JP2024059594A - プラズマローゲン含有組成物、プラズマローゲンの製造方法、プラズマローゲン合成促進用培地、抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物 - Google Patents

プラズマローゲン含有組成物、プラズマローゲンの製造方法、プラズマローゲン合成促進用培地、抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物 Download PDF

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志郎 馬渡
Shiro Mawatari
紗明 庭瀬
Shamim NIWASE
雅則 本庄
Masanori Honjo
啓一郎 今泉
Keiichiro Imaizumi
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Yasunori Nakayama
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Abstract

【課題】ビフィドバクテリウム属に属する菌を用いて効率よく得ることができるプラズマローゲン含有組成物を提供する。【解決手段】プラズマローゲン含有組成物は、ビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体又はその処理物を含む。菌は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される。【選択図】図１

Description

本発明は、プラズマローゲン含有組成物、プラズマローゲンの製造方法、プラズマローゲン合成促進用培地、抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物に関する。
プラズマローゲンは、抗酸化作用を有するリン脂質の一種で、グリセロリン脂質の一つである。プラズマローゲンは哺乳動物の全ての組織に存在し、人体のリン脂質の約１８％を占める。プラズマローゲンの多くは、ドコサヘキサエン酸及びアラキドン酸等の多価不飽和脂肪酸と結合しているため、多価不飽和脂肪酸の貯蔵、及びこれら多価不飽和脂肪酸から産生されるプロスタグランジン及びロイコトリエン等の細胞間シグナルの２次メッセンジャーの放出等に関与する。さらにプラズマローゲンは、細胞融合及びイオン移送等に関与している。プラズマローゲンのビニルエーテル結合（アルケニル結合）が特に酸化ストレスに敏感であるため、プラズマローゲンは細胞の抗酸化機能も果たしている。
プラズマローゲンは神経新生の促進作用、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）による神経炎症の抑制作用、及び脳内アミロイドβ（Ａβ）タンパクの蓄積の抑制作用等を有することが知られている。例えば、特許文献１には、プラズマローゲンを含む抗中枢神経系炎症剤が開示されている。
プラズマローゲンは、認知症、パーキンソン病、うつ病及び統合失調症等の脳神経病の他、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常において減少していることが知られている。減少しているプラズマローゲンを外的に補充することにより、それら疾患の予防及び改善効果が期待できると考えられる。したがって、今後、疾患の予防及び治療、あるいは健康維持のためにプラズマローゲンの需要が高まることが予想される。
プラズマローゲンは、非脊椎動物及び脊椎動物には広く存在しているが、真菌及び植物細胞では確認されていない。細菌では、例えば、特許文献２に開示されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のいくつかの偏性嫌気性菌によるプラズマローゲンの合成が報告されている。
国際公開第２０１２／０３９４７２号 国際公開第２０２１／０２４８７２号
細菌によってプラズマローゲンを生合成できれば、細菌の培養によって効率よくプラズマローゲンを得ることができる。プラズマローゲンを合成可能な細菌は十分に探索されていないうえ、細菌によって合成されるプラズマローゲンの機能についても不明な点が多い。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ビフィドバクテリウム属に属する菌を用いて効率よく得ることができるプラズマローゲン含有組成物を提供することを目的とする。本発明は、ビフィドバクテリウム属に属する菌を用いてプラズマローゲンを効率よく得ることができるプラズマローゲンの製造方法及びプラズマローゲン合成促進用培地を提供することを目的とする。また、本発明は、ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを有効成分とする抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物を提供することを目的とする。
本発明者は、ビフィドバクテリウム属に属する菌をスクリーニングすることで、特定のビフィドバクテリウム属に属する菌がプラズマローゲンを合成することを見いだし、本発明を完成させた。
本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン含有組成物は、
ビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体又はその処理物を含み、
前記菌は、
ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される。
本発明の第２の観点に係るプラズマローゲンの製造方法は、
ビフィドバクテリウム属に属する菌を培養する培養ステップと、
前記菌の菌体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含み、
前記菌は、
ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される。
前記培養ステップでは、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で、前記菌を培養する、
こととしてもよい。
本発明の第３の観点に係るプラズマローゲン合成促進用培地は、
硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含み、
ビフィドバクテリウム属に属する菌の培養に使用される。
本発明の第４の観点に係るプラズマローゲンの製造方法は、
硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で、ビフィドバクテリウム属に属する菌を培養する培養ステップと、
前記菌の菌体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む。
本発明の第５の観点に係る抗炎症剤又は抗炎症用経口組成物は、
ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む。
本発明の第６の観点に係る認知機能改善剤又は認知機能改善用経口組成物は、
ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む。
本発明の第７の観点に係る神経細胞死抑制剤又は神経細胞死抑制用経口組成物は、
ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む。
本発明に係るプラズマローゲン含有組成物は、ビフィドバクテリウム属に属する菌を用いて効率よく得ることができる。本発明に係るプラズマローゲンの製造方法及びプラズマローゲン合成促進用培地によれば、ビフィドバクテリウム属に属する菌を用いてプラズマローゲンを効率よく得ることができる。また、本発明によれば、ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを有効成分とする抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物が提供される。
実施例１においてビフィドバクテリウム属に属する菌（ビフィズス菌）から抽出した総脂質に係るクロマトグラムを示す図である。 実施例１においてビフィズス菌から抽出し、２，４－ジニトロフェニルヒドラジン－塩酸塩（ＤＮＰＨ－ＨＣｌ）処理した総脂質に係るクロマトグラムを示す図である。 実施例１においてビフィズス菌から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１２７５Ｔ及び７００２）から抽出した総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラム及びアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１２７３及び１１３４２）から抽出した総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラム及びアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．７１３９）から抽出した総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラム及びアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１２７５Ｔ）から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．７００２）から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１２７３）から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１１３４２）から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例２においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．７１３９）から抽出したアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。 実施例３においてビフィズス菌（ＪＣＭ Ｎｏ．１１３４２）から抽出した総脂質（Ａ）、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）処理後のサンプル（Ｂ）及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理後のサンプル（Ｃ）に係るクロマトグラムを示す図である。 試験例１に係るＩＬ－１βの発現量を示す図である。 試験例１に係る核内のｐ６５タンパク質の相対量を示す図である。 試験例２に係る細胞内の総プラズマローゲン量を示す図である。 試験例３に係る培地中のＩＬ－１βの濃度を示す図である。 試験例３に係る培地中のＴＮＦ－αの濃度を示す図である。 試験例３に係るＮＦ－κＢの相対的な活性を示す図である。 （Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）はそれぞれ試験例４に係る培地中のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６の濃度を示す図である。 試験例５に係るリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の相対発現量を示す図である。 試験例５に係るＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示す図である。 （Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれ試験例６に係るＥＲＫに対するｐＥＲＫの相対的な発現量及びＡＫＴ１に対するリン酸化ＡＫＴ１（ｐＡＫＴ１）の相対的な発現量を示す図である。
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
（実施の形態１）
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物は、ビフィズス菌の菌体又はその処理物を含む。ビフィズス菌の種としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）等が挙げられる。これらの種に属する亜種も本実施の形態に係るビフィズス菌に包含され、例えば、亜種としては、Bifidobacterium longum subsp. infantis、Bifidobacterium longum subsp. longum及びBifidobacterium longum subsp. suis等が挙げられる。以下では“Bifidobacterium”を“B.”と称することがある。
好ましくは、ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ブレーベからなる群から選択される。
菌体は、培養後の培養液の遠心分離による沈殿として得ることができる。菌体の処理物は、例えば、凍結乾燥させた菌体、アセトンで乾燥させた菌体、菌体に対して溶媒抽出処理を施した抽出物及び菌体又は乾燥菌体を超音波等で破砕した破砕物等、菌体に何らかの処理を加えて得られる菌体、菌体由来の、又は菌体の一部を含む組成物である。溶媒抽出に用いる溶媒としては、水、有機溶媒及びこれらの混合物を用いることができる。有機溶媒としては、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びこれらの混合溶液等が例示される。抽出溶媒を用いて抽出された抽出物は、液状のまま、又は濃縮若しくは希釈して、液状、ゲル状あるいはペースト状の形態で用いることができる。さらに、これを乾燥した乾燥物として用いることができる。乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥及び流動乾燥等の公知の方法で行うことができる。
下記実施例に示すように、上記ビフィズス菌はプラズマローゲンを合成する。このため、上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物はプラズマローゲンを含む。プラズマローゲンは、グリセロール骨格のｓｎ－１位にビニルエーテル結合を有し、ｓｎ－２位にエステル結合を有することで特徴づけられるグリセロリン脂質に特有のサブクラスに属する。本実施の形態におけるプラズマローゲンは、一般にプラズマローゲンに分類されるグリセロリン脂質であれば特に制限されない。プラズマローゲンとして、例えば、エタノールアミン型プラズマローゲン（Ｐｌｓ）、コリン型プラズマローゲン（ＰｌｓＣｈｏ）、イノシトール型プラズマローゲン及びセリン型プラズマローゲン等を挙げることができる。なお、Ｐｌｓはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２が結合した構造を有する。ＰｌｓＣｈｏはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３が結合した構造を有する。
本実施の形態に係るビフィズス菌は、公知の条件で培養することでプラズマローゲンを合成する。ビフィズス菌は、至適温度又は至適温度付近で培養されるのが好ましく、培養温度は、例えば、２７～４５℃、３０～４２℃又は３５～４０℃である。好適には、培養温度は３７℃である。ビフィズス菌は、液体培地でも寒天培地でも培養可能である。好ましくは、ビフィズス菌は嫌気条件下で静置培養される。
本実施の形態に係るビフィズス菌は、下記実施例に示すように、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で培養された場合に、これらを含まない培地で培養された場合よりもプラズマローゲンを効率よく合成する。したがって、好適には、本実施の形態に係るビフィズス菌は、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で培養される。
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物は、生体におけるプラズマローゲンを外的に補充するのに有用である。例えば、プラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲンが減少している疾患の治療薬及び予防薬として使用される。当該疾患としては、例えば、炎症性疾患、中枢神経系炎症疾患、認知症、パーキンソン病、うつ病、統合失調症、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常等が挙げられる。
プラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲンを含有する上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物以外の成分、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含んでもよい。また、プラズマローゲン含有組成物は、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物を含んでもよい。
賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶セルロース及び軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク及びコロイドシリカ等である。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン等である。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム及びカルボキシメチルスターチナトリウム等である。
溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール及びマクロゴール等である。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤は、界面活性剤及び親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等である。
等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン及びＤ－マンニトール等である。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコール等である。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸及びソルビン酸等である。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩及びアスコルビン酸等である。
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲンを合成するビフィズス菌の菌体又はその処理物を含む。ビフィズス菌は大量培養が可能であるため、プラズマローゲン含有組成物を効率よく製造することができる。
下記実施例に示すように、上記ビフィズス菌によって合成されたプラズマローゲンは、炎症性サイトカインの分泌を抑制する。よって、別の実施の形態では、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを含む抗炎症剤が提供される。ビフィズス菌由来のプラズマローゲンは、上記ビフィズス菌が含有するプラズマローゲンであって、上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物であってもよいし、上記ビフィズス菌から単離又は精製したプラズマローゲンであってもよい。一態様では、上記プラズマローゲン含有組成物が抗炎症剤として使用される。
また、下記実施例に示すように、上記ビフィズス菌によって合成されたプラズマローゲンは、神経細胞を活性化させる。よって、別の実施の形態では、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを含む認知機能改善剤が提供される。一態様では、上記プラズマローゲン含有組成物が認知機能改善剤として使用される。
さらに、下記実施例に示すように、上記ビフィズス菌によって合成されたプラズマローゲンは、神経細胞のアポトーシスを抑制する。よって、別の実施の形態では、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを含む神経細胞死抑制剤が提供される。一態様では、上記プラズマローゲン含有組成物が神経細胞死抑制剤として使用される。
下記実施例に示すように、上記ビフィズス菌によって合成されたプラズマローゲンは、細胞内のプラズマローゲン量を増加させる機能を有する。そこで、別の実施の形態では、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを含むプラズマローゲン合成促進剤が提供される。
抗炎症剤、認知機能改善剤、神経細胞死抑制剤及びプラズマローゲン合成促進剤（以下、これらを総称する場合に“抗炎症剤等”とする）は、既知の方法で製造され、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを有効成分として含む。抗炎症剤等は、例えば、有効成分として０．１～９９重量％、１～５０重量％、好ましくは１～２０重量％のプラズマローゲンを含む。
抗炎症剤等の投与対象は、ヒト及びヒト以外の動物である。動物としては、好ましくは哺乳類で、より具体的には、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ及びシカ等があげられる。抗炎症剤等の投与量は、患者の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。抗炎症剤等は、プラズマローゲンが治療上有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。抗炎症剤等の投与量は、典型的には、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。抗炎症剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与されてもよい。なお、必要に応じて、抗炎症剤等は、上記の範囲外の量で使用されてもよい。
抗炎症剤等の投与方法は、特に限定されないが、注射、経鼻、経皮、経肺及び経口等で投与される。投与方法としては、経口投与が特に好ましい。
別の実施の形態では、上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物を含む、プラズマローゲンが減少している疾患の治療用経口組成物、特には、抗炎症用経口組成物、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制用経口組成物及びプラズマローゲン合成促進用経口組成物（以下、これらを総称する場合に単に“経口組成物”とする）が提供される。経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。なお、上述の抗炎症剤等がサプリメントとして使用されてもよいし、飲食品及び機能性食品に添加されてもよい。
サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液及び懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。
“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。機能性食品としては、保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、甘味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤及び香料等を経口組成物に添加してもよい。
機能性食品は、食品であっても飲料であってもよく、経口で摂取できれば特に限定されない。機能性食品の態様としては、例えば、飲料、菓子、穀類加工品、練り製品、乳製品、調味料等が挙げられる。飲料として、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶、緑茶等が例示される。菓子として、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム、ゼリー等が例示される。穀類加工品麺として、パン、米飯、ビスケット等が例示される。練り製品として、ソーセージ、ハム、かまぼこ等が挙げられる。乳製品として、バター、ヨーグルト等が挙げられる。
経口組成物は、食品添加剤として食品に添加されてもよい。この場合、当該食品添加剤は、食品に添加しやすいように、ペースト剤、ゲル状剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤等であってもよい。
本実施の形態に係る経口組成物は、抗炎症、認知機能改善、神経細胞死抑制又はプラズマローゲン合成促進に係る有効性を維持する範囲で、水、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー、機能性成分、食品添加物等を含有してもよい。経口組成物は、必要に応じて上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物以外の他の成分を添加して、公知の方法によって製造することができる。
経口組成物は、１日の摂取量が上述の摂取量となるように１個又は複数個の容器に分けて収容されてもよく、この場合、好ましくは１個の容器に１日分の経口組成物が収容される。
上記の経口組成物は、上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物を含有し、抗炎症、認知機能改善、神経細胞死抑制又はプラズマローゲン合成促進に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができる態様で提供される。例えば、経口組成物に係る製品の包装、説明書及び宣伝物の少なくとも１つに、抗炎症、認知機能改善、神経細胞死抑制又はプラズマローゲン合成促進の効果がある旨が表示される。
経口組成物が飲食品組成物として提供される場合、抗炎症、認知機能改善、神経細胞死抑制、プラズマローゲン合成促進等の用途（保健用途を含む）が表示された飲食品として提供又は販売されてもよい。“表示”行為には、需要者に対して上記の用途を知らせるためのすべての行為が含まれる。上記の用途を想起又は類推させ得るような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物、媒体等の如何に拘わらず、すべて“表示”行為に該当する。
“表示”は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
“表示”には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示が挙げられる。この中でも特に、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造又は機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例として挙げられる。
本実施の形態における別の側面では、抗炎症剤、認知機能改善剤、神経細胞死抑制剤、プラズマローゲン合成促進剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制用経口組成物又はプラズマローゲン合成促進用経口組成物の製造のための上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物の使用が提供される。また、本実施の形態における別の側面では、上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物を対象に投与するステップを含む、炎症抑制方法、認知機能改善方法、神経細胞死抑制方法又はプラズマローゲン合成促進方法が提供される。また、本実施の形態における別の側面では、抗炎症、認知機能改善、神経細胞死抑制又はプラズマローゲン合成促進における使用のための上記ビフィズス菌の菌体又はその処理物が提供される。
（実施の形態２）
本実施の形態に係るプラズマローゲンの製造方法は、培養ステップと、取得ステップと、を含む。培養ステップでは、上述のように、上記ビフィズス菌を培養する。取得ステップでは、当該ビフィズス菌の菌体からプラズマローゲンを得る。取得ステップでは、上記のように溶媒抽出及び超音波等を介した破砕等で菌体を処理することでプラズマローゲンを得ることができる。取得ステップで得たプラズマローゲンを、公知の方法で精製、あるいはプラズマローゲンを単離してもよいし、精製したプラズマローゲンを濃縮してもよい。
本実施の形態に係るプラズマローゲンの製造方法によれば、大量培養が可能なビフィズス菌の菌体からプラズマローゲンが得られる。このため、効率よくビフィズス菌由来のプラズマローゲンを得ることができる。
（実施の形態３）
本実施の形態に係るプラズマローゲン合成促進用培地は、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む。当該プラズマローゲン合成促進用培地は、ビフィズス菌の培養に使用される。プラズマローゲン合成促進用培地は、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖の他に、ビフィズス菌の培養に使用される培地成分、例えば、ペプトン、酵母エキス、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、Ｌ－システイン塩酸塩（１水和物）、カゼインペプトン、トリプシン消化物、牛肉エキス、グルコース、Ｋ２ＨＰＯ４、界面活性剤及び水等を含有してもよい。
本実施の形態に係るプラズマローゲン合成促進用培地でビフィズス菌を培養することで、ビフィズス菌にプラズマローゲンを効率よく合成させることができる。このため、当該プラズマローゲン合成促進用培地は、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンの製造に有用である。
なお、プラズマローゲン合成促進用培地は、液体培地としても寒天培地としても使用できる。また、別の実施の形態では、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種を含むビフィズス菌培養培地添加剤が提供される。他の実施の形態では、それぞれ別個に格納された、硫酸アンモニアと、硫酸マグネシウムと、プロピオン酸ナトリウムと、ガラクトオリゴ糖と、を備えるビフィズス菌培養培地調製キットが提供される。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの検出
［ビフィズス菌の培養］
表１に示す４４種類のビフィズス菌がプラズマローゲンを合成するか否かを検討した。いずれのビフィズス菌も国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）微生物材料開発室から取得した。
表１に示すビフィズス菌を、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ－Ａｎａｅｒｏ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気的条件下、３７℃で２日間培養した。各ビフィズス菌の培養には、表１に示す液体培地１～３を使用した。液体培地１は表２に組成を示すＧＡＭ ｂｒｏｔｈ（日水製薬社製）である。液体培地２は表３に組成を示すＢＩＦＩＤＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ ＭＥＤＩＵＭである。液体培地３は表４に組成を示すＢＲＡＩＮ ＨＥＡＲＴ ＩＮＦＵＳＩＯＮである。培養後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（液体培地）を取り除いた。生理食塩水を５ｍＬ加え混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り除いた。生理食塩水での洗浄と上清の除去を再度行い、冷凍保存した。
［菌体からの総脂質抽出］
解凍した菌体５００ｍｇをガラスのロング試験管に移し、１ｍＬの超純水を加え混和した。クロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）溶液を３．７５ｍＬ加え混和した。１０分間の超音波で抽出し、混和後、室温で３０分間静置した。クロロホルムを１．２５ｍＬ加え混和し、超純水を１．２５ｍＬ加え混和した。室温にて３０００ｒｐｍで５分間遠心し、下層を別のスピッチグラスに移した。残った上層にクロロホルムを２ｍＬ加え混和し、室温にて３０００ｒｐｍで５分間遠心し、得られた下層をスピッチグラス内の下層と合わせた。下層を窒素ガスで乾固し、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）溶液４ｍＬに溶解した。得られた溶液２００μＬをフィルターろ過し、ろ液を脚付きガラスインサートに入れた。得られた総脂質を含むサンプル１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入し、蒸発光散乱器（ＥＬＳＤ）で検出した。
総脂質を検出するためのＨＰＬＣに使用したカラムは、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ＤＩＯＬ（２５０×３ｍｍ、５μｍ、メルク社製）である。移動相Ａが０．０８％トリエチルアミンを含むヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、ｖ／ｖ／ｖ）で、移動相Ｂが０．０８％トリエチルアミンを含むイソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、、ｖ／ｖ／ｖ）である。流量０．８ｍＬ／分、カラム温度５０℃とし、ＨＰＬＣを表５に示すグラジエントで行った。
ＥＬＳＤの条件は次の通りである。
エバポレータ温度：６０℃
ネブライザー温度：３０℃
窒素ガス流量：１．００ ＳＬＭ
［酸加水分解処理］
酸加水分解のためのＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理で総脂質に含まれるプラズマローゲンのビニルエーテル結合が切断され、ビニルエーテル結合を介して結合していた炭化水素鎖がアルデヒドとなる。ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理によって、ビフィズス菌から抽出した総脂質から次のようにプラズマローゲンを検出した。
上述のように菌体から抽出した総脂質１６０μＬをスピッツに取り、窒素ガスで乾固した。ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を０．５ｍＬ加え混和し、超音波を用いて分散させた。３０分間室温に置き、超純水０．５ｍＬとクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）１．９ｍＬとを加え混和した。１０分間室温に置き、クロロホルム０．６２５ｍＬを加え混和し、超純水０．６２５ｍＬを加え混和した。室温にて３０００ｒｐｍで５分間遠心し、下層を別のスピッツに移した。下層を窒素ガスで乾固し、 ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）溶液１６０μＬに溶解した。フィルターろ過し、脚付きガラスインサートに入れた。得られたサンプル２０μＬを、上記のＨＰＬＣに注入しＥＬＳＤで検出した。また、サンプル１０μＬを上記のＨＰＬＣに注入し、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）によって波長３５６ｎｍの紫外線（ＵＶ）で検出した。
標準として使用したアルデヒド標準溶液について以下のように調製した。テトラデカノール（Ｃ１４Ｈ２８Ｏ、東京化成工業社製、Ｔ２６９６）、ヘキサデカノール（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９６）、ヘプタデカノール（Ｃ１７Ｈ３４Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９５）及びオクタデカノール（Ｃ１８Ｈ３６Ｏ、東京化成工業社製、Ｏ０３６８）を別々のスピッツに取り、アセトニトリルで１ｍｇ／ｍＬとした。調製した１ｍｇ／ｍＬの溶液２００μＬを別々のスピッツに取り、窒素ガスで乾固し、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液を０．５ｍＬ加えて混和した。超音波で分散させ、サンプルを３０分間室温に置いた。超純水０．５ｍＬとクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）１．９ｍＬとをサンプルに加え混和した。室温に１０分間置き、クロロホルム０．６２５ｍＬを加え混和した。サンプルに超純水０．６２５ｍＬ加え混和した。サンプルを５分間、室温で遠心（３０００ｒｐｍ）した。下層を別のスピッツに移し、窒素ガスで乾固し、これをアセトニトリル２ｍＬに溶解してストックアルデヒド標準液として－３０℃で保管した。
４種のアルデヒドを混合した混合アルデヒド標準溶液を調製するために、４種類のストックアルデヒド標準液を各３０μＬずつ取り混和した。得られた混合アルデヒド標準溶液を０．４５μｍフィルターで濾過し、１０μＬをＨＰＬＣに注入し、ＤＡＤによって波長３５６ｎｍのＵＶで検出した。
アルデヒドを検出するためのＨＰＬＣに使用したカラムはＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＡ Ｃ１８（３．０×１５０、２．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）である。移動相Ａがアセトニトリルで、移動相Ｂが水である。流量０．３ｍＬ／分、カラム温度４０℃とし、ＨＰＬＣを表６に示すグラジエントで行った。
（結果）
ビフィズス菌４４種の内、ＪＣＭ Ｎｏ．７１１７、７１２４、１２５３、１１６５８（いずれもB. animalis subsp. animalis）及び１２５５Ｔ（B. bifidum）を除く３９種においてプラズマローゲンが検出された。プラズマローゲンが検出されたビフィズス菌の代表として、ＪＣＭ Ｎｏ．１２７５Ｔ（B. adolescentis）、７００２（B. bifidum）、１２７３（B. breve）、１１３４２（B. longum subsp. longum）及び７１３９（B. longum subsp. suis）の総脂質、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質及びアルデヒドに係るクロマトグラムを、それぞれ図１、図２及び図３に示す。なお、図１におけるＰＡ、ＰＧ、ＰＥ、ＰＣ、ＰＳ、ＬｙｓｏＰＥ及びＬｙｓｏＰＣは、それぞれホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、分解ホスファチジルエタノールアミン及び分解ホスファチジルコリンを意味する。
実施例２：ビフィズス菌の培養条件の検討
［ビフィズス菌の培養］
ＪＣＭ Ｎｏ．１２７５Ｔ、７００２、１２７３、１１３４２及び７１３９を用いて、プラズマローゲンの合成効率を指標に培養培地を検討した。使用した培養培地は、表７に組成を示す市販のＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト社製）、表７に示す組成に従って調製したＴＯＳプロピオン酸寒天培地及び表７に示す組成から寒天を除いて調製したＴＯＳプロピオン酸液体培地である。なお、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地及びＴＯＳプロピオン酸液体培地の調製において表７に示す試薬以外として汎用品を使用した。
各培地を使用して、実施例１と同様にビフィズス菌を培養し、総脂質、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質及びアルデヒドを検出した。
（結果）
図４は、１２７５Ｔ及び７００２に関して、総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラムを示す。矢印は、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理で減少又は消失したピークを示す。同様に、１２７３及び１１３４２に関して、総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラムを図５に示す。図６は７１３９に関して、総脂質及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理した総脂質に係るクロマトグラムを示す。
１２７５Ｔ、７００２、１２７３、１１３４２及び７１３９に関して、アルデヒドに係るクロマトグラムを、それぞれ図７、図８、図９、図１０及び図１１に示す。図７～図１１における矢印は、液体培地１又は２と比較してプロピオン酸ナトリウムを含む培地で増加したアルデヒドのピークを示す。液体培地１又は２とプロピオン酸ナトリウムを含む培地との組成を比較して、少なくとも硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム（７水和物）、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖が培地に含まれることでプラズマローゲンの生成量が増加することが示唆された。
実施例３：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの調製
［ビフィズス菌の培養］
ＪＣＭ Ｎｏ．１１３４２（B. longum subsp. longum）を、調製したＴＯＳプロピオン酸液体培地を用いて次のように培養した。
５０ｍＬチューブにＴＯＳプロピオン酸液体培地３０ｍＬを分注し、ビフィズス菌サンプルを白金耳で掻き取り、培地内に加えた。ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ－Ａｎａｅｒｏ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気的条件下、３７℃で２４～４８時間培養した。得られた培養液約７ｍＬを、別途調製したＴＯＳプロピオン酸液体培地約４００～４５０ｍＬを入れた５００ｍＬのフラスコに、軽くミキシングして添加しミキシングした。さらに、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ－Ａｎａｅｒｏ（三菱ガス化学社製）を使用し、嫌気性条件下、３７℃で約７２時間培養した。
得られた培養液を遠心し（２４００～３５００ｒｐｍ、１５分間）、上清を除去し、残ったペレットにｓａｌｉｎｅ １０～１５ｍＬを添加し撹拌した。この遠心からｓａｌｉｎｅを添加して撹拌する操作を再度繰り返し、遠心し、上清を除去し、－８０℃で保存した。
［ＰＬＡ１による加水分解処理］
ＰＬＡ１はグリセロリン脂質のｓｎ－１位のアシル結合を加水分解するが、リン脂質のアルケニル及びアルキル結合には作用しない。一方、グリセロリン脂質のアルケニル結合（ビニルエーテル結合）のみが酸加水分解を受けやすい。したがって、ＰＬＡ１による加水分解と酸加水分解との組み合わせによって、アルキルアシル及びアルケニルアシルリン脂質を含むグリセロリン脂質のサブクラスを同定することが可能である。
上記実施例１における菌体からの総脂質抽出と同様に、凍結した菌体５００ｍｇから得られた総脂質を含むサンプルを窒素ガスで乾固した。サンプルにＰＬＡ１液を６４０μＬ加え混和した。なお、ＰＬＡ１Ａ液は、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ１（Ｓｉｇｍａ社製）と０．１Ｍクエン酸バッファー（ＨＣｌ ｐＨ４．５）とを１：１（ｖ／ｖ）で使用直前に混合することで調製した。サンプルを超音波で分散させ、４５℃で１時間反応させた。反応後、氷水に浸けて反応を停止させ、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）溶液３．２ｍＬを加え混和した。５分間超音波で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を１．６ｍＬ加え混和した。室温にて３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層１．６ｍＬを別のスピッツに移した。サンプルにヘキサン／イソプロパノール（７：２、ｖ／ｖ）溶液１．６ｍＬを加え混和した。室温にて、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を取り、別のスピッツに移しておいた上層と合わせた。上層を窒素ガスで乾固し、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）溶液１．５ｍＬに溶解した。得られた溶液２００μＬフィルターろ過し、ろ液を脚付きガラスインサートに入れた。得られたエーテルリン脂質１５μＬを上述の総脂質の検出に用いた条件のＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法に供した。
さらに、ＰＬＡ１による加水分解処理で得られたエーテルリン脂質を、上述のようにＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理したサンプルを、上述の総脂質の検出に用いた条件のＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法に供した。
１１３４２について、総脂質、ＰＬＡ１処理後のサンプル及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理後のサンプルのＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法で得られたクロマトグラムを、それぞれ図１２（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。プラズマローゲン以外のグリセロリン脂質のｓｎ－１位のアシル結合をＰＬＡ１処理で加水分解した後、さらにＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理によってグリセロリン脂質のビニルエーテル結合が酸加水分解されるため、ＰＬＡ１処理後のサンプルのクロマトグラムにおいて、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理によって減少しているピークの区間（Ａ－Ａ’）がプラズマローゲンである。したがって、区間Ａ－Ａ’をＨＰＬＣで分取し、濃縮したサンプルは、ビフィズス菌由来のプラズマローゲンを含有する。
［ビフィズス菌のプラズマローゲンの調製］
エーテルリン脂質を、上述の総脂質の検出に用いた条件のＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法に供し、接続したフラクションコレクターを介して区間Ａ－Ａ’を分取した。分取した溶液をナシフラスコに移してエバポレータで濃縮した。酢酸除去のためイソプロパノールを加えて超音波で溶解し、エバポレータで濃縮した。イソプロパノールを加える濃縮操作を３回繰り返し、濃縮物を窒素ガスで封入して－３０℃で保管した。
濃縮物の重量を測定し、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）溶液で１ｍｇ／ｍＬになるように溶解した。サンプル１ｍＬをチューブに移して窒素ガスで乾固した。超純水１ｍＬで分散させ、－３０℃で保管した。
抽出された１１３４２由来のプラズマローゲン（Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓ）の機能を以下の試験で評価した。
試験例１：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの抗炎症作用の検討
ミクログリア細胞（ＭＧ６細胞）を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。５μｇ／ｍＬのＢｉｆｉ－Ｐｌｓで２４時間処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）処理を８時間行った。その後、細胞内のＲＮＡを抽出し、炎症性サイトカインＩＬ－１β及びコントロールとしてＧａｐｄｈ遺伝子のＲＮＡ発現をＰＣＲによって検出した。ＩＬ－１βのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。Ｇａｐｄｈ遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。また、ＬＰＳ処理後の細胞核内のタンパク質を抽出し、ｐ６５抗体を用いてウエスタンブロッティング法を行った。
（結果）
図１３は、Ｇａｐｄｈ遺伝子に対するＩＬ－１βの相対的な発現量を示す。ＬＰＳ投与により、ＭＧ６細胞におけるＩＬ－１βのＲＮＡ発現が増加するのに対し、Ｂｉｆｉ－ＰｌｓによってＩＬ－１β発現が減少した。図１４は、核内のｐ６５タンパク質の相対量を示す。ＬＰＳ投与により、炎症マーカーである核内のｐ６５タンパク質の量が増加したが、Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓによって、核内のｐ６５タンパク質の量が有意に減少した（ｎ＝３）。すなわち、ミクログリア細胞におけるＬＰＳ誘発性のｐ６５タンパク質（ＮＦ－ｋＢ）の核局在化がＢｉｆｉ－Ｐｌｓによって抑制された。
試験例２：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの細胞内プラズマローゲン合成促進作用の検討
Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓ添加有り又は無しの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにおいてＭＧ６細胞を２４時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、ＲＩＰＡバッファーを用いて細胞内のタンパク質を抽出した。計１００μｇのタンパク質を用いて、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって脂質を分析した（ｎ＝４）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳでは、サンプルを入れたスピッチグラスに超純水を５００μＬ加え、ピペッティングした。クロロホルム／メタノール（１／２、ｖ／ｖ）で５０００ｎｇ／ｍＬに調製した１２：０ ＰＥ（８５０７０２Ｐ、Ａｖａｎｔｉ社製）を１００μＬ加えた（内部標準：５００ｎｇ／サンプル）。サンプルにクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）１．８ｍＬを加え混和し、５分間超音波で抽出した。３０分間室温で静置し、サンプルにクロロホルム０．６２５ｍＬを加え混和した。サンプルに超純水０．６２５ｍＬを加え混和した。３０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心し、下層を別のスピッツに移した。残った上層にクロロホルムを１ｍＬ加え混和した。３０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心することで得た下層を、スピッツ内の下層と合わせた。下層を窒素ガスで乾固し、メタノール２００μＬに溶解した。フィルターろ過し、脚付きガラスインサートに入れ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに５μＬ注入した。
液体クロマトグラフ（ＬＣ）の条件は、以下のとおりである。
ＵＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ
ＭＳ：Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ ｍｉｃｒｏ
ＭＳソフトウェア：ＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ４．１
データ解析：ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（商標） ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ １．０×１５０ｍｍ
カラム温度：３５℃
サンプル溶媒：メタノール
移動相Ａ：メタノール：アセトニトリル：水＝２：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）、０．１％ギ酸、０．０２５％アンモニア
移動相Ｂ：２－プロパノール、０．１％ギ酸、０．０２５％アンモニア
ＬＣは次のグラジエントで行った。
質量分析の条件は、以下のとおりである。
ｍｏｄｅ：ＥＳＩ＋
Ｓｏｕｒｃｅ Ｖｏｌｔａｇｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：２．０ｋＶ
Ｃｏｎｅ：２０Ｖ
Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１５０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４００℃
Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ：８００Ｌ／Ｈｒ Ｎ２ガス
Ｃｏｎｅ：５０Ｌ／ｈｒ Ａｒガス
なお、比較のためにホタテガイ（Ｍｉｚｕｈｏｐｅｃｔｅｎ ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）から抽出したプラズマローゲン（ｓＰｌｓ）を添加してＭＧ６細胞を同様に培養した。ｓＰｌｓは、生ホタテヒモからヘキサンを用いて抽出する、国際公開第２０１６／１８１４９１号に記載の方法で抽出した。ホタテガイからのプラズマローゲンの抽出では、まず、生ホタテヒモにコクラーゼＰ（三菱ケミカルフーズ社製）とホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１、三菱ケミカルフーズ社製）を加えて、１時間分解した。続いて、ヘキサン／イソプロパノールを加えて撹拌し、静置後上澄みを吸引濾過した。濾液に硫酸ナトリウム水溶液を加えてよく混和し、上層をロータリーエバポレーターで乾固した。これに４℃に冷却したアセトン４０ｍＬを加え混和した。遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで１０分間、４℃で分離した。上清を捨て、沈殿物を回収し、デシケータで一晩乾燥した。
移動相Ａ及び移動相Ｂを用いて表９に示すグラジエントでＨＰＬＣ行い、エタノールアミン型プラズマローゲンのみを分取した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
機器名：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：ＳＰＨＥＲＩＳＯＲＢ ５μｍ Ｓｉｌｉｃａ ４．６×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
ガードカラム：μＰｏｒａｓｉｌ Ｓｉｌｉｃａ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：４０℃
流量：２ｍＬ／分
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール（３：２）
移動相Ｂ：水
検出器：２１０ｎｍ ＵＶ
（結果）
図１５に細胞内の総プラズマローゲン量を示す。対照に比べ、Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓ存在下の細胞内の総プラズマローゲン量が増加した。一方、ｓＰｌｓでは、細胞内の総プラズマローゲン量は増加しなかった。
実施例４：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの調製
［ビフィズス菌の培養］
ＪＣＭ Ｎｏ．７００３（B. bifidum）、１１３４０（B. longum subsp. longum）、１１３４５（B. longum subsp. infantis）、７１３９（B. longum subsp. suis）、７０１９（B. breve）及び７０４５（B. adolescentis）を、約７２時間の培養時間を約７２～９６時間に変更することを除いて、実施例３と同様に培養し、凍結菌体を得た。
実施例３と同様に、凍結した菌体から得られた総脂質のＰＬＡ１による加水分解処理で得られたエーテルリン脂質について、ＤＮＰＨ－ＨＣｌ処理したサンプルのクロマトグラムを参照して区間Ａ－Ａ’を分取した。
抽出されたビフィズス菌由来のプラズマローゲンの機能を下記試験例で検討した。以下では、７００３、１１３４０、１１３４５、７１３９、７０１９及び７０４５由来のプラズマローゲンを、それぞれＢｉｆｉ－１、Ｂｉｆｉ－２、Ｂｉｆｉ－３、Ｂｉｆｉ－４、Ｂｉｆｉ－５及びＢｉｆｉ－６とする。また、比較のためにｓＰｌｓを使用した。
試験例３：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの抗炎症作用の検討１
Ｂｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６又はｓＰｌｓの存在下（５μｇ／ｍＬ）、ＭＧ６細胞を１８時間培養した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理を１２時間行った。その後、ＥＬＩＳＡ法で培地中のＩＬ－１β及びＴＮＦ－αを定量した。
Ｂｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６又はｓＰｌｓの存在下（１、５又は２０μｇ／ｍＬ）、ミクログリア細胞（ＢＶ２）を２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１２時間血清飢餓培養した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）処理を８時間行った。ルシフェラーゼアッセイを行い、細胞内のＮＦ－κＢ活性を解析した。
ルシフェラーゼアッセイには、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ１５０１、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。ルシフェラーゼ遺伝子と融合したＮＦ－ｋＢプロモーターを発現するＢＶ２細胞を２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養し、プラズマローゲン（５μｇ／ｍＬ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅ１５３Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により細胞を溶解した。細胞抽出物５μＬを９６ウェルプレートで５０μＬのルシフェラーゼ基質混合物（Ｅ１５１Ａ及びＥ１５２Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＴＸ ８８０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で測定した。
（結果）
図１６に培地中のＩＬ－１βの濃度を示す。ＬＰＳ処理によって放出されるＩＬ－１βをＢｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６は抑制した。特にＢｉｆｉ－２、Ｂｉｆｉ－４、Ｂｉｆｉ－５及びＢｉｆｉ－６は有意にＩＬ－１βの放出を抑制した。培地中のＴＮＦ－αの濃度を図１７に示す。Ｂｉｆｉ－３を除くビフィズス菌由来プラズマローゲンは、ＬＰＳ処理によって放出されるＴＮＦ－αを有意に抑制した。
図１８はＮＦ－κＢプロモーターで制御されるルシフェラーゼ活性を介して定量したＮＦ－κＢの相対的な活性を示す。図１８におけるエラーバーは標準偏差を示す。Ｂｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６は、ＬＰＳによるＮＦ－κＢの活性化を有意に抑制した。
試験例４：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの抗炎症作用の検討２
Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓ（５μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、ＭＧ６細胞を１８時間培養した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理を１２時間行った。その後、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のキットを用いたＥＬＩＳＡ法で培地中のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６を定量した。
（結果）
培地中のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６の濃度を、それぞれ図１９（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓによって、ＭＧ６細胞におけるＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６の発現がＬＰＳ処理に対して低下した（ＡＮＯＶＡに続くボンフェローニ検定）。
試験例５：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの神経細胞保護作用の検討
２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１２時間血清飢餓培養したヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に、Ｂｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６又はｓＰｌｓ（５μｇ／ｍＬ）を１０分間反応させた。反応停止後、抽出した総タンパク質についてウエスタンブロッティング法によって、内部標準をアクチンとしたｐＥＲＫの相対的な発現量を評価した。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を血清なし培地（Ｎｏ ｓｅｒｕｍ）に入れ、Ｂｉｆｉ１～Ｂｉｆｉ－６を添加し（５μｇ／ｍＬ）、カバーガラス上で３６時間培養した。対照としてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１０％血清あり培地（対照）に入れ、同様に３６時間培養した。カバーガラス上の細胞をＴＵＮＥＬ法 （Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＴＭＲ ｒｅｄ、Ｒｏｃｈｅ社製）で染色し、アポトーシス細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
（結果）
図２０は、同量のタンパク質で比較したｐＥＲＫの相対発現量を示す。血清飢餓状態のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞）においてＥＲＫをＢｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６は活性化した。特にＢｉｆｉ－２、Ｂｉｆｉ－４、Ｂｉｆｉ－５及びＢｉｆｉ－６は有意にＥＲＫを活性化した。図２１は、アポトーシスを起こしている細胞であるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合の平均値を示す。図２１におけるエラーバーは標準偏差を示し、Ｐ値は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって算出した。Ｂｉｆｉ－１～Ｂｉｆｉ－６は、いずれも有意に神経細胞のアポトーシスを抑制することが示された。
試験例６：ビフィズス菌由来プラズマローゲンの神経細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴ１の活性化の検討
２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１２時間血清飢餓培養したマウス由来の神経細胞様細胞Ｎｅｕｒｏ－２Ａに、Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓ（５μｇ／ｍＬ）を２０分間反応させた。対照として、Ｂｉｆｉ－Ｐｌｓの溶媒で同様に細胞を処理した。続いて、サルコシン細胞溶解バッファーで細胞を処理し、抽出した総タンパク質についてウエスタンブロッティング法によって、内部標準をアクチンとしたｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐＡＫＴ１及びＡＫＴ１に対する抗体（いずれもＣｅｌｌ Ｓｉｎｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて相対的な発現量を評価した。
（結果）
ＥＲＫに対するｐＥＲＫの相対的な発現量及びＡＫＴ１に対するｐＡＫＴ１の相対的な発現量を、それぞれ図２２（Ａ）及び（Ｂ）に示す。Ｂｉｆｉ－ＰｌｓによってＥＲＫ及びＡＫＴ１のリン酸化が有意に増加した（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
本発明は、プラズマローゲンの製造に有用である。

Claims (8)

  1. ビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体又はその処理物を含み、
    前記菌は、
    ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される、
    プラズマローゲン含有組成物。
  2. ビフィドバクテリウム属に属する菌を培養する培養ステップと、
    前記菌の菌体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
    を含み、
    前記菌は、
    ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される、
    プラズマローゲンの製造方法。
  3. 前記培養ステップでは、硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で、前記菌を培養する、
    請求項２に記載のプラズマローゲンの製造方法。
  4. 硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含み、
    ビフィドバクテリウム属に属する菌の培養に使用される、
    プラズマローゲン合成促進用培地。
  5. 硫酸アンモニア、硫酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム及びガラクトオリゴ糖を含む培地で、ビフィドバクテリウム属に属する菌を培養する培養ステップと、
    前記菌の菌体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
    を含む、
    プラズマローゲンの製造方法。
  6. ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む、
    抗炎症剤又は抗炎症用経口組成物。
  7. ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む、
    認知機能改善剤又は認知機能改善用経口組成物。
  8. ビフィドバクテリウム属に属する菌由来のプラズマローゲンを含む、
    神経細胞死抑制剤又は神経細胞死抑制用経口組成物。
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