで低下しており、ストレスが効果的に低下したことがわかる。
［実施例４］
＜体重回復試験＞
幼若マウスを用いて、（１）B.longum BB536の抗生物質誘発体重減少に与える影響を調査した。
試験は、３ヶ月齢のB6C3F1マウス（雄）に、抗生物質と共に、B.longum BB536を６日間毎日経口投与した後に、７日目に抗生物質の投与を中止した。試験開始から８日目まで定期的にマウスの体重を測定した。その結果を図１２に示す。
＜体重回復試験＞
幼若マウスを用いて、（１）B.longum BB536の抗生物質誘発体重減少に与える影響を調査した。
試験は、３ヶ月齢のB6C3F1マウス（雄）に、抗生物質と共に、B.longum BB536を６日間毎日経口投与した後に、７日目に抗生物質の投与を中止した。試験開始から８日目まで定期的にマウスの体重を測定した。その結果を図１２に示す。
図１２に示すように、抗生物質と共にB.longum BB536を投与することにより、プラズマローゲン（エタノールアミン型及びコリン型の混合物）を投与した場合と同様に、抗生物質投与による体重減少の効果的な回復がみられた。
本発明の経口組成物は、健康食品等として用いることができるものであり、産業上有用である。
Claims (1)
- ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体からカルジオリピンプラズマローゲンを得ることを特徴とするカルジオリピンプラズマローゲンの取得方法。
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| JP2019145860A JP6664637B1 (ja) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | ストレス低下用及び／又は体重回復用経口組成物、並びにプラズマローゲン含有組成物の製造方法 |
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