JP2008260743A - Nqo1発現増強剤 - Google Patents
Nqo1発現増強剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008260743A JP2008260743A JP2007138250A JP2007138250A JP2008260743A JP 2008260743 A JP2008260743 A JP 2008260743A JP 2007138250 A JP2007138250 A JP 2007138250A JP 2007138250 A JP2007138250 A JP 2007138250A JP 2008260743 A JP2008260743 A JP 2008260743A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nqo1
- effect
- phospholipid
- nqo1 expression
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【解決手段】リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするNQO1発現増強剤、及び、上記NQO1発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物、化粧品、医薬品及び医薬部外品。
【選択図】なし
Description
NQO1活性は全ての組織において普遍的に検出されるが、発現量は組織によって異なっており、腎臓、骨格筋や肺で発現量が高く、膵臓では発現量が低い。
更に、NQO1は、α−tocopherolの誘導体であるα−tocopherolquinoneをα−tocopherolhydroquinoneに還元することによって抗酸化作用を得ることが報告されている(非特許文献3参照)。
なお、非特許文献7では、Nrf2欠損動物(−/−)に環境汚染物質ペンタクロロフェノールを投与した際にNQO1蛋白質の発現が顕著に抑制され、過酸化脂質評価に用いられるチオバルビツール酸反応生成物(TBARS)の増大が認められたことが報告されている。
A.K.Jaiswal(2000)Free Radic.Biol.Med.29:254−262 R.E.Beyer et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:2528−2532 D.Siegel et al.(1997)Mol.Pharmacol.52:300−305 J.H.Suh et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:3381−3386 J.L.Stringer et al.(2004)J Comp Neurol.471:289−297 A.Gaikwad et al.(2001)J.Biol.Chem.276:22559−22654 T.Uemura et al.(2006)Toxicol Sci. 90:111−119
すなわち本発明は、リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするNQO1発現増強剤である。
また、本発明は、上記NQO1発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物、化粧品、医薬品及び医薬部外品である。
本発明のNQO1発現増強剤は、リン脂質を含むものである。
本発明で用いるリン脂質としては特に限定されず、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、これらのリゾ体等が挙げられる。上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらのなかでも、PS、PI及びこれらの混合物が好ましい。PSとPIを混合して用いる場合、その比率は特に限定されないが、通常、PS/PIが0.05〜80の範囲であり、0.1〜10の範囲であると、NQO1発現増強効果に優れたものとなり、好ましい。より好ましくは0.5〜8である。
本明細書において、「神経の保護」「神経の機能維持」とは、ミエリンと呼ばれるリポタンパク質により神経繊維が包まれて髄鞘が形成されること、又は形成されていることを意味する。この髄鞘が絶縁体の役割をすることで、電気信号が神経繊維に沿って速く正確に伝わるので、髄鞘が破損すると神経の信号が正しく伝わらなくなる。髄鞘は、脳卒中、炎症、免疫異常、代謝異常、ビタミンB12欠乏などの栄養素の欠損症等によって破壊されるが、本発明のNQO1発現増強剤を日常的に摂取することにより、髄鞘の破壊を予防する効果も期待できる。
本発明のリン脂質を含有するNQO1発現増強剤を作製する際のリン脂質の含有量、剤型、保存方法および保存形態は、医薬品、医薬部外品、飲食物、化粧品などの用途に応じて適宜決定できる。
製造例1 PI・PS含有リン脂質
レシチンとしてSLP−PIパウダー(辻製油株式会社製)7gをヘプタン及びアセトンの混合液70mLと共に混合して溶解させ、レシチン溶液を得た。これとは別に、セリン20g及びホスホリパーゼD(ナガセケムテックス株式会社製)500Uを1M酢酸緩衝液(pH4.5)67mL中に含む酵素含有セリン溶液を調製した。
このレシチン溶液に酵素含有セリン溶液を加え、30℃にて5時間攪拌した。次いで、ヘプタン及びアセトンの混合液75mL及び塩化ナトリウム20gを加え、1時間攪拌し、これを静置して分離した後、有機層を回収し、PI・PS含有有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液は固形分8gを含有していた。その組成を調べたところ、次の通りであった。ホスファチジルセリン20%、ホスファチジルイノシトール20%、ホスファチジルコリン9%、ホスファチジルエタノールアミン14%、ホスファチジン酸14%、リゾホスファチジルコリン5%、リゾホスファチジルエタノールアミン1%。
レシチンとしてSLP−PS70(辻製油株式会社製)を使用したこと以外は製造例1と同様に反応を行い、PSを主として含有するリン脂質を固形分として7g得た。その組成を調べたところ、次の通りであった。ホスファチジルセリン80%、ホスファチジルイノシトール1%、ホスファチジン酸10%、ホスファチジルエタノールアミン3%、リゾホスファチジルコリン2%、リゾホスファチジルエタノールアミン1%。
BIOMOL社のL−α−phosphatidylinositol Naをクロロホルム/メタノール(9/1)混液で溶解し、エバポレートした。Milli−Q水で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
SIGMA社のL−α−phosphatidylserineをクロロホルムで溶解し、エバポレートした。PBS(−)で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
製造例3及び4で得られたリポソームを細胞添加濃度に合うように必要量ずつ混合し、サンプルとした。配合割合は、図2〜4、図6及び図7に記載の濃度となるように混合した。
BIOMOL社のL−α−phosphatidylinositol NaとSIGMA社のL−α−phosphatidylserineとを1:1で混合し、クロロホルムで溶解し、エバポレートした。Milli−Q水で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
PC12h(PC12をクローニングすることによって得られた細胞)を2×106/wellとなるように6wellコラーゲンタイプIコートのプレートに播種し、前培養した。製造例1〜4で得られたリン脂質を、図1、2に記載の濃度で添加し、32時間培養した後、培養上清を廃棄し、各ウェルにISOGEN(ニッポンジーン社製)1mLを添加し、細胞抽出物を得た。以下、ISOGEN添付の操作方法に準じてmRNAを分取した。
cDNAの分取には、SuperScriptIII First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitorogen社製)を使用し、本キットに添付の操作手順に準じて行った。以下使用したプライマーを示す。
NQO1 Forward primer:GTGTACAGCATTGGCCACAC(配列番号1)
NQO1 Reverse primer:CAAAGGCGAAAACTGAAAGC(配列番号2)
β−actin Forward primer:TGTTTGAGACCTTCAACACC(配列番号3)
β−actin Reverse primer:CGCTCATTGCCGATAGTGAT(配列番号4)
94℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分間の条件でNQO1プライマーセットを用いて28サイクル(配列番号1、2)、β−actinプライマーセットを用いて22サイクル(配列番号3、4)でPCRを行った。DNA polymeraseはGoTaq(Promega)を使用した。PCR終了後のサンプルを1.5%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の解析を行った。
それぞれのバンド強度についてデンシトメトリー解析を行い、NQO1/β−actin比を取ることによってコントロールに対するNQO1発現増強量について半定量的に解析した。結果を図1及び図2に示す。
Neuro 2a(大日本製薬社製)を5×105/wellとなるように6wellコラーゲンタイプIコートのプレートに播種し、前培養した。製造例1〜6で得られたリン脂質を、図3〜図5に記載の濃度で添加し、24時間培養した後、培養上清を廃棄し、各ウェルにISOGEN(ニッポンジーン社製)1mLを添加し、細胞抽出物を得た。以下、ISOGEN添付の操作方法に準じてmRNAを分取した。
cDNAの分取にはSuperScriptIII First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitorogen社製)を使用し、本キットに添付の操作手順に準じて行った。以下使用したプライマーを示す。
NQO1 Forward primer:CTTTTTCCCCAGCTTGTCTG(配列番号5)
NQO1 Reverse primer:AAGTTAGTCCCTCGGCCATT(配列番号6)
β−actin Forward primer:ACTGGGACGACATGGAGAAG(配列番号7)
β−actin Reverse primer:TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG(配列番号8)
94℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分間の条件でNQO1プライマーセットを用いて28サイクル(配列番号5、6)、β−actinプライマーセットを用いて25サイクル(配列番号7、8)でPCRを行った。DNA polymeraseはGoTaq(Promega)を使用した。PCR終了後のサンプルを1.5%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の解析を行った。
それぞれのバンド強度についてデンシトメトリー解析を行い、NQO1/β−actin比を取ることによってコントロールに対するNQO1発現増強量について半定量的に解析した。結果を図3〜図5に示す。
また、ホスファチジルイノシトールのみを添加した細胞においても、ホスファチジルセリンのみを添加した場合と同程度のNQO1発現増強効果が認められた(図4)。
また、ホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールを混合して添加すると、添加の合計量に大きな違いがない場合、PS/PIが0.5〜8の範囲であれば同程度のNQO1発現増強効果が認められた(図4、図5)。
P.Tsvetkov et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5535−5540の方法を一部変更して行った。
(1)細胞の播種とリン脂質の添加
Neuro 2aを5×105/wellとなるように6well plateに播種し、24時間培養した。培地を除去し、製造例1、2、5のリン脂質を図6に記載の濃度で添加し、24時間培養した。
(2)細胞抽出液の調製
(1)で培養したNeuro 2aをPBS(−)で1回洗浄した後、Lysis buffer(25mM Tris−HCl(pH7.5)/1mM EDTA/0.1mM DTT)500μLでサスペンドし、細胞懸濁液を得た。これを氷水中で約20秒間超音波処理した後、15000rpmで15分間、4℃の条件で遠心を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。
(3)タンパク定量(Bradford法)
BSA(スタンダード、SIGMA社製)及び細胞抽出液をそれぞれ10μLずつ96well plateに添加した。Bradford試薬(BIORAD社製)をMilli−Q水で5倍希釈し、各wellに200μLずつ添加した。室温で20分間静置した後、595nmの波長で吸光度測定を行った。BSAスタンダードから、細胞抽出液のタンパク濃度を算出した。
(4)活性測定
細胞抽出液100μLに対して、0.01% Tween20 10μL、40μM menadione 10μL、5μM FAD 10μL及び200μM NADH 10μLを添加した反応系に対し、NQO1阻害剤として10μM dicumarol 10μLを添加あるいは非添加の反応系を作製し、37℃で30分間、NADHの減少量を340nmの波長で吸光度を測定することより算出した。なお、反応系の容量は25mM Tris−HCl(pH7.5)を用いて200μLとした。
NQO1活性(% of control)は以下の式で算出した。
(NQO1活性)=((Dic(−)s−Dic(+)s)/(Dic(−)c−Dic(+)c))×100
Dic(−)s:dicumarol非添加サンプル吸光度
Dic(+)s:dicumarol添加サンプル吸光度
Dic(−)c:dicumarol非添加コントロール吸光度
Dic(+)c:dicumarol添加コントロール吸光度
結果を図6示す。
(1)細胞の播種とリン脂質ならびに一般抗酸化剤の添加
Neuro 2aを1×104/wellとなるように96well plateに播種し、24時間培養した。培地を除去し、製造例3、4、5のリン脂質を図7に記載の濃度で添加し、24時間培養した。
(2)Dicumarol(NQO1阻害剤)および過酸化水素の添加
(1)で培養したNeuro 2aに図7に記載の濃度に調製したDicumarolおよび過酸化水素を添加し、さらに24時間培養した。
(3)細胞保護効果の解析
(2)で培養したNeuro 2aにCell Counting Kit−8(株式会社同仁化学研究所)を10μLずつ添加し、37℃で2時間反応した。その後、プレートリーダーで各wellの450nmにおける吸光度を測定した。
(Viability(細胞生存率)% of control)=((S−BL)/(C−BL))×100
サンプル添加吸光度:S
コントロール吸光度:C
ブランク吸光度:BL
結果を図7に示す。
従って、PurePIとPurePSならびにその混合物によって認められた過酸化水素傷害に対する細胞保護効果にはNQO1が関与していることが考えられた。
(1)細胞の播種と製造例1の添加
Neuro 2aを1×104/wellとなるように96well plateに播種し、24時間培養した。培地を除去し、製造例1で得られたPI・PS含有リン脂質を図8に記載の濃度で添加し、24時間培養した。
(2)過酸化水素の添加
(1)で培養したNeuro 2aに図8に記載の濃度に調製した過酸化水素を添加し、さらに24時間培養した。
(3)細胞保護効果の解析
(2)で培養したNeuro 2aにCell Counting Kit−8(株式会社同仁化学研究所)を10μLずつ添加し、37℃で2時間反応した。その後、プレートリーダーで各wellの450nmにおける吸光度を測定した。
(Viability(細胞生存率)% of control)=((S−BL)/(C−BL))×100
サンプル添加吸光度:S
コントロール吸光度:C
ブランク吸光度:BL
結果を図8に示す。
製造例1のPI・PS含有リン脂質を肥満モデルのZuckerラットに与えた。
食餌組成および飼育方法
6週齢の雄性Zuckerラットを2群に分け(1群6匹)、対照群(TG群、control)と、PI・PS含有リン脂質を2%添加したPIPS群を設けた。以上の2群を4週間飼育し、9時間絶食後、エーテル麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、肝臓を摘出した。
食餌組成を表1に示す。
上記ラットの肝臓をPBS(−)を用いて50mg/mLのホモジネートを調製した。TBARS Assay kit(ZeptoMetrix社製)の添付文書に参考にして、チオバルビツール酸反応生成物の測定を行った。結果はチオバルビツール酸と反応する過酸化脂質由来のマロンジアルデヒド(MDA)量で示した。
測定結果を図9に示す。
また、PI・PS含有リン脂質によるTBARS抑制効果には、少なからずNQO1が関与していることが推測される。
Claims (7)
- リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするNQO1発現増強剤。
- リン脂質がホスファチジルセリンであることを特徴とする請求項1記載のNQO1発現増強剤。
- リン脂質がホスファチジルイノシトールであることを特徴とする請求項1記載のNQO1発現増強剤。
- リン脂質がホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールを含む混合物であることを特徴とする請求項1記載のNQO1発現増強剤。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載のNQO1発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載のNQO1発現増強剤を含むことを特徴とする化粧品。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載のNQO1発現増強剤を含むことを特徴とする医薬品及び医薬部外品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007138250A JP2008260743A (ja) | 2006-08-03 | 2007-05-24 | Nqo1発現増強剤 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006211929 | 2006-08-03 | ||
JP2007073327 | 2007-03-20 | ||
JP2007138250A JP2008260743A (ja) | 2006-08-03 | 2007-05-24 | Nqo1発現増強剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008260743A true JP2008260743A (ja) | 2008-10-30 |
Family
ID=39983495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007138250A Pending JP2008260743A (ja) | 2006-08-03 | 2007-05-24 | Nqo1発現増強剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008260743A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010163403A (ja) * | 2009-01-19 | 2010-07-29 | Nagase Chemtex Corp | イソプラスタン低下剤 |
WO2020137017A1 (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-02 | 日本精化株式会社 | 美白剤、ヒアルロン酸産生促進剤、コラーゲン産生促進剤、細胞内活性酸素消去剤、刺激緩和剤、シワ改善剤、複合体、化粧料、及び皮膚外用剤 |
JP2020105076A (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-09 | 日本精化株式会社 | ホスファチジルイノシトール含有生理活性組成物 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003012520A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-01-15 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 抗酸化剤及びそれを含有する飲食品 |
JP2004248643A (ja) * | 2003-02-18 | 2004-09-09 | Bhn Kk | 透明性基剤及びその利用 |
WO2005037848A2 (en) * | 2003-10-22 | 2005-04-28 | Enzymotec Ltd. | Glycerophospholipids containing omega-3 and omega-6 fatty acids |
-
2007
- 2007-05-24 JP JP2007138250A patent/JP2008260743A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003012520A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-01-15 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 抗酸化剤及びそれを含有する飲食品 |
JP2004248643A (ja) * | 2003-02-18 | 2004-09-09 | Bhn Kk | 透明性基剤及びその利用 |
WO2005037848A2 (en) * | 2003-10-22 | 2005-04-28 | Enzymotec Ltd. | Glycerophospholipids containing omega-3 and omega-6 fatty acids |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010163403A (ja) * | 2009-01-19 | 2010-07-29 | Nagase Chemtex Corp | イソプラスタン低下剤 |
WO2020137017A1 (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-02 | 日本精化株式会社 | 美白剤、ヒアルロン酸産生促進剤、コラーゲン産生促進剤、細胞内活性酸素消去剤、刺激緩和剤、シワ改善剤、複合体、化粧料、及び皮膚外用剤 |
JP2020105076A (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-09 | 日本精化株式会社 | ホスファチジルイノシトール含有生理活性組成物 |
CN113226277A (zh) * | 2018-12-26 | 2021-08-06 | 日本精化株式会社 | 美白剂、透明质酸产生促进剂、胶原蛋白产生促进剂、细胞内活性氧清除剂、刺激缓解剂、皱纹改善剂、复合物、化妆品和皮肤外用剂 |
JP7178257B2 (ja) | 2018-12-26 | 2022-11-25 | 日本精化株式会社 | ホスファチジルイノシトール含有生理活性組成物 |
CN113226277B (zh) * | 2018-12-26 | 2023-12-01 | 日本精化株式会社 | 美白剂、透明质酸产生促进剂、胶原蛋白产生促进剂、细胞内活性氧清除剂、刺激缓解剂、皱纹改善剂、复合物、化妆品和皮肤外用剂 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Valenti et al. | Epigallocatechin-3-gallate prevents oxidative phosphorylation deficit and promotes mitochondrial biogenesis in human cells from subjects with Down's syndrome | |
Swanson et al. | Cereal alkylresorcinols elevate γ-tocopherol levels in rats and inhibit γ-tocopherol metabolism in vitro | |
Shimatsu et al. | Clinical application of “curcumin”, a multi-functional substance | |
Wang et al. | Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescence-accelerated mice | |
Venegas et al. | Determination of coenzyme Q10, coenzyme Q9, and melatonin contents in virgin argan oils: Comparison with other edible vegetable oils | |
US10842179B2 (en) | Agents and mechanisms for treating hypercholesterolemia | |
Dogliotti et al. | Natural zeolites chabazite/phillipsite/analcime increase blood levels of antioxidant enzymes | |
Li et al. | rBTI extends Caenorhabditis elegans lifespan by mimicking calorie restriction | |
EP1827136B1 (en) | Formulation for oral administration having a health-promoting effect on the cardiovascular system | |
WO2009019600A2 (en) | Modulation of endogenous ampk levels for the treatment of obesity | |
Turunen et al. | Blood concentration of coenzyme Q10 increases in rats when esterified forms are administered | |
US10912812B2 (en) | Methods for preparing botanical extracts | |
JP2008260743A (ja) | Nqo1発現増強剤 | |
KR100926798B1 (ko) | 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체배양물로부터 분리된 히스피딘 유사체를 포함하는 항산화조성물 | |
JP2011168541A (ja) | Nrf2活性増強剤、Nrf2活性増強用食品及びNrf2活性増強用化粧品 | |
Hwang et al. | Isodihydrocapsiate stimulates plasma glucose uptake by activation of AMP-activated protein kinase | |
JP7177440B2 (ja) | 有機セレン化合物含有組成物 | |
US20080260873A1 (en) | Agent for prevention or improvement of neuropathy comprising pre-germinated brown rice lipid fraction as an effective ingredient | |
Wang et al. | Metabolic choice tunes Foxp3+ regulatory T cell function | |
JP2008255022A (ja) | 抗癌性物質 | |
EP3142660B1 (en) | Composition comprising 7-hydroxymatairesinol | |
TWI777102B (zh) | 金針菇萃取物的水層萃取物的製備方法及其用途 | |
WO2022050355A1 (ja) | ドコサヘキサエン酸、ドコサヘキサエノイル基含有ホスファチジン酸、又はその誘導体によるセロトニントランスポーター関連精神疾患の予防・治療剤 | |
KR100911672B1 (ko) | 골기질 강화용 건강식품 조성물 및 골기질 강화용 성분의 분리 방법 | |
JP2024059594A (ja) | プラズマローゲン含有組成物、プラズマローゲンの製造方法、プラズマローゲン合成促進用培地、抗炎症剤、抗炎症用経口組成物、認知機能改善剤、認知機能改善用経口組成物、神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用経口組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100316 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120724 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120921 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20120921 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121120 |